CN105331594A - 一种真菌来源的木聚糖酶、其编码基因及其高效异源表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种真菌来源的木聚糖酶、其编码基因及其高效异源表达。本发明还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及利用所述木聚糖酶水解糖苷键的方法。本发明的木聚糖酶的酶活性高，经重组表达后产量高等特点，可良好地应用于工业生产。

Description

一种真菌来源的木聚糖酶、其编码基因及其高效异源表达

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种真菌来源的木聚糖酶、其编码基因及其高效异源表达。

背景技术

木聚糖简介。木聚糖，由木糖分子(D-Xylose)以β-1,4-木糖苷键连结成主链；阿拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙酰基等连结成支链。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要成份，半纤维素是植物多糖中仅次于纤维素的重要成份，是自然界中除纤维素为含量最为丰富的可再生植物多糖。

木聚糖的来源。富含木聚糖的原料来源广泛，包括硬木、软木、秸秆、稻草、麸皮等农、林、工业废弃物及城市固体垃圾等。且不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的15～30％，软材中一般占干重的7～12％。而在一些一年生植物如小麦、甘煎、棉子壳中，木聚糖含量则高达30％以上。

木聚糖酶简介。木聚糖酶(xylanase)是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称。木聚糖酶可以应用在酿造、饲料、生物能源等工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。由于组成木聚糖单糖单元的差异、键的类型不同、以及木聚糖中存在许多不同取代基的支链，木聚糖的彻底降解需要多种酶参与，包括：内切-1，4-β-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase，EC3.2.1.8)，β-木糖苷酶(β-xylosidase，EC3.2.1.37)，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，E.C.3.2.1.39)、β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase，EC3.2.1.39)、乙酰木聚糖酯酶(acetylxylanesterases，E.C.3.1.1.72)以及降解阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯键酚酸酯酶(ferulicorp-coumaricacidesterase，E.C.3.2.1.73)等。其中，内切-1，4-β-木聚糖酶是降解木聚糖最主要的酶。该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为低聚木糖和少量木糖，从而起始多聚糖的逐步降解(BernierR，DriguezH，DesrochersMGene26:59–65，1983)

木聚糖酶在传统产业中的应用。木聚糖酶被广泛应用于包括食品、饲料、造纸、纺织等各种工业部门中，并在其中扮演重要的角色。第一，在食品工业中，木聚糖酶被用于水果、蔬菜和植物加工，以促进浸渍过程，使汁液澄清，提高产量和过滤效率；被用于葡萄酒制造和酿造以促进葡萄皮浸渍和降低成品的混浊度；被用于培烤、磨粉、糕点、糖果的加工中以提高面团的弹性和强度，改善面包质地；被用于咖啡加工中，以降低咖啡提取物的粘度并改善了干燥/冻干过程。第二，在造纸工业中，木聚糖酶被用于促进制浆处理和代替机械制浆，在纸浆蒸煮过程中，木聚糖部分溶解、变性并重新沉积在纤维表面上，木聚糖酶可以清除部分再沉积下来的木聚糖，增大纸浆基质孔隙，使被困的可溶性木质素释放出来，同时也使得化学漂白剂能更有效地渗透进入到纸浆中，它可提高纸浆的漂白率，并因此减少化学漂白剂的用量。第三，在纺织工业中，木聚糖酶被用于纺织品(亚麻，黄麻，兰麻，大麻等)的酶解中，以减少或替代化学混麻方法。第四，在农牧业中，木聚糖酶被广泛应用于单胃动物(如猪和家禽)以及反刍动物的饲料中。辅助动物有效降解木聚糖，降低饲料中非淀粉多糖的含量，以提高饲料的可消化性和营养价值同时减少环境污染。

木聚糖酶在生物能源领域的作用。尤为重要的是，在全球化石资源日益枯竭，开发新型生物能源迫在眉睫的背景下，木聚糖酶可与其他纤维素酶、半纤维素酶共同应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇的工业生产中。一方面，木聚糖酶通过降解木质纤维素中与木质素及纤维素骨架链紧密交联的半纤维素链，大大提高纤维素酶接触并作用于纤维素链的频率和效率，从而间接提高纤维素的降解效率；另一方面，随着近年来五碳糖发酵途径及菌株的研究、开发，利用细菌、酵母及丝状真菌发酵木聚糖水解产物木糖生产燃料乙醇的工艺日趋成熟。两方面共同作用使木质纤维素的转化效率大大提高，从而有效降低燃料乙醇的生产成本。

