CN101724565A - 一种酸性木聚糖酶xynb及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性木聚糖酶XYNB及其基因和应用。本发明分离了一种产酸性木聚糖酶的菌株Bispora sp.X-1，从该菌种中得到酸性木聚糖酶，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，并获得编码上述木聚糖酶的基因，其具有如SEQ ID NO.3或4所示的核苷酸序列。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH2.6，最适温度65℃，良好的pH稳定性和热稳定性；比活2049U/mg；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物饲料、食品、医药、酿酒、能源工业等。

Description

一种酸性木聚糖酶XYNB及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种产酸性木聚糖酶的菌株Bispora sp.X-1，和从该菌种中得到的酸性木聚糖酶及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

半纤维素是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(Prade.Biotech.and Gentic Engi.Rev..13(12)：101～131，1995)。木聚糖是主要类型的半纤维素(Collins et al..FEMS Microbiol Rev.29：3～23.2005)，广泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等中，但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称，对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在适合于食品工业、制浆造纸工业、能源工业等方面的木聚糖酶。

许多微生物包括细菌、真菌和酵母菌都能产木聚糖酶。大多数木聚糖酶属第F/10、G/11族糖基水解酶，不同来源的木聚糖酶其氨基酸序列、空间结构、相对分子质量、等电点以及底物特异性各不相同，因而有必要对编码各种木聚糖酶的基因进行克隆和表达，以满足工业应用的需求。目前，已有许多种木聚糖酶编码基因得到分离，在木聚糖酶基因的高效表达方面也进行了较多尝试(张红莲等，科学通报，48(4)：364～368，2003；Zhou et al..Bioresource Technology.831-838，2008；Li et al.，Appl.Microbiol.Biotechol..inpress，2008)。

近年来，从极端微生物中分离木聚糖酶引起了人们的极大的兴趣。这些木聚糖酶由于适应极端环境而获得了特殊的性质，可以满足工业应用的特殊需求。如来源于Thermotoga sp.嗜热木聚糖酶(Simpson et al.Biochem J.277：413-417.1991)；来源于嗜碱菌Bacillus sp.strain 41M-1嗜碱木聚糖酶(Nakamura et al.，ApplEnviron Microbiol.59：2311-2316.1998)；来源于Penicillium sp.40嗜酸性木聚糖酶(Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem.64：1230-1237.2000)等。

但迄今为止，关于酸性木聚糖酶的报道却不多。由于酸性木聚糖酶在pH值4.0以下时仍然保持较高酶活性，通常酸性木聚糖酶可以广泛应用于饲料工业、酿酒工业、食品工业等众多领域，充分显示出它在生产上的巨大潜力。目前，同时具备耐酸、耐高温、抗蛋白稳定性等性质并运用基因工程手段来产业化生产嗜酸木聚糖酶产品还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产酸性木聚糖酶的菌株Bispora sp.X-1。

本发明的再一目的是提供来源于上述菌株的酸性木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备酸性木聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述酸性木聚糖酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、酿酒以及能源工业中应用新的木聚糖酶。本发明人筛选到一种天然菌株，它所产生的木聚糖酶适合于在饲料、食品、酿酒以及能源工业中使用。该嗜酸真菌Bispora sp.X-1，于2008年9月26日、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)其保藏号为CGMCC No.2676。

从上述菌株中获得了一种酸性木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

  1  MHAFSYLAVA LSALPLLQAA PTSVQKRGAH NFMLSPDHPL

     MVAKRNASLA

 51  RRSSTNYDQD YTTGGSVYFA PASGEFYVSW DTTDDFVVGV

     GWNPGSTEPI

101  THGGSFNVDS GLASLSVYGW STNPLVEYYI IDDEVDLPLS

     GTEKGTVYSD

151  GSTYTIWENQ RVDEPSIEGT STFNQYISIR DSPRVSGTVT

     VENHFQAWAN

201  LGMDLGTLNF QVIAIESWDG SGNAYQTVSN

该酶具有230个氨基酸，其中N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列“MHAFSYLAVA LSALPLLQA”。

因此，成熟的酸性木聚糖酶的理论分子量为23.1kDa，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2：

