CN114369588B - 一种中性纤维素酶突变体及其应用 - Google Patents

一种中性纤维素酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种中性纤维素酶突变体及其在纺织领域中的应用。所述突变体在pH7.0‑8.5范围内具有较高的酶活性，可广泛应用于纺织品的染整加工，提高对织物的除毛、起花效果，减少纤维素酶的用量，从而降低成本。

Description

一种中性纤维素酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种中性纤维素酶突变体及其在纺织领域中的应用。
背景技术
纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它不是单种酶，这组酶可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，使得纤维素转变为纤维二糖和葡萄糖，纤维素酶属于一种复杂的复合物，被称为纤维素酶系。它们之间相互发生协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶属于糖苷水解酶，传统上被分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶（即纤维二糖水解酶）和β-葡萄糖苷酶。
1906年，Seilliere在蜗牛的消化液中发现了纤维素酶，至今已有一百余年。随着工业的发展，纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。从20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球、脱毛以及增柔等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。
2014年，姚斌等筛选到Thielavia arenaria XZ7产生的一种45家族纤维素酶，其最适pH值为5.5，最适温度为60℃，在碱性条件下具有一定酶活力且耐碱性好，在90℃下处理1h保留最适条件70％左右的酶活力，沸水里处理1h后仍具有最适条件50％的酶活力，热稳定性非常好，可很好的应用于纺织领域。2016年，赖伟坚等提供了一种涉及亲本GH45纤维素酶的变体，该变体包含催化结构域和纤维素结合结构域，其中该纤维素酶结合结构域与该催化结构域是异源的，并且其中该变体与亲本GH45纤维素酶相比具有改进的纤维素纺织品生物整理活性。2019年，魏东芝公开了一种来源于深海真菌Phaeosphaeria sp.LH21的具有宽广pH活性纤维素酶，可广泛应用于在生物石洗、织物抛光、纸桨处理以及生物质的转变等方面。
纺织工业是传统意义上的高污染行业，在追求人与环境和谐相处的今天，寻找高效率、低污染的新型纺织技术成为了一个必须解决的难题。当今的服装潮流更是追求工艺低污染、面料纯天然、穿着舒适轻盈。生物技术发展至今其在各个工业领域的辅助作用是无可厚非的,而酶制剂的应用以其高效、低价、低污染的优势必将成为纺织行业等其他传统工业突破技术难题的优良辅助手段。纤维素酶在纺织工业上应用广泛，有着不可替代的优势和良好的发展前景。因此，通过基因工程手段生产高效、低价、低污染的纤维素酶，是目前纺织行业亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种中性纤维素酶突变体及其在纺织领域中的应用。所述突变体在pH7.0-8.5范围内具有较高的酶活性，可广泛应用于纺织品的染整加工，提高对织物的除毛、起花效果，减少纤维素酶的用量，从而降低成本。
本发明一方面涉及一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶的第109位氨基酸由Ser突变为Asn。
本发明一方面涉及编码上述纤维素酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
将上述重组表达载体转入里氏木霉宿主细胞中进行重组表达，获得的纤维素酶突变体在pH7.0-8.5范围内具有更高的酶活力。
本发明还涉及上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
本发明提供的突变位点S109N可使纤维素酶SCD45的pH适用范围向中性和碱性条件偏移，显著提高其在pH7.0-8.5范围内的酶活水平。其中，纤维素酶SCD45的最适pH为6.0，而本发明提供的纤维素酶突变体NSCD45的最适pH为7.0；而且，在pH 8.5条件下，纤维素酶突变体NSCD45的酶活残留率为54.66%，而纤维素酶SCD45的酶活残留率仅为16.43%。所述纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点均匀；所述纤维素酶突变体NSCD45的用量仅为纤维素酶SCD45的59.2%，即可达到相同的除毛、水洗效果，能大大节约用酶成本，提高经济效益，取得了意料不到的技术效果。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳检测图；
图2为纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45最适pH曲线；
图3为纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45的除毛效果对比；
图4为纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45的水洗效果对比。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1 纤维素酶突变体基因的获得及表达载体的构建
1.1 纤维素酶突变体的获得
为了提高纤维素酶SCD45（氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，编码核苷酸序列为SEQ IDNO：2）在中性条件下的酶活力，申请人通过定向进化技术对该酶活性位点附近的氨基酸进行了大量突变的筛选。
设计PCR引物NcE-F1、NcE-R1如下：
NcE-F1： GGCGAATTCGCCGATGGCAAGTCGACC （下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；
NcE-R1：ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTACCAG（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）。
以纤维素酶SCD45基因（SEQ ID NO: 2）为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 μL含有0.1 mMIPTG的LB+Amp培养基，37℃ 220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有纤维素酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出50 μL裂解液至两块新的96孔板，分别在pH6.0和pH7.0条件下测定其纤维素酶酶活，并以pH6.0条件下的酶活计100%，计算pH7.0条件下的相对酶活。结果发现，与纤维素酶SCD45相比，有些突变体在pH7.0条件下的相对酶活没有变化，有些突变体的相对酶活甚至降低了，均不符合要求。最终，申请人获得了既能显著提高纤维素酶在pH7.0条件下的相对酶活，又不会影响原有酶学性质的突变位点：S109N。
