CN112961788B

CN112961788B - 一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用

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Publication number: CN112961788B
Application number: CN202110206889.9A
Authority: CN
Inventors: 喻晓蔚; 闫肃; 徐岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN112961788A

Abstract

本发明公开了一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过表达转录激活因子XYR1增强木聚糖降解酶表达能力，并设计启动子Pcbh1上的转录因子结合位点，使得组成型表达XYR1能够对人工Pcbh1启动子形成进一步的激活作用，并用其表达同源木聚糖酶XYNII，获得重组里氏木霉。在纤维素诱导条件下，重组菌木聚糖酶的表达量达到6410U/mL，木糖苷酶活力达到9.08U/mL；重组菌株可以解除碳代谢阻遏，以可溶性廉价碳源葡萄糖和乳糖为发酵碳源，同样可以获得2514U/mL和3446U/mL的胞外木聚糖酶活，同时木糖苷酶产量较亲本提高了9.3倍和2.3倍。

Description

一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖是主要由木糖通过β-1，4-糖苷键组成的多聚糖，常见于植物中，是仅次于纤维素的第二大碳水化合物。与纤维素不同的是，木聚糖β-1，4-主链多由乙酰基、阿拉伯呋喃基以及葡糖醛酸等侧链取代基修饰形成异质木聚糖，因此，木聚糖的充分降解需要多种酶的协同作用。木聚糖酶是一类能够降解木聚糖的水解酶的总称，包括内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酶等。其中，内切木聚糖酶主要对木聚糖主链进行切割，协同β-木糖苷酶以及其他侧链水解酶，使具有复杂结构的木聚糖被降解为单糖。内切木聚糖酶广泛应用于生物能源，饲料以及食品行业。尤其是近年来，木聚糖酶作为辅助酶参与生物质转化以及饲料领域越来越受到关注，但是其较高的生产成本与较低的产量不能满足市场的需求，阻碍了木聚糖酶大范围的利用。

通过基因工程手段改造细胞工程菌株表达木聚糖酶是获得大量木聚糖酶的有效手段。Ouephanit等在毕赤酵母中表达青霉来源的木聚糖酶，产量达到676 U/mL; Long等通过双质粒手段在毕赤酵母中表达了黑曲霉来源的木聚糖酶XYNC，最终在5L罐中胞外木聚糖酶活力达到1650 U/mL；Miyauchi等在里氏木霉中异源表达灰腐质霉的木聚糖酶，产量达到1780 U/mL。异源表达木聚糖酶会受到诸多限制，例如蛋白降解以及折叠不充分引起的非折叠蛋白响应等，都会阻碍重组蛋白产量的进一步提高。Li等在里氏木霉中组成型表达了同源木聚糖酶XYNII，在7%葡萄糖和5%豆饼粉的复杂培养基上产量高达9266 U/mL，而对木聚糖的高效降解需要多种木聚糖降解酶的协同作用，因此高效生产具有多种木聚糖降解酶组分的木聚糖酶体系能够广泛满足能源以及饲料领域的大规模生产与应用。

里氏木霉中Pcbh1启动子多用于重组蛋白的表达。同时Pcbh1启动子还受到多种转录因子如XYR1，CRE1以及ACE1等的调控。Zou等以及Liu等通过Pcbh1启动子改造使重组蛋白的表达量提高了2.5-5.5倍不等。Daniel等发现xyn1启动子上的反向GGCTAA区域对xyr1结合与激活至关重要，且通过对Pcbh1启动子进行改造，使重组GoxA的活力在木聚糖培养基上提高20.26倍为了进一步增强启动子的强度。Sun等通过替换Pcbh1启动子上的ACE1识别位点为GGCTAA, 使重组甘露糖苷酶的活力提升5倍。

丝状真菌里氏木霉能够在纤维素及其低聚物诱导下大量表达纤维素酶、木聚糖酶，其表达的GH11家族的木聚糖酶XYNII具有较高的催化活力与稳定性，具有较大的应用价值。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是：木聚糖是一类由木糖组成主链以及其他取代基组成支链的异质多聚糖，是除纤维素以外的第二大多聚糖。木聚糖的降解需要多种酶的复合作用，包括内切木聚糖酶、木糖苷酶对主链的切割以及乙酰木聚糖酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶等侧链基团的切割，且内切木聚糖酶的作用还受到侧链基团的限制，因此构建能够高产木聚糖降解复合酶的体系对实现木聚糖的高效降解并利用到能源饲料领域有着重要的意义。

[技术方案]

本发明的目的在于通过改造转录因子XYR1增强木聚糖降解酶系表达能力，同时设计并改良人工Pcbh1启动子上转录因子结合位点，使得组成型表达的XYR1能够对Pcbh1启动子形成进一步激活，并利用人工Pcbh1启动子同源表达XYNII，构建能够高产木聚糖降解酶系的重组菌株，对于木聚糖酶的工业化生产与应用具有非常重要的价值。

本发明提供了一株通过基因工程改造的重组里氏木霉，以里氏木霉RUT-C30Δura3为宿主，以PgpdA启动子表达了转录激活因子XYR1；并将强启动子Pcbh1上的转录抑制因子CRE1, ACE1的识别位点全部替换为7个XYR1反向重复识别位点；并以人工改造的Pcbh1启动子表达了木聚糖酶XYNII。所述里氏木霉RUT-C30Δura3是以里氏木霉RUT-C30为亲本敲除ura3基因构建成尿嘧啶营养缺陷型。所述转录激活因子XYR1来源于里氏木霉。所述木聚糖酶XYNII来源于里氏木霉。

在本发明的一种实施方式中，XYR1的表达框以单交换的方式整合到里氏木霉RUT-C30Δura3基因组的ace1位点的上游，XYNII的表达框以同源重组双交换的方式整合到里氏木霉RUT-C30Δura3基因组的cbh1位点。

在本发明的一种实施方式中，所述转录因子XYR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述转录因子XYR1的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述PgpdA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述人工改造的Pcbh1启动子的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。7个XYR1反向重复识别位点以下划线标注。

在本发明的一种实施方式中，所述XYNII的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述XYNII的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供上述高产木聚糖酶基因工程里氏木霉的构建方法，将XYR1基因与XYNII的基因分别连接到骨架质粒上，将重组质粒转化农杆菌AGL1，并将里氏木霉RUT-C30Δura3与含有相应质粒的农杆菌共培养转化，得到重组里氏木霉。所述方法具体是：

