CN101182352B - 一种转录激活因子及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转录激活因子及其编码基因与应用。该转录激活因子可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平，是由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。本发明的转录激活因子及其编码基因可提高纤维素酶和木聚糖酶基因的表达水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种转录激活因子及其编码基因与应用，特别涉及一种可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子及其编码基因与应用。
背景技术
利用木霉生产的纤维素酶，已经在洗涤、制衣、饲料、造纸、食品和纤维素乙醇等各方面得到了广泛的应用。木霉纤维素酶高产菌株常常通过物理、化学诱变的方法得到。木霉也能表达一定水平的木聚糖酶，并分泌到细胞外。
木霉中，纤维素酶和木聚糖酶的表达主要在基因转录水平上受到调控。纤维素酶基因是包括至少12个基因的一系列基因，其中，含最强启动子的基因是cbh1，它负责CBH I(纤维二糖水解酶I)合成，该酶产量可占胞外分泌蛋白的50％。通过对cbh1基因启动子的研究，已经发现有至少4个和纤维素酶合成相关的转录因子负责调控纤维素酶的转录，包括葡萄糖抑制因子Cre I以及ACE I、ACE II和Xyr1等，它们不仅负责cbh1基因的调控，也负责纤维素酶基因的其它成员和木聚糖酶基因等的表达调控。
Cre I、ACE I和ACE II均是锌指蛋白，前两者为C2H2型锌指蛋白，Cre I含2个锌指，ACE I含3个锌指，负责和纤维素酶和木聚糖酶基因启动子DNA上特定序列的结合；而ACE II为Zn2(Cys)6型锌指蛋白，其锌双核区负责和启动子上特定序列的结合。由于纤维素酶和木聚糖酶受到这三个蛋白的协同调控，因此，在酶基因的启动子区含有能和这三个蛋白结合的特定基序，以1.5kb的cbh1基因启动子为例，分别含有4、7和1个相应的基序。
以前对木霉的遗传学改造一般只涉及化学和物理方法诱变以及后续的筛选工作；自从Penttila等(1987)建立了一套行之有效的原生质体转化方法，对其进行分子操作也就成为了可能。一般对木霉的分子生物学的操作集中在应用cbh1基因的强大启动子进行外源或内源基因的过表达，通过增加某个基因的拷贝数增加其表达量，或对某个基因进行体内敲除构建含不同表达谱的木霉新菌株。目前，国内外都尚无利用嵌合体转录因子增强木霉纤维素酶和/或木聚糖酶表达的报道。本发明通过对木霉纤维素酶和木聚糖酶基因启动子序列的分析，设计了含有两个DNA结合结构域和一个激活结构域的转录激活因子，即将转录抑制因子Cre I和ACE I的DNA结合结构域和转录激活因子ACEII的转录激活结构域连接，形成一个能同时识别启动子上Cre I和ACE I的结合位点，且又能发挥激活作用的激活蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子及其编码基因与应用。
本发明所提供的可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子，是由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由588个氨基酸残基组成。
为了使序列表中序列1的转录激活因子便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 11 | EQKLISEEDL |
上述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸。
其中，序列表中序列2是由1773个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列2的5′端第1位至第1764位核苷酸为编码序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因的重组表达载体、工程菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种提高生物细胞纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平的方法。
所述提高生物细胞纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平的方法，是将纤维素酶和/或木聚糖酶的编码基因与上述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因在同一生物细胞中共同表达。
所述方法中，所述生物细胞为含有纤维素酶和/或木聚糖酶的编码基因可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的生物细胞。
所述方法为将上述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因通过表达载体导入所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的生物细胞中，筛选得到纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平提高的工程菌株。
所述将上述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因通过表达载体导入所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的生物细胞中时，还可同时导入便于筛选的抗性基因。
所述方法中，所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的生物细胞为木霉属真菌优选为瑞氏木霉；所述纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平提高是表达产生的纤维素酶和/或木聚糖酶酶活性和表达量的提高。
