CN102181416B - 一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及其基因和应用，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列，编码上述β-甘露聚糖酶的基因man5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体和应用。本发明的β-甘露聚糖酶的具有以下性质：最适pH5.5，具有强耐碱性，在pH8.0和9.的条件下，酶活分别是最高酶活的45％和36％。最适温度70℃。良好的pH稳定性和热稳定性。比活为1,122U mg^-1；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物及鱼类饲料、食品、医药、酿酒、造纸、及洗涤剂工业等。

Description

一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及其基因和应用。

背景技术

甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC3.2.1.78)是一种能降解甘露聚糖主链的水解酶，属于半纤维素酶类。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、饲料、医药、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。

许多微生物，植物和一些低等动物中都存在β-甘露聚糖酶(Millward-Sadler，et alFEMS Microbiol.Lett.1996.141：183-188)。微生物是β-甘露聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。随着分子生物学的发展，部分甘露聚糖酶的编码基因已被克隆并进行了异源表达(Dhawan and Kaur，Crit.Rev.Biotechnol.2007.27：197-216；Moreira and Filho，Appl.Microbiol.Biotechnol.2008.79：165-178.)。根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，β-甘露聚糖酶多被划分为糖苷水解酶家族5，11或113(Henrissat and Bairoch，Biochem.J.1993.293：781-788)。

不同来源的甘露聚糖酶因性质上的差别，其应用范围和价值也不尽相同。国内外研究和报道较多的细菌产甘露聚糖酶多为中性或碱性酶，包括芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、放线菌等。而真菌来源的β-甘露聚糖酶多为酸性，它们作用的最适pH值在2.4～5.0，其中有些甘露聚糖酶能够pH 8.0下有活性，但高于pH 8.0后不再有活性(Dhawan and Kaur，Crit.Rev.Biotechnol.2007.27：197-216)。本发明得到了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶在碱性pH条件下有高活性并具有强耐碱性，同时，该甘露聚糖酶在酸性和中性条件下有高的酶活性，较好的耐热性和极好的抗蛋白酶能力，可应用于动物及鱼类的饲料，应用于食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。

发明内容

本发明再一目的是提供来源于真菌的耐碱β-甘露聚糖酶。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备耐碱β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述耐碱β-甘露聚糖酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、酿酒、造纸以及能源工业中应用新的β-甘露聚糖酶。

从上述真菌中获得了一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1：

  1 MHISTARLLT TSLLASVVAA APHVPKTSKF LTVEGGKFKL GGKDFHFAGS

 51 NAYYFPFNGN QQDIEKGLTA AKNAGLSVFR TWGFNDKNST YIPGGLPNYG

101 GEGAGPSEVV FQWWHPNGTT TIDVSGFDKV VRAAEKVGIK LIVALTNNWA

151 DYGGMDVYTV NLGGQYHDDF YTMPKIRNAF KRYIKEFVTR YKDSPVIAAW

201 ELANEPRCGA DGVRNLPRSP NCTPAVLSAW IAEMSAYIKS LDRNHLVTWG

251 GEGGFNRQSD DWAYNGSDGG DFDHELSLDT IDFGVFHSYP DWWGKTVEWT

301 HQWIRDHAAA GRRARKPVVH EEYGWLTPDK RLEYTGRVDN RTRVEVLGGW

351 QRLTVEEKLA GSMYWQYGYS SYSYGRNHND GFTIYLDDEE AKVLVYQHAR

401 EMNALNRHAH

其中，该酶全长410个氨基酸，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MHISTARLLT TSLLASVVAA”。

因此，成熟的耐碱β-甘露聚糖酶Man5A的理论分子量为42.3kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