在上述纤维素酶SCD45的基础上，本发明提供了含S109N单个突变位点的突变体，命名为纤维素酶NSCD45，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
1.2 表达载体的构建
申请人依照里氏木霉的密码子偏爱性分别对纤维素酶SCD45的编码核苷酸序列SEQ ID NO：2和突变体纤维素酶NSCD45的编码核苷酸序列SEQ ID NO：4进行优化合成，并且在合成序列的5’和3’两端分别加上KpnI和MluI 两个酶切位点。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。
将上述合成的纤维素酶基因和pSC1G载体分别用限制性内切酶KpnI和MluI（Fermentas）进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接并转化大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素进行选择，并对阳性克隆进行测序（Invitrogen）。测序正确后，即得到含有纤维素酶基因的重组表达载体。
实施例2 重组表达纤维素酶的基因工程菌株的构建与筛选
2.1原生质体制备
接种宿主里氏木霉（Trichoderma reesei）SCHD4菌丝于PDA平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120 mL YEG+U（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；
多层纱布过滤收集菌丝，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于20ml含有0.2g裂解酶（Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma）的溶液Ⅰ（0.7M NaCl）中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；
将预冷的20 mL 溶液Ⅱ（1.2M 山梨醇，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl）加入上述溶液中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入5ml预冷的溶液Ⅱ重悬菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的溶液Ⅱ重悬菌体至原生质体的浓度为108个/ml，以200μL/管进行分装。
2.2 PEG介导的原生质体转化与菌株验证
以下操作均在冰上进行：将10μg重组表达载体加入到200μL上述原生质体溶液中，接着加入50µL 溶液Ⅲ（25% PEG 6000，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl）轻轻混匀，温和混匀后在冰上放置20min，然后加入2mL溶液Ⅲ，轻轻混匀，室温静置5 min，最后加入4 mL溶液Ⅱ，温和混匀各管，把混合物轻轻加到50 mL且熔化后冷却至45-55℃的转化上层培养基（1%葡萄糖，0.6% (NH4)2SO4，1% KH2PO4，0.1% MgSO4，0.3%Na3citrate·2H2O, 0.1%微量元素（微量元素母液：5% FeSO4·7H2O，1.4% ZnSO4·7H2O，1.6% MnSO4·H2O，1.2% COCl2），21.86%山梨醇，1.5%琼脂糖）中，轻轻混匀后倒入转化下层培养基平板（1%葡萄糖，0.6% (NH4)2SO4，1%KH2PO4，0.1% MgSO4，0.3%Na3citrate·2H2O, 0.1%微量元素（微量元素母液：5% FeSO4·7H2O，1.4% ZnSO4·7H2O，1.6% MnSO4·H2O，1.2% COCl2），1.5%琼脂粉），30℃培养5~7 d至转化子长出。
挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2 d；取适量菌丝体置于2 mL离心管中，加入100 mg无菌石英砂和400 μL抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mMNaCl, 1%SDS)；用珠打仪剧烈振荡2 min；65℃水浴20 min后，加入200 μL 10 M NH4AC，冰浴10 min；13000 rpm离心10 min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min；13000 rpm离心10 min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。
以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物SCD45-F’和SCD45-R’进行PCR扩增目的基因进行验证。
SCD45-F’： CGGGGTACCGCCGATGGCAAGTCGACC (KpnI)；
SCD45-R’： CGACGCGTCTACAGGCACTGATGGTACCAG (MluI)。
PCR扩增条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s；58℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃7 min，16℃ 30 min；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，并进行测序分析。测序结果正确的阳性转化子即为重组表达纤维素酶的里氏木霉工程菌。
申请人将上述构建得到的重组表达纤维素酶SCD45的工程菌命名为里氏木霉SCD45（Trichoderma reesei SCD45），将重组表达纤维素酶突变体NSCD45的工程菌命名为里氏木霉NSCD45（Trichoderma reesei NSCD45）。
实施例3 发酵验证和酶学性质测定
将实施例2构建得到的里氏木霉SCD45和里氏木霉NSCD45分别接种于摇瓶发酵培养基（(NH4)2SO4 9.0g/L，(NH4)2HPO4 4g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，柠檬酸·H2O 0.73g/L，FeSO4·7H2O 0.75g/L，CaCl2 1.125g/L，葡萄糖 10g/L，KH2PO4 20g/L，玉米浆 15ml，微量元素 1ml（母液200ml：ZnSO4·7H2O 12g，CuSO4·5H2O 2.4g，MnSO4·H2O 1.06g，H3BO3 0.6g），液糖 40ml），30℃培养48小时，然后25℃培养72小时，分别取发酵上清液进行酶活检测和SDS-PAGE电泳检测。
结果显示，里氏木霉SCD45和里氏木霉NSCD45的摇瓶发酵上清液中纤维素酶酶活分别为145U/ml和161U/ml；如图1所示的电泳图中箭头所指位置处的蛋白条带即为纤维素酶。从而说明，本发明构建得到的基因工程菌里氏木霉SCD45和里氏木霉NSCD45能分别高效表达纤维素酶SCD45及其突变体NSCD45。
纤维素酶酶活测定方法：
（1）酶活定义：
在50℃、pH值为6.0的条件下，每分钟从浓度为5 mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄糖等量。