本发明的转录激活因子及其编码基因可提高纤维素酶和木聚糖酶基因的表达水平。将本发明的转录激活因子的编码基因转入木霉中，在木霉中进行表达以提高纤维素酶和木聚糖酶的表达水平。实验证明，通过构建含有编码该转录激活因子的基因的表达盒的质粒载体，将其转化到瑞氏木霉中后，转化子发酵液中纤维素酶和木聚糖酶酶活大大提高。
附图说明
图1为含有可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因的表达载体的构建流程
具体实施方式
实施例1、可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子及其编码基因的获得及其功能验证。
一、可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子及其编码基因的获得
本发明的可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因含有两个DNA结合结构域和一个激活结构域；其中，两个DNA结合结构域分别为编码CreI启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域基因(具有自GENBANK号为U27356的5′端第23至439位核苷酸)和编码ACE I蛋白DNA结合结构域基因具有自GENBANK号为AF190793的5′端第3218至3656位核苷酸)，激活域为编码ACEII蛋白激活结构域基因具有自GENBANK号为AF220671的5′端第834至1682位核苷酸)；具体获得方法如下所述：
1、编码Cre I启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域基因的获得
将含有1×107个木霉QM9414菌株(ATCC 26921)孢子的悬液接种到100mL含2％葡萄糖的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O1.4mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养2天，收集菌丝，用氯化苄法提取木霉QM9414菌株基因组DNA。以该木霉QM9414菌株基因组DNA作模板，以Pcre1f1(5′GCGGCTCTAGACTCGGTGAGAAGCGTGGAGG 3′(下划线处为XbaI酶切位点))和Pcre1r1(5′ATTAGGATCCGCCATCGACGTGCATGGGGTG 3′(下划线处为BamHI位点))为引物，进行PCR扩增编码Cre I启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域的基因，扩增程序为：95℃×5min；然后94℃×40s变性，55℃×40s复性，72℃×2min延伸，共作35个循环；最后72℃×10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，得到1802bp的条带，经测序表明该片段含有序列表中序列2自5′端第1至417位核苷酸；PCR获得的片段回收后，用XbaI和BamHI双酶切，用乙醇和3M乙酸钠沉淀酶切产物，-20℃保存备用。
2、编码ACE I蛋白DNA结合结构域基因的获得
将含有1×107个木霉QM9414菌株(ATCC 26921)孢子的悬液接种到100mL含2％葡萄糖的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O1.4mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养2天，收集菌丝，用氯化苄法提取木霉QM9414菌株基因组DNA。以该木霉QM9414菌株基因组DNA作模板，以Pace1f(5′TATTAAGCTTGGCAGCGGTGGCTCCGGCACCAGCCGG TCCATGGCCCGCCGG3′(带下划线处为HindIII位点))和Pace1r(5′GAGGGAATTCCTAGCTGTAGCTGGGCGTGGAGG 3′(带下划线处为EcoRI位点))为引物，进行PCR扩增编码ACE I蛋白DNA结合结构域的基因，反应程序为：95℃×5min，然后94℃×40s变性，60℃×40s复性，72℃×1min延伸，共作35个循环；最后72℃×10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，得到488bp的条带，经测序表明该片段具有序列表中序列2自5′端第1294至1773位核苷酸；PCR获得的片段回收后，用HindIII和EcoR I双酶切，用乙醇和3M乙酸钠沉淀酶切产物，-20℃保存备用。
3、编码ACE II蛋白激活结构域基因的获得
将含有1×107个木霉QM9414菌株(ATCC 26921)孢子的悬液接种到100mL含2％葡萄糖的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O1.4mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养2天，收集菌丝，用氯化苄法提取木霉QM9414菌株基因组DNA。以该木霉QM9414菌株基因组DNA作模板，以Pace2f(5′CGTGGATCCGGCGGTAGCGGCACCAGCCATAGTCACAGT CACAA 3′ (带下划线处为BamHI位点))和Pace2r(5′CACGAATTCTTACTAAAGCTTCAGCAGTCTGGCACTGAC 3′(带下划线处依次为EcoR I和HindIII位点))为引物，进行PCR扩增编码ACE II蛋白激活结构域的基因，反应程序为：95℃×5min，然后94℃×40s变性，60℃×40s复性，72℃×1min延伸，共作35个循环；最后72℃×10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，得到894bp的条带，经测序表明该片段具有序列表中序列2自5′端第418至1299位核苷酸；PCR获得的片段回收后，用BamH I和EcoR I双酶切，用乙醇和3M乙酸钠沉淀酶切产物，-20℃保存备用。
