CN104498456A - 一种酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新颖的嗜热真菌Talaromyces leycettanus来源的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和应用。本发明提供了一种新的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B最适pH为4.5，最适温度为65℃；在60℃处理1h基本不失活，具有很好的热稳定性；在pH 3-9条件下处理1h能够保留90％以上的活性，具有很好的pH耐受性。该酶优越的稳定性使其在能源、食品和饲料方面具有很好的应用潜力。

Description

一种酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和应用。

背景技术

纤维素是多个葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖，后者可作为重要的工业原料来生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖的三类酶的总称，即内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又称纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。这三种酶协同作用能够将纤维素转化成葡萄糖。

β-葡萄糖苷酶的分布较为广泛，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍。对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在丝状真菌、酵母、细菌、链霉菌等。β-葡萄糖苷酶在生物技术应用和生物转化方面也有很重要的应用，在纤维素水解为还原糖的过程中，依靠内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用，然而β-葡萄糖苷酶最终把纤维二糖解离成单个的葡萄糖分子,是整个纤维素降解过程的限速步骤，β-葡萄糖苷酶活力较低就会造成纤维二糖的大量积累，积累的纤维二糖对纤维素内切和外切酶有很强烈的抑制作用，所以β-葡萄糖苷酶其性质和酶活力的高低在纤维素水解的过程中决定着总体酶活力。

已经报道的β-葡萄糖苷酶pI大多在酸性范围内，最适的pH值一般在3.5～5.5之间，以pH 4.5居多。很多的生物应用过程中均需要在酸性环境中进行，比如酸处理后的汽爆秸秆粉，纺织和造纸工业以及工农业废料和残留物的处理等，对反应环境的要求很高，需要在耐酸和高温条件下进行反应。本发明的酸性β-葡萄糖苷酶来源于蓝状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)，可适应复杂的反应环境，具有较好的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于能源、食品和饲料用途的酸性β-葡萄糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述β-葡萄糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述β-葡萄糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述β-葡萄糖苷酶的应用。

本发明从嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces leycettanus)中分离得到一种新的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B，并构建了能够高效表达此β-葡萄糖苷酶的重组酵母菌株。

本发明提供了一种酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B，其氨基碱序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MRLGWLEVAALAVATVADAKDLAYCPPFYPSPWADGNGEWAEAHSRAVEFVSGLTLAEKVNLTTGVGWMGETCVGNTGSIPRLGFWGFCAQDSPLGVRDTDYNSAFPAGVNVAATWDKNLAYLRGRAMGEEHRDKGVDVQLGPVAGPLGRAPEGGRNWEGFGPDPVLTGQLMAETIKGIQDVGVIACAKHFILNEQEHFRQVGEAQGYGYNITQAISSNIDDKTLHELYLWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCSNSYTMNKLLKGELNFQGFIMSDWQAHKSGVGDALAGLDMSMPGDTTFNTGESYWGTNLTIAVLNGTIPEWRIDDMAVRIMSAFYKVGRDHVRTPPNFSSWTTDEYGYEHAAVNQGYTKVNDRVDVRSNHKDIIRQVGSSSVVLLKNQWGALPLTGKEKLVGIMGEDAGSNAYGVNGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLITPEQAIQWEVIESGGEVFAITDNGALDQMASVASQASVSLVFVNADSGEGYINVDGNEGDRKNLTLWKNGDEVIKTVAANCNNTIVVMHTVGPVLVTEWYDNPNITAILWAGLPGEQSGNSLVDVLYGRVNPGGKTPFTWGKSFDSWGSHVMTTPNNGNDAPQLDFSEGVFIDYRWFDKNNETPIYEFGYGLSYTTFKYSNLQVTPLNAPKYTPASGKTDPAPSFGQPGSASQYVFPRTLNRIYEYIYPWLNSTNLRESSGDPDYGMKASAYIPAGATDGSAQELLPASGAPGGNPGLYDELFRVSATITNTGKVAGDEVPQLYVSLGGPNDPKVVLRNFDRINIAPGQSVEWTTTLTRRDLSNWDVAAQDWVISKYPKTVYVGSSSRKLPLQATLPQVN

其中，该酶包括860个氨基酸，N端19个氨基酸为其信号肽序列“mrlgwlevaalavatvada”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B的理论分子量为91.33kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