（1）克隆PgpdA启动子与XYR1的编码框架以及ace1上下游片段，通过同源重组构建XYR1表达载体pXYR1；

（2）将重组质粒pXYR1转化农杆菌，挑取转化子与里氏木霉RUT-C30Δura3共培养转化，得到单交换到ace1位点的转化子C30OExyr1；

（3）将cbh1的同源臂上游、潮霉素筛选标记HYG表达框、7IRPcbh1启动子、XYNII的序列、cbh1终止子序列通过InFusion连接到经过改造的pCAMBIA1301G，构建成载体p7IRCbhxyn2Δcbh1；所述经过改造的pCAMBIA1301G，是以pCAMBIA1301G为模板，用引物扩增载体区域，并从里氏木霉基因组上分别扩增启动子Ppki、ura3的CDS区域、终止子Tcbh2以及反筛重叠区域，然后将以上5个片段通过Infusion连接，得到经过改造的pCAMBIA1301G；

（4）将重组质粒p7IRCbhxyn2Δcbh1转化农杆菌，与里氏木霉C30OExyr1进行共培养转化，经潮霉素筛选得到定点整合cbh1位点的转化子C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1。

本发明还提供了利用所述重组里氏木霉生产木聚糖酶的方法，可以以纤维素、乳糖或葡萄糖为碳源发酵生产木聚糖酶，适用于多种工业生产模式。

所述方法包括以下步骤：培养重组里氏木霉，使之生孢；收集孢子，接到SDB培养基培养，然后转接到纤维素诱导发酵培养基、乳糖发酵培养基或乳糖发酵培养基，于28 ˚C200 rpm培养4-5天，培养过程中重组里氏木霉表达木聚糖酶活力与木糖苷酶。

所述纤维素诱导发酵培养基的配方是：20 g/L 麸皮；30 g/L微晶纤维素；4 g/LKH2PO4；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl2；0.6 g/L MgSO4；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO4·H2O；0.0014 g/LZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5。

所述乳糖发酵培养基的配方是：50 g/L 乳糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl2；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/LCoCl₂，pH 5.5。

所述葡萄糖发酵培养基的配方是：50 g/L葡萄糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl2；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002g/L CoCl₂，pH 5.5。

本发明的有益效果

本发明通过表达转录激活因子XYR1增强木聚糖降解酶表达能力，并通过对强启动子Pcbh1上的转录抑制因子CRE1, ACE1的识别位点进行删除，并替换为7个反向重复的XYR1识别位点，使得组成型表达的XYR1能够对人工Pcbh1启动子形成进一步的激活作用。并利用该人工启动子进行同源木聚糖酶XYNII的表达，获得具有高产木聚糖酶的里氏木霉菌株，重组菌株在纤维素为碳源的情况下胞外木聚糖酶酶活达到6410 U/mL，木糖苷酶活力达到9.08U/mL，分别较亲本提高了9.28倍和2.93倍；同时重组菌还解除了碳代谢阻遏现象，在以阻遏廉价碳源葡萄糖和弱诱导物乳糖为碳源时胞外木聚糖酶活力分别达到2514 U/mL和3445 U/mL，木糖苷酶活力较亲本提高了9.3倍和2.3倍，廉价可溶性碳源的利用能够有效减少生产成本，更加适用于大规模发酵。同时以本发明制备的菌株生产的木聚糖酶协同商品纤维素进行秸秆糖化实验可以提高35%的糖化效率能够广泛应用到饲料，能源领域。

附图说明

图1：重组质粒pXYR1的图谱。

图2：重组质粒p7IRCbhxyn2Δcbh1的图谱。

图3：纤维素诱导发酵表达木聚糖酶的SDS-PAGE图。Lane M 为Marker； Lane 1 为纤维素诱导下亲本C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1的发酵液；

图4：纤维素培养条件下不同重组菌与亲本的胞外木聚糖酶（A）以及木糖苷酶（B）活力。其中RUT-C30为亲本菌，C30OExyr1为组成型表达XYR1的转化子，C30/xyn2为以亲本为宿主菌，Pcbh1启动子表达xyn2的菌株；C30OExyr1/xyn2Δcbh1为以C30OExyr1为宿主菌，Pcbh1启动子在cbh1位点表达xyn2的菌株；C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1为本专利中的木聚糖酶高产菌株。

图5：乳糖以及葡萄糖培养条件下不同重组菌与亲本的胞外木聚糖酶（A）以及木糖苷酶（B）活力。其中RUT-C30为亲本菌株；C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1为本专利中的木聚糖酶高产菌株；C30/pdcxyn2为以Li的方法构建的以Ppdc启动子表达XYNII的菌株。

具体实施方式

下列实施例中涉及的培养基如下

LB液体培养基：10g/L葡萄糖；5 g/L酵母粉；10g/L NaCl。

共培养转化IM诱导培养基：2.05 g/L K₂HPO₄；1.45 g/L KH₂PO₄；1.8 g/L葡萄糖；0.5 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L MgSO₄·7H₂O0.15 g/L NaCl；2.5 g/L甘油；0.066 g/L CaCl₂；0.00248 g/LFeSO₄·7H₂O；25 mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)；200 μmol/L乙酰丁香酮(AS)。

PDA培养基：PDA粉末37 g/L。

MM培养基：10 g/L葡萄糖，15 g/L KH₂PO₄；5 g/L (NH4)₂SO₄；0.6 g/L CaCl₂；0.6g/L MgSO₄；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5。

SDB培养基：40 g/L 葡萄糖；10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母粉。

纤维素诱导发酵培养基：20 g/L 麸皮；30 g/L微晶纤维素；4 g/L KH2PO4；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl2；0.6 g/L MgSO4；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO4·H2O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5。

乳糖/葡萄糖发酵培养基：50 g/L 乳糖/葡萄糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl2；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002g/L CoCl₂，pH 5.5。

