CN103320415B - 一种耐热中性纤维素酶Cel61及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐热中性纤维素酶Cel61及其基因。本发明提供了一种来源于Humicola insolens X9的纤维素酶Cel61，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性纤维素酶的编码基因cel61。本发明的纤维素酶具有以下性质：最适pH7.0，最适温度65℃，良好的热稳定性，在中性和碱性范围内依然保持较高酶活，与纤维二糖水解酶协同作用，在复合纤维素酶中添加可以有效提微晶纤维素的水解效率。做为一种新型的纤维素酶制剂，可广泛用于能源、纺织等工业。

Description

一种耐热中性纤维素酶Cel61及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐热中性纤维素酶Cel61及其基因和应用。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40～61%，是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子（WongKK,et al.Microbiol Rev1988,52:305-317.）。木质素约占细胞干重的15～25%，是一种复杂酚类聚合物。纤维素的降解需要纤维素酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。按纤维素酶催化反应的最适p H值,可将其分为酸性纤维素酶(最适p H值为3～5)、中性纤维素酶(最适p H值为6～8)和碱性纤维素酶(最适p H值为8～11)（Zhang YHP,et al.Biotechnol Adv2006,24:612-481.）。

纤维素酶有着广泛的应用，例如：造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域。而同时，由于能源短缺和环境的问题，生物能源作为一种新的替代品而备受人们的关注。目前研究最多的主要为微生物来源的纤维素酶，其中真菌由于其分泌量大，且分泌到胞外而成为研究的热点。但是，不同的工业应用，对纤维素酶的性质的需求是不同的，如：饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要嗜碱的纤维素酶。目前工业应用的纤维素酶，主要来自木霉属Trichoderma reesei和Penicillium spp.，这些酶的最适pH在5.0左右，最适温度在50-60度之间，而嗜热和热稳定性好的酶则有更好的优势：耐热可以提高反应速率，降低底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。

由于不同工业对纤维素酶需求的不同，因此，获得新型具有优良特性纤维素酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于生物能源、纺织等领域。近年来，人们发现糖苷水解酶61家族的纤维素酶具有氧化酶活性，同时发现在瑞氏木霉纤维素酶系中添加少量61家族的纤维素酶可以大大提高玉米秸秆的水解效率。本专利中高温真菌Humicola insolens X9所产纤维素酶大多为高温中性的特性，并且具有很高的微晶纤维素的降解能力，利于在生物能源工业中应用。本发明中纤维素酶Cel61具有以下性质：最适pH7.0，在pH5～10范围内具有60%以上的酶活力，最适温度65℃，良好的热稳定性，在60℃处理1个小时酶活几乎没有损失，并且与复合纤维素酶协同作用可以有效提高玉米秸秆的水解效率。热稳定性优良并在中性和碱性范围内具有较高酶活力的特性使其在工业应用上具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐热中性纤维素酶。

本发明的再一目的是提供编码上述耐热中性纤维素酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐热中性纤维素酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐热中性纤维素酶的应用。

本发明从腐质霉(Humicola insolens X9)中分离得到一种新的耐热中性纤维素酶Cel61。

本发明提供了一种纤维素酶Cel61，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

Mkgllsiaalslavgeasahyifqqlstggtkhpmwkyirqhtnynspvidldsndlrcnvgargagtetvtvaagssltfhldtpvyhqgpvsvymskapgsvsdydgsggwfkiqdwgptftgsgatwklddsytfnipscipdgeylvriqslgihnpwpagipqfyiscaqvrvtgggnanpspqvsipgafketdpgytaniynnfrsytvpgpsvftcsgnsgggsnpsnpnpptpttfttqvttptpvsppsctvakwgqcggqgysgctnceagstcrqqnayysqci

其中，该酶包括296个氨基酸和一个终止密码子，N-端19个氨基酸为信号肽，因此，成熟的纤维素酶Cel61的理论分子量为29.5kDa

本发明的Cel61同时具有好的热稳定性，常温下，在中性和碱性的范围内均具有高活性。本发明的纤维素酶，其最适pH值为7.0，在pH5.0～9.0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为65℃，在60℃和70℃具有良好的热稳定性。

本发明提供了编码上述耐热中性纤维素酶的基因cel61。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

atgaagggacttctcagcatcgccgccctttccctggcggttggtgaggcttcggcccactacatcttccagcagctctcgacgggtggcaccaagcaccccatgtggaagtacatccgccagcacaccaactacaactctcccgtcatcgacctcgactccaacgacctccgctgcaatgtcggtgcccggggtgctggaactgagaccgttacggtcgctgctggctcgagcctgaccttccacctcgacacccccgtctaccaccagggccctgtgtcggtctacatgtccaaggctcccggctccgtgtcggactatgacggcagcggcggctggttcaagattcaagactggggcccgaccttcaccggcagcggcgccacctggaagctggatgactcctacaccttcaacatcccctcgtgcattcccgacggcgagtacctcgtccgcatccagtccctgggtatccacaacccctggccggcgggtattccgcagttctatatctcgtgcgctcaggtgcgcgtcaccggcggtggcaacgcgaacccgagcccgcaggtgtcgatcccaggtgccttcaaggagaccgacccgggctacactgccaacatctacaacaacttccgcagctacaccgtccccggcccgtccgtcttcacctgcagcggcaacagcggcggcggctccaaccccagcaaccctaaccccccgaccccgacgaccttcaccacccaggtgaccaccccgaccccggtgtctccgccctcttgcaccgtcgcgaagtggggccagtgcggtggccagggctacagcggctgcaccaactgcgaggccggctcgacctgcaggcagcagaacgcttactattctcagtgcatctaa

