CN102816748B - 一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。本发明还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及利用所述β-葡萄糖苷酶将底物水解为简单糖的方法。本发明的β-葡萄糖苷酶具有常温活性最高及中性及弱碱性条件下稳定性好的特点，可良好地应用于工业生产。

Description

一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷链连接而成的多聚物，是地球上最丰富的可再生的生物质资源。以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。

纤维素酶是能够将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖及一些纤维寡糖最终生成单个的葡萄糖分子。

作为纤维素复合酶系的重要组成之一，β-葡萄糖苷酶的关键作用主要体现在两个方面：一方面，由于纤维二糖积累对其上游内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有显著的反馈抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶的高效水解对纤维素的彻底降解起到至关重要的作用。另一方面，除水解活性，β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子。而已经发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是：存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成型纤维素酶首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的转糖苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成型透性酶系统进人细胞内，启动纤维素酶的合成。由此可见，提高β-葡萄糖苷酶在纤维素降解体系的催化活性，对于提高纤维素降解体系转化效率及降低纤维素乙醇产业生产成本，具有巨大的商业价值和现实意义。

β-葡萄糖苷酶底物专一性差异很大，除了作用于纤维二糖及纤维糊精而在纤维素乙醇产业发挥重要作用外，还可作用于芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水杨苷及生色化合物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)；烷基葡萄糖苷(甲基-β-D-葡萄糖苷)；β-1，3-葡萄糖苷(昆布二糖)等。因此在其他领域的应用也非常广泛。例如在食品行业中，由于它能将水果中糖苷酶前体的芳香族化合物释放变为具有浓郁香味的化合物，从而改善茶叶、果汁和果酒的风味，因此其作为特殊的风味酶已得到广泛应用；在医药保健品行业中，β-葡萄糖苷酶可通过生物转化功能，将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的物质。例如，β-葡萄糖苷酶可将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元，进而发挥改善更年期综合症、预防骨质疏松、抗氧化等生物学功能等。

β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中许多植物和微生物体内。由于植物来源的β-葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低，所以其分离主要集中在微生物上。起初人们主要从纯培养微生物中分离，如木霉、青霉、黑曲霉等。随着元基因组学技术的兴起，人们意识到占自然界中微生物种类99％以上的微生物实际上未可培养，而其中必然蕴藏着丰富的基因资源，所以越来越多的研究者开始将目光集中到纤维素被活跃降解的各种环境系统上，通过构建和筛选各种环境样品的未培养微生物宏基因组文库获得具有不同优良生化性质的β-葡萄糖苷酶新基因，如Walter等人构建鼠大肠未培养微生物的BAC基因文库，并克隆到一个β-葡萄糖苷酶基因(Walter等，Appl Environ Microbiol，71：2347-2354，2005)；Ferrer等人构建了奶牛的瘤胃内容物的宏基因组文库，从中克隆到包括9个内切葡聚糖酶基因和1个β-葡萄糖苷酶基因(Ferrer M等，Environ Microbiol，7：1996-2010，2005.)；Feng等人报道从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了4个内切葡聚糖酶和7个β-葡萄糖苷酶基因C(Feng Y等，Appl MicrobiolBiotechnol，75：319-328，2007)；唐咸来等人从沼气池宏基因组文库中克隆和鉴定了一个β-葡萄糖苷酶基因等。

针对不同工业用途需要使用不同性质的β-葡萄糖苷酶，而现有技术中的大部分，尤其是细菌来源的β-葡萄糖苷酶的活力较低，在产量、理化特性、催化效率等方面也远远不能满足现代工业生产的需求，因而有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出酶活较高、理化特性更趋多样化的新的β-葡萄糖苷酶。白蚁作为自然界生态系统中木质纤维素的重要降解者，其独特的肠道共生微生物基因组中必然蕴藏着丰富的纤维素酶基因资源和代谢途径。但至今尚且没有从白蚁肠道细菌中克隆到相关β-葡萄糖苷酶基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新功能基因的克隆方法。

本发明的目的在于提供一种新型β-葡萄糖苷酶(Bgl7O16)及其编码基因(bgl7O16)和应用。

本发明的目的在于提供包括β-葡萄糖苷酶基因的表达载体和宿主细胞，基因的表达和蛋白纯化方法，以及重组蛋白的酶学特性和功能特征。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO：2的蛋白片段(较佳地，其与SEQ IDNO：2的序列相同性高于70％；更佳地高于75％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)。