  1 APHVPKTSKF LTVEGGKFKL GGKDFHFAGS NAYYFPFNGN QQDIEKGLTA

 51 AKNAGLSVFR TWGFNDKNST YIPGGLPNYG GEGAGPSEVV FQWWHPNGTT

101 TIDVSGFDKV VRAAEKVGIK LIVALTNNWA DYGGMDVYTV NLGGQYHDDF

151 YTMPKIRNAF KRYIKEFVTR YKDSPVIAAW ELANEPRCGA DGVRNLPRSP

201 NCTPAVLSAW IAEMSAYIKS LDRNHLVTWG GEGGFNRQSD DWAYNGSDGG

251 DFDHELSLDT IDFGVFHSYP DWWGKTVEWT HQWIRDHAAA GRRARKPVVH

301 EEYGWLTPDK RLEYTGRVDN RTRVEVLGGW QRLTVEEKLA GSMYWQYGYS

351 SYSYGRNHND GFTIYLDDEE AKVLVYQHAR EMNALNRHAH

本发明还提供了编码上述耐碱β-甘露聚糖酶的基因。

该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

   1 ATGCACATCT CGACTGCAAG GTTGCTGACC ACCAGCCTCC TGGCTAGTGT CGTTGCTGCG

  61 GCGCCGCATG TTCCCAAGAC GTCGAAGTTC CTCACTGTGG AAGGGGGGAA GTTCAAGCTT

 121 GGGGGGAAAG ACTTCCACTT TGCGGGAAGC AACGCTTACT ATTTCCCGTT CAATGGGGTA

 181 TGTGGGATTT TTCCGTTGAT CGTCCCGTCA TACCTATGAG ACTGAGGTGT TCAGCTCACT

 241 CACCACCCAA TAATCTAGAA CCAGCAAGAC ATCGAAAAGG GCCTCACGGC AGCAAAGAAC

 301 GCTGGCTTGA GTGTGTTCCG CACGTGGGGC TTCAATGACA AAAACTCGAC GTATATCCCC

 361 GGTGGCCTTC CGAACTATGG CGGCGAGGGC GCTGGGCCTT CCGAGGTCGT GTTCCAGTGG

 421 TGGCATCCTA ACGGAACAAC CACGATCGAT GTTAGCGGCT TCGACAAGGT TGTTCGGGCC

 481 GCGGAAAAGG TGGGAATCAA GCTCATTGTT GCCTTGACGA ACAATTGGGC CGACTATGGC

 541 GGAATGGACG TATACACAGT GAACCTCGGC GGCCAATACC ACGACGATGT AGGTCGATCT

 601 ATTCCCGTTA CATGTCACGG ACTAACACCA GCCCAGTTCT ACACGATGCC CAAAATTAGG

 661 AACGCCTTCA AGAGGTACAT CAAAGAATTT GTTACGCGAT ACAAGGACTC GCCTGTGATT

 721 GCTGCCTGGG AACTTGCGAA CGAGCCTCGC TGTGGTGCTG ATGGGGTGCG CAACCTGCCG

 781 CGGAGCCCAA ACTGTACACC GGCCGTCTTG TCGGCATGGA TTGCTGAGAT GAGCGCATAC

 841 ATCAAGTCGT TGGATCGGAA CCACCTTGTG ACCTGGGGCG GCGAGGGTGG CTTCAACCGC

 901 CAGTCCGACG ATTGGGCATA CAACGGCAGT GATGGCGGCG ACTTCGATCA TGAACTATCC

 961 CTCGATACTA TCGACTTCGG TGTTTTCCAC TCCTACCCCG ACTGGTGGGG TAAGACGGTT

1021 GAATGGACAC ACCAGTGGAT TCGGGATCAC GCAGCTGCTG GCCGCCGAGC CCGCAAGCCT

1081 GTTGTCCACG AAGAGTATGG TTGGCTGACT CCGGACAAAC GGCTTGAATA CACGGGAAGA

1141 GTCGATAACC GCACCCGTGT TGAAGTGCTG GGCGGTTGGC AAAGGCTTAC TGTTGAGGAG

1201 AAGTTGGCTG GGAGCATGTA CTGGCAATAT GGCTACTCGT CATATTCCTA CGGCCGCAAC

1261 CACAACGATG GGTTCACGAT TTACCTCGAT GATGAGGAGG CCAAGGTTCT TGTCTATCAG

1321 CACGCGAGAG AGATGAACGC ACTTAACCGT CACGCTCACT AG

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一β-甘露聚糖酶基因man5A，DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶Man5A结构基因man5A全长1362bp，含有3个内含子，+178～+258bp，+589～636bp为其内含子序列，cDNA长1233bp，其cDNA序列如SEQIDNO.4所示。