4、编码Cre I终止子基因的获得
将含有1×107个木霉QM9414菌株(ATCC 26921)孢子的悬液接种到100mL含2％葡萄糖的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O1.4mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养2天，收集菌丝，用氯化苄法提取木霉QM9414菌株基因组DNA。以该木霉QM9414菌株基因组DNA作模板，以Pcre1f2(5′GAGAATTCCTAGAATGTCCGGTACTCATGG 3′(带下划线处为EcoRI位点))和Pcre1r2(5′GCGTCGACCACTAAAGCATCTAA AGTAGG 3′(带下划线处为Sal I位点))为引物，进行PCR扩增编码Cre I终止子的基因，反应程序为：95℃×5min，然后94℃×40s变性，58℃×40s复性，72℃×2min延伸，共作35个循环；最后72℃×10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，得到1496bp的条带；PCR获得的片段回收后，用EcoR I和Sal I双酶切，用乙醇和3M乙酸钠沉淀酶切产物，-20℃保存备用。
5、可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因的获得及含有该基因的表达载体的构建(载体构建流程示意图如图1所示)
用EcoR I和Sal I双酶切pBluescript KS-质粒，产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带(3kb的条带)，将回收片段与步骤4获得的用EcoR I和Sal I双酶切的编码Cre I终止子的基因连接，转化大肠杆菌DH5，筛选氨苄抗性转化子。将筛选得到的阳性转化子提取质粒用EcoR I和Sal I双酶切检测，将酶切检测表明正确的质粒进行测序验证，将酶切和测序验证表明含有编码Cre I终止子的基因的重组载体命名为pKST(结构简图如图1所示)；
将pKST用Xba I和BamH I双酶切，产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带(4.5kb的条带)，将回收片段与步骤1获得的用XbaI和BamH I双酶切的编码Cre I启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域基因连接，转化大肠杆菌DH5，筛选氨苄抗性转化子。将筛选得到的阳性转化子提取质粒用Xba I和BamH I双酶切检测，将酶切检测表明正确的质粒进行测序验证，将酶切和测序验证表明含有编码Cre I终止子的基因和编码Cre I启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域基因的重组载体命名为pKSTC(结构简图如图1所示)；
将pKSTC用BamH I和EcoR I双酶切，产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带(6.3kb的条带)，将回收片段与步骤3获得的用BamH I和EcoR I双酶切的编码ACE II蛋白激活结构域的基因连接，转化大肠杆菌DH5，筛选氨苄抗性转化子。将筛选得到的阳性转化子提取质粒用BamH I和EcoR I双酶切检测，将酶切检测表明正确的质粒进行测序验证，将酶切和测序验证表明含有编码Cre I终止子的基因和编码Cre I启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域基因以及编码ACE II蛋白激活结构域的基因的重组载体命名为pKSTCC(结构简图如图1所示)；
将pKSTCC用HindIII和EcoR I双酶切，回收目的条带(7.2kb的条带)与步骤2获得的用HindIII和EcoR I双酶切的编码ACE I蛋白DNA结合结构域的基因连接，转化大肠杆菌DH5，筛选氨苄抗性转化子，将筛选得到的阳性转化子提取质粒用HindIII和EcoR I双酶切检测，将酶切检测表明正确的质粒进行测序验证，将酶切和测序验证表明，编码含有本发明的嵌合体转录激活因子的编码基因的表达载体命名为pChi(7.7kb，结构简图如图1所示)。本发明的嵌合体转录激活因子的编码基因，包括依次串联的步骤1获得的编码Cre I启动子及Cre I蛋白DNA结合结构域基因、步骤2获得的编码ACE I蛋白DNA结合结构域基因和步骤3获得的编码ACE II蛋白激活结构域基因，具有序列表中序列2的核苷酸序列，自序列表中序列2的5′端第1至1767位核苷酸为编码序列，自序列表中序列2的5′端第1位至第1764位核苷酸为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白，即本发明的可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子。本发明的可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因可从上述获得重组载体pChi中酶切或亚克隆得到，或者直接人工合成得到。
二、利用本发明的可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子提高宿主菌的纤维素酶和木聚糖酶表达水平
1、pChi对瑞氏木霉RUT C-30的转化
将pChi用Xba I线性化，将pAN7-1质粒(GENBANK号为Z32698)用HindIII酶切线性化。分别取3μg的线性化pChi和5μg的线性化的pAN7-1质粒混合，无水乙醇和乙酸钠共沉淀，将DNA沉淀溶于10uL灭菌水中。