在一个优选例中，所述的多肽来源于白蚁肠道元基因组。

在另一优选例中，所述的多核苷酸它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或如SEQ ID NO：1中第77-所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(a)培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于形成简单糖(如葡萄糖)。

在另一优选例中，所述的多肽用于水解糖苷键。

在另一优选例中，所述的多肽水解选自(但不限于)下述底物的糖苷键：纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷。

在另一优选例中，所述的底物选自(但不限于)水杨苷、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷或对硝基苯纤维二糖苷。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于：

作为以纤维素为原料的乙醇发酵的添加物；

作为食品工业中调节风味的添加物；

作为医药保健品的添加物(例如：将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元)。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物还含有调节酶活性的添加物。

在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；较佳地选自：K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺，或可水解(或可解离)形成K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺的物质；更佳地选自Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺，或可水解形成Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺的物质；或

所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物：较佳地选自：Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl，或可水解形成Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl的物质；更佳地选自Cu²⁺、Ag⁺，或可水解形成Cu²⁺、Ag⁺的物质。

在本发明的另一方面，提供一种形成简单糖的方法，该方法包含：用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，所述的底物选自(但不限于)：纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷。更具体地，所述的底物选自(但不限于)水杨苷、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷或对硝基苯纤维二糖苷。

在另一优选例中，在pH4.5-8.5(较佳地是PH5.0-8.0；更佳地是PH5.5-7.5；更佳地是PH6.0-7.0；最佳地是PH6.5)条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在温度10-50℃(较佳地是15-45℃；更佳地是20-40℃；更佳地是25-35℃；最佳地是30-35℃)条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，用所述的多肽处理的同时，还加入调节酶活性的添加物。

在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；较佳地选自：K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺，或可水解形成K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺的物质；更佳地选自Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺，或可水解形成Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺的物质；或

所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物：较佳地选自：Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl，或可水解形成Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl的物质；更佳地选自Cu²⁺、Ag⁺，或可水解形成Cu²⁺、Ag⁺的物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl7O16菌体PCR后的电泳图。

图2为β-葡萄糖苷酶基因bgl7O16的表达。其中泳道M为蛋白分子量marker，泳道1为未诱导时细胞裂解液总蛋白，泳道2为未诱导时裂解液上清中的蛋白，泳道3为未诱导时裂解液沉淀中的蛋白；泳道4为诱导后细胞裂解液总蛋白，泳道5为诱导后裂解液上清中的蛋白，泳道6为诱导后裂解液沉淀中的蛋白。

图3为表达产物的纯化SDS-PAGE图。泳道M为蛋白分子量marker，泳道1为待纯化细胞裂解液(含总蛋白)，泳道2为细胞裂解液流穿液(含10mM咪唑)，泳道3为20mM咪唑洗脱液，泳道4为60mM咪唑洗脱液，泳道5为250mM咪唑洗脱液。

图4为Bgl7O16在不同pH条件下的酶活力曲线。

图5为Bgl7O16对不同pH的耐受性测定。

图6为Bgl7O16在不同温度条件下的酶活力曲线。

图7为Bgl7O16对不同温度的耐受性检测结果。

具体实施方式

本发明人通过筛选白蚁肠道元基因组DNA文库，获得了一个新的β-葡萄糖苷酶，将之命名为Bgl7O16。与现有细菌来源的β-葡萄糖苷酶相比，本发明的β-葡萄糖苷酶Bgl7O16活性较高，超过40U/mg，且具有常温活性最高及中性及弱碱性条件下稳定性好的特点，具有良好地应用于工业生产的潜能。

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“本发明的β葡萄糖苷酶”、“Bgl7O16蛋白”、“Bgl7O16多肽”或“β葡萄糖苷酶Bgl7O16”可互换使用，都指具有β葡萄糖苷酶Bgl7O16氨基酸序列(SEQ IDNO：2或其变异形式或衍生物)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的β葡萄糖苷酶Bgl7O16。

如本文所用，术语“本发明的基因”、“Bgl7O16基因”、“Bgl7O16”指具有β葡萄糖苷酶编码基因序列(SEQ ID NO：1或其变异形式或衍生物)的多核苷酸。

