CN104388407B - 一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用 - Google Patents

一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104388407B
CN104388407B CN201410597169.XA CN201410597169A CN104388407B CN 104388407 B CN104388407 B CN 104388407B CN 201410597169 A CN201410597169 A CN 201410597169A CN 104388407 B CN104388407 B CN 104388407B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dextranase
glu16
gene
acidic
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410597169.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104388407A (zh
Inventor
姚斌
罗会颖
游帅
石鹏君
黄火清
王亚茹
柏映国
杨培龙
孟昆
师霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201410597169.XA priority Critical patent/CN104388407B/zh
Publication of CN104388407A publication Critical patent/CN104388407A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104388407B publication Critical patent/CN104388407B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2448—Licheninase (3.2.1.73)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C7/00—Preparation of wort
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性葡聚糖酶GLU16‑8及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的葡聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.0，最适温度60℃，比活为5763.2U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解对β‑葡聚糖昆布多糖和地衣多糖以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，酿酒、食品、能源工业等。

Description

一种酸性葡聚糖酶GLU16-8及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性葡聚糖酶GLU16-8及其基因和应用。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40～45％，是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子。木质素约占细胞干重的15～25％，是一种复杂酚类聚合物。半纤维素约占细胞干重的30～35％，是继纤维素之后最丰富的可再生生物资源，它由杂聚多糖组成，按主链组成占多数的糖来命名，称之为葡聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、和葡甘露聚糖等(Schulze E1891.Ber Dtsch Chem Ges 24,2277-2287.)。其中β-葡聚糖是单子叶禾本科植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，主要存在于糊粉层和胚乳细胞中，如大麦和燕麦胚乳细胞壁含有约70～75％的葡聚糖(Philippe Set al.2006.Planta 224(2),449-461.)
β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷键链成的葡萄糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同,β-葡聚糖酶可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶两类。其中内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶(酶学分类号E.C.3.2.1.73)可以水解β-1,3-1,4-葡聚糖，专一作用于与β-1,3键相连的β-1,4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性。改变单胃动物肠道内容物的特性，提高内源性消化酶活性，改变肠道微生物环境，利于动物对营养物质的消化和吸收,提高生长性能和饲料的转化率(Mathlouthi N et al.2002.Amin Res 51,395-406.)在食品和饲料工业等方面有广阔的应用前景。
葡聚糖酶是可将葡聚糖降解成低聚糖和葡萄糖的一类酶的总称。目前葡聚糖酶在食品，饲料，啤酒、医药等领域得到了日益广泛的应用。目前大麦主要被应用于啤酒的酿造和饲料中，因此相关的葡聚糖酶在啤酒酿造和饲料工业中得到了最为广泛的应用，尤其在欧洲，以大麦，豆粕为主要原料的饲料配方中，葡聚糖酶的添加更为广泛。大麦发芽过程中，大麦当中的葡聚糖不能够被自身内源性葡聚糖酶完全分解，通常仅能分解30％-70％，残留的葡聚糖使糖化醪粘度增加，过滤速率降低，成品啤酒容易形成雾浊或早期凝胶沉淀。在麦芽制造中，加入耐高温β-葡聚糖酶可显著降低成品麦芽中β-葡聚糖含量，降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒的非生物稳定性。在以大麦、小麦、黑麦、燕麦为基础的畜禽饲料中含有大量的β-葡聚糖，由于单胃动物体内没有消化β-葡聚糖的酶，因此不能够水解饲料当中的β-葡聚糖。β-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内吸收较多的水分后，具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜充分接触，从而影响营养物质的吸收，成为一种抗营养因子。添加β-葡聚糖酶，可以有效消除β-葡聚糖的抗营养作用，大大提高了饲料的利用效率。
在饲料工业中，动物胃肠道是酸性环境(如猪的胃肠道)，并且含有大量的内源性蛋白酶，同时在饲料的加工过程中，有一个短时的高温过程。因此，获得新型具有优良温度稳定性和适用性的，具有对各种蛋白酶(特别是胃蛋白酶)具有抗性的酸性葡聚糖酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有温度稳定性和蛋白酶抗性的酸性葡聚糖酶可以更好的应用于饲料，而且可以降低生产成本，都是葡聚糖酶应用于工业化生产所必需的。