木聚糖酶的研究历史。由于木聚糖酶有着广泛的用途，对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，且己经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。研究得较为清楚的有Trichodermareesei(里氏木霉)、Aspergillusniger(黑曲霉)、Streptomyceslividans(变铅青链霉菌)、Cellulomonasfimi(粪肥杆菌)、Clostridiumthermocellum(热纤梭菌)、Penicilliumsimplicissimum(简青霉)等所产生的木聚糖酶。需要指出的是，这些木聚糖酶基因大部分都是从纯培养的微生物中分离出来的，而自然界中可培养微生物的种类尚不足1％，获得的木聚糖酶在理化特性、催化效率、产量等方面也远远不能满足现代工业生产的需求。

鉴于现有技术中大部分木聚糖酶的活力较低，在理化特性、催化效率、产量等方面也远远不能满足现代工业生产的需求，有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出新的、酶活性高的木聚糖酶，以用于工业生产，提高生产效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自土曲霉木聚糖酶(TrXYNA)和它的编码基因(xynA)在里氏木霉高效分泌表达和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO:2或第20-231位(去除信号肽)所示氨基酸序列多肽；

(b)由(a)所述的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；或

(c)在(a)或(b)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个优选例中，自SEQIDNO:2的氨基端的第1-19位为信号肽序列，第53-230位为糖基水解酶第11家族氨基末端保守功能域。为了便于蛋白在各种宿主中分泌表达，可在SEQIDNO:2的第1-19位信号肽序列可用其他信号肽序列替换。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞(原核或真核宿主细胞，例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的整合包括定向整合或随机整合。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是里氏木霉，其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，基因组中整合有至少1个拷贝的所述的多核苷酸；更佳地为1-20拷贝；如2、3、4、5、6、10、15拷贝。

在另一优选例中，所述的宿主细胞中包括一构建物，该构建物从5’至3’依次包括以下操作性连接的元件：同源上臂(上游同源臂)，所述的多核苷酸，终止子，同源下臂(下游同源臂)；

所述的同源上臂为里氏木霉cbh1基因ATG上游的启动子序列；

所述的同源下臂为里氏木霉cbh1基因TAG及TAG下游至少500bp；较佳地至少1000bp，如2000bp。

在另一优选例中，所述的同源上臂通过SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的引物从里氏木霉基因组中扩增获得。

在另一优选例中，所述的同源下臂通过SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物从里氏木霉基因组中扩增获得。

在另一优选例中，所述的终止子是构巢曲霉的Ttrpc。较佳地，以SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物从构巢曲霉基因组中扩增获得。

在另一优选例中，所述的宿主细胞中包括所述的构建物，且还转化有所述的载体。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(i)培养所述的宿主细胞；

(ii)收集含有所述的多肽的培养物；

(iii)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，所述的多肽用于水解β-1,4-木糖苷键。

在一个优选例中，所述的多肽水解的底物是木聚糖或含有木聚糖的物质；较佳地，将木聚糖或含有木聚糖的物质降解成低聚木糖、木寡糖或单糖。

在本发明的另一方面，提供一种用于降解木聚糖的组合物，它含有安全有效量的所述的多肽或含有所述的宿主细胞的培养物以及食品学或工业上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种水解β-1,4-木糖苷键的方法，所述方法包括将所述的多肽或所述的组合物与木聚糖或含有木聚糖的物质混合，从而水解β-1,4-木糖苷键，降解木聚糖。

在一个优选例中，将木聚糖或含有木聚糖的物质降解成低聚木聚糖、木寡糖或单糖。

在另一优选例中，所述的木聚糖包括(但不限于)：山毛榉木聚糖，桦木木聚糖等。

在另一优选例中，所述的含有木聚糖的物质包括(但不限于)：纸浆、饲料、食品或秸秆。

在另一优选例中，降解木聚糖的反应条件为：pH为3-7.5，优选4.5-7.5，更优选5.0-7.0；进一步更优选5.5-6.5(如pH6.0)；温度为35-65℃，优选为40-60℃，更优选为50-60℃(如55℃)。