如本文所用，所述的“简单糖”指糖苷链被切割后形成的糖，其链长度低于被切割前。例如，所述的简单糖为葡萄糖。

如本文所用，所述的“糖苷”指单糖或寡糖的半缩醛羟基与糖或非糖物质缩合形成的化合物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的Bgl7O16蛋白或多肽”是指Bgl7O16多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Bgl7O16蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。Bgl7O16多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括Bgl7O16蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Bgl7O16蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“Bgl7O16多肽”指具有Bgl7O16蛋白活性的SEQ IDNO：2序列的多肽。该术语还包括具有与Bgl7O16蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列编码多肽的片段的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。因此该术语还包括Bgl7O16蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Bgl7O16 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Bgl7O16多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Bgl7O16多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Bgl7O16多肽的可溶性片段。通常，该片段具有Bgl7O16多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供Bgl7O16蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Bgl7O16多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“Bgl7O16蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu

Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的Bgl7O16蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，C-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述Bgl7O16的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如α-factor信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Bgl7O16蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的Bgl7O16核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Bgl7O16蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的Bgl7O16多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码Bgl7O16多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Bgl7O16多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Bgl7O16编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的Bgl7O16的用途包括(但不限于)：水解纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷等底物，将长链切割为短链，或形成简单糖。预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高Bgl7O16的酶活力、或扩大Bgl7O16适用的PH值范围、温度范围及热稳定性，因此其应用前景良好。一些蛋白的分子改造技术是本领域人员熟知的，因此采用这些技术改造Bgl7O16后生成的葡萄糖苷酶也包含在本发明中。

用表达的重组Bgl7O16蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Bgl7O16蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对Bgl7O16 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Bgl7O16基因产物或片段。较佳地，指那些能与Bgl7O16基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Bgl7O16蛋白的分子，也包括那些并不影响Bgl7O16蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Bgl7O16基因产物结合的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Bgl7O16基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Bgl7O16蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。抗Bgl7O16蛋白的抗体可用于检测样本中的Bgl7O16蛋白。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Bgl7O16蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的Bgl7O16多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

所述的组合物中还可添加调节本发明的Bgl7O16酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，所述的提高本发明的Bgl7O16酶活性的物质选自：K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺。此外，一些物质可以降低酶活性，选自：Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl。

在获得了本发明的Bgl7O16酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解底物的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种形成简单糖的方法，该方法包含：用本发明所述的Bgl7O16酶处理待水解的底物，所述的底物包括但不限于纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷等。较佳地，在pH4.5-8.5条件下，用所述的Bgl7O16酶处理待水解的底物。较佳地，在温度10-50℃条件下，用所述的Bgl7O16酶处理待水解的底物。较佳地，用所述的Bgl7O16酶处理的同时，还加入K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺或Fe³⁺；更佳地，加入所述的K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺的浓度是1±0.5mM。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从白蚁肠道元基因组中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2214个碱基，编码全长为737个氨基酸的Bgl7O16蛋白(SEQ ID NO：2)。所述的Bgl7O16蛋白(SEQ ID NO：2)序列中，第89-313位为糖基水解酶第3家族pfam00933保守功能域；第381-626位氨基酸为糖基水解酶第3家族pfam01915保守功能域。所述的Bgl7O16蛋白与已知氨基酸序列的相似性最高为55％，证明是一种新的β-葡萄糖苷酶。

实验证明本发明的β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活且在较宽的pH范围内有较好稳定性，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、β-葡萄糖苷酶及其编码基因的分离

利用元基因组技术从白蚁肠道元基因组系统中筛选到β-葡萄糖苷酶阳性克隆Y8007O16，提取该克隆的质粒DNA进行454高通量测序，序列拼接后可以获得较为完整的Fosmid片段序列。用DNAStar软件寻找ORF，用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BlastP搜寻GenBank数据库，得到β-葡萄糖苷酶的编码基因，该基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，命名为bgl7O16。自SEQ ID NO：1的5’端第1至2214位核苷酸为bgl7O16的开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)，自SEQ ID NO：1的5’端的第1-3位核苷酸为bgl7O16基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO：1的5’端的第2212至2214位核苷酸为bgl7O16基因的终止密码子TAA。