（2）检测方法：
取三支试管各加入0.5 mL CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5 min。在第一、二试管中各加入0.5 mL待测酶液，并计时，50℃水浴中反应15 min。反应完后在三支试管中各加入1.5 mL DNS试剂，并在第三支试管补加0.5 mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5 min。迅速冷却至室温，用水定到5.0 mL。以第三支试管试液为对照在540 nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。
酶活X＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n
其中:X——酶活力单位，IU/g(mL)；
180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；
15——待测液与底物的反应时间；
0.5——加入反应的待测酶液量；
n——稀释倍数。
实施例4 纤维素酶酶学性质分析
用pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0的缓冲液分别稀释上述里氏木霉SCD45和里氏木霉NSCD45的发酵上清液，在50℃的条件下测定其纤维素酶酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
结果如图2所示，纤维素酶SCD45的最适pH为6.0，而本发明提供的纤维素酶突变体NSCD45的最适pH为7.0；而且，在pH 8.5条件下，纤维素酶突变体NSCD45的酶活残留率为54.66%，而纤维素酶SCD45的酶活残留率仅为16.43%。
上述结果表明，本发明提供的突变位点S109N可使纤维素酶SCD45的pH适用范围向中性条件偏移，显著提高其在pH7.0-8.5范围内的酶活水平，使其更有利于在纺织领域中的应用，取得了意料不到的技术效果。
实施例5 纤维素酶突变体在纺织行业的应用
5.1纯棉针织布的除毛应用
作用温度为50℃；
处理时间为20min/30min/45min/60min；
pH为7.0；
使用的设备为工业水洗机等。
分别采用上述纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45对纯棉针织布（160g/m2）进行处理，其中纤维素酶突变体的添加量为4.5g，纤维素酶SCD45的添加量为7.6g。浸泡处理20min/30min/45min/60min，观察除毛效果。
结果如图3所示，纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45对纯棉针织布的除毛效果差不多，但纤维素酶突变体NSCD45的添加量仅为纤维素酶SCD45的59.2%，有效减少了除毛过程中的用酶成本。
5.2纯棉牛仔布的水洗应用
作用温度为50℃；
处理时间为20min/30min/45min/60min；
pH为7.0；
使用的设备为工业水洗机等。
采用上述纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45对纯棉牛仔布（230g/m2）进行处理，其中纤维素酶突变体的添加量为4.5g，纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45的添加量为7.6g。处理20min/30min/45min/60min，观察褪色、起花效果。
结果如图4所示，纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45对纯棉牛仔布的褪色、起花效果差不多，但纤维素酶突变体的添加量仅为纤维素酶SCD45添加量的59.2%，有效减少了水洗过程中的用酶成本。
此外，酶促反应在水洗设备的摩擦和揉搓作用下，不可避免地会对布料产生强力损失。从表1的数据可以看出，纤维素酶突变体NSCD45和纤维素酶SCD45对牛仔布的强力损失差不多，可用于纺织品的染整加工。
表1纤维素酶 NSCD45和SCD45对布料的强力损失
纤维素酶 顶破强力 顶破强度 扩张度
突变体NSCD45 353.0 23.53833 25.72
纤维素酶SCD45 354.7 23.65166 30.67
综上，本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点均匀；所述纤维素酶突变体NSCD45的用量仅为纤维素酶SCD45的59.2%，即可达到相同的除毛、水洗效果，能大大节约用酶成本，提高经济效益。
序列表
<110> 潍坊康地恩生物科技有限公司
青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种中性纤维素酶突变体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys Ser
20 25 30
Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Val Lys Ser Gly Cys Asp
35 40 45
Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn
50 55 60
Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ser Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Thr Asn His Phe Asp Leu Ala Met Pro Gly Gly Gly Val
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Pro Gln Phe Gly Gly Leu Ala Gly Asp
130 135 140
Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Ala
145 150 155 160
Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala
165 170 175
Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu
180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala
195 200 205
Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro
210 215 220
Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly
225 230 235 240
Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr
245 250 255
Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu
260 265
<210> 2
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgatggca agtcgacccg ctactgggac tgttgcaagc cgtcgtgctc gtggcccggc 60