 1  APTSVQKRGA HNFMLSPDHP LMVAKRNASL ARRSSTNYDQ

    DYTTGGSVYF

51  APASGEFYVS WDTTDDFVVG VGWNPGSTEP ITHGGSFNVD

    SGLASLSVYG

101  WSTNPLVEYY IIDDEVDLPL SGTEKGTVYS DGSTYTIWEN

     QRVDEPSIEG

151  TSTFNQYISI RDSPRVSGTV TVENHFQAWA NLGMDLGTLN

     FQVIAIESWD

201  GSGNAYQTVS N

该木聚糖酶XYNB同时具有好的热稳定性而在常温下又具备高活性、在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到的嗜酸真菌Bisporasp.X-1所产生的木聚糖酶，其最适pH值为2.6，在pH2～4的范围内维持50％以上的酶活性；最适温度为65℃，在60℃下保温60min，酶活性基本维持不变，70℃下保温15min，剩余酶活性为90％以上，处理60min后，酶活仍在70％以上；用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60分钟，酶活性维持在85～100％。这种性质的木聚糖酶还未曾有过报道。

本发明还提供了编码上述酸性木聚糖酶的基因。

该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

  1  ATGCATGCAT TCTCATACTT GGCTGTGGCG CTCTCCGCCC

     TCCCGTTGTT ACAAGCTGCT

 61  CCAACATCTG TCCAAAAGCG CGGGGCCCAC AACTTCATGC

     TTTCCCCTGA TCATCCACTG

121  ATGGTGGCTA AGCGGAATGC AAGCCTTGCC CGTAGATCCT

     CCACAAATTA CGATCAAGAT

181  TACACTACTG GAGGGTCGGT ATATTTCGCG CCTGCCAGCG

     GCGAGTTCTA TGTCTCGTGG

241  GATACTACAG ATGATTTCGT TGTTGGCGTA GGCTGGAACC

     CAGGCAGTAC CGAGTAAGT C

301  TTCGTTACAC GTTCCCGTGC TGCTGTCATT GTCTTCTCGT

     ACTGACCTAT TGGCACTAGA

361  CCAATCACCC ACGGTGGTAG TTTCAACGTC GATTCCGGCT

     TGGCTAGCCT CTCTGTATAT

421  GGCTGGTCGA CCAACCCACT GGTTGAATAC TATATCATCG

     ACGACGAAGT CGACCTACCT

481  CTGTCAGGTA CGGAGAAAGG CACTGTCTAT AGCGACGGCT

     CCACCTACAC CATTTGGGAG

541  AACCAACGTG TGGATGAGCC TTCCATCGAA GGCACGTCGA

     CCTTTAATCA GTATATCTCC

601  ATTCGCGACT CCCCACGTGT TAGTGGAACT GTCACTGTAG

     AAAACCATTT CCAAGCATGG

661  GCAAATCTCG GTATGGACCT TGGAACTCTG AATTTCCAGG

     TTATTGCGAT CGAAAGTTGG

721  GACGGGAGTG GAAATGCGTA TCAGACTGTG TCGAATTAG

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因xynB，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYNB结构基因xynB全长759bp，含有一个内含子，cDNA长693bp，+294～+359bp为66bp的内含子序列，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4：