β-葡萄糖苷酶基因bgl7O16编码一个含有737个氨基酸的蛋白质Bgl7O16，具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为79.4kDa，等电点pI为5.43。自SEQ ID NO：2的氨基端的第89-313位为糖基水解酶第3家族pfam00933保守功能域；第381-626位氨基酸为糖基水解酶第3家族pfam01915保守功能域。

序列比较结果显示，该β-葡萄糖苷酶同已知蛋白的氨基酸序列一致性最高为55％，表明该β-葡萄糖苷酶为新酶。

实施例2、bgl7O16在大肠杆菌中的表达

1.重组表达载体的构建

通过PCR从上述筛选到的Fosmid阳性克隆中扩增预测到的β-葡萄糖苷酶ORF编码基因，所用正向引物为：5’ATCCCATGGAGCCTAAGGACGAGGCT3’(SEQ ID NO：3)，其5’端添加NcoI识别位点：CCATGG；反向引物为5’CTTCTCGAGGTAGTTGAATGTTACTGG 3’(SEQ ID NO：4)，其5’端添加Xho I识别位点：CTCGAG。该引物扩增的是SEQ ID NO：1中从5’端第77位碱基起的序列片段。

将PCR产物纯化后用Nco I和Xho I酶切，应用Axgen PCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样双酶切的回收的载体pET-22b(+)(Novagen公司)用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pET 22b(+)-bgl7O16。其中，起始密码子和终止密码子由表达载体pET-22b(+)提供。表达产物的C末端有一个由表达载体提供的His标签(6×His-Tag)，便于后续纯化。

2.bgl7O16基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的转化及平板活性检测

将上述构建好的质粒pET 22b(+)-bgl7O16转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，将得到的BL21(DE3)/pET22(+)-bgl7O16转化子随机挑取8个单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养液中，以菌液为模板，通过载体上的T7启动子引物(cat.no.69348-3)和T7终止子引物(cat.no.69337-3)PCR鉴定阳性克隆。结果如图1所示，8个单克隆中均有目的片段扩出。

挑取阳性克隆于含0.1％(w/v)七叶苷和0.25％(w/v)柠檬酸铁铵的LB固体培养基(含氨苄青霉素，并用适量IPTG诱导)进行平板活性检测。37℃过夜培养。然后观察菌落周围有无黑褐色，存在黑褐色表示该克隆为携带重组质粒pET22b(+)-bgl7O16的阳性克隆。

3.bgl7O16的表达和表达产物Bgl7O16的纯化

(1)bgl7O16的表达

接种E.coli BL21(DE3)/pET22-bgl7O16于5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃ 200rpm培养过夜。取5ml培养液到500ml LB培养液中，37℃ 200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。冷水冷却后加入50μM IPTG，于28℃ 120rpm继续培养16个小时，离心收集菌体。用2ml水重悬菌体，冰上超声10分钟，功率10％，保存100μl细胞裂解液作为总蛋白，其余细胞裂解液以2000g离心15分钟，留上清检测可溶性蛋白，沉淀用水重悬检测包涵体。

电泳结果如图2所示，泳道M为蛋白分子量marker(分子量从大到小依次为94、60、45、27、18Kd)，泳道1为未诱导时细胞裂解液总蛋白，泳道2为未诱导时裂解液上清中的蛋白，泳道3为未诱导时裂解液沉淀中的蛋白；泳道4为诱导后细胞裂解液总蛋白，泳道5为诱导后裂解液上清中的蛋白，泳道6为诱导后裂解液沉淀中的蛋白。可见，诱导后目的蛋白的表达量明显提高，但在包涵体中比例也有所提高。

(2)表达产物Bgl7O16蛋白的提取纯化

用裂解液(1ysis buffer：NaH₂PO₄ 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，咪唑10mmol/L，pH8.0)悬浮收集的菌体，超声波破碎细胞后离心收集上清液即为粗酶液。用购自Qiagen公司的Ni柱(Ni-NTA Column)纯化粗酶液，纯化时所用洗涤液(wash bufer)：NaH₂PO₄ 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，咪唑60mmol/L，pH8.0；洗脱液(elution bufer)：NaH₂PO₄ 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，咪唑250mmol/L，pH8.0。