  1 ATGCACATCT CGACTGCAAG GTTGCTGACC ACCAGCCTCC TGGCTAGTGT CGTTGCTGCG

 61 GCGCCGCATG TTCCCAAGAC GTCGAAGTTC CTCACTGTGG AAGGGGGGAA GTTCAAGCTT

121 GGGGGGAAAG ACTTCCACTT TGCGGGAAGC AACGCTTACT ATTTCCCGTT CAATGGGAAC

181 CAGCAAGACA TCGAAAAGGG CCTCACGGCA GCAAAGAACG CTGGCTTGAG TGTGTTCCGC

241 ACGTGGGGCT TCAATGACAA AAACTCGACG TATATCCCCG GTGGCCTTCC GAACTATGGC

 301 GGCGAGGGCG CTGGGCCTTC CGAGGTCGTG TTCCAGTGGT GGCATCCTAA CGGAACAACC

 361 ACGATCGATG TTAGCGGCTT CGACAAGGTT GTTCGGGCCG CGGAAAAGGT GGGAATCAAG

 421 CTCATTGTTG CCTTGACGAA CAATTGGGCC GACTATGGCG GAATGGACGT ATACACAGTG

 481 AACCTCGGCG GCCAATACCA CGACGATTTC TACACGATGC CCAAAATTAG GAACGCCTTC

 541 AAGAGGTACA TCAAAGAATT TGTTACGCGA TACAAGGACT CGCCTGTGAT TGCTGCCTGG

 601 GAACTTGCGA ACGAGCCTCG CTGTGGTGCT GATGGGGTGC GCAACCTGCC GCGGAGCCCA

 661 AACTGTACAC CGGCCGTCTT GTCGGCATGG ATTGCTGAGA TGAGCGCATA CATCAAGTCG

 721 TTGGATCGGA ACCACCTTGT GACCTGGGGC GGCGAGGGTG GCTTCAACCG CCAGTCCGAC

 781 GATTGGGCAT ACAACGGCAG TGATGGCGGC GACTTCGATC ATGAACTATC CCTCGATACT

 841 ATCGACTTCG GTGTTTTCCA CTCCTACCCC GACTGGTGGG GTAAGACGGT TGAATGGACA

 901 CACCAGTGGA TTCGGGATCA CGCAGCTGCT GGCCGCCGAG CCCGCAAGCC TGTTGTCCAC

 961 GAAGAGTATG GTTGGCTGAC TCCGGACAAA CGGCTTGAAT ACACGGGAAG AGTCGATAAC

1021 CGCACCCGTG TTGAAGTGCT GGGCGGTTGG CAAAGGCTTA CTGTTGAGGA GAAGTTGGCT

1081 GGGAGCATGT ACTGGCAATA TGGCTACTCG TCATATTCCT ACGGCCGCAA CCACAACGAT

1141 GGGTTCACGA TTTACCTCGA TGATGAGGAG GCCAAGGTTC TTGTCTATCA GCACGCGAGA

1201 GAGATGAACG CACTTAACCG TCACGCTCAC TAG

其中，信号肽的碱基序列为：ATGCACATCT CGACTGCAAG GTTGCTGACC ACCAGCCTCCTGGCTAGTGT CGTTGCTGCG。

该酶属于糖基水解酶第5家族。将β-甘露聚糖酶基因man5A cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因多与假定蛋白有高的序列一致性，而与来源于Aspergillus nidulans的甘露聚糖酶序列一致性最高为68％，与来源于Phanerochaete chrysosporium的甘露聚糖酶序列一致性最高为36％说明Man5A是一种新的甘露聚糖酶。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-man5A。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5A。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/man5A。

