CN104450653B - 一种纤维素酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种纤维素酶突变体及其应用。该纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，最适作用温度为65℃，在70℃条件下能保持96％的酶活，在80℃条件下，仍能保持48％以上的酶活；而野生型的最适作用温度为60℃，在70℃时仅能保持51％的酶活，在80℃条件下，仅剩11％的酶活。本发明的纤维素酶突变体的最适作用pH为5.5，且在pH4.5‑8.0范围内均能保持60％以上的酶活水平，而野生型仅在pH4.5‑7.0范围内维持60％以上的酶活，至pH8.0时，酶活降为30％，从而说明本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，比野生型更适合应用于纺织工业领域。

Description

一种纤维素酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种纤维素酶突变体及其应用。
背景技术
纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，主要来源于真菌和细菌，如丝状真菌Trichoderma reesei等可大量合成和分泌胞外纤维素酶。其中根据其催化反应的功能不同，主要分为：外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，纤维素酶对纤维素的降解，是在多种酶组分的协同作用下完成的。纤维素酶是在工业中应用最广泛的酶之一，一般应用于纺织工业、去污剂工业、纸浆和造纸工业、饲料和食品工业、在采油、医药等方面也有巨大的潜在市场。
纤维素酶可以按照其一级序列分类成各种糖基水解酶家族，这得到了家族一些成员的三维结构分析的支持(Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993，1996)。例如，糖基水解酶家族5、7、12和45含有内切葡聚糖酶。大多数纺织用酸性纤维素酶属于家族5，而大多数纺织用中性纤维素酶为家族12或45。
目前，利用纤维素酶对纤维素织物进行生物整理即酶降解整理，由于其环保、节能和高效的效果而得到广泛应用。织物经整理蓬松、丰满、柔软、滑爽、布面清晰、悬垂性好、吸湿性强，并具有一定的“丝光”效果，纤维素酶的用量在0.5％—3％，即可达到满意的整理效果。酸性纤维素酶在处理纤维织物时，在较短的时间内就产生有效的化学磨损效果，但它对织物的剥蚀作用强，返沾染效果差，中性纤维素酶对织物的剥蚀作用比酸性纤维素酶弱，需要较长的作用时间，但沾色较少，处理后可获得更加丰满的手感，因此在纺织工业应用广泛，需求更为迫切，为了降低成本，节约能源，急需提高纤维素酶在中性偏碱性条件下的酶活力水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种纤维素酶突变体及其应用。本发明通过对纤维素酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且耐热性更强，更适合应用于纺织工业领域。
本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶第10位氨基酸由Cys变为Trp，第29位氨基酸由Ala变为Arg，第61位氨基酸由Thr变为Ser，第141位氨基酸由Asp变为Lys，第216位氨基酸由Val变为His。
上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：3的纤维素酶突变体基因的质粒。
将上述质粒转入里氏木霉中进行重组表达。
本发明还提供了上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
本发明所述纤维素酶突变体的最适作用温度为65℃，在70℃条件下能保持96％的酶活，在80℃条件下，仍能保持48％以上的酶活；而野生型的最适作用温度为60℃，在70℃时仅能保持51％的酶活，在80℃条件下，仅剩11％的酶活；从而说明纤维素酶突变体的耐热性明显高于野生型。所述纤维素酶突变体的最适作用pH为5.5，且在pH4.5-8.0范围内均能保持60％以上的酶活水平，而野生型仅在pH4.5-7.0范围内维持60％以上的酶活，至pH8.0时，酶活降为30％，从而说明本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，比野生型更适合应用于纺织工业领域。
附图说明
图1为发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，
其中M所示为蛋白Marker；泳道1所示为里氏木霉工程菌McE发酵上清液中蛋白表达情况；泳道2所示为里氏木霉工程菌McE5发酵上清液中蛋白表达情况；泳道3所示为宿主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液中蛋白表达情况；箭头所指处为分子量为48KDa的蛋白条带；
图2为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-温度曲线图；
图3为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1：纤维素酶突变体基因的合成
为了提高纤维素酶(野生型氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ IDNO：2，由上海生工生物工程股份有限公司合成)在中性偏碱性条件下的酶活力，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物McE-F1、McE-R1如下：
McE-F1：GGCGAATTCGCCAGCTGCTCCTCCGTCTA(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)
McE-R1：ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGATACCAG(下划线为限制性内切酶NotI识别位点)
以SEQ ID NO:2基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μL含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有纤维素酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出50μL裂解液至两块新的96孔板，分别在pH 6.0和pH 8.0的条件下测定其纤维素酶活，结果发现，有些突变子在碱性条件的酶活力没有变化，有些突变甚至使其碱性耐受性降低了，对在pH 8.0条件下依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终获得了能显著提高纤维素酶碱性耐受性的突变位点组合C10W、A29R、T61S、D141K和V216H。
含C10W、A29R、T61S、D141K和V216H五点突变的纤维素酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：4由上海生工生物工程股份有限公司合成完成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点。
合成后的质粒用限制性内切酶KpnI和XbaI(Fermentas)进行酶切；同时，用限制性内切酶KpnI和XbaI对载体pTG进行酶切；凝胶回收目的基因片段和载体；并用T4DNA连接酶将上述两片段连接，转化Trans5α大肠杆菌，用氨苄青霉素进行筛选。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，纤维素酶重组表达质粒命名为pTG-McE5。
实施例2：纤维素酶突变体木霉重组菌株的构建及验证
(1)原生质体制备
取纤维素酶基因缺陷型的宿主菌里氏木霉SCHD4孢子悬液，接种于PDA平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120mL YEG+U(0.5％酵母粉、1％葡萄糖、0.1％尿苷)的液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养14～16h；
用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL10mg/mL裂解酶液(Sigma L1412)的三角瓶中，30℃，90rpm作用1-2h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；