植物和微生物都能产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶，在植物种子发芽过程中可以由糊粉层和盾片分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶以分解胚乳细胞壁中的β-葡聚糖。生产中应用较多的是微生物所产的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，包括细菌(主要为芽孢杆菌)、真菌和瘤胃微生物。目前已经有多种不同来源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因被克隆和表达。不同来源的基因可以在不同的载体和寄主系统中得到表达，包括大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及转基因大麦和烟草等，但不同表达系统的葡聚糖酶活性有较大的差异。
然而，获得新型具有优良特性葡聚糖酶的研究仍具有重大意义。本发明克隆和分离的葡聚糖酶具有良好的热稳定性和底物特异性，对大麦葡聚糖、昆布多糖、地衣多糖以及魔芋粉都有不同程度的降解能力，在饲料生产和新能源的开发中应用潜力较大，该葡聚糖酶比活力较高，热稳定性好，并且对大麦芽粘度降解的效果很明显，在啤酒酿造中具有很好的应用潜力，该葡聚糖酶的pH稳定性非常好，在1～11.0之间保持稳定，具有良好的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，因此在饲料、食品、造纸、以及能源产业当中具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的酸性葡聚糖酶。
本发明的再一目的是提供编码上述酸性葡聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述酸性葡聚糖酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述酸性葡聚糖酶的应用。
本发明从同合根霉Rhizopus homothallicus中分离得到一种新的酸性葡聚糖酶GLU16-8。
本发明提供了一种酸性葡聚糖酶GLU16-8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQID NO.1：
MKQHLLTVSLLVSSVLLQGAQAAWTLQDTYEGSTFFNGFDFFTSADPTHGFVQYVDQATAQSSGLIYNQGSQVIIKADNTSTTPNGRPSVRISSQATYNSGLFIFDLEHMPFGCATWPAIWLVGPNWPNGGEIDIIEGVNLQTTDSMTLHTASGCTMENVARTETGTPTGHQDCDVTNDPSNLGCGVTSTSTTSYGQGFNNENGGVYATRWTASTGIQIWFFDRSSIPSDIQSGSPNPDSWPTPAADFPFTSCNPSLFSNMKIVLDLTFCGDWAGSVYSSSGCPSDCTTYVSNTPSGFDEAYWRINSFKVYQSS*
其中，该酶基因编码314个氨基酸和一个终止密码子，N端22个氨基酸为信号肽序列“mkqhlltvsllvssvllqgaqa”(SEQ ID NO.3)。
因此，成熟的酸性葡聚糖酶GLU16-8的理论分子量为31.6kDa，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示：
AWTLQDTYEGSTFFNGFDFFTSADPTHGFVQYVDQATAQSSGLIYNQGSQVIIKADNTSTTPNGRPSVRISSQATYNSGLFIFDLEHMPFGCATWPAIWLVGPNWPNGGEIDIIEGVNLQTTDSMTLHTASGCTMENVARTETGTPTGHQDCDVTNDPSNLGCGVTSTSTTSYGQGFNNENGGVYATRWTASTGIQIWFFDRSSIPSDIQSGSPNPDSWPTPAADFPFTSCNPSLFSNMKIVLDLTFCGDWAGSVYSSSGCPSDCTTYVSNTPSGFDEAYWRINSFKVYQSS*
本发明的葡聚糖酶GLU16-8同时具有好的pH稳定性，并且常温下在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到同合根霉Rhizopushomothallicus所产生的葡聚糖酶，其最适pH值为4.0，在pH1.0～11.0的范围内维持60％以上的酶活性；最适温度为60℃；用胃蛋白酶处理30分钟,酶活基本没损失，用胰蛋白酶酶处理30分钟，酶活活仍在50％以上。
本发明提供了编码上述酸性葡聚糖酶GLU16-8。
成熟蛋白理论分子量为31.6kDa，经比对说明GLU16-8是一种新的葡聚糖酶。
本发明还提供了包含上述酸性葡聚糖酶基因GLU16-8的重组载体，优选为pPIC-GLU16-8。将本发明的葡聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-GLU16-8。
本发明还提供了包含上述酸性葡聚糖酶基因GLU16-8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/GLU16-8。
本发明还提供了一种制备酸性葡聚糖酶GLU16-8的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；以及
3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶GLU16-8。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/GLU16-8。
本发明还提供了上述酸性葡聚糖酶GLU16-8的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的葡聚糖酶。本发明的葡聚糖酶最适pH为4.0，在pH3.0～5.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力；并且具有较高纤 维素酶活性。本葡聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解葡聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。因此，本葡聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。
附图说明
图1重组葡聚糖酶的最适pH。
图2重组葡聚糖酶的pH稳定性。
图3重组葡聚糖酶的最适温度。