在另一优选例中，所述方法还包括：在所述多肽与木聚糖或含有木聚糖的物质混合物中还加入调节所述多肽的酶活性的添加物，所述添加物包括K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺，或在添加至底物后可水解形成K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺或其任意混合物的物质。

在另一优选例中，所述方法还包括：在将所述的多肽与木聚糖或含有木聚糖的物质混合之前，对所述木聚糖或含有木聚糖的物质或所述多肽或含有所述多肽的组合物进行处理，以除去会影响所述多肽酶活的物质，所述物质包括：Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和EDTA，或可水解形成Ni²⁺、Zn²⁺或Fe³⁺的物质。

在本发明的另一方面，提供所述多肽的用途，所述用途包括(但不限于)：

(1)作为食品添加物(包括提高加工物的产量和过滤效率；提高面团的弹性和强度及改善面包质地；降低咖啡提取物粘度及改善干燥/冻干过程)；

(2)作为造纸过程添加物(包括促进制浆处理；提高纸浆的漂白率)；

(3)作为纺织品加工过程添加物(包括纺织品的酶解)；

(4)作为饲料添加物(包括提高饲料的可消化性和营养价值；减少环境污染)；或

(5)应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇。

在本发明的另一方面，提供一种用于重组表达所述的多肽的构建物，所述构建物从5’至3’依次包括以下操作性连接的元件：同源上臂(上游同源臂)，所述的多核苷酸，终止子，同源下臂(下游同源臂)；

所述的同源上臂为里氏木霉cbh1基因ATG上游的启动子序列；

所述的同源下臂为里氏木霉cbh1基因TAG及TAG下游至少500bp(较佳地至少1000bp，如2000bp)的序列。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是TrXYNA里氏木霉表达转化子PCR验证。

图中泳道M为DS-2000DNAMarker电泳结果(片段从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)泳道1-10为里氏木霉TrXYNA表达转化子基因组为模板扩增xynA基因后电泳图，11为阴性对照。

图2是TrXYNA表达，表达产物纯化SDS-PAGE(A-B)和Westernblot(C)图。

图2A中，泳道M为蛋白Marker(分子量从上到下依次为97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3kDa)泳道1为木霉RC30-8发酵上清液，泳道2，3，4是TrXYNA三个转化子发酵上清液。

图2B中，泳道5，6分别为上清液挂镍柱后用含40mM和60mM咪唑缓冲液的洗脱液的电泳结果。

图2C中，泳道M’为蛋白质预染Marker(分子量从上到下依次为170，130，100，70，55，40，35，25，15kDa)泳道7为RC30-8发酵上清，泳道8，9，10为TrXYNA三个转化子发酵上清液。

图3为TrXYNA在不同pH条件下酶活力曲线，其中pH3-6为乙酸盐缓冲液，pH6-7.5为磷酸盐缓冲液。

图4为TrXYNA在不同温度条件下酶活力曲线。

图5为TrXYNACBHI同源重组转化子单孢PCR验证。图中泳道M为DS-2000DNAMarker电泳结果(片段从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)泳道1-12为TrXYNACBHI同源重组子12个单孢，其中图5A为CBHI基因内部引物验证，未扩增出来说明CBHI已被同源重组，泳道-为阴性对照，泳道+为阳性对照。图5B为单孢基因组验证，扩增出来说明所抽单孢基因组是完整的。

图6为各种TrXYNA遗传操作转化子酶活数据。其中，1表示control菌株木霉RC30-87d发酵液上清在0.1MpH6.0乙酸缓冲液，60℃反应条件下木聚糖酶活，2表示RC30-8的TrXYNA单拷贝随机插入转化子在相同条件下木聚糖酶活，3表示TrXYNA基因同源重组CBHI的单拷贝定点整合转化子木聚糖酶活，4，5，6表示在3转化子的基础上再随机插入一拷贝TrXYNA转化子木聚糖酶活。

具体实施方式

本发明人经过大规模的筛选和深入的研究，从土曲霉中克隆到了一个木聚糖酶基因，并成功地在宿主细胞(包括里氏木霉)中得到了高效分泌表达，具有良好的应用于工业生产的潜能。