本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了耐热中性纤维素酶基因cel61，cDNA全序列分析结果表明，中性纤维素酶Cel61的结构基因cel61全长891bp。

成熟蛋白理论分子量为29.5kDa，将纤维素酶基因cel61序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定Cel61是一种新的纤维素酶。

本发明还提供了包含上述耐热中性纤维素酶基因cel61的重组载体，命名为pPIC-cel61。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel61。

本发明还提供了包含上述耐热中性纤维素酶基因cel61的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/cel61。

本发明还提供了一种制备耐热中性纤维素酶Cel61的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel61。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel61。

本发明还提供了上述耐热中性纤维素酶Cel61的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在能源工业中应用新的纤维素酶。本发明的纤维素酶最适pH为7.0，在pH5.0～9.0都有较高的酶活性。其耐耐热特性，可使其在需求耐热环境的工业生产上应用。本纤维素酶可应用于能源工业，纤维物质转化为可发酵糖的过程。

附图说明

图1重组纤维素酶Cel61的最适pH。

图2重组纤维素酶Cel61的pH稳定性。

图3重组纤维素酶Cel61的最适温度。

图4重组纤维素酶Cel61的热稳定性。

图5重组纤维素酶Cel61与其他纤维素酶协同作用。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从腐质霉(Humicola insolens X9)中分离得到分离得到一种新的耐热中性纤维素酶Cel61。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

（1）Phialophora sp.培养基为马铃薯培养基：1000mL200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1腐质霉Humicola insolens X9纤维素酶编码基因cel61的克隆

提取Humicola insolens X9基因组DNA：

将PDB（200g/L土豆煮汁，葡萄糖20g/L）液体培养5天的培养物离心收集菌体放入研钵中研磨5min,加入10mLCTAB提取液，置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解2h以上，每隔20min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于-20℃静置30min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

腐质霉Humicola insolens X9分离于河北省森林土壤，最适生长温度45℃，pH为6.0。在PDA培养基培养3d后，菌落黑色，边缘有菌褶。分生孢子梗短，单生，呈暗色。分生孢子，单生，球形或亚球形，棕色。

根据第61家族纤维素酶基因的保守(AHYIFQ和FYISCAQ)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-GCNCAYTAYATHTTYCAR-3'；

P2:5'-YTGNGCRCANSWDATRTARAA-3')。

以Humicola insolens X9总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约470bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送博迈德公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3(上游特异性引物)、dsp1、dsp2、dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.纤维素酶Cel61TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德公司测序。拼接后Cel61纤维素酶基因全长891bp，编码296个氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为29.5kDa。

实施例2重组纤维素酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码纤维素酶的基因cel61双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟纤维素酶的基因片段（不包含信号肽序列）与表达载体pPIC9连接，获得含有Humicola insolens X9纤维素酶基因cel61的重组质粒pPIC-Cel61并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/cel61。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定纤维素酶的活力。重组纤维素酶的表达量为1.5U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组纤维素酶在毕赤酵母中得到了表达。重组纤维素酶的比活为26.3U/mg。

以同样方法构建包含信号肽序列的纤维素酶基因cel61的重组质粒，并转化表达，收集上清，检测到重组维素酶的活性。

实施例3重组纤维素酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH7.0，65℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4重组纤维素酶Cel61的性质测定

1、重组纤维素酶Cel61的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例2纯化的重组纤维素酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物CMC-Na用不同pH的0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中65℃下进行纤维素酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶Cel61的最适pH为7.0，在pH5.0～10.0有60%以上的相对酶活性。纤维素酶于上述各种不同pH的缓冲液中60℃处理120min，再在pH7.0缓冲液体系中65℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。在pH4.0～10.0，处理60min，酶活保持基本不变，有很好的稳定性（图2）。

2、纤维素酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

纤维素酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为纤维素酶在不同温度下处理不同时间，再在65℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为65℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Cel61有良好的热稳定性，在60℃下温育2h，酶活保持不变，70℃时其半衰期为0.5h。

3、不同金属离子化学试剂对Cel61酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在65℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为10mmol时重组纤维素酶的活力没有明显变化。但是Ag⁺、Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。

4、重组纤维素酶Cel61与纤维素酶系的协同作用

纤维素转化分析体系为25g/L微晶纤维素（Avicel）溶解到50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)中，50℃下反应1到5天。其中加入每g纤维素中加入50mgCel61,10mg纤维二糖水解酶（HiCDH）（Cellobiose dehydrogenases from Humicolainsolens strain DSM1800,GenBank accession number:AF257654），50mg混合纤维酶CelMix（Celluclast Plus，Novozymes）。水解产物利用HPLC进行分析。结果发现（图5），单独添加Cel61并不能对微晶纤维素进行高效水解，但添加少量Cel61和HiCDH能有效提高纤维素酶降解微晶纤维素能力，并且随着时间的延长其水解效果更明显。

Claims (10)

1.一种耐热中性纤维素酶Cel61，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种耐热中性纤维素酶基因cel61，其特征在于，编码权利要求1所述的耐热中性纤维素酶Cel61。

3.如权利要求2所述的耐热中性纤维素酶基因cel61，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述耐热中性纤维素酶基因cel61的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-Cel61，将权利要求2所述的耐热中性纤维素酶基因cel61插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控。

6.包含权利要求2所述耐热中性纤维素酶基因cel61的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.一种制备权利要求1所述耐热中性纤维素酶cel61的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel61。

9.权利要求1所述耐热中性纤维素酶Cel61用于降解微晶纤维素的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述耐热中性纤维素酶Cel61与纤维二糖水解酶共同使用。