图4重组葡聚糖酶的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从同合根霉Rhizopus homothallicus中分离得到一种新的酸性葡聚糖酶GLU16-8。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦葡聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)Phialophora sp.G5 CGMCC 3328培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1同合根霉Rhizopus homothallicus葡聚糖酶编码基因GLU16-8的克隆
提取同合根霉Rhizopus homothallicus基因组DNA：
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。
根据第16家族葡聚糖酶基因的保守(GYCDA(S)QC和GCG(D)FNPY)序列设计合成了简并引物P1，P2
P1:5'-TGCGGTAYNTGGCCNGC-3'；
P2:5'-CCGGCCCANTBNCCRCARAA-3'。
以同合根霉Rhizopus homothallicus总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约558bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后GLU16-8葡聚糖酶基因全长1017bp，编码314个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端22个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为31.6kDa。
实施例2重组葡聚糖酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码葡聚糖酶的基因GLU16-8双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟葡聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有同合根霉Rhizopus homothallicus葡聚糖酶基因GLU16-8的重组质粒pPIC-GLU16-8并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/GLU16-8。
以同样的方法构建含信号肽序列的葡聚糖酶基因GLU16-8的表达质粒，并且获得重组毕赤酵母菌株。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定葡聚糖酶的活力。重组葡聚糖酶的表达量为412.8U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组葡聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组葡聚糖的比活为5763.2U/mg。
实施例3重组葡聚糖酶的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH5.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量。
实施例4重组葡聚糖酶GLU16-8的性质测定
1、重组葡聚糖酶GLU16-8的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例4纯化的重组葡聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物葡聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中60℃下进行葡聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶GLU16-8的最适pH为4.0，在pH3.0～5.0有60％以上的相对酶活性。葡聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明葡聚糖酶在pH 1.0-11.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％左右，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、葡聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
葡聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为葡聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，GLU16-8有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。
3、葡聚糖酶的Km值测定方法如下：
用不同浓度的葡聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其Km值。经测定，以葡聚糖为底物时的Km值为10.7mg/mL，最大反应速度Vmax为10080.65μmol/min·mg。
4、不同金属离子化学试剂对GLU16-8酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在60℃、pH4.0条件下测定酶活性。结果表明，部分离子和化学试剂在浓度为5mmol时重组葡聚糖酶的活力没有明显变化。但是Ag+、Cu2+可以抑制其一半左右活力。当Mg2+,Ni2+，Fe3+、Mg2+在浓度为10mmol时部分抑制其酶活力。而Zn2+、Na+、Co2+和EDTA可以激活GLU16-8酶活力,其中Zn2+和EDTA可以提高20％以上。
5、葡聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：
用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/葡聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温30和60min取样，在pH4.0及60℃条件下测定酶活性。实验结果表明葡聚糖酶GLU16-8用胃蛋白酶处理60min后，酶活无损失，胰蛋白酶处理30分钟后GLU16-8仍具有50％以上的酶活。
6、重组葡聚糖酶的底物特异性
该酶除可作用于大麦葡聚糖外，对地衣多糖和昆布多糖也有一定的降解作用。因此其主要切割β-1,4建，对于β-1,3键也有一定的催化作用。其对地衣多糖和昆布多糖的降解能力相对于葡聚糖分别为82.4％和27.7％。
7、添加木聚糖酶对大麦麦芽汁黏度和过滤速度的影响
大麦麦芽经粉碎机处理，过0.2mm筛网，溶于100mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。添加100或150U的重组葡聚糖酶GLU16-8。然后分别在55、60、65℃处理30min,60℃处理60min,70℃处理30min,最后煮沸5min灭活。实验对照为不添加葡聚糖酶。用滤纸测定其过滤速度。取5ml过滤液用黏度剂测定其黏度数值。结果表明，添加100U的酶液处理，其与对照比较，过滤速度和黏度分别降低11.3％和10.7％。