本发明人经过对曲霉、木霉、青霉、草菇、元基因组或其他细菌来源的GH11家族基因进行分离克隆并在里氏木霉表达系统进行表达，在表达土曲霉木聚糖酶XYNA时获得转化子酶活可达10754±472U/mL，酶活高于已知的木聚糖酶。转化子的发酵液中含有大量的木聚糖酶，将其纯化分离后获得XYNA，其最适pH为6.0，最适温度为55℃，和里氏木霉的纤维素酶酶系及其内源木聚糖酶的特性较为一致，以山毛榉木聚糖为底物，比活可达8746±38U/mg，经超过目前报道的最高的黑曲霉来源的木聚糖酶XylB的8007U/mg。本发明的木聚糖酶可良好地应用于里氏木霉纤维素酶系的复配或直接应用于如食品、纺织等行业中。本发明的木聚糖酶XYNA在里氏木霉系统中成功获得分泌表达，特别是里氏木霉转化子的XYNA分泌表达效率尤为突出，具有非常好的应用前景。

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“本发明的木聚糖酶”、“XYNA蛋白”、“XYNA多肽”、“TrXYNA”或“木聚糖酶XYNA”可互换使用，都指具有木聚糖酶XYNA氨基酸序列(SEQIDNO:2、其片段或变异形式或衍生物)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的木聚糖酶XYNA。

如本文所用，术语“本发明的基因”、“xynA基因”、“xynA”指具有木聚糖酶编码基因序列(SEQIDNO:1或其变异形式或衍生物)的多核苷酸。如本文所用，术语“本发明的里氏木霉转化子”、“本发明的里氏木霉重组子”、“TrXYNA里氏木霉重组子”或“TrXYNA里氏木霉转化子”可互换使用，都指以里氏木霉为宿主，异源表达了土曲霉木聚糖酶XYNA氨基酸序列(SEQIDNO:2或其变异形式或衍生物)。

本发明的木聚糖酶可作用于木聚糖长链分子的内部，以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为简单糖(如木寡糖)。

如本文所用，所述的“简单糖”广义地指木聚糖链被切割后形成的一类糖的总称，其链长度低于被切割前。例如，所述的简单糖含有1-50个木糖，较佳的，含有1-30个木糖；更佳的，含有1-15个木糖；更佳地含有1-10个木糖，如2，3，4，5，6，7，8，9个木糖。所述的简单糖包括：单糖、木二糖、木三糖、木四糖等。本发明中，所述的简单糖又指：低聚木糖、少量木糖、木寡糖。

如本文所用，所述的“木糖”指一种含有五个碳原子的单糖。分子式C₄H₉O₄CHO。所述的“木聚糖”是“木糖”的聚合体。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的XYNA蛋白或多肽”是指XYNA多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化XYNA蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。XYNA多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括XYNA蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然XYNA蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“XYNA多肽”指具有XYNA蛋白活性的SEQIDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与XYNA蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白同样的催化功能。因此该术语还包括XYNA蛋白的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQIDNO:2的保守功能域(第53-230位氨基酸)之外。变异可以是1-3个氨基酸缺失、取代和插入。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与xynADNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗XYNA多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含XYNA多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了XYNA多肽的片段。通常，该片段具有XYNA多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供XYNA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然XYNA多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“XYNA蛋白保守性变异多肽”指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn

Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的XYNA蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2、标签的序列

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述XYNA的氨基酸氨基末端用pelB等信号肽替换本身信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，但与SEQIDNO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严谨条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码XYNA蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的xynA核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或XYNA蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的XYNA多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码XYNA多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，xynA多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含XYNA编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，采用里氏木霉作为宿主细胞来表达XYNA。里氏木霉是商业纤维素酶的主要生产微生物，但其纤维素酶系中的半纤维素酶比例与活性都偏低，成为高效水解纤维素，特别是工业上预处理秸秆的限制因子。因此，目前的商品化纤维素酶，都是在里氏木霉生产的酶制剂中再添加或复配从其他真菌(例如高产半纤维素酶的黑曲霉)生产的半纤维素酶。本发明通过构建表达系统，在里氏木霉中异源表达多来源的木聚糖酶，并通过比较和评价，获得异源表达土曲霉XYNA木霉转化子，并筛选得到具有高分泌效率特性的转化子，加上转化子发酵培养的碳源是麸皮等简单易得的农用废弃物，在提高纤维素酶制剂的水解效率方面有着十分明显的作用，如应用在食品其他行业生产中，也将大大降低其生产成本。