  1  ATGCATGCAT TCTCATACTT GGCTGTGGCG CTCTCCGCCC

     TCCCGTTGTT ACAAGCTGCT

 61  CCAACATCTG TCCAAAAGCG CGGGGCCCAC AACTTCATGC

     TTTCCCCTGA TCATCCACTG

121  ATGGTGGCTA AGCGGAATGC AAGCCTTGCC CGTAGATCCT

     CCACAAATTA CGATCAAGAT

181  TACACTACTG GAGGGTCGGT ATATTTCGCG CCTGCCAGCG

     GCGAGTTCTA TGTCTCGTGG

241  GATACTACAG ATGATTTCGT TGTTGGCGTA GGCTGGAACC

     CAGGCAGTAC CGAACCAATC

301  ACCCACGGTG GTAGTTTCAA CGTCGATTCC GGCTTGGCTA

     GCCTCTCTGT ATATGGCTGG

361  TCGACCAACC CACTGGTTGA ATACTATATC ATCGACGACG

     AAGTCGACCT ACCTCTGTCA

421  GGTACGGAGA AAGGCACTGT CTATAGCGAC GGCTCCACCT

     ACACCATTTG GGAGAACCAA

481  CGTGTGGATG AGCCTTCCAT CGAAGGCACG TCGACCTTTA

     ATCAGTATAT CTCCATTCGC

541  GACTCCCCAC GTGTTAGTGG AACTGTCACT GTAGAAAACC

     ATTTCCAAGC ATGGGCAAAT

601  CTCGGTATGG ACCTTGGAAC TCTGAATTTC CAGGTTATTG

     CGATCGAAAG TTGGGACGGG

661  AGTGGAAATG CGTATCAGAC TGTGTCGAAT TAG

其中，信号肽的碱基序列为：ATGCATGCAT TCTCATACTT GGCTGTGGCG

CTCTCCGCCC TCCCGTTGTT ACAAGCT。

成熟蛋白理论分子量为23.1kDa。将木聚糖酶基因xynB cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。推导的氨基酸序列同Hypocrea jecorina，Penicillium funiculosum和Phanerochaete chrysosporium来源的木聚糖酶有较高的序列相似性，分别为57.1，49.8和44.4％。为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料，说明XYNB是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-xynB。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xynB。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/xynB。

本发明还提供了一种制备酸性木聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xynB。

本发明还提供了上述酸性木聚糖酶的应用。

本发明的木聚糖酶最适pH为2.6，在pH2.0～4.0都有较高的酶活性；热稳定性好，能够满足普通饲料制粒工艺；具有极好的抗蛋白酶的能力。符合动物消化生理特点、pH适应范围提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染；提高谷物加工副产品的营养价值，提升饲料产品品质。本发明的木聚糖酶可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。还可以将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为D-木糖单体，而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，本发明的木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为增稠剂、脂肪代替物和抗冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。木聚糖的水解产物还可以进一步转化为液体燃料、单细胞蛋白、溶剂和低热量甜味剂。

附图说明

嗜酸真菌Bispora sp.X-1，于2008年9月26日、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)其保藏号为CGMCC No.2676。

图1xynB在毕赤酵母中表达的木聚糖酶的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2，3发酵培养上清；4，纯化的重组木聚糖酶。

图2本发明重组木聚糖酶的最适pH值。

图3本发明重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4本发明木重组聚糖酶最适反应温度。

图5本发明重组木聚糖酶热稳定性。

图6蛋白酶处理本发明木聚糖酶后的酶活曲线(A)和SDS-PAGE分析(B)，

1，分子量标准；2，胰蛋白酶处理后的XYNB；3，胃蛋白酶处理后的XYNB；4，纯化的重组木聚糖酶XYNB。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：Bispora sp.X-1由本发明人分离获得，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Bispora sp.X-1培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1分离嗜酸真菌Bispora sp.X-1

将来源于江西某矿的铀矿废水样品经富集培养后(富集培养基：(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，玉米芯粉0.5％，麸皮0.5％，pH2.5)，按常规稀释后涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，木聚糖1％，1.5％琼脂糖，pH 2.5)平板上，30℃培养5～6d，挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌木聚糖酶的菌株。

本菌株在PDA上30℃下培养7d菌落直径2～3cm，灰黑色或灰褐色，呈圆形放射状，表面有绒状皱褶且不易于挑起。分生孢子梗直立，(6～9)μm×(10～13)μm。顶端产生链生孢子，分生孢子有隔，0～1隔，椭圆形至纺锤形，无分枝，棕色至深棕色，(5～8.25)μm×(10～19)μm。其最适生长pH为2.5～3.0，最适温度30℃。

实施例2嗜酸真菌Bispora sp.X-1木聚糖酶编码基因xynB的克隆

提取嗜酸真菌Bispora sp.X-1基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十一家族木聚糖酶基因的保守(YLAVYGW和STFNQYI)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TACCTTGC(C/T)(A/T/C/G)T(C/G)TA(C/T)GG(A/T/C)TGG 3′；

P2：5′-AT(A/G)TA(C/T)TG(A/G)TT(A/G)AA(A/T/G/C)GT(A/T/G/C)GA-3′。

以嗜酸真菌Bispora sp.X-1总DNA为模板进行Touchdown PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min；然后94℃变性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1min，为一个循环；然后每个循环退火温度降低1℃，10个循环后退火温度为37℃；94℃变性30sec，37℃4退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约191bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYNB TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