KDLAYCPPFYPSPWADGNGEWAEAHSRAVEFVSGLTLAEKVNLTTGVGWMGETCVGNTGSIPRLGFWGFCAQDSPLGVRDTDYNSAFPAGVNVAATWDKNLAYLRGRAMGEEHRDKGVDVQLGPVAGPLGRAPEGGRNWEGFGPDPVLTGQLMAETIKGIQDVGVIACAKHFILNEQEHFRQVGEAQGYGYNITQAISSNIDDKTLHELYLWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCSNSYTMNKLLKGELNFQGFIMSDWQAHKSGVGDALAGLDMSMPGDTTFNTGESYWGTNLTIAVLNGTIPEWRIDDMAVRIMSAFYKVGRDHVRTPPNFSSWTTDEYGYEHAAVNQGYTKVNDRVDVRSNHKDIIRQVGSSSVVLLKNQWGALPLTGKEKLVGIMGEDAGSNAYGVNGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLITPEQAIQWEVIESGGEVFAITDNGALDQMASVASQASVSLVFVNADSGEGYINVDGNEGDRKNLTLWKNGDEVIKTVAANCNNTIVVMHTVGPVLVTEWYDNPNITAILWAGLPGEQSGNSLVDVLYGRVNPGGKTPFTWGKSFDSWGSHVMTTPNNGNDAPQLDFSEGVFIDYRWFDKNNETPIYEFGYGLSYTTFKYSNLQVTPLNAPKYTPASGKTDPAPSFGQPGSASQYVFPRTLNRIYEYIYPWLNSTNLRESSGDPDYGMKASAYIPAGATDGSAQELLPASGAPGGNPGLYDELFRVSATITNTGKVAGDEVPQLYVSLGGPNDPKVVLRNFDRINIAPGQSVEWTTTLTRRDLSNWDVAAQDWVISKYPKTVYVGSSSRKLPLQATLPQVN

本发明筛选到Talaromyces leycettanus JCM12802所产生的一种第3家族β-葡萄糖苷酶，其最适pH为4.5，最适温度为65℃；在60℃处理1h基本不失活，具有很好的热稳定性；在pH 3-9条件下处理1h能够保留90％以上的活性，具有很好的pH稳定性。