作为本发明的优选方式，通过同源重组的技术，选择里氏木霉基因组中特定位点(cbh1基因)进行同源重组，以XYNA的编码基因取代cbh1基因，构建了基因组中定向整合有xynA的里氏木霉重组子，其可高效地表达XYNA。

更优选地，在上述里氏木霉重组子中进一步转化包含XYNA编码基因的表达载体，多拷贝的表达进一步提高了表达效率。应理解，还可以进一步对高酶活菌株进行进一步遗传改造与优化，以期获得活性更高，分泌量更大的转化子，这对于工业生产是十分有帮助的。

重组的XYNA的用途包括(但不限于)：水解木聚糖，将木聚糖长链切割为短链，或形成简单糖。已知的木聚糖酶的活力都低于本发明的XYNA的酶活力，预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高XYNA的酶活力、或扩大XYNA适用的PH值范围、温度范围及热稳定性，因此其应用前景良好。一些蛋白的分子改造技术是本领域人员熟知的，因此采用这些技术改造XYNA后生成的木聚糖酶也包含在本发明中。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的XYNA多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中XYNA多肽的有效量。

所述的组合物中还可添加调节本发明的XYNA酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，所述的提高本发明的XYNA酶活性的物质选自：K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺的物质，如氯化钾、硫酸锰。此外，一些物质可以降低酶活性，选自：Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和EDTA；或在添加至底物后可水解形成Ni²⁺、Zn²⁺或Fe³⁺的物质。

在获得了本发明的XYNA酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解底物(特别是木聚糖)的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种降解木聚糖的方法，该方法包含：用本发明所述的XYNA酶处理待水解的底物，所述的底物包括但不限于桦木木聚糖和山毛榉木聚糖等。通常，在pH3-8条件下，用所述的XYNA酶处理待水解的底物。通常，在温度30-80℃条件下，用所述的XYNA酶处理待水解的底物。较佳地，用所述的XYNA酶处理的同时，还加入K⁺，Mn²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺，Mn²⁺的物质。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从土曲霉在纤维素诱导培养下通过mRNA逆转录成的cDNA中通过PCR分离出的。其序列如SEQIDNO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为696个碱基，编码全长为231个氨基酸的XYNA蛋白(SEQIDNO:2)。所述的TrXYNA蛋白(SEQIDNO:2)序列中，自氨基端的第53-230位氨基酸为糖基水解酶第11家族氨基端保守功能域。所述的XYNA重组蛋白在里氏木霉重组子中用纤维素诱导能够高效分泌表达。更佳地，在里氏木霉宿主中能够在纤维素和麸皮共同诱导下更高效的分泌表达。更进一步地，在里氏木霉宿主中表达多拷贝xynA基因并能够在纤维素酶和麸皮共同诱导下更为高效地分泌表达。

实验证明本发明的内切-1,4-β-木聚糖酶具有很高的木聚糖酶活性，最适pH和最适温度和纤维素酶工业菌株里氏木霉酶系一致，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、木聚糖酶及其编码基因的分离

在37℃下，用含有纤维素的察氏培养基诱导培养土曲霉2天，抽提RNA，再逆转录成cDNA，通过土曲霉基因组数据库搜寻xynA基因号Gene：ATEG_07461(http://www.cadre-genomes.org.uk/Aspergillus_terreus)，以cDNA为模板，用聚合酶链式反应分离合成双链DNA，分离合成的基因具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，即为xynA编码序列。SEQIDNO:1的5’端第1至696位核苷酸为xynA的开放阅读框(OpenReadingFrame，ORF)，SEQIDNO:1的5’端的第1-3位核苷酸为xynA基因的起始密码子ATG，SEQIDNO:1的5’端的第694至696位核苷酸为xynA基因的终止密码子TGA。

内切-1,4-β-木聚糖酶基因xynA编码一个含有231个氨基酸的蛋白质TrXYNA，具有SEQIDNO:2的氨基酸残基序列，预测到该蛋白质的理论分子量大小为24.75kDa，等电点pI为6.05。SEQIDNO:2氨基端的第53-230位氨基酸为糖基水解酶第11家族保守功能域。