用5μl洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图3所示。其中泳道M为蛋白分子量marker(分子量从大到小依次为94、66.2、45、26、20Kd)，泳道1为待纯化细胞裂解液(含总蛋白)，泳道2为细胞裂解液流穿液(含10mM咪唑)，泳道3为20mM咪唑洗脱液，泳道4为60mM咪唑洗脱液，泳道5为250mM咪唑洗脱液。从图中可见，咪唑浓度到达60mM时可将几乎全部杂蛋白去除，虽然目的蛋白也被部分洗脱；最后用250mM高浓度咪唑洗脱时就可得到单一条带的目的蛋白，说明此时已经得到高纯度的目的蛋白。将所有含有目的蛋白的洗脱液合并，用GE公司10Kd截留的vivaspin6超滤管浓缩透析，同时用20mM pH7.4 NaH₂PO₄的置换缓冲液，以去除咪唑。

实施例3、重组Bgl7O16蛋白酶学性质的分析

以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物检测β-葡萄糖苷酶的酶活及理化特性，具体操作如下：

(1)对硝基苯酚(pNP)标准曲线制备

取12支薄壁离心管，按表3加入溶液。

表3

pNP浓度为1mg/ml。上表每份标样加200μl 1M NaCO₃，终止反应并显色，每管吸取100μl于酶标板中，用酶标仪测405nm光吸收，标样编号0为空白对照。各样品值减空白后制备标线。

(2)标准酶活测定

在100μl反应体系中，加入终浓度为2.5mM pNPG，终浓度为50mM的pH6.5 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，然后加入用该缓冲液稀释至一定稀释度的适量酶液(酶量是0.4μg(0.01692U))30℃反应5分钟，再加入200μl 1M NaCO₃终止反应并显色(对照为在上述反应体系中先加入200μl 1M NaCO₃后再加酶液)，用酶标仪测405nm光吸收值，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位(U)。

酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化pNPG产生1μmol pNP所需的酶量。

比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

结果表明Bgl7O16对pNPG在pH6.5，30℃下的比活力为42.3U/mg。

(3)Bgl7O16最适pH测定

pH范围为4.5-8.5，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的缓冲液配制为：pH4.5～5.0用终浓度为50mM的NaAc；pH5.5～8.5用终浓度为50mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄。将酶液加入各pH缓冲液的体系中，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在30℃反应条件下，Bgl7O16在pH6.5的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力。

结果如图4所示，Bgl7O16最适pH为6.5，且在pH5.5～8之间具有最高活力40％以上的活力；在pH5.5～7.5之间均具有最高活力60％以上的活力，说明Bgl7O16的反应pH范围较宽，能够适应弱酸性、中性及弱碱性的反应环境。

(4)Bgl7O16pH耐受性测定

将酶液与pH范围为4.5-8.5的上述各缓冲液(每0.5个单位为一个梯度)在4℃保存24h，再按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。以Bgl7O16在pH6.5中保存0min时反应的比活力为100％，换算Bgl7O16在各pH值缓冲液中保存24h后的相对酶活力。

结果如图5所示，Bgl7O16在pH6.5～8.5之间均能够保持最高活力的70％以上，说明其在pH6.5至8.5的中性及弱碱性的条件下具有较好的pH耐受性，有别于多数同类酶偏酸性的特点。

(5)Bgl7O16最适温度测定

在最适pH7.5条件下，在温度范围为10-50℃之间，按如前所述标准酶活测定方法测定。

结果如图6所示，Bgl7O16的最适温度为30～35℃，以30℃下酶活力为100％，换算各个温度下的相对酶活力后可知Bgl7O16在30-40℃的温度范围内可保持最高活力60％以上的活力。在20℃也能保持最高活力40％以上的活力。

(6)Bgl7O16温度耐受性测定

将Bgl7O16酶液保存于最适pH缓冲液中，在不同温度(10～50℃之间，每隔5℃设为一个温度条件)保持30min后，在pH6.5，30℃下测定酶活力。其对照是未热处理的酶液在pH6.5，30℃下所测定的活力，以此为100％，换算在不同温度下保温30分钟后的剩余相对活力。

结果如图7所示，Bgl7O16在10～15℃的温度范围内保存30min时，约能剩余最大活力的90％左右；在20～30℃的温度范围内保存30min时，约能剩余最大活力的75％左右；当温度高于40℃时，活力损失最大，基本下降到最大活力的5％以下。