酶活的定义和检测方法

木聚糖酶的酶活测定方法：

称取0.5 g木聚糖溶于50 mM pH 5.3的柠檬酸钠缓冲液配置成1%木聚糖溶液。取180 μL 1%木聚糖溶液于2 mL离心管，并加入20 μL稀释适当倍数的发酵上清液，50 ˚C保温5 min后，加入300 μL DNS试剂终止反应，沸水浴5 min，冰水浴冷却后取50 μL于含有150 μL ddH₂O的酶标板中，酶标仪读取A₅₄₀。酶活定义为每分钟催化1%木聚糖生成1 μmol木糖所需的酶量定义为1 U。

木糖苷酶的酶活测定方法：

称取10.8 mgpNPX（对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷）溶于10 mL 50 mM pH 5.0的NaAc Buffer，向1.5 mL EP管加入90 μL底物，再加入20 μL稀释到一定倍数的酶液，50 ˚C保温10 min，加入110 μL 2% Na₂CO₃终止反应，然后取200 μL测A₄₁₀。酶活定义为每分钟催化底物生成1 μmolpNP所需的酶量定义为1 U。

菌株（载体）的来源或构建方法：

里氏木霉RUT-C30：CICC （中国工业微生物菌种保藏管理中心）13052。

里氏木霉RUT-C30Δura3：以里氏木霉RUT-C30为亲本敲除ura3基因构建成尿嘧啶营养缺陷型。

农杆菌AGL1：购自上海唯地生物。

pCAMBIA1301G：以质粒pCAMBIA1301为模板，通过引物P23/P24 反向PCR获得载体序列；并以P25/P26为引物、以pAN7-1为模板，对PgpdA启动子进行扩增，将反向PCR得到的载体序列与扩增得到的PgpdA启动子通过Infusion连接得到pCAMBIA1301G。

载体2：以pCAMBIA1301G为模板，用引物P27/P28扩增载体区域，并从里氏木霉基因组上分别通过引物P29/P30，P31/P32，P33/P34，P35/P36分别扩增启动子Ppki，ura3的CDS区域，终止子Tcbh2以及反筛重叠区域，然后将以上5个片段通过Infusion连接构建成载体2。

冻融法转化农杆菌

1. 取0.5~1 µL重组质粒DNA，加入到农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀。

2. 冰浴5 min，液氮冷冻5 min，迅速转移至37 ˚C水浴锅中温浴融化5 min，然后置于冰上5 min。

3. 加入800 µL新鲜液体LB培养基，28 ˚C慢摇2-4 h。

4. 5000 rpm离心3 min，弃上清，适当浓缩菌体，约200 µL，涂布在含有相应抗性LB固体平板上，28 ˚C培养36-48 h直至长出单菌落。

农杆菌与里氏木霉的共培养转化

1. 先将含有目标质粒的农杆菌在含有利福平和相应抗性的LB试管中培养1-1.5天至试管浑浊。

2. 取0.5 mL菌液离心，弃上清，用500 µL含有MES和AS的IM液体培养基重悬菌体，并加入到试管中（初始OD₆₀₀约0.2-0.3），培养6-8h使OD₆₀₀达到0.8左右。

3. 将里氏木霉孢子悬浮液160 µL与农杆菌40 µL混合后涂布与覆盖玻璃纸的IM平板上，锡纸包裹至于24 ˚C静置培养48 h。

4. 用镊子将玻璃纸转移至含有相应抗性与300 µg/mL 头孢的PDA/MM平板上，置于30 ˚C培养箱培养3-5天后转化子长出。

5. 用接种环扣少量单菌落至复筛平板上，培养36 h长出菌落后接液体培养基提取基因组验证。

6. 验证正确的转化子接种PDA平板，待产孢后在抗性平板划线/涂布分离单孢子，并再次提取基因组验证。

7. 将验证正确的转化子接种PDA培养基产孢，收集孢子后用于发酵。

实施例1重组质粒及里氏木霉重组菌株的构建

利用引物P1、P2，以里氏木霉基因组为模板扩增XYR1的编码区域，并通过InFusion连接到通过引物P3、P4反向扩增获得的pCAMBIA1301G载体序列，构建成含有XYR1表达框架的载体1，并用引物P5、P6以载体1为模板对含有PgpdA启动子以及XYR1编码框+终止子的区域扩增获得XYR1的表达框。接下来用引物P7、P8以载体2为模板扩增URA3筛选标记。然后以里氏木霉基因组为模板，用引物P9、P10扩增ace1同源臂上游，P11、P12扩增ace1同源臂下游。将ace1同源臂上游、XYR1的表达框、扩增URA3筛选标记、ace1同源臂下游与EcoRI和SnaBI双酶切的载体2进行InFusion连接构建成载体pXYR1。

将重组质粒pXYR1通过冻融法转化农杆菌AGL1，待转化子长出后挑取单克隆接种LB试管，并添加50mg/L的卡那霉素和20mg/L的利福平，28˚C培养浑浊后转接IM诱导试管继续培养6-8h后与里氏木霉RUT-C30Δura3的孢子在含有0.1%尿嘧啶的IM平板上进行共培养转化，24˚C培养48h后将玻璃纸转移到含有300 mg/L 头孢噻肟钠的MM平板，等待转化子长出并验证后获得菌株C30OExyr1。

以里氏木霉cDNA为模板，利用引物P13、P14扩增木聚糖酶XYNII的序列。以合成的含有7IRPcbh1的质粒为模板，用引物P15，P16扩增人工启动子7IRPcbh1。并以里氏木霉基因组为模板，引物P17、P18扩增cbh1终止子序列，以P19、P20扩增cbh1的同源臂上游。用P21、P22，以质粒pCAMBIA1301G为模板扩增潮霉素筛选标记HYG表达框，将以上5个片段（cbh1的同源臂上游、潮霉素筛选标记HYG表达框、7IRPcbh1启动子、XYNII的序列、cbh1终止子序列）通过InFusion连接到EcoRI和SnaBI双酶切的载体2进行，构建成载体p7IRCbhxyn2Δcbh1。

将重组质粒p7IRCbhxyn2Δcbh1通过冻融法转化农杆菌AGL1，待转化子长出后挑取单克隆接种LB试管，并添加50 mg/L的卡那霉素和20 mg/L的利福平，28˚C培养浑浊后转接IM诱导试管继续培养6-8 h后与里氏木霉C30OExyr1的孢子在IM平板上进行共培养转化，24 ˚C培养48 h后将玻璃纸转移到含有300 mg/L 头孢噻肟钠以及20 mg/L 潮霉素的PDA平板，等待转化子长出并验证后获得木聚糖酶高产菌株C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1。

实施例2木聚糖酶的高效分泌表达

接种1 μL里氏木霉孢子到PDA平板中心，30˚C培养7天生孢。用生理盐水收集孢子，并稀释到浓度为10⁷/mL。接种0.5 mL 10⁷/mL 孢子到20 mL 的SDB培养基，28 ˚C 200 rpm培养40 h，然后转接5 mL 菌丝到纤维素诱导发酵培养基，28 ˚C 200 rpm培养4-5天，离心收集发酵液，检测发酵液上清的木聚糖酶活力与木糖苷酶活力。重组菌株C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1发酵液中的木聚糖酶活力最高达到6410 U/mL (图4A)，发酵液上清的SDS-PAGE如图3所示。除了木聚糖酶活力的提升，C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1的木糖苷酶活力的提升对整体木聚糖的降解带来积极的影响，发酵液上清中的木糖苷酶活力达到9.08 U/mL，如图 4B所示。

接种1 μL里氏木霉孢子到PDA平板中心，30˚C培养7天生孢。用生理盐水收集孢子，并稀释到浓度为10⁷/mL。接种0.5 mL 10⁷/mL 孢子到20 mL 的SDB培养基，28 ˚C 200 rpm培养40 h，然后接种到以廉价且可溶的碳源葡萄糖或乳糖为唯一碳源的发酵培养基时（乳糖/葡萄糖发酵培养基），28 ˚C 200 rpm培养4-5天，离心收集发酵液，检测发酵液上清的木聚糖酶活力与木糖苷酶活力。结果表明，菌株依然可以大量表达木聚糖酶，其中，在以葡萄糖或乳糖为碳源时，胞外木聚糖酶活力达到2514 U/mL和3446 U/mL，如图5A所示。同时，在以乳糖为碳源培养时，木糖苷酶活力达到1.22 U/mL，是亲本里氏木霉RUT-C30的2.35倍，如图5B所示；在葡萄糖培养基上的木糖苷酶活力达到0.75 U/mL，而亲本里氏木霉RUT-C30在葡萄糖培养基上的木糖苷酶的表达由于碳代谢阻遏而被抑制（图5B），这说明本专利中的高产木聚糖酶菌株可以在葡萄糖这种抑制碳源存在的情况下仍然表达相当可观的木聚糖酶与木糖苷酶。除此之外，以葡萄糖或乳糖为碳源的木聚糖酶表达模式大量减少了工业发酵时的底物昂贵问题，且可溶性的底物能够减少工业发酵时的传质传热损失，方便工业规模的扩大培养。

实施例3以木聚糖酶发酵液协同商品纤维素酶进行秸秆糖化实验

接种1 μL重组里氏木霉孢子到PDA平板中心，30˚C培养7天生孢。用生理盐水收集孢子，并稀释到浓度为10⁷/mL。接种0.5 mL 10⁷/mL 孢子到20 mL 的SDB培养基，28 ˚C 200rpm 培养40 h，然后转接5 mL 菌丝到纤维素诱导发酵培养基，28 ˚C 200 rpm培养4-5天，离心收集发酵液，得到木聚糖酶粗酶液。

将木聚糖酶粗酶液与商品纤维素酶（宁夏夏盛）共同进行秸秆糖化实验。糖化实验秸秆添加量保持固液比5%，即20 mL反应液含有1 g秸秆，所添加酶蛋白添加总量为8 mg/g秸秆（其中木聚糖酶粗酶液含有1971 U/mg木聚糖酶活，3.43 U/mg木糖苷酶酶活，0.6 U/mg纤维素酶酶活；而商品纤维素酶含有1.90 U/mg纤维素酶酶活，45 U/mg木聚糖酶酶活，0.37U/mg木糖苷酶酶活），在50°C，150rpm反应72h，通过HPLC测定葡萄糖生成量。在添加木聚糖酶酶活：纤维素酶酶活为500时，最后释放的葡萄糖总量比仅添加纤维素酶时高出35%，表明本实施例中的木聚糖酶作为纤维素酶的协同添加剂，在保持酶蛋白添加量相同的时候，能够更大幅度的提升秸秆降解率，具有应用在能源以及饲料领域的潜力。

对比例1纤维素诱导条件下本专利菌株与其他转化子的木聚糖酶生产能力对比

将木聚糖酶高产菌株与经过其他改造的菌株在纤维素诱导下进行发酵，检测胞外木聚糖酶与木糖苷酶活力。结果显示，亲本菌株RUT-C30能够生成690 U/mL的木聚糖酶；组成型表达XYR1的菌株C30OExyr1能够表达1095U/mL木聚糖酶活；以RUT-C30为宿主表达XYNII的菌株C30/xyn2能够生产2163U/mL木聚糖酶；以C30OExyr1为宿主菌在cbh1位点表达XYNII的菌株C30OExyr1/xyn2Δcbh1能够产生5256U/mL木聚糖酶活；而本专利中的菌株C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1由于对Pcbh1启动子进行了理性改造，删除了转录抑制因子CRE1以及ACE1的识别位点，并替换为7个XYR1反向重复识别序列，使得木聚糖酶的表达量进一步提升到6410U/mL，如图4A所示。对其木糖苷酶酶活测定表明，亲本菌株RUT-C30的木糖苷酶表达能力与C30/xyn2相近，而组成型表达XYR1的菌株中木糖苷酶酶活均有所提升，本专利中的菌株C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1亦能产生9.08 U/mL木糖苷酶，为亲本的2.93倍（图4B）。酶活测定表明本专利的高产木聚糖酶菌株能够表达更多的木聚糖酶与木糖苷酶。

对比例2本专利高产木聚糖酶的菌株与组成型表达XYNII的菌株在可溶碳源上的木聚糖酶生产能力对比

Li等报道利用组成型启动子Ppdc表达XYNII可以获得9266U/mL的木聚糖酶活力，为了对比本专利中高产木聚糖酶菌株在同等条件下相比组成型启动子Ppdc表达XYNII菌株的的木聚糖酶生产能力，我们在葡萄糖培养基上对菌株RUT-C30, C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1与C30/pdcxyn2进行发酵培养。结果表明，本专利中的高产木聚糖酶菌株在葡萄糖培养基上仍可以表达2514 U/mL的木聚糖酶，且胞外木糖苷酶活力可以达到0.75 U/mL，而亲本菌株在葡萄糖培养基上的木聚糖酶、木糖苷酶产量由于碳代谢阻遏的原因几乎丧失。而在组成型表达XYNII菌株C30/pdcxyn2中，木聚糖酶活力仅为1398 U/mL，而木糖苷酶活力也与由于碳代谢阻遏几乎没有表达。以乳糖为发酵碳源时，本专利菌株可以产生3445 U/mL木聚糖酶以及1.22 U/mL木糖苷酶，而亲本RUT-C30中仅为106 U/mL木聚糖酶和0.53 U/mL木糖苷酶活力，表明本专利的菌株在可溶碳源下也可以表达可观的木聚糖酶。

对比例3 XYR1插入位点与XYNII表达框插入位点对木聚糖酶表达差异的对比

XYR1表达框插入ace1上游时，构建菌株C30OExyr1，发酵能够表达1095 U/mL木聚糖酶，而当以双交换插入到ace1位点时，构建菌株C30OExyr1Δace1，发酵仅能表达1015 U/mL木聚糖酶；当以改造后的Pcbh1启动子表达XYNII的表达框以双交换插入到cbh1位点，构建菌株C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1，发酵能够生产6410 U/mL木聚糖酶，而随机整合插入的菌株C30OExyr1/7IRxyn2，仅能表达3510 U/mL木聚糖酶。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用

<130> BAA201535A

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 920

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 1

Met Leu Ser Asn Pro Leu Arg Arg Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ile Ser

1 5 10 15

Ser Ala Ser Phe Asp Pro Asn Tyr His Gly Ser Gln Ser His Leu His

20 25 30

Ser Ile Asn Val Asn Thr Phe Gly Asn Ser His Pro Tyr Pro Met Gln

35 40 45

His Leu Ala Gln His Ala Glu Leu Ser Ser Ser Arg Met Ile Arg Ala

50 55 60

Ser Pro Val Gln Pro Lys Gln Arg Gln Gly Ser Leu Ile Ala Ala Arg

65 70 75 80

Lys Asn Ser Thr Gly Thr Ala Gly Pro Ile Arg Arg Arg Ile Ser Arg

85 90 95

Ala Cys Asp Gln Cys Asn Gln Leu Arg Thr Lys Cys Asp Gly Leu His

100 105 110

Pro Cys Ala His Cys Ile Glu Phe Gly Leu Gly Cys Glu Tyr Val Arg

115 120 125

Glu Arg Lys Lys Arg Gly Lys Ala Ser Arg Lys Asp Ile Ala Ala Gln

130 135 140

Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln His Ser Gly Gln Val Gln Asp Gly

145 150 155 160

Pro Glu Asp Gln His Arg Lys Leu Ser Arg Gln Gln Ser Glu Ser Ser

165 170 175

Arg Gly Ser Ala Glu Leu Ala Gln Pro Ala His Asp Pro Pro His Gly

180 185 190

His Ile Glu Gly Ser Val Ser Ser Phe Ser Asp Asn Gly Leu Ser Gln

195 200 205

His Ala Ala Met Gly Gly Met Asp Gly Leu Glu Asp His His Gly His

210 215 220

Val Gly Val Asp Pro Ala Leu Gly Arg Thr Gln Leu Glu Ala Ser Ser

225 230 235 240

Ala Met Gly Leu Gly Ala Tyr Gly Glu Val His Pro Gly Tyr Glu Ser

245 250 255

Pro Gly Met Asn Gly His Val Met Val Pro Pro Ser Tyr Gly Ala Gln

260 265 270

Thr Thr Met Ala Gly Tyr Ser Gly Ile Ser Tyr Ala Ala Gln Ala Pro

275 280 285

Ser Pro Ala Thr Tyr Ser Ser Asp Gly Asn Phe Arg Leu Thr Gly His

290 295 300

Ile His Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Gly Ser Ser Pro Ser Trp Gly Gln

305 310 315 320

Ser Asp Leu Arg Tyr Pro Val Leu Glu Pro Leu Leu Pro His Leu Gly

325 330 335

Asn Ile Leu Pro Val Ser Leu Ala Cys Asp Leu Ile Asp Leu Tyr Phe

340 345 350

Ser Ser Ser Ser Ser Ala Gln Met His Pro Met Ser Pro Tyr Val Leu

355 360 365

Gly Phe Val Phe Arg Lys Arg Ser Phe Leu His Pro Thr Asn Pro Arg

370 375 380

Arg Cys Gln Pro Ala Leu Leu Ala Ser Met Leu Trp Val Ala Ala Gln

385 390 395 400

Thr Ser Glu Ala Ser Phe Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ala Arg Ser Lys

405 410 415

Val Cys Gln Lys Leu Leu Glu Leu Thr Val Gly Leu Leu Gln Pro Leu

420 425 430

Ile His Thr Gly Thr Asn Ser Pro Ser Pro Lys Thr Ser Pro Val Val

435 440 445

Gly Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Gly Val Ala Met Pro Gly Ser Leu

450 455 460

Asn Met Asp Ser Leu Ala Gly Glu Thr Gly Ala Phe Gly Ala Ile Gly

465 470 475 480

Ser Leu Asp Asp Val Ile Thr Tyr Val His Leu Ala Thr Val Val Ser

485 490 495

Ala Ser Glu Tyr Lys Gly Ala Ser Leu Arg Trp Trp Gly Ala Ala Trp

500 505 510

Ser Leu Ala Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Glu Leu Pro Pro Gly Asn