实施例2、xynA在宿主里氏木霉中的分泌表达

(1)宿主里氏木霉中重组表达载体的构建

通过PCR、以上述分离到的基因为模板克隆木聚糖酶ORF编码基因，所用正向引物为：5’GCTCTAGAATGGTCTCCTTCCTTCGTCTTGCCGTTGCCTGCTTCGC3’(SEQIDNO:3)，其5’端包括XbaI识别位点：TCTAGA；反向引物为5’GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGGTACACAGTAATGGACG3’(SEQIDNO:4)，其5’端包括XbaI识别位点：TCTAGA。

将PCR产物纯化后用XbaI酶切，应用AxygenPCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样酶切的回收的载体pHDt/sk(参见MicrobialCellFactories，2012，11:21)磷酸化处理后，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pHDt/sk-TrxynA。表达产物的C末端提供的His标签(6×His-Tag)，便于后续纯化。

(2)xynA基因在里氏木霉中的表达

将上述构建好的质粒pHDt/sk-TrxynA转化入根癌农杆菌AGL1中，在根癌农杆菌的介导下转化入里氏木霉RC30-8菌株(参见MicrobialCellFactories，2012，11:21)中，将长出的转化子接种于SDB培养液中，2天后抽提DNA为模板，通过载体上的启动子处设计正向引物5’CTCCAGGAGACTTGTACACCATC3’(SEQIDNO:5)和xynA基因的反向引物为5’GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGGTACACAGTAATGGACG3’(SEQIDNO:4)，PCR鉴定阳性转化子。

结果如图1所示，10个阳性转化子中均有目的片段扩出，选择其中1，2，3号转化子进行下一步实验。

(3)xynA的表达和表达产物TrXYNA的纯化

(1)xynA的表达

接种里氏木霉转化子1于10mlSDB培养液中，28℃200rpm培养2天。取1ml培养液到10ml含有诱导物(3％微晶纤维素和2％麸皮)的无机盐培养液(0.4％KH₂PO₄，0.28％(NH₄)₂SO₄，0.06％MgSO₄·7H₂O，0.05％CaCl₂，0.06％尿素，0.3％蛋白胨，0.1％Tween80，0.5％CaCO₃，0.001％FeSO₄·7H₂O，0.00032％MnSO₄·H₂O，0.00028％ZnSO₄·7H₂O，0.0004％CoCl₂，pH调至5.5)中，28℃200rpm培养7天。4℃离心收集发酵上清液。上清进行SDS-PAGE和WesternBlot，结果可检测目的蛋白。

(2)表达产物TrXYNA蛋白的提取纯化

用结合缓冲液(bindingbuffer：NaH₂PO₄20mmol/L，Na₂HPO₄20mmol/L，0.5MNaCl，pH7.4)预处理购自GE公司的Ni柱(Ni-NTAColumn)后，直接用发酵上清液过柱，再用含有不同浓度咪唑的洗脱液梯度洗脱，并收集。各浓度的洗脱液为上述裂解液分别加入终浓度20、40、60、80、100、200及500mM的咪唑，保持pH7.4不变。各咪唑浓度收集液，超滤去除咪唑后，用5μl洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图2A-C所示。其中泳道M为蛋白Marker(分子量从上到下依次为97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3kDa)泳道1为木霉RC30-8发酵上清液，泳道2，3，4是TrXYNA三个转化子发酵上清液。泳道5，6分别为上清液挂镍柱后用含40mM和60mM咪唑缓冲液的洗脱液的电泳结果。泳道M’为蛋白质预染Marker(分子量从上到下依次为170，130，100，70，55，40，35，25，15kDa)泳道7，8，9，10和左边PAGE图谱样品一一对应。从图中可见，咪唑浓度60mM时可将全部杂蛋白去除。

上述操作获得纯化的TrXYNA蛋白。

实施例3、重组TrXYNA蛋白酶学性质的分析

以2％的山毛榉木聚糖(Xylanfrombeechwood，Sigma，产品编号X4252)为底物检测木聚糖酶的酶活及理化特性，具体操作如下：

(1)木糖标准曲线制备

首先配制10mg/mL的木糖(D(+)-Xylose，生工，产品编号XB0998)母液。然后稀释获得不同浓度木糖标样，如表3所示。

表3

标样编号	0	1	2	3	4	5
							木糖总量(μg)	0	100	200	300	400	500
木糖母液体积(μl)	0	10	20	30	40	50
							补充H2O(μl)	1000	990	980	970	960	950

