CN105821020A

CN105821020A - 一种β-甘露聚糖酶mRmMan5A及其编码基因与应用

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Publication number: CN105821020A
Application number: CN201610324502.9A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 李延啸; 闫巧娟; 徐梦宇; 易萍; 刘学强
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-05-17
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2036-05-17
Also published as: WO2017197546A1; CN105821020B

Abstract

本发明涉及一种β‑甘露聚糖酶mRmMan5A及其编码基因与应用。本发明所述的β‑甘露聚糖酶mRmMan5A，与原始β‑甘露聚糖酶RmMan5A相比具有以下优点：最适pH低，为4.5，最适温度高，为65℃。与以前所报道的β‑甘露聚糖酶相比，在食品、饲料等行业中具有更大的应用价值。将该蛋白的编码基因导入毕赤酵母中构成的工程菌发酵液的β‑甘露聚糖酶的酶活力可达72626U/mL(蛋白含量为9.1mg/mL)，实现了高效表达。将该β‑甘露聚糖酶用于水解汽爆处理后的棕榈粕，水解液中主要为聚合度为2‑4之间的甘露寡糖，甘露寡糖得率为19.6％，甘露聚糖转化率约为60％。

Description

一种β-甘露聚糖酶mRmMan5A及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种β-甘露聚糖酶mRmMan5及其编码基因与应用。

背景技术

β-甘露聚糖是甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的高分子多聚糖，是半纤维素的第二大组成部分。β-甘露聚糖的主链通常由甘露糖组成，期间还会插入一些葡萄糖残基，如葡甘露聚糖；此外，在一些甘露聚糖中还存在以α-1,6-糖苷键连接的半乳糖侧链，如半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(Malgas et al.World Journal ofMicrobiology and Biotechnology,2015,31:1167-1175)。由于甘露聚糖结构复杂，其完全降解需要多种酶的协同作用，如β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)和甘露聚糖乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)等(Moreira et al.Applied Microbiology andBiotechnology,2008,79:165-178)。β-甘露聚糖酶可以随机水解甘露聚糖主链中β-1,4-糖苷键，产生低分子量的甘露寡糖，是甘露聚糖降解酶系中最重要的糖苷水解酶。因此近年来β-甘露聚糖酶被广泛应用于食品、饲料、燃料乙醇等行业中(Chauhan et al.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2012,93:1817-1830)。

β-甘露聚糖酶主要来自糖苷水解酶5、9、26、44、113和134家族，其在细菌、真菌以及高等植物中均有发现(Dhawan et al.Critical Reviews in Biotechnology,2007,27:197-216)。细菌来源的β-甘露聚糖酶主要是中性偏碱性的甘露聚糖酶，而真菌来源的β-甘露聚糖酶一般呈酸性(van Zyl et al.Process Biochemistry,2010,45:1203-1213)。目前已经有许多β-甘露聚糖酶被克隆表达，但这些甘露聚糖酶的酶学性质往往存在一定缺陷，如：最适pH不合适、温度稳定性差、表达量低等，限制了β-甘露聚糖酶在实际生产中的应用。在大部分食品及饲料加工应用中，β-甘露聚糖酶主要在酸性环境下使用，因此，对β-甘露聚糖酶进行定向进化，开发在酸性条件下更加稳定的β-甘露聚糖酶对于其在食品、饲料等工业中应用具有重要意义。

定向进化技术通常不依赖于目的蛋白详细的结构信息，已经广泛地应用于改善酶的酶学性质，如：最适催化条件、稳定性、催化活性等(Wang et al.Bioresource Technology,2012,115:117-125)。易错PCR和DNA改组技术是定向进化技术中最主要的两种技术手段。易错PCR是指在体外扩增目的基因时以一定的频率在基因内部引入点突变，由于突变只发生在单一分子内部，属于无性进化。而DNA改组技术则是利用重叠延伸PCR技术，将已获得的存在于不同基因中的多突变信息随机重组到同一个DNA分子，形成新的基因随机突变库，属于有性进化。目前，已有一些β-甘露聚糖酶通过定向进化技术优化了酶学性质，使其更加适合于工业应用，如来源于成团泛菌(Wanget al.Journal of Biotechnology,2013,167:350-356)和柄孢霉(Couturier et al.PLoS one,2013,8:e7980011)的β-甘露聚糖酶。