实施例3木聚糖酶基因的RT-PCR分析

提取Bispora sp.X-1的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(XynB F：5′-ATGCATGCATTCTCATACTTGGCTGTGGCG-3′，XynB R：5′-CTAATTCGACACAGTCTGATACGCATTTCCACTCC-3′)扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

通过比较木聚糖酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个内含子，cDNA长693bp，编码231个氨基酸，N端19个氨基酸为其信号肽序列。推导的氨基酸序列同Hypocrea jecorina，Penicillium funiculosum和Phanerochaetechrysosporium来源的木聚糖酶有较高的序列相似性，分别为57.1，49.8和44.4％。证明从Bispora sp.X-1中分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。

实施例4重组木聚糖酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因xynB双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora sp.X-1木聚糖酶基因xynB的重组质粒pPIC-xynB并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xynB。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为64U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例5重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH2.6，65℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例6重组木聚糖酶XYNB的性质测定

1、重组木聚糖酶XYNB的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中65℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明：XYNB的最适pH为2.6。XYNB在pH1.5～6.0之间，处理后剩余酶活性在80％以上，而在pH7.0～9.0处理后酶活开始下降，在pH9.0，酶活剩余52％。在pH高于10.0的缓冲液中处理后，酶活剩余不足10％(图3)。该酶在整个酸性和中性条件下稳定性好。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH2.6)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在65℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果表明，其最适温度为65℃。在40℃～75℃间具有50％以上的酶活力(图4)。XYNB在60℃下保温60min，酶活性基本维持不变，70℃下保温15min，剩余酶活性为90％以上，处理60min后，酶活仍在70％以上。说明该酶在60℃和70℃条件下，具有非常好的热稳定性(图5)。

3、木聚糖酶的Km值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From birchwood)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH2.6)缓冲液体系中，65℃下测定酶活性，计算出其在65℃下的K_m值。经测定，此木聚糖酶在65℃下以木聚糖为底物的K_m值为29.96mg/mL，V_max为1757.2μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYNB酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1，5和10mmol/L。在65℃、pH2.6条件下测定酶活性。结果(表2)表明：低浓度的Mg²⁺、Cr³⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和β-巯基乙醇对木聚糖酶XYNB有明显的激活作用。低浓度的Cu²⁺、Pb³⁺和Hg²⁺对酶活有部分的抑制作用，SDS的存在使酶完全失活。其余金属离子在低浓度时对XYNB的酶促反应无显著影响。高浓度的Li⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、β-巯基乙醇和EDTA对酶活有明显的激活作用。高浓度的Cu²⁺、Pb³⁺和Hg²⁺对酶活有较强抑制作用，SDS可使酶完全失活。高浓度的其它离子对酶活影响不大。

表2.各种金属离子及化学试剂对木聚糖酶XYNB活力的影响

注：“-”代表无法检测。

5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH2.0 KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0 Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0 KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0 Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/木聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温0、2、5、8、10、20、30和60min取样，在pH2.6及65℃条件下测定酶活性。实验结果表明木聚糖酶XYNB用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后60min后，胰蛋白酶处理的XYNB的酶活性略有降低，是原来的85％。胃蛋白酶处理的XYNB的酶活基本没有发生变化。说明XYNB具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力(图6A)。胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的木聚糖酶XYNB经SDS-PAGE分析表明：胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的XYNB的分子量没有发生改变(图6B)。

6、木聚糖酶降解燕麦木聚糖产物的分析如下：

在500μL 1％的木聚糖中加入100μL纯化的酶液，最适温度下保温3～4h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶XYNB降解燕麦木聚糖的产物主要是木糖，木二糖和少量木三糖和木四糖。产物中木糖含量为47.9％，木二糖含量为50.58％，木三糖的含量为0.21％，木四糖的含量为1.31％。

序列表

<110>广东溢多利生物科技股份有限公司

<120>一种酸性木聚糖酶XYNB及其基因和应用

<160>4

<210>1

<211>230

<212>PRT

<213>真菌(Bispora sp.X-1)

