CN107513527B

CN107513527B - 一种纤维素酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN107513527B
Application number: CN201610429613.6A
Authority: CN
Inventors: 刘艳萍; 张青; 许丽红; 吴佳鹏; 黄亦钧; 王华明
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2016-06-16
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2036-06-16
Also published as: CN107513527A

Abstract

本发明涉及酶制剂领域，具体涉及一种纤维素酶突变体及其应用。所述的纤维素酶突变体相较于野生型，其与纤维织物结合的CBD结构域发生了替换，替换后突变体的除毛和起花效果均优于野生型，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH 4.0‑8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同酶活的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。

Description

一种纤维素酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶制剂领域，具体涉及一种纤维素酶突变体及其应用。

背景技术

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，这组酶可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，使得纤维素转变为纤维二糖和葡萄糖，纤维素酶属于一种复杂的复合物，被称为纤维素酶系。它们之间相互发生协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶属于糖苷水解酶，传统上被分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(即纤维二糖水解酶)和β-葡萄糖苷酶。

1906年，Seilliere在蜗牛的消化液中发现了纤维素酶，至今已有一百余年。随着工业的发展，纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。

纺织工业是传统意义上的高污染行业，在追求人与环境和谐相处的今天，寻找高效率、低污染的新型纺织技术成为了一个必须解决的难题。当今的服装潮流更是追求工艺低污染、面料纯天然、穿着舒适轻盈，而纤维素酶在纺织工业上应用广泛，有着不可替代的优势和良好的发展前景。从20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；后续开发的中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球、脱毛以及增柔等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。因此，通过基因工程手段开发更高效、低价、低污染的纤维素酶，是目前纺织行业亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶突变体及其高效重组表达菌株。本发明通过对来源于Staphylotrichum coccosporum的纤维素酶进行蛋白质工程改造，获得了一种突变体蛋白，其在纺织除毛和水洗中的应用效果得到显著的提高，可广泛应用于纺织工业领域。

本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶第208-295位氨基酸序列替换成特异腐质霉(Humicola insolens)来源的纤维素酶的CBD(Cellulose Binding Domain，纤维素结合域)序列。

所述特异腐质霉(Humicola insolens)来源的纤维素酶的CBD序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

所述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其编码基因的核酸序列为SEQID NO：6。

本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：6的纤维素酶突变体基因的重组质粒。

本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。

所述工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

本发明还涉及上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。

本发明所述的纤维素酶突变体SD相较于野生型，其与纤维织物结合的CBD结构域发生了替换，替换后突变体的除毛和起花效果均优于野生型，取得了意料不到的技术效果。申请人推测可能是由于CBD结构域置换导致蛋白质结构发生某种变化，使替换后的CBD结构域与织物的亲和力更高，更利于其对织物的酶促作用，进而使其应用效果得到显著提高。本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH 4.0-8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同酶活的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。

附图说明

图1为纤维素酶突变体与野生型摇瓶发酵SDS-PAG电泳图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1：纤维素酶突变体的获得

为了提高野生型纤维素酶StceI(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2)在纺织用品除毛和水洗中的应用效果，提高其应用活力，申请人对该酶的CBD序列进行了大量的置换筛选。在筛选过程中，申请人发现：有些置换的CBD对该酶的应用效果没有影响，而有些CBD甚至会导致其应用效果更差了，还有些置换虽然能显著提高该酶的应用效果，但酶学性质更差，不适用于工业生产。最终，申请人筛选到一种既能使该纤维素酶的应用效果显著提高、又不影响其酶学性质的CBD序列，即：野生型纤维素酶StceI的第208-295位氨基酸序列替换为特异腐质霉(Humicola insolens)来源的纤维素酶的CBD序列。所述特异腐质霉(Humicola insolens)来源的纤维素酶的CBD序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

申请人将上述置换了CBD序列的纤维素酶突变体命名为SD，其氨基酸序列为SEQID NO：5，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6。

申请人以野生型纤维素酶StceI基因SEQ ID NO:2为模板，设计引物StceI-F(含KpnI酶切位点)及R1，PCR扩增得到上游片段；

StceI-F：CGGGGTACCGCCGATG GCAAGTCGACC(KpnI)

