CN104388408B - 一种酸性高比活葡聚糖酶glu16-3及其基因和应用 - Google Patents

一种酸性高比活葡聚糖酶glu16-3及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性葡聚糖酶GLU16‑3及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的葡聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.0，最适温度60℃，比活为14796.6U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解对β‑葡聚糖昆布多糖和地衣多糖以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，酿酒、食品、能源工业等。

Description

一种酸性高比活葡聚糖酶GLU16-3及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性葡聚糖酶GLU16-3及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40～45％，是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子。木质素约占细胞干重的15～25％，是一种复杂酚类聚合物。半纤维素约占细胞干重的30～35％，是继纤维素之后最丰富的可再生生物资源。它由杂聚多糖组成，按主链组成占多数的糖来命名，称之为葡聚糖、甘露聚糖、和葡甘露聚糖等(Schulze E 1891.Ber Dtsch Chem Ges 24,2277-2287.)。其中β-葡聚糖是单子叶禾本科植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，主要存在于糊粉层和胚乳细胞中，如大麦和燕麦胚乳细胞壁含有约70～75％的葡聚糖(Philippe S etal.2006.Planta 224(2),449-461.)
β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷键链成的葡萄糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同,β-葡聚糖酶可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶两类。其中内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶(酶学分类号E.C.3.2.1.73)可以水解β-1,3-1,4-葡聚糖，专一作用于与β-1,3键相连的β-1,4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性。改变单胃动物肠道内容物的特性，提高内源性消化酶活性，改变肠道微生物环境，利于动物对营养物质的消化和吸收,提高生长性能和饲料的转化率(Mathlouthi N et al.2002.Amin Res 51,395-406.)在食品和饲料工业等方面有广阔的应用前景。
在啤酒酿造行业具有潜在的应用前景，在啤酒酿造过程中，麦芽中的葡聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性葡聚糖酶和葡聚糖酶协同作用，可以解决以上问题。因此，酸性葡聚糖酶的产生、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。
由于不同工业对葡聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性葡聚糖酶的研究仍具有重大意义。本次克隆和分离的酸性的葡聚糖酶比活力非常高，可以有效降低其在工业应用中的成本，可以更好的应用于饲料、酿酒，食品工业。本发明中的葡聚糖酶在酸性、中性pH下均具有较高酶活力，具有优良的pH稳定性，在 pH1～10之间保持稳定，并且具有很好热稳定性和胃蛋白酶以及胰蛋白酶抗性，表现出较高的半纤维素酶活性，大麦芽粘度降解实验显示，其对大麦芽粘度的降低具有明显的效果，符合多种工业需要，尤其是在饲料，啤酒酿造以及食品等工业领域中具有很好的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的酸性葡聚糖酶。
本发明的再一目的是提供编码上述酸性葡聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述酸性葡聚糖酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述酸性葡聚糖酶的应用。
本发明从蓝状菌(Talaromyces leycettanus)中分离得到一种新的酸性葡聚糖酶GLU16-3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MRSTTTLLPLVALLAKLSTAGYVLQDDYGNSDSFFDKFTFFTGSDPTHGFVQYVDQATAENAGLIHASNGEVYIGVDHTNVASGSGRQSVRITSTNSYTHGLFIVDLAHMPGSICGAWPAFWMVGANWPNNGEIDIIEGVNQQTNNAMTLHTNEGCTIDNSGFTGTLVTSNCWINAPGQSTNAGCSIDSTSSQSYGTGFNNAGGGVYATEWTSNGISIWFFPRGSTPADISSGSPDPSTWGTPAASFGGSGCDIDSHFGAQQIVFDTTFCGDWAGNVWSSGSCASLAGTCQDYVANNPSAFAEAYWYVNSLKVYQDTAESTIIAHGPGNVTSTHSTTAPVPFARTHRIRRHGHGN
其中，该酶基因编码355个氨基酸，N端20个氨基酸为其信号肽序列“mrstttllplvallaklsta”(SEQ ID NO.3)。
因此，成熟的酸性葡聚糖酶GLU16-3的理论分子量为35.4kDa，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示：