Claims (6)

1.一种酸性葡聚糖酶GLU16-8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。
2.一种酸性葡聚糖酶基因GLU16-8，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性葡聚糖酶GLU16-8。
3.包含权利要求2所述酸性葡聚糖酶基因GLU16-8的重组载体。
4.包含权利要求2所述酸性葡聚糖酶基因GLU16-8的重组菌株。
5.一种制备权利要求1所述酸性葡聚糖酶GLU16-8的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求3的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶GLU16-8。
6.权利要求1所述酸性葡聚糖酶GLU16-8用于水解葡聚糖的应用。
CN201410597169.XA 2014-10-30 2014-10-30 一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用 Active CN104388407B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410597169.XA CN104388407B (zh) 2014-10-30 2014-10-30 一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410597169.XA CN104388407B (zh) 2014-10-30 2014-10-30 一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104388407A CN104388407A (zh) 2015-03-04
CN104388407B true CN104388407B (zh) 2017-06-27

Family

ID=52606368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410597169.XA Active CN104388407B (zh) 2014-10-30 2014-10-30 一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104388407B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978183B (zh) * 2011-09-06 2014-04-09 北京卫诺恩生物科技有限公司 一种酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A及其基因和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104388407A (zh) 2015-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112481240B (zh) 一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用
CN101457207B (zh) 一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用
CN101457206B (zh) 一种酸性木聚糖酶xyl10a及其基因和应用
CN104388408B (zh) 一种酸性高比活葡聚糖酶glu16-3及其基因和应用
CN107129976B (zh) 一种木聚糖酶及其编码基因和其应用
CN104357429B (zh) 一种高温中性β‑葡萄糖苷酶HiBgl3A及其基因和应用
CN101748108B (zh) 一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和应用
CN107002055B (zh) 真菌来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用
CN104498456B (zh) 一种酸性β‑葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和应用
CN101724565A (zh) 一种酸性木聚糖酶xynb及其基因和应用
CN103275954A (zh) 一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用
CN104388407B (zh) 一种酸性葡聚糖酶glu16‑8及其基因和应用
CN102358898B (zh) 一种中温β-葡萄糖苷酶BglA1及其基因和应用
CN103695397B (zh) 一种中温酸性木聚糖酶xyn10l1及其基因和应用
CN102154246B (zh) 一种酸性葡聚糖酶cel7g5及其基因和应用
CN114561303A (zh) 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用
CN101892208B (zh) 一种高温酸性木聚糖酶xyn10j88及其基因和应用
CN102399768B (zh) 一种低温木聚糖酶ba-xyl11a及其基因和应用
CN102154343A (zh) 一种新型β-甘露聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备
CN102154244B (zh) 一种高温酸性纤维素酶EgG5及其基因和应用
CN105176950B (zh) 一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用
CN111100853A (zh) 木聚糖酶xyn11A及其编码基因与应用
CN102586206B (zh) 一种高温酸性木聚糖酶xyn10c1及其基因和应用
CN103898079B (zh) 一种中温中性木聚糖酶xyn11b及其基因和应用
CN103789283A (zh) 一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200828

Address after: 100193 Beijing Old Summer Palace West Road, Haidian District, No. 2

Patentee after: Beijing Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Address before: 100081 Beijing, Zhongguancun, South Street, No. 12, No.

Patentee before: FEED Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES