CN116144571A - 一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不依赖于抗生素并稳定高产α‑淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用，属于基因工程和发酵工程领域。所述短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)的保藏编号为CCTCC NO：M 2023265。本发明通过敲除短小芽孢杆菌基因组中的必需基因ftsz，同时在表达重组α‑淀粉酶的质粒中插入ftsz，获得重组的短小芽孢杆菌菌株。本发明的短小芽孢杆菌菌株发酵过程中不依赖于额外的抗生素，具有极高遗传稳定性，且发酵产酶水平由改造前的6241.3U/mL提高至23603.2U/mL，提高了3.8倍。因此，本发明有助于酶制剂的高效低成本生产，具有很好的工业应用前景。

Description

一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及 其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程和发酵工程领域，特别是涉及一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)作为一种具有卓越合成及分泌蛋白质能力、并且胞外蛋白酶活性低等优点的革兰氏阳性菌，其逐渐被用于各种目的蛋白质的重组生产，比如环糊精糖基转移酶和普鲁兰酶等。
构建产酶的重组短小芽孢杆菌最便捷的方法是克隆待表达的酶编码基因到游离型表达载体，再将表达载体转入短小芽孢杆菌中获得产酶的重组芽孢杆菌。然而这种方法也存在缺陷，表达重组酶的质粒在宿主细胞中以游离形式存在，在细胞传代的过程中表达质粒会丢失，从而导致宿主细胞的产酶能力下降。目前，抗性筛选标记是短小芽孢杆菌表达系统最常用的筛选标记。那么维持重组短小芽孢杆菌中表达质粒稳定性的方法是在短小芽孢杆菌发酵生产的过程中，向培养基中加入一定浓度的抗生素来避免重组质粒的丢失。但是这样做又会带来一些新的问题，比如发酵生产成本的增加，分离纯化目标产物的难度加大，同时抗生素的大量使用也会造成环境污染问题。因此，需要建立一种简单、高效和快捷的通过游离质粒表达实现工业酶制剂高效、稳定表达的新方法，并且所获得的酶高产菌能够满足工业化高效稳定生产的需要。
淀粉酶在动物、植物和微生物中广泛存在，它是水解淀粉和糖原生物这一类酶的总称，是工业化生产应用的最早的一种酶制剂，也是迄今为止用途广、产量大、应用相当成功的酶制剂产品之一。例如：早在1905年日本就开始采用米曲霉的α-淀粉酶进行退浆。使用α-淀粉酶对纺织品退浆，不仅效率高，而且对环境污染和纤维损伤都很少。由于纺织工业生产条件剧烈、复杂，温度和pH波动较大，甚至某些工艺必须在高温下才能进行，这需要α-淀粉酶在很宽温度范围和pH范围内表现为高活性。极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA-m的最适反应pH为5～6.5，最适反应温度为100℃，在此温度下的绝对酶活力为5201.08U/mg，于100℃半衰期为80min。因此，极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkAm在织物退浆工艺中具有巨大的应用潜力。极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkAm的高效稳定表达可以为其在织物退浆工艺中的应用奠定基础。基于α-淀粉酶的广泛应用，建立一种简单、高效和快捷的制备方法非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过基因工程构建的重组短小芽孢杆菌，经过发酵培养发现可以显著提高α-淀粉酶产量，具有很好的工业应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌，其命名为短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)AF，所述短小芽孢杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2023265，保藏时间为2023年3月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明还提供一种所述的短小芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将获取的短小芽孢杆菌基因组中细菌微管蛋白FtsZ的表达框以及表达α-淀粉酶的编码基因克隆入表达载体中，构建重组表达质粒；所述表达载体包括但不限于pNCMO2；
(2)将所述重组表达质粒转入短小芽孢杆菌，获得重组菌株；
(3)合成由FtsZ编码基因上游同源臂、Erm抗性基因表达框以及FtsZ编码基因下游同源臂构成的DNA片段，并进行扩增；
(4)将步骤(3)扩增后的DNA片段转入步骤(2)获得的重组菌株中，通过所述DNA片段敲除短小芽孢杆菌基因组中FtsZ编码基因，获得所述短小芽孢杆菌。
优选的是，步骤(1)中，所述重组表达质粒的具体构建方法包括：获取短小芽孢杆菌基因组中细菌微管蛋白FtsZ的表达框，并将其克隆入短小芽孢杆菌表达载体的非功能区，然后将表达α-淀粉酶编码基因克隆入所述表达载体的外源基因表达框中，获取重组表达质粒；
优选的是，所述细菌微管蛋白FtsZ的表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达α-淀粉酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的是，步骤(2)中，所述短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)SP3或其衍生菌株。
优选的是，步骤(3)中，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种所述的短小芽孢杆菌在生产α-淀粉酶中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的基于基因构成构建的重组短小芽孢杆菌，是通过敲除短小芽孢杆菌基因组中的必需基因ftsz，同时在表达重组α-淀粉酶的质粒中插入必需基因ftsz，获得的不依赖于抗生素并且稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌菌株。通过实验发现，该菌株在发酵生产过程中不需要额外添加抗生素，并且菌株在生产过程中始终保持极高的遗传稳定性。将所构建的短小芽孢杆菌菌株于无抗液体培养基传代培养10代后，质粒的丢失率由35.9％下降至0.5％。利用本发明方法构建的不依赖于抗生素并且稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌菌株，在3L发酵罐发酵72h产酶水平由对照(改造前)的6241.3U/mL提高至23603.2U/mL，提高了3.8倍。因此，本发明有助于酶制剂的高效低成本生产，具有很好的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明重组质粒pNCMO2的示意图；