aaggcctcgg tgaaccagcc cgtcttcgcc tgcagcgcca acttccagcg catcagcgac 120
cccaacgtca agtcgggctg cgacggcggc tccgcctacg cctgcgccga ccagaccccg 180
tgggccgtca acgacaactt ctcgtacggc ttcgccgcca cgtccatctc gggcggcaac 240
gaggcctcgt ggtgctgtgg ctgctacgag ctgaccttca cctcgggccc cgtcgctggc 300
aagaccatgg ttgtccagtc cacctcgacc ggcggcgacc tcggcaccaa ccacttcgac 360
ctggccatgc ccggtggtgg tgtcggcatc ttcgacggct gctcgcccca gttcggcggc 420
ctcgccggcg accgctacgg cggcgtctcg tcgcgcagcc agtgtgactc gttccccgcc 480
gccctcaagc ccggctgcta ctggcgcttc gactggttca agaacgccga caacccgacc 540
ttcaccttcc gccaggtcca gtgcccgtcg gagctcgtcg cccgcaccgg ctgccgccgc 600
aacgacgacg gcaacttccc tgccgtccag atcccctcca gcagcaccag ctcgagcccg 660
cccgtccagc ctacgactcc cagcggctgc actgctgaga ggtgggctca gtgcggcggc 720
aatggctgga gcggctgcac cacctgcgtc gctggcagca cctgcacgaa gattaatgac 780
tggtaccatc agtgcctgta g 801
<210> 3
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys Ser
20 25 30
Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Val Lys Ser Gly Cys Asp
35 40 45
Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn
50 55 60
Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ser Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Asn Thr Gly Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Thr Asn His Phe Asp Leu Ala Met Pro Gly Gly Gly Val
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Pro Gln Phe Gly Gly Leu Ala Gly Asp
130 135 140
Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Ala
145 150 155 160
Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala
165 170 175
Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu
180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala
195 200 205
Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro
210 215 220
Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly
225 230 235 240
Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr
245 250 255
Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu
260 265
<210> 4
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgatggca agtcgacccg ctactgggac tgttgcaagc cgtcgtgctc gtggcccggc 60
aaggcctcgg tgaaccagcc cgtcttcgcc tgcagcgcca acttccagcg catcagcgac 120
cccaacgtca agtcgggctg cgacggcggc tccgcctacg cctgcgccga ccagaccccg 180
tgggccgtca acgacaactt ctcgtacggc ttcgccgcca cgtccatctc gggcggcaac 240
gaggcctcgt ggtgctgtgg ctgctacgag ctgaccttca cctcgggccc cgtcgctggc 300
aagaccatgg ttgtccagtc caccaacacc ggcggcgacc tcggcaccaa ccacttcgac 360
ctggccatgc ccggtggtgg tgtcggcatc ttcgacggct gctcgcccca gttcggcggc 420
ctcgccggcg accgctacgg cggcgtctcg tcgcgcagcc agtgtgactc gttccccgcc 480
gccctcaagc ccggctgcta ctggcgcttc gactggttca agaacgccga caacccgacc 540
ttcaccttcc gccaggtcca gtgcccgtcg gagctcgtcg cccgcaccgg ctgccgccgc 600
aacgacgacg gcaacttccc tgccgtccag atcccctcca gcagcaccag ctcgagcccg 660
cccgtccagc ctacgactcc cagcggctgc actgctgaga ggtgggctca gtgcggcggc 720
aatggctgga gcggctgcac cacctgcgtc gctggcagca cctgcacgaa gattaatgac 780
tggtaccatc agtgcctgta g 801

Claims (6)

1.一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶的第109位氨基酸由Ser突变为Asn。
2.编码权利要求1所述的纤维素酶突变体的DNA分子。
3.一种重组表达载体，包含权利要求2所述的DNA分子。
4.一种宿主细胞，包含权利要求3所述的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
6.权利要求1所述的纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
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