将含有1×107个瑞氏木霉RUT C-30菌株(ATCC 56765)孢子的悬液接种到100mL含2％葡萄糖的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养18h。然后用4层纱布过滤收集菌丝，灭菌水洗涤菌丝。用含1.2M MgSO4和10mM磷酸钠，pH5.8溶液按照5mg/mL Lysing enzymes(Sigma L1412)溶液的量与菌丝混合消化，于28℃、70rpm孵育1.5h。孵育结束后，8000rpm离心收集原生质体，然后用1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液重悬洗涤原生质体2次，将原生质体重悬于200μL含有1M山梨醇，10mM Tris-HCl，和50mM CaCl2，pH7.5的缓冲液中。取100μL原生质体重悬液，和10μL线性化pChi和pAN7-1共沉淀质粒混合，加入1mL含有10mM Tris-HCl，50mM CaCl2，和质量百分含量为60％PEG4000，pH7.5的溶液中，于冰上孵育20分钟，加入2mL含有1M山梨醇，10mM Tris-HCl，和50mMCaCl2，pH7.5的溶液，混合均匀，涂布于含150μg/mL的潮霉素平板上，28℃培养5-7天。
2、阳性转化子的筛选
挑取潮霉素平板上的木霉转化子，接种于5mL含2％葡萄糖的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4·H2O1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养3天。提取基因组DNA，以Pchif(5’TATAACTAGTATGCCTCGTCCCTACAAGTG3’)和Pchir(5’TCAGACTAGTCTAGCTGTAGCTGGGCGT GGAGG3’)引物扩增编码本发明转录激活因子的基因，所用条件如下：95℃×5min，然后94℃×40s变性，50℃×40s复性，72℃×2min延伸，共作35个循环；最后72℃×10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，检测是否有目的条带。出现目的条带者为阳性转化子。结果表明，获得一个检测阳性的转入pChi的瑞氏木霉RUT C-30菌株。
3、转入pChi的瑞氏木霉RUT C-30的纤维素酶和木聚糖酶表达水平的检测
1)转入pChi的瑞氏木霉RUT C-30的表达
将步骤2获得的转入pChi的瑞氏木霉RUT C-30阳性转化子重新划线于土豆培养基(土豆汁1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g)平板，挑取单菌落，接种于100mL含2％甘油的基础培养基中，250rpm、28℃培养3天。4层纱布过滤收集菌丝，灭菌水洗涤菌丝。将菌丝按质量百分含量为1％的量接种于100mL含质量百分含量为2％Avicel纤维素的基础培养基(含有(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 15.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.6g/L，CoCl2·6H2O 3.7mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，ZnSO4·7H2O1.4mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L的培养基)中，250rpm、28℃培养5天，以相同条件培养的野生型瑞氏木霉RUT C-30为对照。
2)转化子培养物发酵液蛋白浓度、纤维素酶和木聚糖酶酶活的测定
将Avicel基础培养基中的转化子培养物取出，离心，收集上清，即为发酵液。Folin-酚法测定蛋白质浓度，另外采用DNS法分别测定纤维素酶和木聚糖酶酶活。转化子的发酵液中的总蛋白浓度、纤维素酶滤纸酶酶活和木聚糖酶酶活分别为1.01mg/mL、0.91IU/mL和11.41IU/mL，相比瑞氏木霉RUT C-30的(0.87mg/mL、0.47IU/mL和5.12IU/mL)，分别提高了16.1％、93.6％和122.9％。此株转化子的纤维素酶的主要组成部分-cbh1酶活(1.27nkat/mL)、CMCase酶活(6.54IU)和葡萄糖苷酶酶活(1.10nkat/mL)，相较出发菌株RUT C-30的cbh1(1.13nkat/mL)、CMCase酶活(3.80IU)和葡萄糖苷酶酶活(0.99nkat/mL)比较，分别提高了15.5％、72.2％和11.1％。
序列表
<160>2
<210>1
<211>588
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Gln Arg Ala Gln Ser Ala Val Asp Phe Ser Asn Leu Leu Asn Pro
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ala Gly Gln Asp Ser Gly Ala Met Ser Thr Ala Ala Val
20 25 30
Thr Val Ile Lys Pro Asn Gly Pro Ile Pro Gly Thr Gln Ser Thr Glu
35 40 45
Thr Ala Asn Glu Leu Pro Arg Pro Tyr Lys Cys Pro Leu Cys Asp Lys
50 55 60
Ala Phe His Arg Leu Glu His Gln Thr Arg His Ile Arg Thr His Thr
65 70 75 80
Gly Glu Lys Pro His Ala Cys Gln Phe Pro Gly Cys Ser Lys Lys Phe
85 90 95
Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ser Arg Ile His Ser Asn Pro
100 105 110
Asn Ser Arg Arg Gly Asn Lys Gly Gln Gln Gln His Gln Leu His His
115 120 125
Gln Gly Met Pro His Pro Met His Val Asp Gly Gly Ser Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Thr Ser His Ser His Ser His Asn His Asn Gly Val Gly