本发明还提供了一种制备耐碱β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/man5A。

本发明还提供了上述耐碱β-甘露聚糖酶的应用。

运用基因工程手段来产业化生产真菌耐碱甘露聚糖酶产品还未见报道。本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有在酸性中性及碱性范围内均具有高活性，作用pH范围广，且具有强的耐碱性。具有较好的耐热性和优良的抗蛋白酶能力，可作应用于动物及鱼类的饲料、食品、医药、造纸等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产耐碱甘露聚糖酶。

附图说明

图1man5A在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2，发酵培养上清；3，纯化的重组β-甘露聚糖酶；4，脱糖基后的β-甘露聚糖酶。

图2本发明重组β-甘露聚糖酶的最适pH值。

图3本发明β-甘露聚糖酶的pH稳定性。

图4本发明β-甘露聚糖酶最适反应温度。

图5本发明β-甘露聚糖酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Humicola insolens Y1培养基为麸皮培养基：在11水中加入24g麦麸煮沸15min，纱布过滤，滤液调pH6.0.培养温度42℃。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1β-甘露聚糖酶编码基因man5A的克隆

真菌Y1分离自河北树林土壤。提取真菌Humicola insolens Y1基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据已发表的甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物P1，P2。以Humicolainsolens Y1总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，32个循环后72℃保温8min。得到一约230bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物usp1，usp2，usp3；dsp1，dsp2，dsp3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。

表1.甘露聚糖酶基因克隆的简并引物及TAIL-PCR特异性引物

实施例2β-甘露聚糖酶基因的RT-PCR分析

提取Humicola insolens Y1的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(MAN5A F：5′-ATGCACATCTCGACTGCAAGGTTGCTGACC-3′，MAN5A R：5′-CTAGTGAGCGTGACGGTTAAGTGCGTTCATC-3′)扩增该单链cDNA，获得甘露聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

通过比较甘露聚糖酶酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有2个内含子，cDNA长1233bp，编码410个氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列，所测出的基因man5A的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的甘露聚糖酶基因序列进行同源比较，该基因多与假定蛋白有高的序列一致性，而与来源于Aspergillus nidulans的甘露聚糖酶序列一致性最高为68％，与来源于Phanerochaete chrysosporium的甘露聚糖酶序列一致性最高为36％，证明从Humicolainsolens Y1中分离克隆得到的编码甘露聚糖酶的基因为新基因。

实施例3重组β-甘露聚糖酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码甘露聚糖酶的基因man5A双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟甘露聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Humicola insolens Y1甘露聚糖酶基因man5A的重组质粒pPIC-man5A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/man5A。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定甘露聚糖酶的活力。重组甘露聚糖酶的表达量为15U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。

实施例4重组β-甘露聚糖酶的活性分析

采用DNS法对本发明的甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 5.5，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。

甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(IU)。

实施例5甘露聚糖酶Man5A的最适pH及pH稳定性

经纯化的甘露聚糖酶Man5A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 22～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，pH 8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液及pH10.0～12.0的Gly-NaOH系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶Man5A在不同pH的缓冲体系，70℃下测定的pH适性结果(图2)表明：Man5A的最适pH为5.5，在pH5.5～7.0范围内，酶活性维持在75％以上，而在pH9.0和10.0以上，酶活性分别维持在35％和10％以上。这是首次分离的在碱性条件下有高酶活的真菌甘露聚糖酶。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH5.0～12.0之间保持最适pH下酶活的85％以上，这说明此酶具有较好的耐碱特性。

实施例6甘露聚糖酶Man5A酶反应最适温度及热稳定性。

最适温度的测定在pH 5.5缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为70℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，Man5A在50℃下稳定。

实施例7甘露聚糖酶Man5A的动力学参数的测定

用不同浓度的角豆胶(0.5-10mg ml^-1)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系中，70℃下测定酶活性，计算出其K_m值。经测定，以角豆胶为底物时的K_m值分别为1.49mg ml^-1和1,122μmol min^-1mg^-1。

