CN108486026A

CN108486026A - 一种新型木聚糖酶及其制备方法

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Publication number: CN108486026A
Application number: CN201810298910.0A
Authority: CN
Inventors: 唐蕾; 王华广; 沈微; 胡方觊; 张建华; 张宏建; 毛忠贵
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-04-04
Also published as: CN108486026B

Abstract

本发明公开了一种新型木聚糖酶及其制备方法，属于生物技术领域。本发明将来自C.clariflavum Clocl‑2441中的木聚糖酶的GH10结构域在大肠杆菌中进行了异源表达，得到了一株可成功表达木聚糖酶的重组菌，粗酶液的酶活性是表达全长木聚糖酶的6倍，该酶具有耐热性强，耐酸碱性强，对金属离子耐受能力强的优良性质。

Description

一种新型木聚糖酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型木聚糖酶及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

木质纤维素是丰富的可再生生物质资源占地球所有可再生有机碳的三分之一。目前这部分潜在资源没有被有效的开发利用，造成了生物质资源的极大浪费。木聚糖是半纤维素的主要成分，如何开发和利用木聚糖是利用半纤维素生物质资源的关键。木聚糖酶可以水解木聚糖中的糖苷键，把木聚糖降解成木糖或者低聚木糖。大多数木聚糖侧链上含有不同的基团为杂多糖，如阿拉伯糖、乙酰基、阿魏酸残基、4-O甲基葡萄糖醛酸基等。因此完全水解木木聚糖需要多种酶的共同作用，其中起重要作用的是β-1,4内切木聚糖酶。生物酶法催化有高效和环境友好的优点在工业应用中正在取代化学催化法。木聚糖酶主要应用在纺织、食品、饲料、造纸、木质纤维素生物质转化等工业方面。由于不同应用环境对酶有不同的要求，因此开发出适用于不同用途的木聚糖酶非常必要，目前采取的手段包括新酶的挖掘和酶的分子改造。

根据蛋白的氨基酸序列、结构特征、底物的特异性、作用机制等理化性质的不同，木聚糖酶可分为六个糖苷水解酶家族：GH5、GH8、GH10、GH11、GH30、GH43，大多数木聚糖酶属于GH10和GH11。GH10家族木聚糖酶具有较大的分子量(>30kDa)、低等点电、广泛的底物特异性、典型的(β/α)₈桶折叠结构等特点。

目前有些木聚糖酶包含多个催化结构域和非催化结构域导致基因序列较长，不利于异源表达，或存在耐热性差，最适pH范围较窄，不利于工业化应用等问题。因此，提供一种表达量高，耐热性强，耐酸碱的木聚糖酶是亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达木聚糖酶的基因工程菌，所述基因工程菌表达量高，所述木聚糖酶的耐热性、耐酸碱性强。

本发明的第一个目的是提供一种表达木聚糖酶的基因工程菌，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述木聚糖酶的核苷酸序列是SEQ ID BO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建方法是扩增得到SEQ IDNO.2所示的基因序列，然后将基因序列连接到表达载体pET28a(+)上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到基因工程菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH10。

本发明的第二个目的是提供一种木聚糖酶的发酵方法，所示方法的具体步骤为：将基因工程菌以2-4％的接种量转接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，35-38℃、150-200r/min培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，向培养基中加入终浓度为0.3-0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，24-26℃、150-200r/min条件下诱导表达8-10h，离心收集菌体，破碎菌体得到粗酶液，纯化得到木聚糖酶。

在本发明的一种实施方式中，所述破碎方法为将收集的菌体用磷酸缓冲液重新悬浮进行超声破碎、离心收集上清得到粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述纯化的方法为将酶液用0.22μm水系滤膜过滤后通过镍柱进行纯化，有酶活性的洗脱峰通过脱盐柱(Sephadex G25)进行脱盐，得到电泳纯的蛋白。

本发明的有益效果：

(1)本发明将来自C.clariflavum Clocl-2441中的木聚糖酶的一部分GH10结构域在大肠杆菌中进行了异源表达，得到了一株重组菌，并且重组酶成功以可溶性形式表达，粗酶液的酶活性是表达全长木聚糖酶的6倍。