145 150 155 160
Val Ser Phe Asp Trp Leu Asp Leu Met Ser Leu Glu Gln Gln Gln Glu
165 170 175
Gln Gln Gln Gly Gln Pro Gln His Pro Pro Pro Pro Val Gln Thr Leu
180 185 190
Ser Glu Arg Leu Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Arg Met Leu Gln
195 200 205
Ala Val Pro Ser Ser Leu Asp Met His His Val Ser Arg Gln Gln Leu
210 215 220
Arg Glu Tyr Ala Asp Thr Val Gly Thr Gly Phe Asp Leu Gln Ser Thr
225 230 235 240
Leu Asp Ser Leu Leu His His Ala Gln Asp Leu Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Glu Ala Val Pro Ala Ser Phe Asn Lys Arg Thr Thr Ala Ala Glu Ala
260 265 270
Asp Ala Leu Cys Ala Val Pro Asp Cys Val His Gln Asp Arg Thr Ser
275 280 285
Leu His Thr Thr Pro Leu Pro Lys Leu Asp His Ala Leu Leu Asn Leu
290 295 300
Val Met Ala Cys His Ile Arg Leu Leu Asp Val Met Asp Thr Leu Ala
305 310 315 320
Glu His Gly Arg Met Cys Ala Phe Met Val Ala Thr Leu Pro Pro Asp
325 330 335
Tyr Asp Pro Lys Phe Ala Val Pro Glu Ile Arg Val Gly Thr Phe Val
340 345 350
Ala Pro Thr Asp Thr Ala Ala Ser Met Leu Leu Ser Val Val Val Glu
355 360 365
Leu Gln Thr Val Leu Val Ala Arg Val Lys Asp Leu Val Ala Met Val
370 375 380
Asp Gln Val Lys Asp Asp Ala Arg Ala Ala Arg Glu Ala Lys Val Val
385 390 395 400
Arg Leu Gln Cys Gly Ile Leu Leu Glu Arg Ala Glu Ser Thr Leu Gly
405 410 415
Glu Trp Ser Arg Phe Lys Asp Gly Leu Val Ser Ala Arg Leu Leu Lys
420 425 430
Leu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Ser Arg Ser Met Ala Arg Arg Lys
435 440 445
Lys Asn Ala Thr Pro Glu Asp Val Ala Pro Lys Lys Cys Arg Glu Pro
450 455 460
Gly Cys Thr Lys Glu Phe Lys Arg Pro Cys Asp Leu Thr Lys His Glu
465 470 475 480
Lys Thr His Ser Arg Pro Trp Lys Cys Pro Ile Pro Thr Cys Lys Tyr
485 490 495
His Glu Tyr Gly Trp Pro Thr Glu Lys Glu Met Asp Arg His Ile Asn
500 505 510
Asp Lys His Ser Asp Ala Pro Ala Met Tyr Glu Cys Leu Phe Lys Pro
515 520 525
Cys Pro Tyr Lys Ser Lys Arg Glu Ser Asn Cys Lys Gln His Met Glu
530 535 540
Lys Ala His Gly Trp Thr Tyr Val Arg Thr Lys Thr Asn Gly Lys Lys
545 550 555 560
Ala Pro Ser Gln Asn Gly Ser Thr Ala Gln Gln Thr Pro Pro Leu Ala
565 570 575
Asn Val Ser Thr Pro Ser Ser Thr Pro Ser Tyr Ser
580 585
<210>2
<211>1773
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atgcaacgag cacagtctgc cgtggatttt tccaacctcc tgaatccaac gtcggcagca 60
ggacaggaca gcggcgccat gtctaccgcc gcggtcaccg tcatcaagcc caatgggccc 120
attccaggaa cacagtcgac cgagactgcc aacgagctgc ctcgtcccta caagtgccct 180
ctttgcgaca aggctttcca ccgcctggag caccagacca ggcacattcg cacccacacg 240
ggcgagaagc cccatgcctg ccagttccct ggctgcagca agaagttctc ccgctccgat 300
gagctgacga ggcactcgag gatacacagc aaccccaact caaggcgcgg caacaagggc 360