将预冷的20mL 1.2M山梨醇(1.2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入预冷的5mL 1.2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入适量预冷的1.2M山梨醇悬浮分装(200μL/管，原生质体浓度为108个/mL)。
(2)表达载体转化与菌株验证
以下操作均在冰上进行，取10μg重组质粒加入到含有200μL原生质体溶液的无菌7mL离心管中，然后加入50μL 25％PEG(25％PEG，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)，轻弹管底混匀，冰上放置20min；加入2mL 25％PEG，混匀后室温放置5min；加入4mL 1.2M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中(0.1％MgSO4,1％KH2PO4,0.6％(NH4)2SO4,1％葡萄糖,18.3％山梨醇,0.35％琼脂糖)；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上(2％葡萄糖，0.5％(NH4)2SO4,1.5％KH2PO4,0.06％MgSO4,0.06％CaCl2，1.5％琼脂)，30℃培养5～7d至有转化子长出。
挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2d；取适量菌丝体置于2mL离心管中，加入100mg无菌石英砂和400μL抽提缓冲液(100mM Tris-HCl,100mM EDTA,250mM NaCl,1％SDS)；用珠打仪剧烈振荡2min；65℃水浴20min后，加入200μL 10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。
以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物McE-F和McE-R进行PCR扩增目的基因进行验证。
McE-F：GCCAGCTGCTCCTCCGTCTA
McE-R：CTACAGGCACTGATGATACCAG；
PCR扩增条件为94℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃1min，30个循环；72℃7min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，构建得到了含纤维素酶突变体基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉McE5(Trichoderma reesei McE5)。
采用上述同样的方法构建得到重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌，命名为里氏木霉McE(Trichoderma reesei McE)。
实施例3发酵验证和酶活检测
将上述里氏木霉工程菌McE与里氏木霉工程菌McE5接种于PDA平板，30℃培养6d，待孢子丰富后，取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH4)2SO4，0.09％MgSO4，2％KH2PO4，0.04％CaCl2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素)，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，将发酵液离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，泳道1，2所述里氏木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5发酵上清液在48KDa处均有一明显蛋白条带，与本发明重组表达的纤维素酶的理论分子量大小一致，而泳道3所述宿主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液在48KDa处无明显蛋白条带，从而说明本发明构建得到的里氏木霉工程菌McE能有效重组表达野生型纤维素酶，里氏木霉工程菌McE5能有效重组表达纤维素酶突变体。
(1)酶活测定方法
在50℃、pH值为4.8(中性为pH6.0)的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄糖等量。
取三支试管各加入0.5mL CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5mL待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mLDNS试剂，并在第三支试管总补加0.5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。
酶活X＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n
其中:X——酶活力单位,IU/g(mL)；
180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；
15——待测液与底物的反应时间；
0.5——加入反应的待测酶液量；
n——稀释倍数；
(2)酶活测定结果
采用上述方法检测上述发酵上清液的酶活，结果显示：宿主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液中几乎检测不出纤维素酶酶活，重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌McE发酵上清液酶活为115U/mL，而重组表达纤维素酶突变体的里氏木霉工程菌McE5发酵上清液酶活为140U/mL。酶活检测结果进一步证实，本发明所选用的宿主菌本身不产纤维素酶，而本发明构建的里氏木霉工程菌McE能高效表达野生型纤维素酶，里氏木霉工程菌McE5能高效表达纤维素酶突变体。
实施例4酶学性质分析
1、最适作用温度
分别在20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃，pH6.0条件下测定里氏木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的发酵上清液酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明所述纤维素酶突变体的最适作用温度为65℃；在70℃条件下能保持96％的纤维素酶酶活，在80℃条件下，仍能保持48％以上的纤维素酶酶活；而野生型纤维素酶的最适作用温度为60℃，在70℃时仅能保持51％的酶活，在80℃条件下，仅剩11％的纤维素酶酶活。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体具有更高的耐热性。
2、最适作用pH值
分别用pH值为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释里氏木霉工程菌McE和里氏木霉工程菌McE5的发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，纤维素酶突变体的最适作用pH为5.5，在pH4.5-8.0范围内，均能保持60％以上的酶活水平，且在pH6.0-8.0范围内，酶活水平保持稳定；而野生型纤维素酶的最适作用pH为6.0，仅在pH4.5-7.0范围内能维持60％以上的酶活，且在pH6.0-8.0范围内，酶活下降明显，至pH8.0时，酶活仅剩30％。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，具有更大的应用空间。
综上所述，本发明突变后的纤维素酶具有更强的耐热性，且在碱性条件下的适用范围更加宽泛，因此更适合其在纺织工业中的应用，前景广阔。

Claims (7)

1.一种纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的纤维素酶。
3.如权利要求2所述的基因，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒为携带有权利要求2所述的基因的质粒。
5.一种重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为转化/转染有权利要求4所述的重组质粒的菌株。
6.如权利要求5所述的重组菌株，所述的菌株为里氏木霉。
7.权利要求1所述的纤维素酶在纺织领域中的应用。
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