甘露寡糖是指由2-10个单糖通过糖苷键连接而成的寡糖，具有稳定、低热量、不引发龋齿、降血糖等特点，是新一代功能性食品，受到国内外研究者的关注。此外，甘露寡糖还可以有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道有益菌群的增殖，抑制病原菌的生长，具有改善肠道内菌群结构、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏等多种生理功能。目前，利用酶法制备低聚甘露糖的底物主要为富含甘露聚糖的植物胶类。其中，以魔芋粉与瓜尔豆胶为原料制备甘露寡糖最为广泛(Zang et al.Enzyme and Microbial Technology,2015,78:1-9；Kurakake et al.Journal of Agriculture and FoodChemistry,2006,54:7885-7889)。中国专利申请号200810237785.9、200910014349.X、201310428885.0、201510175978.6和201510465107.8中公开的生产甘露寡糖所用的原料均为槐豆胶、魔芋粉、瓜尔豆胶等植物胶类。此外，一些富含甘露聚糖的农业废弃物，如：椰子粕、咖啡渣、棕榈粕等，也是制备甘露寡糖的良好底物，但是有关报道相对较少(Chiyanzu et al.Applied Biochemistry andBiotechnology,2014,172:3538-3557；Ghosh et al.MolecularBiotechnology,2015,57:111-127)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β-甘露聚糖酶mRmMan5A及其编码基因与应用，该β-甘露聚糖酶mRmMan5A与原始β-甘露聚糖酶RmMan5A相比具有以下优点：最适pH低，最适温度高，在食品、饲料等行业中具有更大的应用价值。

本发明所提供的蛋白mRmMan5A，是对来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432(一株能够分泌多种糖苷水解酶的嗜热丝状真菌，其分泌的β-甘露聚糖酶具有多种优良的酶学性质(Katrolia et al.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61:394-401))的β-甘露聚糖酶基因(RmMan5A，GenbankAGC24277.1)进行体外分子随机突变和重组得到的，具有β-甘露聚糖酶功能，为如下(1)或(2)或(3)或(4)的蛋白质：

(1)序列表序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)序列表序列3自氨基末端第20至378位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(3)在所述(2)的氨基末端添加Poly-His标签的蛋白质；具体为在所述(2)的氨基末端添加MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS组成的蛋白质。

(4)将所述(1)或(2)或(3)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有相同功能的由(1)或(2)或(3)衍生的蛋白质。

为了使(1)或(2)或(3)或(4)中的蛋白质便于纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基数	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白质的编码基因可通过将序列表序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明保护上述蛋白质的编码基因。

所述编码基因为以下(a)或(b)或(c)或(d)的DNA分子：

(a)序列表序列4所示的DNA分子；

(b)序列表序列4的第58至1137位所示的DNA分子；

(c)在严格条件下与(a)或(b)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(d)与(a)或(b)或(c)限定的DNA分子具有至少75％的序列同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

本发明保护含有以上任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明保护扩增以上任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对。

本发明保护上述蛋白质在水解具有β-1,4糖苷键连接的甘露聚糖中的应用，或上述蛋白质在作为β-甘露聚糖酶中的应用。

所述具有β-1,4糖苷键连接的甘露聚糖具体可为槐豆胶。

在上述应用中，所述水解的pH值可为3—8.5；具体可为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5；或上述任两个所述点值间的范围值如3—8；或3.5—7.5；或4—7；或4—6.5；或4—4.5；或4.5—5内的pH值；

和/或，所述水解的温度为30—85℃；具体可为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃；或上述任两个所述点值间的范围值如30—65℃；或65—80℃；或45—75℃；或55—65℃；或65—70℃；或30—60℃；或30—50℃内的温度。