cagcagcagc accagcttca ccaccagggc atgcctcacc ccatgcacgt cgatggcgga 420
tccggatccg gcggtagcgg caccagccat agtcacagtc acaatcataa cggggtaggc 480
gtcagctttg actggctcga tctcatgagc ttggagcagc agcaggagca gcaacaaggc 540
cagcctcaac atcctccacc accagtccaa accctctccg aacggctggc agctcttctg 600
tgtgccctgg accgcatgct ccaagccgta ccctcatccc tcgacatgca tcacgtctca 660
aggcagcagc tgagagagta cgccgacacc gtgggaaccg gcttcgacct gcagtccacc 720
ctcgacagcc tcctccacca cgcccaggat ctcgcctccc tctattccga ggccgtaccc 780
gcctcgttca acaagcgcac aaccgctgcc gaggccgacg ccctctgtgc cgttccggac 840
tgcgtacacc aggaccgcac ctcgttgcac acgacgccgt tgcccaagct ggaccacgcc 900
ctgttgaacc tcgtcatggc gtgccacatc cgtctgctcg atgtcatgga cactctcgca 960
gagcacgggc ggatgtgcgc cttcatggtg gccactctgc cgccggacta cgaccccaag 1020
tttgcggttc ctgagatacg ggtgggcact tttgtcgccc ctaccgatac ggctgcctca 1080
atgctgctct ctgttgtcgt ggagcttcaa acggtgctgg tggcgagggt caaggacttg 1140
gtggccatgg ttgaccaggt gaaggatgat gcaagagcgg cgagagaagc aaaggtcgtt 1200
cgtctgcagt gtgggatttt actggaacga gccgagtcga cgcttggaga gtggtccagg 1260
ttcaaggacg ggctggtcag tgccagactg ctgaagcttg gcagcggtgg ctccggcacc 1320
agccggtcca tggcccgccg gaagaagaac gccacccccg aggacgtggc gcccaagaag 1380
tgccgcgagc ccggctgcac caaggagttc aagcgccctt gcgacctcac caagcacgag 1440
aagactcact ctcgtccctg gaagtgcccc atccccactt gcaagtacca cgagtacggc 1500
tggcccaccg agaaggaaat ggaccgccac atcaacgaca agcactcgga cgccccggcc 1560
atgtacgaat gcctcttcaa gccctgcccg tacaagtcga agcgtgagtc gaactgcaag 1620
cagcacatgg aaaaggccca cggctggacc tatgtccgca ccaagaccaa cggcaagaag 1680
gcaccgagcc agaatggctc cactgcccag cagacccccc ctctcgccaa cgtgtctacg 1740
ccttcctcca cgcccagcta cagctaggaa ttc 1773
Claims (10)
1.一种可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子，是由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述可提高纤维素酶和木聚糖酶表达水平的转录激活因子的编码基因，是序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、工程菌或转基因细胞系。
5.一种提高宿主细胞纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平的方法，是将纤维素酶和/或木聚糖酶的编码基因与权利要求2或3所述的编码基因在同一宿主细胞中共同表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为含有纤维素酶和/或木聚糖酶的编码基因可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法为将权利要求2或3所述编码基因通过表达载体导入所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的宿主细胞中，筛选得到纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平提高的工程菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：将权利要求2或3所述编码基因通过表达载体导入所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的宿主细胞中时，还同时导入便于筛选的抗性基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的宿主细胞为木霉属真菌；所述纤维素酶和/或木聚糖酶表达水平提高是表达产生的纤维素酶和/或木聚糖酶酶活性和表达量的提高。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述可表达纤维素酶和/或木聚糖酶的宿主细胞为瑞氏木霉。
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