本发明提供了编码上述酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atgaggcttgggtggcttgaggtggccgcacttgcggttgccaccgttgctgatgccaaggacctggcttattgtcccccattctacccgtcaccatgggcagacggcaatggagagtgggcgggggctcacagtcgtgccgtggaatttgtgtcaggcctcacgcttgctgagaaggtcaatctcacgactggtgttgggtaggtcgactgtgattcctccatttccaagggcaaaccgttgttttcatgagccattttttactgatatcacatagttggatgggagaaacgtgtgtcggtaataccggtagcattcccagactcggattttggggattttgcgcccaagattctccccttggtgttcgagacagtaaggctcttccttgagttgtctgctttcttcactgtcttttattgacattcctcctccagctgattacaattccgctttccccgcgggtgtcaatgttgccgctacctgggacaagaaccttgcctacctccggggtagagccatgggtgaagaacacccaaacaaaagcgcggacgtccaaacccgcccaggaccgggcaatcgaggcaggacaccagaaaggggaagaaacagggagggcttagggcctgaccctgtcttgaccggtcaattgatggcggagaccatcaagggtattcaggatgtcggtgttattgcctgtgcaaagcatgacagcccaaacgagcacgaacaccatcgccaggttggggaggctcaaggctatggctacaatattacgcaagccattagctccaacattgacgacaagacccttcacgaattgtacctgtggccctttgcggatgccgtgcgtgctggcgtgggctcggtgatgtgctcttacaaccagatcaacaacagttacggatgctcgaacagctacacgatgaacaagctgctcaaaggtgaactcaactttcagggcttcatcatgagcgactggcaggcgcataaaagtggtgttggcgacgccttggctggtctggacatggccatgccgggtgacactaccttcaacaccggagagtcctactggggcaccaacctgactattgccgtcttgaacggcaccatccctgagtggcgtattgacgacatggccgtccgcatcatgtcggctttctacaaggtcggccgtgaccgtgtccgcactcctccaaacttcagctcatggaccaccgacgaatatggctacgagcatgctgctgtcaaccagggctatacgaaggtcaacgacagagttgatgtgcgctctaaccataaagatattattcgccaggttggctcttccagcgtcgtccttttgaaaaaccagtggggagcacttcccttgactggcaaggagaagcttgttggtatcatgggtgaagacgcaggatccaatgcttatggcgttaatggctgcagtgaccgcggctgcgacaacggcactttggccatgggctggggcagtggcaccgcaaacttcccttacctcatcactcccgagcaggccatccaatgggaagtcatcgagagcgggggtgaggtcttcgcgatcaccgacaacggggcccttgaccagatggcgtctgttgcatctcaggctagcgtgtcccttgtgttcgtgaacgccgactctggagaaggttacatcaatgtcgatggcaatgagggagatcgtaagaacctcactctctggaagaacggagatgaggttatcaagactgtcgcggccaactgcaacaacaccattgtggtgatgcataccgccggacctgttcttgtcactgagtggtacgacaaccccaacatcaccgcaattctctgggctggtcttcctggcgagcagagcggcaactctttggtcgatgtgctctacggccgtgtcaaccctggcggcaagactccattcacctggggcaagagtttcgactcgtggggttctcatgtaatgactacgcccaacaacggcaatgatgcgccacagctggatttctcggaaggcgttttcatcgactacagatggtttgacaagaacaacgagactcccatttacgagttcggttacggtctgagctacaccacgttcaagtactccaaccttcaggtcacgcccttgaatgcccccaagtacacccctgctagtggaaagaccgaccctgctcccagtttcggacagcctggcagcgcgtcccaatatgtgttcccacgtacactgaacagaatctacgagtacatctacccgtggttgaactcgaccaacctcagggagtcgtcgggagatcccgactatggcatgaaggcgtctgcatacatcccggccggcgcaacagatggatctgcgcaagagctgcttccagccagcggtgctcctggtggcaaccctggtctttatgacgagctgttcagggtctctgctaccatcactaacaccggcaaagtcgctggtgatgaggttccccaattgtatgtctctcttggcggtcctaacgaccccaaggttgttctccgcaacttcgaccgcatcaacattgctccgggccagtccgtcgagtggactaccactctgacccgacgtgacctctccaactgggatgttgcggcccaggactgggtcattagcaagtaccccaagacggtctatgttggtagctcttctcgcaagcttcctctgcaggcgacattgcctcaggtcaactga

本发明基于PCR的方法分离克隆了β-葡萄糖苷酶基因bgl3B，DNA全序列分析结果表明，去除内含子后的β-葡萄糖苷酶基因bgl3B cDNA全长2583bp。其中，信号肽的碱基序列为：