在上述应用中，所述应用具体可为在制备甘露寡糖中的应用。

在上述应用中，所述制备甘露寡糖为以棕榈粕为原料进行。

本发明保护上述蛋白质、编码基因及重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备β-甘露聚糖酶中的应用。

所述在制备β-甘露聚糖酶中的应用具体可为一种制备β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组菌，得到β-甘露聚糖酶；所述重组菌具体可为含有所述重组载体的巴斯德毕赤酵母GS115，具体可为重组菌乙。

本发明所述的β-甘露聚糖酶mRmMan5A，与原始β-甘露聚糖酶RmMan5A相比具有以下优点：最适pH低，最适温度高。与以前所报道的β-甘露聚糖酶相比，在食品、饲料等行业中具有更大的应用价值。该酸性β-甘露聚糖酶mRmMan5A的最适pH为4.5，最适温度为65℃。将该蛋白的编码基因导入毕赤酵母中构成的工程菌(即重组菌乙)在5L发酵罐中高密度发酵，发酵液的β-甘露聚糖酶的酶活力可达72626U/mL(蛋白含量为9.1mg/mL)，实现了高效表达。将该β-甘露聚糖酶用于水解汽爆处理后的棕榈粕，水解液(即上清液)中主要为聚合度为2-4之间的甘露寡糖，甘露寡糖得率为19.6％，甘露聚糖转化率约为60％。本发明为β-甘露聚糖酶的蛋白质工程改造提供了重要方法，也为酸性β-甘露聚糖酶在甘露寡糖制备中的应用提供了重要依据。

附图说明

图1为重组蛋白mRmMan5A的纯化电泳图。

图2为重组蛋白mRmMan5A和RmMan5A作为β-甘露聚糖酶的最适pH测定曲线图。

图3为重组蛋白mRmMan5A和RmMan5A作为β-甘露聚糖酶的pH稳定性测定曲线图。

图4为重组蛋白mRmMan5A和RmMan5A作为β-甘露聚糖酶的最适温度测定曲线图。

图5为重组蛋白mRmMan5A和RmMan5A作为β-甘露聚糖酶的温度稳定性测定曲线图。

图6为毕赤酵母高密度发酵分泌β-甘露聚糖酶mRmMan5A历程。

图7为重组蛋白mRmMan5A水解汽爆棕榈粕过程中甘露寡糖各组分含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中β-甘露聚糖酶酶活测定方法如下：

取0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.9mL 0.5％(质量体积比)的槐豆胶底物溶液中(用50M，pH 4.5的柠檬酸磷酸缓冲液配制)，65℃水浴反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定所释放的还原糖量，以甘露糖作为标准。

β-甘露聚糖酶的活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol的还原糖(以甘露糖计)所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。

比酶活定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

1个β-甘露聚糖酶酶活单位的定义：在pH 4.5、65℃条件下，每分钟分解0.5％槐豆胶底物释放1μmol的甘露糖所需要的酶量，酶活计算公式为：H＝Cx×n/(T×V)，其中，H代表酶活力(U/mL)，Cx代表生成甘露糖物质的量(μmol)，n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间(min)，V代表加入稀释后的酶液体积(mL)。

实施例1、β-甘露聚糖酶基因的定向进化

一、β-甘露聚糖酶基因(RmMan5A)的随机突变

1、易错PCR

对米黑根毛霉β-甘露聚糖酶的野生型基因(如序列表的序列2所示)进行序列分析，发现该基因5’端包含编码19个氨基酸残基组成的信号肽的序列。根据米黑根毛霉β-甘露聚糖酶的成熟蛋白编码区(即去掉信号肽编码序列)设计易错PCR引物RmMan5AF和RmMan5AR。引物序列如下：

RmMan5AF：5’-CGCGGATCCGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG-3’；下划线所示的序列为BamHI酶切识别位点；下划线后的序列与序列表序列2或4的第58至80位序列相同；