<400>1

MHAFSYLAVA LSALPLLQAA PTSVQKRGAH NFMLSPDHPL MVAKRNASLA

RRSSTNYDQD     60

YTTGGSVYFA PASGEFYVSW DTTDDFVVGV GWNPGSTEPI THGGSFNVDS

GLASLSVYGW    120

STNPLVEYYI IDDEVDLPLS GTEKGTVYSD GSTYTIWENQ RVDEPSIEGT

STFNQYISIR    180

DSPRVSGTVT VENHFQAWAN LGMDLGTLNF QVIAIESWDG SGNAYQTVSN 230

<210>2

<211>211

<212>PRT

<213>真菌(Bispora sp.X-1)

<400>2

APTSVQKRGA HNFMLSPDHP LMVAKRNASL ARRSSTNYDQ DYTTGGSVYF

APASGEFYVS     60

WDTTDDFVVG VGWNPGSTEP ITHGGSFNVD SGLASLSVYG WSTNPLVEYY

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SGTEKGTVYS DGSTYTIWEN QRVDEPSIEG TSTFNQYISI RDSPRVSGTV

TVENHFQAWA    180

NLGMDLGTLN FQVIAIESWD GSGNAYQTVS N             211

<210>3

<211>759

<212>DNA

<213>真菌(Bispora sp.X-1)

<400>3

atgcatgcat tctcatactt ggctgtggcg ctctccgccc tcccgttgtt acaagctgct     60

ccaacatctg tccaaaagcg cggggcccac aacttcatgc tttcccctga tcatccactg    120

atggtggcta agcggaatgc aagccttgcc cgtagatcct ccacaaatta cgatcaagat    180

tacactactg gagggtcggt atatttcgcg cctgccagcg gcgagttcta tgtctcgtgg    240

gatactacag atgatttcgt tgttggcgta ggctggaacc caggcagtac cgagtaagtc    300

ttcgttacac gttcccgtgc tgctgtcatt gtcttctcgt actgacctat tggcactaga    360

ccaatcaccc acggtggtag tttcaacgtc gattccggct tggctagcct ctctgtatat    420

ggctggtcga ccaacccact ggttgaatac tatatcatcg acgacgaagt cgacctacct    480

ctgtcaggta cggagaaagg cactgtctat agcgacggct ccacctacac catttgggag    540

aaccaacgtg tggatgagcc ttccatcgaa ggcacgtcga cctttaatca gtatatctcc    600

attcgcgact ccccacgtgt tagtggaact gtcactgtag aaaaccattt ccaagcatgg    660

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gacgggagtg gaaatgcgta tcagactgtg tcgaattag                           759

<210>4

<211>693

<212>DNA

<213>真菌(Bispora sp.X-1)

<400>1

atgcatgcat tctcatactt ggctgtggcg ctctccgccc tcccgttgtt acaagctgct     60

ccaacatctg tccaaaagcg cggggcccac aacttcatgc tttcccctga tcatccactg    120

atggtggcta agcggaatgc aagccttgcc cgtagatcct ccacaaatta cgatcaagat    180

tacactactg gagggtcggt atatttcgcg cctgccagcg gcgagttcta tgtctcgtgg    240

gatactacag atgatttcgt tgttggcgta ggctggaacc caggcagtac cgaaccaatc    300

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ctcggtatgg accttggaac tctgaatttc caggttattg cgatcgaaag ttgggacggg    660

agtggaaatg cgtatcagac tgtgtcgaat tag                                 693

Claims (12)

1.一种嗜酸真菌Bispora sp.X-1，其保藏号为：CGMCC No.2676。

2.一种酸性木聚糖酶XYNB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种酸性木聚糖酶XYNB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种酸性木聚糖酶基因xynB，其特征在于，编码权利要求2或3所述的木聚糖酶。

5.如权利要求4所述的木聚糖酶基因xynB，，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO.3所示。

6.如权利要求4所述的木聚糖酶基因xynB，，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO.4所示。

7.包含权利要求4所述木聚糖酶基因的重组载体。

8.包含权利要求4所述木聚糖酶基因的重组载体pPIC9-xynB。

9.包含权利要求4所述木聚糖酶基因的重组菌株。

10.一种制备酸性木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求7的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYNB的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNB。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。

12.权利要求2或3所述的酸性木聚糖酶XYNB的应用。

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