从各管各取100μl木糖标样，加入100μlDNS，95℃反应10min后，取100μl反应液加入到酶标板中，酶标仪检测540nm处光吸收。以0的读数为空白，各反应液读数减去空白，得到标准曲线。

(2)标准酶活测定

首先用水配制5％山毛榉木聚糖母液，使用时用NaAc/HAc缓冲液稀释到2％作为底物。

在100μl反应体系中，加入50μl2％的山毛榉木聚糖，然后加入浓度为0.1M的NaAc/HAc(pH6.0)缓冲液稀释至一定稀释度的酶液50μl，60℃反应10分钟，再加入100μlDNS，95℃反应10min后，取100μl反应液加入到酶标板中，酶标仪检测540nm处光吸收，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位(U)。

酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化木聚糖产生1μmol木糖所需的酶量。

比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

结果表明TrXYNA对2％木聚糖在pH6.0，60℃下的比活力为8746±38U/mg。

(3)重组TrXYNA最适pH测定

pH范围为3.0-7.5，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的缓冲液配制为：pH3.0-6.0用浓度为0.1M的NaAc/HAc缓冲液；pH6.0-7.5用浓度为0.1MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液。将酶液加入各pH缓冲液的体系中稀释，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在60℃反应条件下，TrXYNA在pH6.0的NaAc/HAc缓冲液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力。

结果如图3所示，TrXYNA最适pH为pH6.0，在pH4.0-8.0之间均具有最高活力40％以上的活力，说明TrXYNA的反应pH范围偏酸性且范围较广，能够适应酸性和弱碱性的反应环境，和真菌源纤维素酶制剂的最适反应pH一致。

(4)重组TrXYNA最适温度测定

在最适pH6.0条件下，在温度范围为35-65℃之间，按如前所述标准酶活测定方法步骤测定。结果如图4所示，重组TrXYNA的最适温度为45-60℃，以55℃下酶活力为100％，换算各个温度下的相对酶活力后可知TrXYNA在45-60℃的温度范围内可保持最高活力70％以上的活力。

实施例4、TrXYNA各种遗传操作子的获得和酶学性质测定

实施例2中，本发明人已经获得TrXYNA的插入转化子，接下来本发明人进一步通过遗传操作，以期望进一步提高TrXYNA的分泌量和酶活。

(1)同源重组CBHI转化子的获得

A.同源重组载体构建

以pXBt载体(获自浙江大学，含有Kan和Ble筛选标记)为骨架，构建TrXYNA的CBHI同源重组子。首先利用正向引物：5’ACGCGTCGACAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTG3’(SEQIDNO:6)和反向引物：5’GCTCTAGATTGACTATTGGGTTTCTGTGCCTC3’(SEQIDNO:7)扩增里氏木霉基因组获得Pcbh1作为TrXYNA表达的启动子同时作为同源上臂，其中正向引物5’添加SalI酶切位点GTCGAC，反向引物5’添加XbaI酶切位点TCTAGA。TrXYNA引物如实施实例2中所示，利用正向引物：5’GCTCTAGAAGTAGATGCCGACCGGATCGATCCA3’(SEQIDNO:8)和反向引物：5’GGACTAGTCAGGGCTGGTGACGGAATTTTCATA3’(SEQIDNO:9)扩增里氏木霉基因组获得Ttrpc作为TrXYNA表达终止子，其中正向引物5’添加XbaI酶切位点TCTAGA，反向引物5’添加SpeI酶切位点ACTAGT。接下来利用正向引物：5’CCGCTCGAGAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG3’(SEQIDNO:10)和反向引物：5’CCGCTCGAGGTTTCGTGCGGCTGAATCC3’(SEQIDNO:11)扩增里氏木霉基因组中cbh1基因TAG后2000bp(Dcbh1)序列作为同源下臂，此正向引物和反向引物5’均添加XhoI酶切位点CTCGAG。首先PCR扩增获得Pcbh1，SalI/XbaI酶切后用AxygenPCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样酶切的回收的载体pXBt，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到载体pXBt-Pcbh1，接下来PCR扩增得到Ttrpc片段后XbaI/SpeI双酶切与XbaI酶切并去磷后载体pXBt-Pcbh1，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到载体pXBt-Pcbh1-Ttrpc，接下来利用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为引物PCR扩增得到TrXYNA后XbaI酶切后与同样酶切后并去磷的载体pXBt-Pcbh1-Ttrpc、用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜得到载体pXBt-Pcbh1-TrXYNA-Ttrpc。最后PCR扩增Dcbh1，XhoI酶切后与同样酶切并去磷载体pXBt-Pcbh1-TrXYNA-Ttrpc，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到载体pXBt-Pcbh1-TrXYNA-Ttrpc-Dcbh1，至此得到TrXYNA的CBHI同源重组质粒，其中ble抗性标记位于Ttrpc和Dcbh1之间。

B.农杆菌转化并筛选同源敲除子

转化的方法同实施实例2，同源重组敲除子验证如图6，其中CBHI基因内部验证所用正向引物是：5’CATGGCAGAAATGCTCGTC3’(SEQIDNO:12),反向引物是5’AGCGGTGTTGGTGGGATA3’(SEQIDNO:13)，基因组验证正向引物是5’TTCCAGCCTTCTGTAGCA3’(SEQIDNO:14)，反向引物是5’GACCCTTCGCACTGATGT3’(SEQIDNO:15)。

C.酶学性质测定

酶活测定的具体方法同实施实例3，图6中的3即为同源敲除子，酶活达9979±836U/ml。

(2)两拷贝转化子获得

在(1)中获得TrXYNA的CBHI同源重组子基础上再将实施实例2中pHDt/sk-TrXYNA质粒转入该同源重组子，获得双拷贝转化子。

酶学性质测定同前，结果见图6。图6中4，5，6即为双拷贝转化子酶活数据，酶活依次为9254±882U/ml，10754±472U/ml，9638±612U/ml。同时图6中1为RC30-8酶活数据，为2677±93U/ml，2为TrXYNA单拷贝随机插入转化子酶活数据，为6019±271U/ml。至此获得了一个酶活较高的TrXYNA多拷贝木霉转化子，其木聚糖酶活为10754±472U/ml。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO:2或第20-231位所示氨基酸序列多肽；

(b)由(a)所述的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；或

(c)在(a)或(b)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2-3任一所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2-3任一所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是里氏木霉，其基因组中整合有权利要求2-3任一所述的多核苷酸。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包括一构建物，该构建物从5’至3’依次包括以下操作性连接的元件：同源上臂，权利要求2-3任一所述的多核苷酸，终止子，同源下臂；

所述的同源上臂为里氏木霉cbh1基因ATG上游的启动子序列；

所述的同源下臂为里氏木霉cbh1基因TAG及TAG下游至少500bp；较佳地至少1000bp，如2000bp。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包括所述的构建物，且还转化有权利要求4所述的载体。

9.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(i)培养权利要求5-8任一所述的宿主细胞；

(ii)收集含有权利要求1所述的多肽的培养物；

(iii)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

10.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，所述的多肽用于水解β-1,4-木糖苷键。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的多肽水解的底物是木聚糖或含有木聚糖的物质；较佳地，将木聚糖或含有木聚糖的物质降解成低聚木糖、木寡糖或单糖。

12.一种用于降解木聚糖的组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽或含有权利要求5-8任一所述的宿主细胞的培养物以及食品学或工业上可接受的载体。

13.一种水解β-1,4-木糖苷键的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的多肽或权利要求12所述的组合物与木聚糖或含有木聚糖的物质混合，从而水解β-1,4-木糖苷键，降解木聚糖。

14.如权利要求11所述的用途或权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的含有木聚糖的物质包括：纸浆、饲料、食品或秸秆。

15.如权利要求13-14任一所述的方法，其特征在于，降解木聚糖的反应条件为：pH为3-7.5，优选4.5-7.5，更优选5.0-7.0；进一步更优选5.5-6.5；温度为35-65℃，优选为40-60℃，更优选为50-60℃。

16.权利要求1所述多肽的用途，其特征在于，所述用途包括：

(1)作为食品添加物；

(2)作为造纸过程添加物；

(3)作为纺织品加工过程添加物；

(4)作为饲料添加物；或

(5)应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇。

17.一种用于重组表达权利要求1所述的多肽的构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3’依次包括以下操作性连接的元件：同源上臂，权利要求2-3任一所述的多核苷酸，终止子，同源下臂；

所述的同源上臂为里氏木霉cbh1基因ATG上游的启动子序列；

所述的同源下臂为里氏木霉cbh1基因TAG及TAG下游至少500bp的序列。