RmMan5AR：5’-CCGCTCGAGTCACTTCTTGGCCATGGCATCAGC-3’；下划线所示序列为XhoI酶切识别位点；下划线后的序列与序列表序列2或4的第1137至1114位序列相匹配。

以米黑根毛霉CAU432cDNA为模板，用RmMan5AF和RmMan5AR组成的引物对进行易错PCR扩增，得到PCR扩增产物。

易错PCR体系(50μL)：7mmol/L Mg²⁺，0.2mmol/L Mn²⁺，0.2mmol/LdATP，0.2mmol/L dGTP，1mmol/L dCTP，1mmol/L dTTP，0.2μmol/LRmMan5AF，0.2μmol/L RmMan5AR，2.5U Taq DNA聚合酶，20ng cDNA。

易错PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃总延伸5min。

2、DNA片段化

用DNase I对步骤1的PCR扩增产物进行酶切处理。

酶切体系(100μL)：8mmol/L Mg²⁺，0.67mmol/L Mn²⁺，8μg PCR扩增产物，0.0252U DNase I。

酶切条件：20℃反应15min，加入2.5mmol/L EDTA终止反应，90℃保温10min灭活DNase I。

回收纯化40-60bp左右的DNA片段。

3、获得随机突变体库

(1)重叠延伸PCR

将步骤2的DNA片段作为模板，进行重叠延伸PCR，得到重叠延伸PCR产物。

重叠延伸PCR体系(50μL)：0.2mmol/L dNTP，1.5mmol/L MgSO₄，8μL(约2μg)模板，1U Pfu DNA聚合酶。

重叠延伸PCR条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸2min，10个循环，72℃总延伸5min。

(2)全长PCR

以步骤(1)的重叠延伸PCR扩增产物为模板，用RmMan5AF和RmMan5AR组成的引物对进行全长PCR，得到PCR扩增产物(随机突变体库)。

全长PCR体系(50μL)：0.2mmol/L dNTP，1.5mmol/L MgSO₄，0.2μmol/L RmMan5AF，0.2μmol/L RmMan5AR，1μL(50-100ng)模板，1U Pfu DNA聚合酶。

全长PCR条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃总延伸5min。

4、获得突变体表达文库

(1)用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤3的随机突变体库，回收酶切产物。

(2)用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切pET-28a(+)载体，回收酶切产物中的载体骨架。

(3)将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，利用电转化法将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，收集所有转化子，即为突变体表达文库。随机挑选10个转化子进行测序分析，突变率约为0.72％。

二、突变体表达文库定向筛选

1、将步骤一的突变体表达文库适当稀释后均匀涂布于LB平板(含50μg/mL卡那霉素)，37℃培养24h。

2、收集步骤1平板上的菌落，编号，转移至筛选平板(含有0.5％槐豆胶、1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和50μg/mL卡那霉素的LB平板)，37℃培养1天。

3、将步骤2中的筛选平板于60℃放置1h，使菌体裂解，然后用0.1％刚果红溶液染色15min后，用1mol/L NaCl溶液脱色；通过透明圈对应菌落相应编号，从原平板上挑取相应菌落，进行步骤4复筛。

4、将步骤3得到的菌株进行酶学性质鉴定，具体方法如下：

将采用相同培养条件得到的各菌株的发酵液于10000×g离心5min，菌体用蒸馏水重悬，超声破壁后10000×g离心10min取上清液(粗酶液)。在测定温度为55℃条件下，分别用不同pH的柠檬酸磷酸缓冲液测定粗酶液酶活力。在测定pH值为7.0的条件下，分别在不同温度下测定粗酶液酶活力。

在pH小于7.0和温度高于55℃的条件下，如果突变菌株的粗酶液β-甘露聚糖酶酶活力高于对照菌(该对照菌是将序列表的序列2自5’末端第58至1137位核苷酸所示的DNA片段插入pET-28a(+)载体的BamHI和XhoI酶切位点间得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌)的粗酶液，则该菌株即为正突变子。经复筛，得到1个正突变子。

5、将正突变子提取质粒进行测序，质粒中插入的DNA片段序列与RmMan5A基因(序列表序列2第1至1137位)对比，有5个核苷酸发生突变，分别为T→C(序列表的序列2自5’末端第754位核苷酸)、T→C(序列表的序列2自5’末端第840位核苷酸)、A→T(序列表的序列2自5’末端第848位核苷酸)、A→G(序列表的序列2自5’末端第1011位核苷酸)、A→G(序列表的序列2自5’末端第1085位核苷酸)，即序列表的序列2所示的RmMan5A基因突变为序列表的序列4所示的DNA，将其命名为mRmMan5A基因；以上核苷酸突变引起了序列表的序列1所示蛋白质的三个氨基酸残基发生突变，分别为Y→H(序列表的序列1自N末端第252位氨基酸残基)、K→M(序列表的序列1自N末端第283位氨基酸残基)、N→S(序列表的序列1自N末端第362位氨基酸残基)，即序列表的序列1所示的RmMan5A蛋白质突变为序列表的序列3所示的蛋白质，将序列表的序列3所示的蛋白质命名为mRmMan5A蛋白质。该正突变子即将重组载体甲(即在质粒pET-28a(+)的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第58至1137位核苷酸序列所示的DNA片段)转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌甲。

实施例2、β-甘露聚糖酶的制备及其酶学性质测定

一、重组蛋白制备

1、重组蛋白的诱导表达

将重组菌甲或对照菌接种至液体LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)振荡培养(37℃，200rpm)，至OD₆₀₀达到0.6-0.8之间，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃诱导培养过夜，10000×g收集菌体，重悬后超声破碎，10000×g离心10min，收集上清液即为粗酶液。

2、重组蛋白的纯化

使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白。具体步骤如下：

用缓冲液A平衡Ni-IDA亲和柱5-10个柱体积，将步骤1得到的重组菌甲或对照菌的粗酶液以0.5mL/min流速上样，分别用缓冲液A和缓冲液B以1mL/min流速洗脱至OD₂₈₀<0.05，最后以缓冲液C洗脱并收集目的蛋白质，得到纯化产物。

其中，缓冲液A为含有NaCl(300mmol/L)和咪唑(20mmol/L)的磷酸缓冲液(pH 8.0)；

缓冲液B为含有NaCl(300mmol/L)和咪唑(50mmol/L)的磷酸缓冲液(pH 8.0)；

缓冲液C为含有NaCl(300mmol/L)和咪唑(200mmol/L)的磷酸缓冲液(pH 8.0)。

重组菌甲的粗酶液得到的纯化产物为重组蛋白mRmMan5A(其氨基酸序列为在序列表序列3中第20至378位所示氨基酸序列的氨基末端添加了MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS)，对照菌的粗酶液得到的纯化产物为重组蛋白RmMan5A(其氨基酸序列为在序列表序列1中第20至378位所示氨基酸序列的氨基末端添加了MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS)。

重组菌甲的粗酶液及其得到的纯化产物(重组蛋白mRmMan5A)的SDS-PAGE纯化图如图1所示。

图1中，泳道M为分子量标准，1为重组菌甲的粗酶液，2为重组菌甲的粗酶液的纯化产物即重组蛋白mRmMan5A。图1的结果表明，重组蛋白mRmMan5A的大小为44kDa，与预期大小一致。

二、重组蛋白mRmMan5A作为β-甘露聚糖酶的酶学性质

1、最适pH的测定

将实施例2步骤一制备的重组蛋白RmMan5A的水溶液和mRmMan5A的水溶液作为待测酶液，将其分别在不同pH的缓冲液条件下进行酶活测定。各种缓冲液具体如下：

1)柠檬酸磷酸缓冲液(pH 3.0-7.0)；

2)醋酸缓冲液(pH 4.0-6.0)；

3)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)；

4)Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液(pH 7.0-9.0)；

5)CHES(1-环己氨基乙磺酸)缓冲液(pH 8.0-10.0)；

6)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5-11.0)。

测定RmMan5A酶活力时反应温度为55℃，测定mRmMan5A酶活力时反应温度为65℃。在不同缓冲液存在重叠pH的情况下，选择酶活力较高的结果作为该pH下的结果。将RmMan5A在最适pH下的酶活力作为100％，计算其他pH下RmMan5A的相对酶活(％)；将mRmMan5A在最适pH下的酶活力作为100％，计算其他pH下mRmMan5A的相对酶活(％)，结果如图2所示。

图2中：方形点代表RmMan5A的结果，RmMan5A在55℃条件下的最适pH为7.0；圆形点代表mRmMan5A的结果，mRmMan5A在65℃的最适pH为4.5。

2、pH稳定性测定

将实施例2步骤一制备的重组蛋白RmMan5A的水溶液和mRmMan5A的水溶液分别用步骤1中的缓冲液进行稀释，置于50℃水浴锅中处理30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经上述50℃保温处理的RmMan5A和mRmMan5A的酶活力分别作为100％，计算经过不同pH处理后RmMan5A和mRmMan5A的相对酶活。

测定RmMan5A酶活力的条件为：50mmol/L柠檬酸磷酸缓冲液(pH7.0)反应温度55℃。

测定mRmMan5A酶活力的条件为：50mmol/L柠檬酸磷酸缓冲液(pH4.5)反应温度65℃。

结果如图3所示：方形点代表RmMan5A的结果，圆形点代表mRmMan5A的结果，RmMan5A和mRmMan5A在酸性环境下pH稳定性基本一致，在碱性换环境下RmMan5A的稳定性好于mRmMan5A。

3、最适温度的测定

将实施例2步骤一制备的重组蛋白RmMan5A和mRmMan5A用各自最适pH缓冲液适当稀释后，分别在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃)测定各自酶活力。以RmMan5A和mRmMan5A在各自最适温度下的酶活力为100％，计算其他温度下RmMan5A和mRmMan5A的相对酶活(％)。

结果如图4所示：方形点代表RmMan5A的结果，圆形点代表mRmMan5A的结果，RmMan5A的最适温度为55℃，mRmMan5A的最适温度为65℃。

4、温度稳定性的测定

将实施例2步骤一制备的重组蛋白RmMan5A的水溶液和mRmMan5A的水溶液用各自最适pH缓冲液适当稀释后，分别在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃)保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经上述不同温度保温处理的RmMan5A和mRmMan5A的酶活力分别作为100％，计算经过不同温度保温处理后RmMan5A和mRmMan5A的相对酶活(％)。测定RmMan5A酶活力的条件为：50mmol/L柠檬酸磷酸缓冲液(pH 7.0)反应温度55℃。测定mRmMan5A酶活力的条件为：50mmol/L柠檬酸磷酸缓冲液(pH 4.5)反应温度65℃。

结果如图5所示：方形点代表RmMan5A的结果，圆形点代表mRmMan5A的结果，RmMan5A和mRmMan5A的温度稳定性基本一致，在55℃以下保持稳定。

实施例3、毕赤酵母高密度发酵表达重组蛋白mRmMan5A

一、重组菌的获得

1、以实施例1获得的正突变子所提取质粒(含mRmMan5A基因)为模板，采用mRmMan5AF和mRmMan5AR引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

mRmMan5AF：5’-CCATGTACGTAGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG-3’；下划线所示的序列为SnaBI酶切识别位点；下划线后的序列与序列表序列2或4的第58至80位序列相同；

mRmMan5AR：5’-CCGCCTAGGTCACTTCTTGGCCATGGCATC-3’；下划线所示的序列为AvrII酶切识别位点；下划线后序列与序列表序列2或4的第1117至1137位序列相匹配。

2、用限制性内切酶SnaBI和AvrII对步骤1得到的PCR扩增产物进行双酶切，回收酶切后的DNA片段；用限制性内切酶SnaBI和AvrII对pPIC9K载体进行双酶切，回收酶切后的骨架载体；将DNA片段与骨架载体连接，得到重组载体乙(即在pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第58至1137位核苷酸所示的DNA片段)。

3、将重组载体乙转化巴斯德毕赤酵母GS115，得到含有重组载体乙的重组菌乙。

二、重组菌乙的发酵

1、发酵方法

发酵方法参照文献“Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B,053002,Invitrogen)”中的方法。发酵采用5L发酵罐。种子培养基、发酵基本培养基、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基参照上述文献中的方法配制。整个发酵过程采用分批培养、甘油分批补料培养、100％甲醇诱导培养三个阶段。

2、发酵结果

检测发酵过程中上清液(含重组蛋白mRmMan5A，其氨基酸序列为在序列表序列3中第20至378位所示氨基酸序列)中β-甘露聚糖酶的酶活力。酶活力测定条件：50mmol/L柠檬酸磷酸缓冲液(pH 4.5)，反应温度65℃。

发酵过程中，重组菌乙生长及分泌β-甘露聚糖酶历程如图6所示。图6中，三角形点代表菌体湿重(g/L)；方形点代表发酵液酶活力(U/mL)；圆形点代表发酵液蛋白浓度(mg/mL)。

结果表明，经过168h发酵，重组菌乙的发酵上清液中β-甘露聚糖酶的酶活力达到72626U/mL，发酵液蛋白含量达到9.1mg/mL，菌体湿重达465g/L。

实施例4、重组蛋白mRmMan5A作为β-甘露聚糖酶在制备甘露寡糖中的应用

1、将棕榈粕于40℃干燥24h，取500g干燥后的棕榈粕与一定量蒸馏水混合至终含水率为50％，静置过夜后，进行汽爆处理，汽爆条件：1.5MPa，保温7.5min。

2、取汽爆后的棕榈粕，按照料水比1:5调浆，调节pH至4.5，每克棕榈粕加入实施例2步骤一或实施例3步骤二中制备的重组蛋白mRmMan5A 200U(即200个β-甘露聚糖酶酶活单位)，50℃下水解0—24h，加热至100℃灭酶10min。取2mL酶解液，10000×g离心5min，取上清液。

3、在水解0、1、2、4、6、8、12、24h时，分别用高效液相色谱法(HPLC)检测上清液中甘露寡糖组分及含量。色谱条件：色谱柱为Sugar-D，柱温35℃，流动相为75％乙腈，流速为1ml/min，示差检测器。

实施例2步骤一制备的重组蛋白mRmMan5A在不同水解时间上清液中甘露寡糖含量如图7所示。结果表明：上清液中主要为聚合度2-4之间的甘露寡糖。最终，甘露寡糖得率为19.6％，其中，甘露糖得率0.3％，甘露二糖得率9.6％，甘露三糖得率为8.6％，甘露四糖得率为1.2％(图7未示出)。棕榈粕中甘露聚糖制备甘露寡糖转化率约为60％。

实施例3步骤二制备的重组蛋白mRmMan5A在不同水解时间上清液中甘露寡糖含量结果与图7所示结果相同。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims

1.一种蛋白质，是以下(1)或(2)或(3)或(4)的蛋白质：

(1)序列表序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(3)在所述(2)的氨基末端添加Poly-His标签的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为以下(a)或(b)或(c)或(d)的DNA分子：

(a)序列表序列4所示的DNA分子；

(b)序列表序列4的第58至1137位所示的DNA分子；

(c)在严格条件下与(a)或(b)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

(d)与(a)或(b)或(c)限定的DNA分子具有至少75％的序列同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。

6.权利要求1所述蛋白质在水解具有β-1,4糖苷键连接的甘露聚糖中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述水解的pH值为3—8.5；

和/或，所述水解的温度为30—85℃。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述应用为在制备甘露寡糖中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述制备甘露寡糖为以棕榈粕为原料进行。

10.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述编码基因及权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备β-甘露聚糖酶中的应用。