(2)将重组酶进行分离纯化得到电泳纯后对其酶学性质进行表征，重组酶以榉木木聚糖为底物的V_max为1691.5μmol/mg/min，K_m值为2.5mg/ml，K_cat为1236.4/s，K_cat/K_m为494.6ml/mg/s。重组酶的最适温度为70℃属于嗜热木聚糖酶，其温度稳定性在65℃以下稳定，耐热性强。重组酶的最适pH为7.0，虽属于中性木聚糖，但其在pH4.0-9.0范围内比较稳定，耐酸碱性强。

(3)大多数金属离子对重组木聚糖酶的影响比较小，重组酶的应用限制性较小。

附图说明

图1重组酶的最适温度

图2重组酶的最适pH

图3重组酶的温度稳定性

图4重组酶的pH稳定性

具体实施方式

木聚糖酶酶活测定方法：

将1％的木聚糖底物与梯度稀释后的酶液反应10min后，用3,5-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid，DNS)法测定还原糖(以木糖计)。通过标准曲线计算还原糖量和相应的酶活性(三个平行取平均值)。酶活单位定义为每分钟水解木聚糖产生1μmol还原糖所需的酶量为1U。

实施例1：基因工程菌的构建

本实验室前期，成功将木聚糖酶基因Clocl-2441序列(ID：11562857)构建到pET28a(+)载体上，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，命名为BL21(DE3)/pET28a(+)-2441，将表达的全长重组酶命名为rXyn2441。此重组酶具有多个结构域，在对重组酶的研究过程中发现其虽成功表达，但是存在表达量偏低，表达不完全的问题，为了解决问题，发明人对其进行截断组合表达，总共表达了包括GH11和GH10在内的6个片段，其中GH10效果最好。

(1)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH10的构建：

提取先前构建的重组质粒为模板，通过引物GH10-F/GH10-R，扩增单个GH10结构域的基因SEQ ID NO.2，将得到的基因序列与pET28a(+)质粒连接，导入大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH10，将表达的截断重组酶命名为rXyn2441GH10。

(2)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH11的构建：

提取先前构建的重组质粒为模板，通过引物GH11-F/GH11-R，扩增单个GH11结构域的基因SEQ ID NO.3，将得到的基因序列与pET28a(+)质粒连接，导入大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH11，将表达的截断重组酶命名为rXyn2441GH11。

(3)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GHX3的构建：扩增单个GHX3结构域的基因SEQ ID NO.4

(4)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GHX4的构建：扩增单个GHX4结构域的基因SEQ ID NO.5

(5)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GHX5的构建：扩增单个GHX5结构域的基因SEQ ID NO.6

(6)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GHX6的构建：扩增单个GHX6结构域的基因SEQ ID NO.7

实施例2：多株重组工程菌的对比

a)诱导表达

采用最适条件对BL21(DE3)/pET28a(+)-2441、BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH10、X3、X4、X5、X6、GH11株菌分别进行诱导表达。

b)发酵方法

将7株基因工程菌在相同的条件下进行诱导表达方法如下：将预培养的7株基因工程菌以2-4％的接种量转接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，35-38℃、150-200r/min培养至OD600达到0.6～0.8，向培养基中加入终浓度为0.3-0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，24-26℃、150-200r/min条件下诱导表达8-10h。取相同的菌体量用磷酸缓冲液重新悬浮进行超声破碎、离心收集上清，进行SDS-PAGE蛋白电泳和酶活测定。

b)酶活测定

将7种重组酶的粗酶用DNS法进行酶活测定，组合截断表达的6个重组酶的比酶活是全长酶rXyn2441的1.5-6倍。其中最高的rXyn2441GH10的比酶活为269.8U/mg是全长酶rXyn2441的6倍。