atgaggcttgggtggcttgaggtggccgcacttgcggttgccaccgttgctgatgcc(SEQ ID NO.6)。

成熟的β-葡萄糖苷酶基因Bgl3B的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

aaggacctggcttattgtcccccattctacccgtcaccatgggcagacggcaatggagagtgggcggaggctcacagtcgtgccgtggaatttgtgtcaggcctcacgcttgctgagaaggtcaatctcacgactggtgttggttggatgggagaaacgtgtgtcggtaataccggtagcattcccagactcggattttggggattttgcgcccaagattctccccttggtgttcgagacactgattacaattccgctttccccgcgggtgtcaatgttgccgctacctgggacaagaaccttgcctacctccggggtagagccatgggtgaagaacaccgtgacaaaggcgtggacgttcaacttggcccagtcgctggtcctctcggcagagcgcccgaaggtggcagaaactgggagggcttcggtcctgaccctgtcttgaccggtcaattgatggcggagaccatcaagggtattcaggatgtcggtgttattgcctgtgcaaagcattttatcctcaacgagcaggagcactttcgccaggttggggaggctcaaggctatggctacaatattacgcaagccattagctccaacattgacgacaagacccttcacgaattgtacctgtggccctttgcggatgccgtgcgtgctggcgtgggctcggtgatgtgctcttacaaccagatcaacaacagttacggatgctcgaacagctacacgatgaacaagctgctcaaaggtgaactcaactttcagggcttcatcatgagcgactggcaggcgcataaaagtggtgttggcgacgccttggctggtctggacatgtcgatgccgggtgacactaccttcaacaccggagagtcctactggggcaccaacctgactattgccgtcttgaacggcaccatccctgagtggcgtattgacgacatggccgtccgcatcatgtcggctttctacaaggtcggccgtgaccatgtccgcactcctccaaacttcagctcatggaccaccgacgaatatggctacgagcatgctgctgtcaaccagggctatacgaaggtcaacgacagagttgatgtgcgctctaaccataaagatattattcgccaggttggctcttccagcgtcgtccttttgaaaaaccagtggggagcacttcccttgactggcaaggagaagcttgttggtatcatgggtgaagacgcaggatccaatgcttatggcgttaatggctgcagtgaccgcggctgcgacaacggcactttggccatgggctggggcagtggcaccgcaaacttcccttacctcatcactcccgagcaggccatccaatgggaagtcatcgagagcgggggtgaggtcttcgcgatcaccgacaacggggcccttgaccagatggcgtctgttgcatctcaggctagcgtgtcccttgtgttcgtgaacgccgactctggagaaggttacatcaatgtcgatggcaatgagggagatcgtaagaacctcactctctggaagaacggagatgaggttatcaagactgtcgcggccaactgcaacaacaccattgtggtgatgcataccgtcggacctgttcttgtcactgagtggtacgacaaccccaacatcaccgcaattctctgggctggtcttcctggcgagcagagcggcaactctttggtcgatgtgctctacggccgtgtcaaccctggcggcaagactccattcacctggggcaagagtttcgactcgtggggttctcatgtaatgactacgcccaacaacggcaatgatgcgccacagctggatttctcggaaggcgttttcatcgactacagatggtttgacaagaacaacgagactcccatttacgagttcggttacggtctgagctacaccacgttcaagtactccaaccttcaggtcacgcccttgaatgcccccaagtacacccctgctagtggaaagaccgaccctgctcccagtttcggacagcctggcagcgcgtcccaatatgtgttcccacgtacactgaacagaatctacgagtacatctacccgtggttgaactcgaccaacctcagggagtcgtcgggagatcccgactatggcatgaaggcgtctgcatacatcccggccggcgcaacagatggatctgcgcaagagctgcttccagccagcggtgctcctggtggcaaccctggtctttatgacgagctgttcagggtctctgctaccatcactaacaccggcaaagtcgctggtgatgaggttccccaattgtatgtctctcttggcggtcctaacgaccccaaggttgttctccgcaacttcgaccgcatcaacattgctccgggccagtccgtcgagtggactaccactctgacccgacgtgacctctccaactgggatgttgcggcccaggactgggtcattagcaagtaccccaagacggtctatgttggtagctcttctcgcaagcttcctctgcaggcgacattgcctcaggtcaactga

成熟蛋白理论分子量为91.33kDa，将β-葡萄糖苷酶基因bgl3B成熟编码序列及推导出的氨基酸序列进行BLAST比对，确定Bgl3B是一种新的β-葡萄糖苷酶。

本发明提供了包含上述酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B的重组载体，选为pPIC-bgl3B。将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-bgl3B。

本发明还提供了包含上述酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株GS115/bgl3B。

本发明还提供了一种制备β-葡萄糖苷酶基因Bgl3B的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶基因Bgl3B表达；

3)回收并纯化所表达的β-葡萄糖苷酶基因Bgl3B。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/bgl3B。

本发明还提供了上述β-葡萄糖苷酶Bgl3B的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有微生物来源的β-葡萄糖苷酶普遍酶活不高，催化效率偏低且热稳定性和耐酸能力不足的问题，从而提供一种新的能够成功应用于生物质能源、食品工业和饲料工业中的高催化效率的β-葡萄糖苷酶。本发明的β-葡萄糖苷酶Bgl3B最适pH为4.5，最适温度为65℃；在60℃处理1h基本不失活，具有很好的热稳定性；在pH 3-9条件下处理1h能够保留90％以上的活性，具有很好的pH稳定性。可见，本发明的β-葡萄糖苷酶基因Bgl3B能够在较为复杂多变的条件下发挥水解作用，将纤维素类生物质水解为葡萄糖和将异黄酮、人森皂甙等天然苷元类物质转化为活性糖苷，在能源、秸秆处理、食品和饲料行业都有较好的应用前景。

附图说明

图1β-葡萄糖苷酶的最适pH。

图2重组β-葡萄糖苷酶的pH稳定性。

图3重组β-葡萄糖苷酶的最适温度。

图4重组β-葡萄糖苷酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces leycettanus)中分离得到一种新的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。pNPG购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH自然。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH自然)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH自然。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1蓝状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)β-葡萄糖苷酶编码基因bgl3B的克隆