(7)不同化学试剂及金属离子对Bgl7O16酶活的影响

各种化合物(终浓度为1mmol/L)与酶液在30℃下保温30min，然后按常规方法测定酶活力，以未加任何化学试剂及金属离子并在30℃下保温30min的酶活力为100％。不同化学试剂及金属离子对Bgl7O16酶活的影响结果如表4所示，其中Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺对Bgl7O16有显著激活作用，如Mg²⁺可使酶活力提高至252％左右；其中K⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺对Bgl7O16有轻微激活作用；其中Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl对Bgl7O16有略微抑制作用；而Cu²⁺、Ag⁺对Bgl7O16有显著抑制作用，如Ag⁺可使酶丧失95％以上活力。

表4

(8)Bgl7O16对不同底物的水解情况

将各种底物(终浓度为2.5％(w/w))与适量酶(0.4μg)在pH6.5及30℃下作用5min，测定酶活力。其中，测定Bgl7O16对pNPC(对硝基苯纤维二糖苷)和水杨苷的酶活力时，与测定对pNPG(对硝基苯-β-D-葡萄糖苷)的酶活力的方法相同，测定Bgl7O16对纤维二糖的酶活力时，根据Sigma公司Glucose(GO)AssayKit(GAGO20)试剂盒说明书测定。结果如表5所示。

表5

实施例4、重组Bgl7O16蛋白变异体的活性分析

用一编码序列替换表达载体pET 22b(+)-bgl7O16中的bgl7O16编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第723位为Leu(bgl7O16野生型蛋白中为Ile)。Ile和Leu同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似，该位点变异对酶活性影响不大。

用一编码序列替换表达载体pET 22b(+)-bgl7O16中的bgl7O16编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第65位为Ala(bgl7O16野生型蛋白中为Val)。Ala和Val同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似，该位点变异对酶活性影响不大。

用一编码序列替换表达载体pET 22b(+)-bgl7O16中的bgl7O16编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第26位后面插入为一个氨基酸Gly。Gly为氨基酸中最小的且为中性，插入位点靠近蛋白氨基端，该位点插入对蛋白的三维结构基本没有变化，不会影响酶活。

将上述获得的纯化的重组bgl7O16蛋白变异体如实施例3进行酶活测定，结果发现，它们的酶活与bgl7O16野生型蛋白基本相同，在pH6.5，30℃下的比活力为30-100U/mg。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (21)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组： 

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽； 

(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示但其中第723位为Leu的多肽； 

(c)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示但其中第65位为Ala的多肽；或 

(d)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示但其中第26位后面插入一个氨基酸Gly。 

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其是编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸。 

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽。 

4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或如SEQ ID NO:1中从5’端第77位碱基起的序列片段；所述序列片段由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的引物扩增获得。 

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。 

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。 

7.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含： 

(a)培养权利要求6所述的宿主细胞； 

(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。 

8.权利要求1所述的多肽的用途，用于形成简单糖。 

9.如权利要求8的用途，所述的多肽用于水解糖苷键。 

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的多肽水解选自下述底物的糖苷键：纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷。 

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的底物选自水杨苷、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷或对硝基苯纤维二糖苷。 

12.权利要求1所述的多肽的用途，用于： 

作为以纤维素为原料的乙醇发酵的添加物； 

作为食品工业中调节风味的添加物； 

作为医药保健品的添加物。 

13.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及食品工业上可接受的载体。 

14.如权利要求13的组合物，其特征在于，还含有调节酶活性的添加物。 

15.如权利要求14的组合物，其特征在于，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物，选自：K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺，或可水解形成K⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺的物质。 

16.如权利要求15的组合物，其特征在于，所述的调节酶活性的添加物选自Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺，或可水解形成Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺的物质。 

17.如权利要求14的组合物，其特征在于，所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物：选自Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl，或可水解形成Ag⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、EDTA、Tris-Cl的物质。 

18.如权利要求17的组合物，其特征在于，所述的调节酶活性的添加物选 自Cu²⁺、Ag⁺，或可水解形成Cu²⁺、Ag⁺的物质。 

19.一种形成简单糖的方法，其特征在于，该方法包含：在pH4.5-8.5、温度10-50℃条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。 

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的底物选自：纤维二糖、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷。 

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，用权利要求1所述的多肽处理的同时，还加入调节酶活性的添加物。