实施例8不同化学试剂甘露聚糖酶Man5A酶活性的影响。

在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度分别为5mmol/L和10mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明：Na⁺，K⁺，Li⁺，Mg²⁺，EDTA或β-巯基乙醇对酶活有激活作用或没有影响。Ca²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，或5mM Cr³⁺能部分(＜50％)抑制Man5A的活性。Pb²⁺，Hg²⁺，SDS，或10mM Cr³⁺，Mn²⁺和Cu²⁺，Hg²⁺和SDS对Man5A有极强的抑制作用。

表2各种化学试剂对甘露聚糖酶Man5A活力的影响

实施例9甘露聚糖酶Man5A的蛋白酶能力。

将纯化的Man5A(100μg ml^-1)与不同的蛋白酶，包括：胰蛋白酶(pH 7.6，25℃)，一α-胰凝乳蛋白酶(pH 7.8，25℃)，胶原蛋白酶(pH 7.4，37℃)，枯草杆菌蛋白酶A(pH 7.4，37℃)和蛋白酶K(pH 7.5，37℃)，按1∶10(蛋白酶：Man5A，w/w)的比例混合温浴。温浴30分钟或60分钟后，在pH6.5及50℃条件下测定酶活性。实验结果表明甘露聚糖酶Man5A用胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，胶原蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K处理30min或60min后，木聚糖酶的活力均维持在97％以上。说明Man5A有很强的抗蛋白酶降解的能力。

Claims (7)

1.一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种耐碱β-甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，编码权利要求1所述的β-甘露聚糖酶。

3.如权利要求2所述的β-甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，其碱基序列如下所示：

gcgccgcatg ttcccaagac gtcgaagttc ctcactgtgg aaggggggaa gttcaagctt      60

ggggggaaag acttccactt tgcgggaagc aacgcttact atttcccgtt caatgggaac      120

cagcaagaca tcgaaaaggg cctcacggca gcaaagaacg ctggcttgag tgtgttccgc      180

acgtggggct tcaatgacaa aaactcgacg tatatccccg gtggccttcc gaactatggc      240

ggcgagggcg ctgggccttc cgaggtcgtg ttccagtggt ggcatcctaa cggaacaacc      300

acgatcgatg ttagcggctt cgacaaggtt gttcgggccg cggaaaaggt gggaatcaag      360

ctcattgttg ccttgacgaa caattgggcc gactatggcg gaatggacgt atacacagtg      420

aacctcggcg gccaatacca cgacgatttc tacacgatgc ccaaaattag gaacgccttc      480

aagaggtaca tcaaagaatt tgttacgcga tacaaggact cgcctgtgat tgctgcctgg      540

gaacttgcga acgagcctcg ctgtggtgct gatggggtgc gcaacctgcc gcggagccca      600

aactgtacac cggccgtctt gtcggcatgg attgctgaga tgagcgcata catcaagtcg      660

ttggatcgga accaccttgt gacctggggc ggcgagggtg gcttcaaccg ccagtccgac      720

gattgggcat acaacggcag tgatggcggc gacttcgatc atgaactatc cctcgatact      780

atcgacttcg gtgttttcca ctcctacccc gactggtggg gtaagacggt tgaatggaca      840

caccagtgga ttcgggatca cgcagctgct ggccgccgag cccgcaagcc tgttgtccac      900

gaagagtatg gttggctgac tccggacaaa cggcttgaat acacgggaag agtcgataac      960

cgcacccgtg ttgaagtgct gggcggttgg caaaggctta ctgttgagga gaagttggct      1020

gggagcatgt actggcaata tggctactcg tcatattcct acggccgcaa ccacaacgat      1080

gggttcacga tttacctcga tgatgaggag gccaaggttc ttgtctatca gcacgcgaga      1140

gagatgaacg cacttaaccg tcacgctcac tag                                   1173

。

4.包含权利要求2所述β-甘露聚糖酶基因的重组载体。

5.包含权利要求2所述β-甘露聚糖酶基因的重组载体pPIC9-man5A，其特征在于，将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC9-man5A。

6.包含权利要求2所述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

7.权利要求1所述的耐碱β-甘露聚糖酶Man5A用于水解-甘露聚糖的应用。

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