R1:GGGGATCTGGACGGCAGGGA AGTTGCCGTCGTCG

以特异腐质霉(Humicola insolens)来源的纤维素酶的CBD基因SEQ ID NO：4为模板，设计引物F1及CBD-R(含MluI酶切位点)，PCR扩增得到下游片段；

F1:CGACGACGGCAACTTCCCTGCCGTCCAGATCCCC

CBD-R:CGACGCGTCTACAGGCACTGATGATACCAG(MluI)

分别以扩增得到的上游片段和下游片段为模板，以StceI-F及CBD-R为引物，进行融合PCR扩增，获得的基因片段即为纤维素酶突变体SD的基因SEQ ID NO：6。

野生型纤维素酶StceI的基因片段由上海生工生物工程股份有限公司完成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

实施例2纤维素酶突变体的表达

2.1表达载体的构建

将合成后的纤维素酶突变体基因片段和pSC1G载体分别用限制性内切酶KpnI和MluI(Fermentas)进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接并转化大肠杆菌Trans5α(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序(Invitrogen)。测序正确后，即得到含有纤维素酶突变体基因的重组载体pSC1G-SD。

采用上述同样方法构建得到含有野生型纤维素酶StceI基因的重组载体pSC1G-StceI。

2.2重组菌株的构建及筛选

(1)原生质体制备

接种宿主菌里氏木霉(Trichoderma reesei)SCHD4菌丝于PDA平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120mL YEG+U(0.5％酵母粉、1％葡萄糖、0.1％尿苷)的液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养14～16h；

多层纱布过滤收集菌丝，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL 10mg/mL裂解酶液(Sigma L1412)的三角瓶中，30℃，90rpm作用1-2h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；

将预冷的20mL 1.2M山梨醇(1.2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂)加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入预冷的5mL 1.2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入适量预冷的1.2M山梨醇悬浮分装(200μL/管，原生质体浓度为10⁸个/mL)。

(2)PEG介导的原生质体转化与菌株验证

以下操作均在冰上进行，将10μg重组质粒加入到200μL上述原生质体溶液中，接着加入50μL25％PEG轻轻混匀，温和混匀后在冰上放置20min，然后加入1mL25％PEG，轻轻混匀，室温静置5min，然后加入2mL25％PEG溶液和4mL1.2M山梨醇溶液，温和混匀各管，把混合物轻轻加到50mL左右且熔化后冷却至45-55℃的转化上层培养基中(0.1％MgSO₄，1％KH₂PO₄，0.6％(NH₄)₂SO₄，1％葡萄糖，18.3％山梨醇，0.35％琼脂糖，0.1％微量元素(微量元素：在250mL dlH₂O中加入1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·₇H₂O，0.4g CuSO₄·5H₂O，0.15gMnSO₄·4H₂O，0.1g Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1L))，轻轻混匀后倒入转化下层培养基平板(2％葡萄糖，0.5％(NH4)₂SO₄,1.5％KH₂PO₄,0.06％MgSO₄,0.06％CaCl₂，1.5％琼脂，0.1％微量元素)，30℃培养5～7d至转化子长出。

挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2d；取适量菌丝体置于2mL离心管中，加入100mg无菌石英砂和400μL抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA，250mM NaCl，1％SDS)；用珠打仪剧烈振荡2min；65℃水浴20min后，加入200μL 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。

以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物StceI-F和CBD-R进行PCR扩增目的基因进行验证。

PCR扩增条件为94℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃1min，30个循环；72℃7min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，并进行测序分析。测序结果正确的阳性转化子即为含纤维素酶突变体基因SD的里氏木霉工程菌。申请人将其中一个阳性转化子命名为里氏木霉SD(Trichoderma reesei SD)。

采用上述同样的方法构建得到含有野生型纤维素酶基因的里氏木霉工程菌，命名为里氏木霉StceI(Trichoderma reesei StceI)。

实施例3发酵验证和酶活测定

将上述构建得到的里氏木霉工程菌StceI(Trichoderma reesei StceI)与里氏木霉工程菌SD(Trichoderma reesei SD)分别接种于发酵培养基(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH₄)₂SO₄，0.09％MgSO₄，2％KH₂PO₄，0.04％CaCl₂，0.018％吐温-80，0.018％微量元素，0.018％聚丙二醇-2000)，28℃培养48小时，然后25℃培养72小时，离心取上清液。将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测分析和酶活检测。电泳结果如图1所示，野生型纤维素酶的分子量为49KD，而纤维素酶突变体的分子量为32KD，与预期分子量大小一致，说明本发明构建的里氏木霉工程菌StceI和SD能分别重组表达野生型纤维素酶StceI和突变体SD。