GYVLQDDYGNSDSFFDKFTFFTGSDPTHGFVQYVDQATAENAGLIHASNGEVYIGVDHTNVASGSGRQSVRITSTNSYTHGLFIVDLAHMPGSICGAWPAFWMVGANWPNNGEIDIIEGVNQQTNNAMTLHTNEGCTIDNSGFTGTLVTSNCWINAPGQSTNAGCSIDSTSSQSYGTGFNNAGGGVYATEWTSNGISIWFFPRGSTPADISSGSPDPSTWGTPAASFGGSGCDIDSHFGAQQIVFDTTFCGDWAGNVWSSGSCASLAGTCQDYVANNPSAFAEAYWYVNSLKVYQDTAESTIIAHGPGNVTSTHSTTAPVPFARTHRIR RHGHGN
本发明的葡聚糖酶GLU16-3同时具有好的pH稳定性，并且常温下在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到Talaromyces leycettanus产生的葡聚糖酶，其最适pH值为4.0，在pH1.0～10.0的范围内维持60％以上的酶活性；最适温度为60℃；用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理30分钟,酶活无损失。
本发明提供了编码上述酸性葡聚糖酶GLU16-3。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：
atgcggtccacaaccacactccttcctctcgtggccctgttggccaagctcagcacagctggttatgtgctgcaggatgattatggaaactcggattccttctttgacaagttcactttcttcacggtatgcgctcgatgatatatagcttaccggttggacctacgtgcactgacacgactttcagggctctgacccaacccacggctttgtccagtatgtcgaccaggccacagcagagaatgcaggtctgattcacgcgtcgaacggcgaggtctatattggcgtcgatcataccaatgtcgccagtggtagcggccgtcagagcgtgcgcatcaccagcaccaacagctatactcatggcctgttcattgtggaccttgcgcatatgcccggtagcatctgcggagcctggcctgccttgtaagtggcagttaatctcttccactctcatctgccagggttttttttgttttacctgacctggcaacagctggatggtcggtgccaactggccgaacaacggcgaaatcgatatcatcgaaggagtcaaccaacagaccaacaacgccatgacccttcacactaacgaaggatgcaccatcgacaactctggcttcacgggcactctcgtcaccagcaactgctggataaacgcccccggccaatccaccaacgcaggatgcagcatcgactcgacctcctcacagtcctacggcacgggcttcaacaacgccggcggcggcgtctacgccaccgaatggaccagcaacggcatcagcatctggttcttcccccgcggaagcacccccgcggacatctcatccggcagccccgacccatcgacctggggtactcccgcggcgagcttcggcggctcaggctgcgacatcgactcgcactttggcgcgcagcagatcgtcttcgacacgaccttctgcggcgactgggccggcaacgtctggagctccggcagctgtgcctccctcgcgggcacatgccaggattacgtcgccaacaacccttccgcgttcgccgaggcgtactggtacgtcaactcgttgaaggtctaccaggacaccgcggaaagtactataatagctcatggccccggtaatgtgacttcgacacattcgacgaccgctccggttcccttcgcgcgcacacaccgtatccgcagacatggccatggcaattag
本发明通过PCR的方法分离克隆了葡聚糖酶基因GLU16-3，DNA全序列分析结果表明，葡聚糖酶GLU16-3基因组GLU16-3全长1199bp，cNDA编码基因序列全长1068bp。其中，信号肽的碱基序列为：
ATGCGGTCCACAACCACACTCCTTCCTCTCGTGGCCCTGTTGGCCAAGCTCAGCACAGCT(SEQ IDNO.6)。
成熟的葡聚糖酶GLU16-3的cDNA(去信号肽)序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5
Ggttatgtgctgcaggatgattatggaaactcggattccttctttgacaagttcactttcttcacgggctctgacccaacccacggctttgtccagtatgtcgaccaggccacagcagagaatgcaggtctgattcacgcgtcgaacggcgaggtctatattggcgtcgatcataccaatgtcgccagtggtagcggccgtcagagcgtgcgcatcaccagcaccaacagctatactcatggcctgttcattgtggaccttgcgcatatgcccggtagcatctgcggagcctggcctgccttctggatggtcggtgccaactggccgaacaacggcgaaatcgatatcatcgaaggagtcaaccaacagaccaacaacgccatgacccttcacactaacgaaggatgcaccatcgacaactctggcttcacgggcactctcgtcaccagcaactgctggataaacgcccccggccaatccaccaacgcaggatgcagcatcgactcgacctcctcacagtcctacggcacgggcttcaacaacgccggcggcggcgtctacgccaccgaatggaccagcaacggcatcagcatctggttcttcccccgcggaagcacccccgcggacatctcatccggcagccccgacccatcgacctggggtactcccgcggcgagcttcggcggctcaggctgcgacatcgactcgcactttggcgcgcagcagatcgtcttcgacacgaccttctgcggcgactgggccggcaacgtctggagctccggcagctgtgcctccctcgcgggcacatgccaggattacgtcgccaacaacccttccgcgttcgccgaggcgtactggtacgtcaactcgttgaaggtctaccaggacaccgcggaaagtactataatagctcatggccccggtaatgtgacttcgacacattcgacgaccgctccggttcccttcgcgcgcacacaccgtatccgcagacatggccatggcaattag
成熟蛋白理论分子量为35.5kDa，GLU16-3是一种新的葡聚糖酶。
本发明还提供了包含上述酸性葡聚糖酶基因GLU16-3的重组载体，优选为pPIC-GLU16-3。将本发明的葡聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-GLU16-3。
本发明还提供了包含上述酸性葡聚糖酶基因GLU16-3的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/GLU16-3。
本发明还提供了一种制备酸性葡聚糖酶GLU16-3的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；以及
3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶GLU16-3。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/GLU16-3。
本发明还提供了上述酸性葡聚糖酶GLU16-3的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的葡聚糖酶。本发明的葡聚糖酶最适pH为4.0，在pH2.0～6.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力； 并且具有较高 纤维素酶活性。该葡聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解葡聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。因此，本葡聚糖酶在能源工业中的应用 也显示出其巨大的潜力。
附图说明
图1重组葡聚糖酶的最适pH。
图2重组葡聚糖酶的pH稳定性。
图3重组葡聚糖酶的最适温度。
图4重组葡聚糖酶的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从(Talaromyces leycettanus)中分离得到一种新的酸性葡聚糖酶GLU16-3。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦葡聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)Talaromyces leycettanus JCM12802培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802葡聚糖酶编码基因GLU16-3的克隆
提取蓝状菌12802Talaromyces leycettanus JCM12802基因组DNA：
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。
根据第16家族葡聚糖酶基因的保守(GYCDA(S)QC和GCG(D)FNPY)序列设计合成了简并引物P1，P2
P1:5'-TGCGGTAYNTGGCCNGC-3'；
P2:5'-CCGGCCCANTBNCCRCARAA-3'。
以Talaromyces leycettanus JCM12802总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约558bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后GLU16-3葡聚糖酶基因全长1199bp，编码355个氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为35.5kDa。
实施例2重组葡聚糖酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码葡聚糖酶的基因GLU16-3双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟葡聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Talaromyces leycettanus JCM12802葡聚糖酶基因GLU16-3的重组质粒pPIC-GLU16-3并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/GLU16-3。
以同样方法构建含有信号肽序列的葡聚糖酶基因GLU16-3的重组表达质粒，并获得重组重组毕赤酵母菌株。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定葡聚糖酶的活力。重组葡聚糖酶的表达量为706.9U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组葡聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。 重组葡聚糖的比活为14796.6U/mg。
实施例4重组葡聚糖酶的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH5.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量。