提取嗜热真菌蓝状菌(Talaromyces leycettanus)基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解120min，每隔20min混匀一次,在4℃下13000rpm离心10min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于-20℃静置30min后,4℃下13000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

根据第三家族β-葡萄糖苷酶基因的保守区SSNIDD和GLDMT(A)MPGD(S)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-GGCCGCAAYTGGGARGGNTT-3'；

P2:5'-GTCACCAGGCATNGHCATRTC-3'

以Talaromyces leycettanus JCM12802总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约475bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送睿博新科生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度

在60～65℃。并将它们分别命名为SF1，SF2(上游特异性引物),SR1，SR2(下游特异性引物)见表1。

表1.β-葡萄糖苷酶BGL3B TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后β-葡萄糖苷酶Bgl3B基因DNA全长2722bp，包含4个内含子区域，其成熟基因序列全长2526bp，编码841个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端19个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为91.33kDa。

实施例2重组β-葡萄糖苷酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码β-葡萄糖苷酶Bgl3B的基因bgl3B双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟β-葡萄糖苷酶的基因片段(不包含信号肽序列)与表达载体pPIC9连接，获得含有Talaromyces leycettanus JCM12802β-葡萄糖苷酶基因bgl3B的重组质粒pPIC-bgl3B并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/bgl3B。

同样构建含有信号肽序列的重组表达质粒，并转化毕赤酵母。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定β-葡萄糖苷酶的活力。重组β-葡萄糖苷酶的粗酶液酶活为1.5U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中得到了表达。

实施例3重组β-葡萄糖苷酶的活性分析

β-葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝基苯酚(pNP)的量。

反应步骤：125μl 2mM pNPG底物与125μl缓冲液混匀，加入250μl适当稀释的酶液，于60℃反应10min，加入1.5mL 1M的Na₂CO₃终止反应，使用分光光度计测定OD₄₀₅值。

酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pNPG生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。

实施例4重组β-葡萄糖苷酶的性质测定

测定实施例2获得重组β-葡萄糖苷酶的性质

1、重组β-葡萄糖苷酶Bgl3B的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例2纯化的重组β-葡萄糖苷酶Bgl3B在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物pNPG用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中65℃下进行葡萄糖苷酶活力测定。结果(图1)表明，β-葡萄糖苷酶Bgl3B的最适pH为4.5，在pH3.0下保留部分酶活。β-葡萄糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中65℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果(图2)表明β-葡萄糖苷酶Bgl3B的pH耐受性。

2、β-葡萄糖苷酶Bgl3B的最适温度及热稳定性测定方法如下：

β-葡萄糖苷酶Bgl3B的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为β-葡萄糖苷酶Bgl3B在不同温度下处理不同时间，再在最适温度下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为65℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，β-葡萄糖苷酶Bgl3B有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，能保持酶活不降低。

3、β-葡萄糖苷酶Bgl3B的酶动力学测定方法如下：

用不同浓度的pNPG为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，65℃下测定酶活性，计算出其在65℃下的K_m值。经测定，以pNPG为底物时的K_m值为0.293mM，最大反应速度V_max为133.21μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对β-葡萄糖苷酶BGL3B酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在65℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶的活力没有影响，对SDS和Cu²⁺具有较好的耐受能力，在5mmol/L SDS和Cu²⁺条件下具有最适条件84％的相对酶活力，而Ag⁺和Fe³⁺使该酶几乎丧失全部活性。

5、重组β-葡萄糖苷酶Bgl3B的底物特异性

β-葡萄糖苷酶Bgl3B底物较为专一，特异性水解非还原端的葡萄糖苷元，对纤维类多聚糖基本没有水解能力(表2)。

表2.β-葡萄糖苷酶Bgl3B底物特异性分析

Claims (9)

1.一种酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B，其特征在于，其氨基碱序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B。

3.如权利要求2所述的酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B的重组载体。

5.包含权利要求2所述酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B的重组载体pPIC-bgl3B。

6.包含权利要求2所述酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B的重组菌株。

7.一种制备重组酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导酸性β-葡萄糖苷酶基因bgl3B表达；

3)回收并纯化所表达的重组酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B。

8.权利要求1所述酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B的应用。

9.权利要求1所述酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B在能源、食品和饲料方面的应用。