515 520 525

Pro Pro Ala Asn Gln Glu Asp Gly Glu Gly Leu Ser Glu Asp Val Asp

530 535 540

Glu His Asp Leu Asn Arg Asn Asn Thr Arg Phe Val Thr Glu Glu Glu

545 550 555 560

Arg Glu Glu Arg Arg Arg Ala Trp Trp Leu Val Tyr Ile Val Asp Arg

565 570 575

His Leu Ala Leu Cys Tyr Asn Arg Pro Leu Phe Leu Leu Asp Ser Glu

580 585 590

Cys Ser Asp Leu Tyr His Pro Met Asp Asp Ile Lys Trp Gln Ala Gly

595 600 605

Lys Phe Arg Ser His Asp Ala Gly Asn Ser Ser Ile Asn Ile Asp Ser

610 615 620

Ser Met Thr Asp Glu Phe Gly Asp Ser Pro Arg Ala Ala Arg Gly Ala

625 630 635 640

His Tyr Glu Cys Arg Gly Arg Ser Ile Phe Gly Tyr Phe Leu Ser Leu

645 650 655

Met Thr Ile Leu Gly Glu Ile Val Asp Val His His Ala Lys Ser His

660 665 670

Pro Arg Phe Gly Val Gly Phe Arg Ser Ala Arg Asp Trp Asp Glu Gln

675 680 685

Val Ala Glu Ile Thr Arg His Leu Asp Met Tyr Glu Glu Ser Leu Lys

690 695 700

Arg Phe Val Ala Lys His Leu Pro Leu Ser Ser Lys Asp Lys Glu Gln

705 710 715 720

His Glu Met His Asp Ser Gly Ala Val Thr Asp Met Gln Ser Pro Leu

725 730 735

Ser Val Arg Thr Asn Ala Ser Ser Arg Met Thr Glu Ser Glu Ile Gln

740 745 750

Ala Ser Ile Val Val Ala Tyr Ser Thr His Val Met His Val Leu His

755 760 765

Ile Leu Leu Ala Asp Lys Trp Asp Pro Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asp

770 775 780

Asp Leu Trp Ile Ser Ser Glu Gly Phe Val Thr Ala Thr Ser His Ala

785 790 795 800

Val Ser Ala Ala Glu Ala Ile Ser Gln Ile Leu Glu Phe Asp Pro Gly

805 810 815

Leu Glu Phe Met Pro Phe Phe Tyr Gly Val Tyr Leu Leu Gln Gly Ser

820 825 830

Phe Leu Leu Leu Leu Ile Ala Asp Lys Leu Gln Ala Glu Ala Ser Pro

835 840 845

Ser Val Ile Lys Ala Cys Glu Thr Ile Val Arg Ala His Glu Ala Cys

850 855 860

Val Val Thr Leu Ser Thr Glu Tyr Gln Arg Asn Phe Ser Lys Val Met

865 870 875 880

Arg Ser Ala Leu Ala Leu Ile Arg Gly Arg Val Pro Glu Asp Leu Ala

885 890 895

Glu Gln Gln Gln Arg Arg Arg Glu Leu Leu Ala Leu Tyr Arg Trp Thr

900 905 910

Gly Asn Gly Thr Gly Leu Ala Leu

915 920

<210> 2

<211> 2950

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<400> 2

atgttgtcca atcctctccg tcgctattct gcctaccccg acatctcctc ggcgtcattt 60

gacccgaact accatggctc acagtcgcat ctccactcga tcaacgtcaa cacattcggc 120

aacagccacc cctatcccat gcagcacctc gcacagcatg cggagctttc gagttcacgc 180

atgataaggg ccagtccggt gcagccaaag cagcgccagg gctctcttat tgctgccagg 240

aagaattcaa cgggtactgc tgggcccatt cggcggagga tcagtcgcgc ttgtgaccag 300

tgcaaccagc ttcgtaccaa gtgcgatggc ttacacccat gtgcccattg tataggtatg 360

tcccttttcc tctacacagt gatgctgcgc tcaagcacat gtactgatcg atcttgttta 420

gaattcggcc ttggatgcga atatgtccga gagagaaaga agcgtggcaa agcttcgcgc 480

aaggatattg ctgcccagca agccgcggcg gctgcagcac aacactccgg ccaggtccag 540

gatggtccag aggatcaaca tcgcaaactc tcacgccagc aaagcgaatc ttcgcgtggc 600

agcgctgagc ttgcccagcc tgcccacgac ccgcctcatg gccacattga gggctctgtc 660

agctccttca gcgacaatgg cctttcccag catgctgcca tgggcggcat ggatggcctg 720

gaagatcacc atggccacgt cggagttgat cctgccctgg gccgaactca gctggaagcg 780

tcatcagcaa tgggcctggg cgcatacggt gaagtccacc ccggctatga gagccccggc 840

atgaatggcc atgtgatggt gcccccgtcg tatggcgcgc agaccaccat ggccgggtat 900

tccggtatct cgtatgctgc gcaagccccg agtccggcta cgtatagcag cgacggtaac 960

tttcgactca ccggtcacat ccatgattac ccgctggcaa atgggagctc gccctcatgg 1020

ggagtctcgc tggcctcgcc ttcgaaccag ttccagcttc agctctcgca gcccatcttc 1080

aagcaaagcg atttgcgata tcctgtgctt gagcctctgc tgcctcacct gggaaacatc 1140

ctccccgtgt ctttggcgtg cgatctgatt gacctgtact tctcctcgtc ttcatcagca 1200

cagatgcacc caatgtcccc atacgttctg ggcttcgtct tccggaagcg ctccttcttg 1260

caccccacga acccacgaag gtgccagccc gcgctgcttg cgagcatgct gtgggtggcg 1320

gcacagacta gcgaagcgtc cttcttgacg agcctgccgt cggcgaggag caaggtctgc 1380

cagaagctgc tcgagctgac cgttgggctt cttcagcccc tgatccacac cggcaccaac 1440

agcccgtctc ccaagactag ccccgtcgtc ggtgctgctg ccctgggagt tcttggggtg 1500

gccatgccgg gctcgctgaa catggattca ctggccggcg aaacgggtgc ttttggggcc 1560

atagggagcc ttgacgacgt catcacctat gtgcacctcg ccacggtcgt ctcggccagc 1620

gagtacaagg gcgccagcct gcggtggtgg ggtgcggcat ggtctctcgc cagagagctc 1680

aagcttggcc gtgagctgcc gcctggcaat ccacctgcca accaggagga cggcgagggc 1740

cttagcgaag acgtggatga gcacgacttg aacagaaaca acactcgctt cgtgacggaa 1800

gaggagcgcg aagagcgacg gcgagcatgg tggctcgttt acatcgtcga caggcacctg 1860

gcgctctgct acaaccgccc cttgtttctt ctggacagcg agtgcagcga cttgtaccac 1920

ccgatggacg acatcaagtg gcaggcaggc aaatttcgca gccacgatgc agggaactcc 1980

agcatcaaca tcgatagctc catgacggac gagtttggcg atagtccccg ggcggctcgc 2040

ggcgcacact acgagtgccg cggtcgtagc atttttggct acttcttgtc cttgatgaca 2100

atcctgggcg agattgtcga tgtccaccat gctaaaagcc acccccggtt cggcgttgga 2160

ttccgctccg cgcgggattg ggacgagcag gttgctgaaa tcacccgaca cctggacatg 2220

tatgaggaga gcctcaagag gttcgtggcc aagcatctgc cattgtcctc aaaggacaag 2280

gagcagcatg agatgcacga cagtggagcg gtaacagaca tgcaatctcc actctcggtg 2340

cggaccaacg cgtccagccg catgacggag agcgagatcc aggccagcat cgtggtggct 2400

tacagcaccc atgtgatgca tgtcctccac atcctccttg cggataagtg ggatcccatc 2460

aaccttctag acgacgacga cttgtggatc tcgtcggaag gattcgtgac ggcgacgagc 2520

cacgcggtat cggctgccga agctattagc cagattctcg agtttgaccc tggcctggag 2580

tttatgccat tcttctacgg cgtctatctc ctgcagggtt ccttcctcct cctgctcatc 2640

gccgacaagc tgcaggccga agcgtctcca agcgtcatca aggcttgcga gaccattgtt 2700

agggcacacg aagcttgcgt tgtgacgctg agcacagagt atcaggtaag ccctatcagt 2760

tcaaacgtct atcttgctgt gaatcaaaga ctgacttgga catcagcgca actttagcaa 2820

ggttatgcga agcgcgctgg ctctgattcg gggccgtgtg ccggaagatt tagctgagca 2880

gcagcagcga cgacgcgagc ttcttgcact ataccgatgg actggtaacg gaaccggtct 2940

ggccctctaa 2950

<210> 3

<211> 679

<212> DNA

<213> 构巢曲霉

<400> 3

cggagaatat ggagcttcat cgaatcaccg gcagtaagcg aaggagaatg tgaagccagg 60

ggtgtatagc cgtcggcgaa atagcatgcc attaacctag gtacagaagt ccaattgctt 120

ccgatctggt aaaagattca cgagatagta ccttctccga agtaggtaga gcgagtaccc 180

ggcgcgtaag ctccctaatt ggcccatccg gcatctgtag ggcgtccaaa tatcgtgcct 240

ctcctgcttt gcccggtgta tgaaaccgga aaggccgctc aggagctggc cagcggcgca 300

gaccgggaac acaagctggc agtcgaccca tccggtgctc tgcactcgac ctgctgaggt 360

ccctcagtcc ctggtaggca gctttgcccc gtctgtccgc ccggtgtgtc ggcggggttg 420

acaaggtcgt tgcgtcagtc caacatttgt tgccatattt tcctgctctc cccaccagct 480

gctcttttct tttctctttc ttttcccatc ttcagtatat tcatcttccc atccaagaac 540

ctttatttcc cctaagtaag tactttgcta catccatact ccatccttcc catcccttat 600

tcctttgaac ctttcagttc gagctttccc acttcatcgc agcttgacta acagctaccc 660

cgcttgagca gacatcacc 679

<210> 4

<211> 1373

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<400> 4

catgaaaggc tatgagaaat tctggagacg gcttgttgaa tcatggcgtt ccattcttcg 60

acaagcaaag cgttccgtcg cagtagcagg cactcattcc cgaaaaaact cggagattcc 120

taagtagcga tggaaccgga ataatataat aggcaataca ttgagttgcc tcgacggttg 180

caatgcaggg gtactgagct tggacataac tgttccgtac cccacctctt ctcaaccttt 240

ggcgtttccc tgattcagcg tacccgtaca agtcgtaatc actattaacc cagactgacc 300

ggacgtgttt tgcccttcat ttggagaaat aatgtcattg cgatgtgtaa tttgcctgct 360

tgaccgactg gggctgttcg aagcccgaat gtaggattgt tatccgaact ctgctcgtag 420

aggcatgttg tgaatctgtg tcgggcagga cacgcctcga aggttcacgg caagggaaac 480

caccgatagc agtgtctagt agcaacctgt aaagccgcaa tgcagcatca ctggaaaata 540

caaaccaatg gctaaaagta cataagttaa tgcctaaaga agtcatatac cagcggctaa 600

taattgtaca atcaagtggc taaacgtacc gtaatttgcc aacggcttgt ggggttgcag 660

aagcaacggc aaagccccac ttccccacgt ttgtttcttc actcagtcca atctcagctg 720

gtgatccccc aattgggtcg cttgtttgtt ccggtgaagt gaaagaagac agaggtaaga 780

atgtctgact cggagcgttt tgcatacaac caagggcagt gatggaagac agtgaaatgt 840

tgacattcaa ggagtattta gccagggatg cttgagtgta tcgtgtaagg aggtttgtct 900

gccgatacga cgaatactgt atagtcactt ctgatgaagt ggtccatatt gaaatgtaag 960

tcggcactga acaggcaaaa gattgagttg aaactgccta agatctcggg ccctcgggcc 1020

ttcggccttt gggtgtacat gtttgtgctc cgggcaaatg caaagtgtgg taggatcgaa 1080

cacactgctg cctttaccaa gcagctgagg gtatgtgata ggcaaatgtt caggggccac 1140

tgcatggttt cgaatagaaa gagaagctta gccaagaaca atagccgata aagatagcct 1200

cattaaacgg aatgagctag taggcaaagt cagcgaatgt gtatatataa aggttcgagg 1260

tccgtgcctc cctcatgctc tccccatcta ctcatcaact cagatcctcc aggagacttg 1320

tacaccatct tttgaggcac agaaacccaa tagtcaaccg cggactgcgc atc 1373

<210> 5

<211> 231

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 5

Met Val Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Gly Val Ala Ala Ile Ser Gly

1 5 10 15

Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Val Glu Ser Val Ala Val Glu Lys

20 25 30

Arg Gly Ser His His His His His His Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr

35 40 45

Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly

50 55 60

Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp

65 70 75 80

Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr

85 90 95

Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn

100 105 110

Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr

115 120 125

Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr

130 135 140

Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg

145 150 155 160

Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr

165 170 175

Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn

180 185 190

Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly

195 200 205

Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly

210 215 220

Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser

225 230

<210> 6

<211> 696

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<400> 6

atggtctcct tcacctccct cctcgccggc gtcgccgcca tctcgggcgt cttggccgct 60

cccgccgccg aggtcgaatc cgtggctgtg gagaagcgcg gatcccatca tcaccatcac 120

caccagacga ttcagcccgg cacgggctac aacaacggct acttctactc gtactggaac 180

gatggccacg gcggcgtgac gtacaccaat ggtcccggcg ggcagttctc cgtcaactgg 240

tccaactcgg gcaactttgt cggcggcaag ggatggcagc ccgggaccaa gaacaaggtc 300

atcaacttct cgggaagcta caaccccaac ggcaacagct acctctccgt gtacggctgg 360

tcccgcaacc ccctgatcga gtactacatc gtcgagaact ttggcaccta caacccgtcc 420

acgggcgcca ccaagctggg cgaggtcacc tccgacggca gcgtctacga catttaccgc 480

acgcagcgcg tcaaccagcc gtccatcatc ggcaccgcca ccttttacca gtactggtcc 540

gtccgccgca accaccgctc gagcggctcc gtcaacacgg cgaaccactt caacgcgtgg 600

gctcagcaag gcctgacgct cgggacgatg gattaccaga ttgttgccgt ggagggttac 660

tttagctctg gctctgcttc catcaccgtc agctaa 696

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcttgagca gacatcacca tgttgtccaa tcctctccgt cg 42

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccggtcggc atctacttta gagggccaga ccggttcc 38

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agtagatgcc gaccggatct gt 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtgatgtct gctcaagcgg g 21

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cggagaatat ggagcttcat cgaat 25

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggccgctagt ctcaccgtta gatctggatt ttagtactgg attttggttt tag 53

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taacggtgag actagcggcc g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtttccaggt gctcctgggc c 21

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

attcggggga attcgcgtgc ttgcactgct gatttccgac 40

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgaagctcc atattctccg caagcccgag atagacgaag gc 42

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccaggagca cctggaaaca gatgctgcaa acgcttatcc ac 42

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggattcaatc ttaatacgta cctgcacaga ggtacgcagc aaagag 46

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gactgcgcat catggtctcc ttcacctccc tcc 33

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agctgagctc ttagctgacg gtgatggaag c 31

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttggtaccca tgaaaggcta tgagaaattc tggagacg 38

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aaggagacca tgatgcgcag tccgcggtt 29

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agctaagagc tcagctccgt ggcgaaag 28

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

attcaatctt aatacgtaaa ctcgtgctct ctcgcg 36

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

taattcgggg gaattcgcgt acatccatca tcacgcacga c 41

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaatccagat cgagctctac gaacaaacaa gcgacccaat tgg 43

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgtagagctc gatctggatt ttagtactgg attttggttt tag 43

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agcctttcat gggtaccaat tcgtaatcat ggtcatagct gtt 43

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atgaaaaagc ctgaactcac cgc 23

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aagctccata ttctccgcca ccatgttggc aagctgc 37

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cggagaatat ggagcttcat cgaat 25

<210> 32

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gagttcaggc tttttcatgg tgatgtctgc tcaagcg 37

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

caggtacgta ttaagattga atcctgttgc cg 32

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

acgcgaattc ccccgaatta attcggcgtt aattcagt 38

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

attcggggga attcgcgtta acggtgagac tagcggccg 39

<210> 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ggtgtggtgc catggttaag aggttcttcc ggcttcg 37

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

taaccatggc accacacccg acgctcaa 28

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ctatcgcagc agcctctcgg t 21

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

agaggctgct gcgatagggc tttcgtgacc gggcttcaaa 40

<210> 40

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gattaggtga tgctgcgcgt taacatgacc agactgatcg ccat 44

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gcgcagcatc acctaatctt ggc 23

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggattcaatc ttaatacgta cctggtttcc aggtgctcct gggcc 45

Claims

1.一株重组里氏木霉，其特征在于，以里氏木霉RUT-C30Δura3为宿主，以PgpdA启动子表达了转录激活因子XYR1，并以改造后的人工Pcbh1启动子表达了木聚糖酶XYNII；

编码所述转录激活因子XYR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

所述PgpdA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

所述改造后的人工Pcbh1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

编码所述木聚糖酶XYNII的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述里氏木霉RUT-C30Δura3是以里氏木霉RUT-C30为亲本敲除ura3基因构建成尿嘧啶营养缺陷型。

2.权利要求1所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，将XYR1基因与XYNII的基因分别连接到骨架质粒上，将重组质粒转化农杆菌AGL1，并将里氏木霉RUT-C30Δura3与含有相应质粒的农杆菌共培养转化，得到重组里氏木霉。

3.根据权利要求2所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，

（3）将cbh1的同源臂上游、潮霉素筛选标记HYG表达框、7IRPcbh1启动子、XYNII的序列、cbh1终止子序列通过InFusion连接到经过改造的pCAMBIA1301G，构建成载体p7IRCbhxyn2Δcbh1；所述经过改造的pCAMBIA1301G，是以pCAMBIA1301G为模板，用引物扩增载体，并从里氏木霉基因组上分别扩增启动子Ppki、ura3的CDS区域、终止子Tcbh2以及反筛重叠区域，然后将以上5个片段通过Infusion连接，得到经过改造的pCAMBIA1301G；

4.利用权利要求1所述的重组里氏木霉生产木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养重组里氏木霉，使之生孢；收集孢子，接到SDB培养基培养，然后转接到纤维素诱导发酵培养基、乳糖发酵培养基或葡萄糖发酵培养基，于28 ˚C 200 rpm培养4-5天，培养过程中重组里氏木霉表达木聚糖酶活力与木糖苷酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纤维素诱导发酵培养基的配方是：20g/L 麸皮；30 g/L微晶纤维素；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl₂；0.6 g/LMgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乳糖发酵培养基的配方是：50 g/L 乳糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl₂；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5；

所述葡萄糖发酵培养基的配方是：50 g/L葡萄糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl₂；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/LCoCl₂，pH 5.5。