图2为本发明重组质粒pNCMO2-apkam的示意图；
图3为本发明重组质粒pNCMO2-apkam/ftsz的示意图；
图4为本发明短小芽孢杆菌菌株的菌落PCR验证结果；M：DNA标准分子；泳道1：转入ftsz前FtsZ-F/R引物检测结果；泳道2：转入ftsz前ApkAm-F/R引物检测结果；泳道3：转入ftsz后FtsZ-F/R引物检测结果；泳道4：转入ftsz后ApkAm-F/R引物检测结果；
图5为本发明短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF的构建示意图；
图6为本发明短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF的构建验证结果；M：DNA标准分子；泳道1：缺失ftsz前F1/R1引物检测结果；泳道2：缺失ftsz前F1/R3引物检测结果；泳道3：缺失ftsz前F3/R1引物检测结果；泳道4：缺失ftsz前F3/R3引物检测结果；泳道5：缺失ftsz后F1/R1引物检测结果；泳道:6：缺失ftsz后F1/R3引物检测结果；泳道7：缺失ftsz后F3/R1引物检测结果；泳道8：缺失ftsz后F3/R3引物检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用到的主要实验样品和试剂：
(1)菌株与载体
大肠杆菌Escherichia coli JM109、短小芽孢杆菌Brevibacillus choshinensisSP3、短小芽孢杆菌表达载体pNCMO2均购自TaKaRa公司。
(2)酶类及其他生化试剂
KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶购自Toyobo公司，DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、低分子量蛋白质Marker购自Fermentase公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.购自Omega Bio-tek公司，其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
(3)培养基
LB液体培养基(1L)：10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl。
LB固体培养基：含有2％(m/v)琼脂粉的LB液体培养基。
TM液体培养基(1L)：10g多聚蛋白胨、5g牛肉粉、2g酵母粉、10g葡萄糖、0.01gFeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·4H2O、0.001g ZnSO4·7H2O。
TM固体培养基：含有2％(m/v)琼脂粉的TM液体培养基。
3L发酵罐发酵基础培养基(1L)：10g葡萄糖、15g多聚蛋白胨、15g牛肉提取物、0.1gZnSO4·7H2O、1g KH2PO4、1g MnSO4·4H2O、1g FeSO4·7H2O、0.5g(NH4)2SO4、2gMgSO4·7H2O。
3L发酵罐发酵补料培养基(1L)：100g葡萄糖。
本发明中所用到的分子克隆技术和蛋白质检测技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照如下实验手册中的相关部分来进行：Green MR,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2012。
实施例1重组质粒的构建
(1)重组质粒pNCMO2-apkam的构建
α-淀粉酶ApkAm编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，采用化学全基因合成方法合成α-淀粉酶ApkAm编码基因apkam。根据合成基因apkam的核苷酸序列设计PCR引物ApkAm-F和ApkAm-R，上游引物ApkAm-F含有BamH I内切酶酶切位点，下游引物ApkAm-R含有Xba I内切酶酶切位点，引物序列如表1所示。
表1引物列表
Figure BDA0004156829440000051
以合成基因为模板，以ApkAm-F和ApkAm-R为引物，进行PCR扩增；PCR扩增条件为：98℃5min；98℃20sec，60℃20sec，74℃1min，30个循环；74℃，10min；扩增产物经BamH I和Xba I双酶切，连接至经同样双酶切处理后的载体pNCMO2。
将连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，于37℃过夜培养。挑取LB固体平板上的单菌落进行PCR验证并进行测序。将测序验证正确的重组大肠杆菌单克隆接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。待培养结束后，于12000rpm离心5min收集菌体沉淀，采用质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.提取重组大肠杆菌中所含质粒pNCMO2-apkam。表达载体pNCMO2的示意图如图1所示，重组质粒pNCMO2-apkam的示意图如图2所示。
(2)重组质粒pNCMO2-apkam/ftsz的构建
取短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3菌株，接种于TM液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。待培养结束后，于12000rpm离心5min收集菌体沉淀，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3基因组DNA。短小芽孢杆菌B.choshinensisSP3中细菌微管蛋白FtsZ的表达框具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。根据细菌微管蛋白FtsZ表达框的核苷酸序列设计PCR引物FtsZ-F和FtsZ-R(见表1)。
以短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3基因组DNA为模板，以FtsZ-F和FtsZ-R为引物，进行PCR扩增，从短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3基因组克隆出细菌微管蛋白FtsZ的表达框。PCR扩增条件为：98℃5min；98℃20sec，60℃25sec，74℃1min，30个循环；74℃，10min；扩增产物经限制性内切酶Sam I和Hind III双酶切，再连接至经同样双酶切处理后的载体pNCMO2。将连接产物转入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，于37℃过夜培养。挑取LB固体平板上的单菌落进行PCR验证并进行测序。将测序验证正确的重组大肠杆菌单克隆接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。待培养结束后，于12000rpm离心5min收集菌体沉淀，采用质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.提取重组大肠杆菌中所含重组质粒pNCMO2-ftsz。
以pNCMO2-apkam为模板，以ApkAm-F和ApkAm-R为引物，进行PCR扩增；PCR扩增条件同上。扩增产物经BamH I和Xba I双酶切，连接至经同样双酶切处理后的载体重组质粒pNCMO2-ftsz。将连接产物转入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，于37℃过夜培养。挑取LB固体平板上的单菌落进行PCR验证并进行测序。将测序验证正确的重组大肠杆菌单克隆接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。待培养结束后，于12000rpm离心5min收集菌体沉淀，采用质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.提取重组大肠杆菌中所含重组质粒pNCMO2-apkam/ftsz。重组质粒pNCMO2-apkam/ftsz的示意图如图3所示。
实施例2短小芽孢杆菌菌株的构建
(1)短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam的构建
将重组质粒pNCMO2-apkam转入短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3感受态细胞，转化产物全部涂布于含30μg/mL新霉素的TM固体平板上，于37℃过夜培养。挑取TM固体平板上的单克隆菌落，分别采用引物对FtsZ-F/FtsZ-R和引物对ApkAm-F/ApkAm-R进行菌落PCR验证，菌落PCR验证结果如图4所示，并同时将菌落PCR产物送至DNA测序。菌落PCR验证结果和DNA测序结果表明短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam构建成功。
(2)短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis AF的构建
短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis AF的构建示意图如图5所示。将重组质粒pNCMO2-apkam/ftsz转入短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3感受态细胞，转化产物全部涂布于含30μg/mL新霉素的TM固体平板上，于37℃过夜培养。挑取TM固体平板上的单克隆菌落，分别采用引物对FtsZ-F/FtsZ-R和引物对ApkAm-F/ApkAm-R进行菌落PCR验证，菌落PCR验证结果如图4所示，并同时将菌落PCR产物送至DNA测序。菌落PCR验证结果和DNA测序结果表明短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz构建成功。
由短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3中细菌微管蛋白FtsZ编码基因上游同源臂-Erm抗性基因表达框-FtsZ编码基因下游同源臂构成的DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。采用化学全基因合成方法合成由FtsZ编码基因上游同源臂-Erm抗性基因表达框-FtsZ编码基因下游同源臂构成的DNA片段。以该DNA片段为模板，采用表1中引物F2和R2对DNA片段进行PCR扩增。将DNA片段转入短小芽孢杆菌B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz感受态细胞，转化产物全部涂布于含30μg/mL新霉素和10μg/mL红霉素的TM固体平板上，于37℃过夜培养。挑取TM固体平板上的单克隆菌落，以短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz为对照，分别采用引物对F1/R1、F1/R3、F3/R1及F3/R3对短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz及上述单克隆菌落进行菌落PCR验证，菌落PCR验证结果如图6所示。如图6所示菌落PCR验证结果显示，上述单克隆菌落的基因组中细菌微管蛋白FtsZ编码基因ftsz已缺失。以上结果表明短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3(△ftsz)/pNCMO2-apkam/ftsz构建成功，将短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3(△ftsz)/pNCMO2-apkam/ftsz命名为Brevibacillus choshinensisAF(构建示意图见图5)。
实施例3短小芽孢杆菌菌株的遗传稳定性评价
短小芽孢杆菌菌株的遗传稳定性评价方法如下：将实施例2构建的短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz作为稳定性评价对照菌，将实施例2构建的短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF作为稳定性评价测试菌。将短小芽孢杆菌菌株单菌落接种至100mL TM液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养。12h后以10％接种量接种至100mL新鲜TM液体培养基中，连续培养10代，每12h转接1次。将传代培养过程中获得的菌液涂布于TM固体平板，随机挑取100个单菌落点板转接至TM固体平板和含30μg/mL新霉素的TM固体平板上，比较2种平板上菌落数，计算无抗平板与抗性平板上生长菌落的比例。短小芽孢杆菌菌株的遗传稳定性评价结果如表2所示，短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF经过10代120h无抗传代培养后在抗性平板上的生长比例达到99.5％，完全满足发酵生产的要求。
表2重组短小芽孢杆菌的遗传稳定性评价结果
Figure BDA0004156829440000071
实施例4短小芽孢杆菌菌株的产酶性能评价
以实施例2构建的短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF作为生产菌株，以实施例2构建的短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz作为生产对照菌株，在3L发酵罐中采用未添加抗生素的发酵培养基进行发酵生产重组α-淀粉酶ApkAm。
短小芽孢杆菌菌株的3-L发酵罐发酵培养条件如下：
(1)3-L发酵罐发酵种子培养：从-80℃冰箱保存的甘油管中，按照0.2％(v/v)的接种量转接至50mL TM液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12h即可获得3-L发酵罐发酵种子液。
(2)3-L发酵罐发酵培养：将培养好的3-L发酵罐发酵种子液按照10％(v/v)的接种量转接到装有1L发酵罐发酵基础培养基的3-L发酵罐中，在37℃、pH 7.0、200rpm，通气量为1.5vvm，溶氧(DO)为30％的初始条件下进行上罐发酵。在发酵过程中，利用3mol/L的NaOH和20％(v/v)的H2SO4将发酵液的pH维持在7.0；通过调节注入气体中纯氧的比例来维持发酵液的DO在30％；通过调整发酵罐发酵补料培养基的流速将发酵液中的葡萄糖浓度控制在5g/L以下。3-L发酵罐发酵的培养时间为72h。
待发酵培养结束后，取1mL发酵液，于12000rpm离心10min，收集发酵液上清进行α-淀粉酶酶活力测定。
α-淀粉酶酶活力测定采用DNS法。具体方法如下：将10μL发酵液上清与490μL含1％(m/v)可溶性淀粉的50mM MES，pH 6.5缓冲液混合，于90℃反应30min后，迅速放入冰水浴中终止反应，然后采用DNS法测定反应体系中还原糖量。DNS试剂的配制：称取6.5g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液262mL，50℃水浴溶解后，再加入185g酒石酸钾钠及5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，冷却后定容至1L，储存至棕色瓶中，放置于4℃冰箱待用。葡萄糖标准曲线的制作：配制0～0.6mol/L不同浓度的葡萄糖溶液。取10μL不同浓度的葡萄糖溶液与490μL DNS溶液混合，于100℃沸水浴中煮沸10min。迅速至于冰水浴中冷却，稀释5倍后，测定样品的OD540nm。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。酶活力单位(U)定义：在一定反应条件下，每分钟催化产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)的酶量为一个酶活力单位(U)。
短小芽孢杆菌菌株在3-L发酵罐中采用未添加抗生素的发酵培养基进行发酵生产重组α-淀粉酶ApkAm。待发酵72h时，短小芽孢杆菌菌株B.choshinensis SP3/pNCMO2-apkam/ftsz发酵液上清中重组α-淀粉酶的酶活力为6241.3U/mL；短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF发酵液上清中重组α-淀粉酶的酶活力为23603.2U/mL。即本发明方法构建的不依赖于抗生素并且稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌菌株Brevibacillus choshinensis AF，在3L发酵罐发酵72h产酶水平由对照(改造前)的6241.3U/mL提高至23603.2U/mL，提高了3.8倍。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)，其特征在于，所述短小芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2023265。
2.一种根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将获取的短小芽孢杆菌基因组中细菌微管蛋白FtsZ的表达框以及表达α-淀粉酶的编码基因克隆入表达载体中，构建重组表达质粒；
(2)将所述重组表达质粒转入短小芽孢杆菌，获得重组菌株；
(3)合成由FtsZ编码基因上游同源臂、Erm抗性基因表达框以及FtsZ编码基因下游同源臂构成的DNA片段，并进行扩增；
(4)将步骤(3)扩增后的DNA片段转入步骤(2)获得的重组菌株中，通过所述DNA片段敲除短小芽孢杆菌基因组中FtsZ编码基因，获得所述短小芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组表达质粒的具体构建方法包括：获取短小芽孢杆菌基因组中细菌微管蛋白FtsZ的表达框，并将其克隆入短小芽孢杆菌表达载体的非功能区，然后将表达α-淀粉酶编码基因克隆入所述表达载体的外源基因表达框中，获取重组表达质粒。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细菌微管蛋白FtsZ的表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达α-淀粉酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌SP3或其衍生菌株。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种权利要求1所述的短小芽孢杆菌在生产α-淀粉酶中的应用。
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