(1)酶活测定方法

在50℃、pH值为6.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄糖等量。

取三支试管各加入0.5mL CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5mL待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mL DNS试剂，并在第三支试管总补加0.5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。

酶活X＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n

其中:X——酶活力单位，IU/g(mL)；

180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；

15——待测液与底物的反应时间；

0.5——加入反应的待测酶液量；

n——稀释倍数；

(2)酶活测定结果

采用上述方法检测上述发酵上清液的酶活，结果显示：宿主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液中几乎检测不出纤维素酶酶活，而里氏木霉工程菌StceI发酵上清液酶活为100U/mL，里氏木霉工程菌SD发酵上清液酶活高达140U/mL，酶活检测结果进一步证实，本发明所选用的宿主菌本身不产纤维素酶，从而说明本发明构建的里氏木霉工程菌StceI和SD能分别高效重组表达野生型纤维素酶StceI和突变体SD。

实施例4纤维素酶突变体酶学性质分析

4.1最适反应pH分析

分别用pH值为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释实施例3所述里氏木霉工程菌StceI和氏木霉工程菌SD发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示，纤维素酶突变体和野生型的最适作用pH均为6.0，且在pH 5.0-7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平。

4.2最适反应温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，pH 6.0条件下，测定实施例3所述里氏木霉工程菌StceI和氏木霉工程菌SD发酵上清液的纤维素酶酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：与野生型相比，本发明提供的纤维素酶突变体的最适作用温度没有发生改变，最适温度均为60℃。

实施例6纤维素酶突变体在纺织加工领域中的应用

1、牛仔面料的防染应用

应用温度为55℃；

处理时间为45min；

pH为7.5；

适用的浴比范围为1:5，使用的设备类型为工业水洗机等。

通过添加上述野生型纤维素酶或突变体对牛仔裤腿和衬布进行处理，用量均为50000U/mL。其灭活条件为添加纯碱至pH值为10，或升温到70℃以上并保持10分钟。对比防染效果，具体结果见表1。

表1纤维素酶突变体和野生型防染效果比较

从表1的数据可以看出，与野生型相比，在相同添加量的情况下，本发明提供的纤维素酶突变体SD对牛仔面料的防染效果并无明显区别。

2、牛仔面料的除毛及水洗应用

应用温度为60℃；

处理时间为60分钟；

pH为7.5；

适用的浴比范围为1:10，使用的设备类型为工业水洗机等，野生型纤维素酶或突变体的用量为50000-100000U/mL。其灭活条件为添加纯碱至pH值到10，或升温到70℃以上并保持10分钟。对比达到相同除毛和水洗效果所需野生型纤维素酶和突变体的用量，具体结果见表2。

表2纤维素酶突变体和野生型达到相同除毛和水洗效果所需酶用量

名称	所需用量(U/mL)
		纤维素酶突变体SD	50000
野生型纤维素酶StceI	70000

从表2的数据可知，要达到相同的除毛和水洗效果，所需要野生型纤维素酶的用量为突变体的1.4倍，从而说明，与野生型相比，本发明提供的纤维素酶突变体在除毛和水洗方面具有更好的效果。

本发明所述的纤维素酶突变体SD相较于野生型，其与纤维织物结合的CBD结构域发生了替换，替换后其除毛和起花效果均优于野生型，取得了意料不到的技术效果。申请人推测可能是由于CBD结构域置换导致蛋白质结构发生某种变化，使替换后的CBD结构域与织物的亲和力更高，更利于其对织物的酶促作用，进而使其应用效果得到显著提高。

综上，本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH 4.0-8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同酶活的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。

Claims

1.一种纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO：5。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的纤维素酶突变体。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQ ID NO：6。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。

5.一种重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株带有权利要求4所述的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

7.权利要求1所述的纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。

8.权利要求5所述的重组工程菌株在纺织领域中的应用。