实施例5重组葡聚糖酶GLU16-3的性质测定
1、重组葡聚糖酶GLU16-3的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例4纯化的重组葡聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物葡聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中60℃下进行葡聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶GLU16-3的最适pH为4.0，在pH3.0～5.0有60％以上的相对酶活性。葡聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明葡聚糖酶在pH 1.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％左右，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、葡聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
葡聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为葡聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，GLU16-3有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。
3、葡聚糖酶的Km值测定方法如下：
用不同浓度的葡聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其Km值。经测定，以葡聚糖为底物时的Km值为4mg/mL，最大反应速度Vmax为20000μmol/min·mg。
4、不同金属离子化学试剂对GLU16-3酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在60℃、pH4.0条件下测定酶活性。结果表明，部分离子和化学试剂在浓度为5mmol时重组葡聚糖酶的活力没有明显变化。但是Ag+、、Pb2+、Cu2+、Mn2 +、Fe3+可以抑制其将近一半活力，而SDS可强烈抑制其活力。而Na+可以部分激活GLU16-3酶活力。
5、葡聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：
用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/葡聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温30和60min取样，在pH5.0及60℃条件下测定酶活性。实验结果表明葡聚糖酶GLU16-3用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，蛋白酶处理后的GLU16-3仍具有85％以上的酶活。
6、重组葡聚糖酶的底物特异性
该酶除可作用于大麦葡聚糖外，对地衣多糖、昆布多糖以及魔芋粉也有一定的降解作用。该酶主要切割β-1,4糖苷键，可将大麦葡聚糖和地衣多糖分解为葡萄糖或纤维二糖。其对昆布多糖的降解能力相对于大麦葡聚糖为5.2％，说明其具有微弱的切割β-1,3糖苷键能力。对半纤维素魔芋粉的降解能力相对于大麦葡聚糖为4.5％。
7、添加木聚糖酶对大麦麦芽汁黏度和过滤速度的影响
大麦麦芽经粉碎机处理，过0.2mm筛网，溶于100mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。添加100或150U的重组葡聚糖酶GLU16-3。然后分别在55、60、65℃处理30min,60℃处理60min,70℃处理30min,最后煮沸5min灭活。实验对照为不添加葡聚糖酶。用滤纸测定其过滤速度。取5ml过滤液用黏度剂测定其黏度数值。结果表明，添加100U的酶液处理，其与对照比较，过滤速度和黏度分别降低20.1％和17.8％。

Claims (10)

1.一种酸性葡聚糖酶GLU16-3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。
2.如权利要求1所述的酸性葡聚糖酶GLU16-3，其特征在于，序列SEQ ID NO.1在N端包含信号肽，所述信号肽的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种酸性葡聚糖酶基因GLU16-3，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性葡聚糖酶GLU16-3。
4.如权利要求3所述的酸性葡聚糖酶基因GLU16-3，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5所示。
5.如权利要求3所述的酸性葡聚糖酶基因GLU16-3，其特征在于，所述酸性葡聚糖酶基因GLU16-3包括编码信号肽的序列，所述序列如SEQ ID NO.6所示。
6.包含权利要求3所述酸性葡聚糖酶基因GLU16-3的重组载体。
7.包含权利要求3所述酸性葡聚糖酶基因GLU16-3的重组载体pPIC9-GLU16-3，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的酸性葡聚糖酶基因GLU16-3插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC9-GLU16-3。
8.包含权利要求3所述酸性葡聚糖酶基因GLU16-3的重组菌株。
9.一种制备酸性葡聚糖酶GLU16-3的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的酸性葡聚糖酶GLU16-3。
10.权利要求1所述酸性葡聚糖酶GLU16-3在饲料制造、食品领域的应用。
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