表1 7种重组酶的酶活

实施例3：木聚糖酶的纯化方法

a)粗酶液准备

将收集的菌体用磷酸缓冲液重新悬浮进行超声破碎、离心收集上清，粗酶液用0.22μm水系滤膜过滤备用。

b)亲和层析

将准备好的样品通过GE公司的1mL预装镍柱，首先用镍柱平衡缓冲液进行平衡，平衡好后进行上样，流速为1mL/min，上样结束后用15mL平衡缓冲液清洗未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液线性和梯度结合方式洗脱，将穿透峰和洗脱峰收集，测定酶活与蛋白含量，进一步用蛋白电泳验证目的蛋白的纯度。

c)脱盐

将测得酶活和SDS-PAGE检验的洗脱峰以上样速度5mL/min通过平衡好的脱盐柱(Sephadex G25)进行脱盐，收集洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定纯度，测定蛋白量和酶活。

实施例4：木聚糖酶性质的测定

a)最适温度

在0.1M的磷酸缓冲溶液(pH6.5)条件下，45℃～85℃范围内(梯度为5℃)检测酶活性，以最高酶活为100％计算相对酶活。

根据图1可知，最适反应温度是70℃，在60～75℃之间酶活比较高，属于嗜热木聚糖，为在较高温度环境下的应用提供了新选择。

b)最适pH

在pH 5.0-8.0(梯度为0.5)值缓冲溶液和最适温度条件下检测不同pH下的酶活，以最高酶活为100％计算相对酶活。

根据图2可知，最适反应pH是7.0，在pH 6.0～7.5之间酶活为最适酶活的70％以上，属于中性木聚糖酶。

c)温度稳定性

将蛋白浓度为0.08mg/mL的酶液，在55、60、65、70℃下处理不同的时间，在最适温度和pH下检测剩余酶活，以处理0h的酶活为100％计算处理不同时间的剩余酶活。

结合图3和表2可知，在60℃及以下很稳定，在55、60℃处理6h后剩余酶活为初始酶活的90％以上。与多数不同来源的GH10木聚糖酶相比，本发明的木聚糖酶在65℃以下稳定性更强(表2)。

d)pH稳定性

将酶液在pH值3.0-9.0范围的缓冲溶液中20℃下处理5h，在最适条件下测定其剩余酶活，以未处理的酶活为100％计算不同pH处理后剩余酶活。

结合图4和表2可知，在pH4.0-9.0条件下比较稳定，与已知的GH10木聚糖酶相比pH稳定性范围更宽，适合的应用范围更广泛。

e)金属离子及EDTA对重组木聚糖酶活性的影响

以Tris-HCl缓冲液配置不同金属离子母液，按需添加至稀释后的酶液中，分别考察了1mmol/L和5mmol/L的KCl、LiCl、CoCl₂、MgCl₂、MnCl₂、CaCl₂、FeCl₃、AlCl₃和EDTA对rXyn2441GH10酶活的影响。在最适条件下检测酶活，以未添加金属离子和EDTA的酶活为100％计算酶活的变化。

K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺和Fe³⁺离子对rXyn2441GH10酶活有促进作用，其中5mM的Mg²⁺使的酶活提高了79.2％。Li⁺、CO²⁺和Mn²⁺离子对酶活有抑制作用，5mM的CO²⁺使酶活降低到58.3％。EDTA对酶活有微弱的促进作用。

f)木聚糖酶的动力学参数测定

在酶的最适条件下测定不同底物浓度下的初始酶活，根据Lineweaver-Burk双倒数作图。以底物1/[S]为X轴，1/[V]为Y轴作图拟合出线性方程，计算不同底物的K_m和V_max以及其它参数。

根据线性方程计算动力学参数(表3)，相比之下重组酶水解榉木木聚糖效率更高，且与文献总结的不同来源的GH10木聚糖酶相比有更大的V_max和K_cat，但对羧甲基纤维素钠没有活性，与文献报道相一致。

表2不同微生物来源的GH10木聚糖酶的对比分析

具体文献：

[1]KIM D Y,HAN M K,OH H W,et al.Novel intracellular GH10 xylanasefrom Cohnella laeviribosi HY-21:biocatalytic properties and alterations ofsubstrate specificities by site-directed mutagenesis of Trpresidues.Bioresource Technology,2010,101(22):8814.

[2]KIM D Y,HAN M K,OH H W,et al.Catalytic properties of a GH10 endo-β-1,4-xylanase from Streptomyces thermocarboxydus HY-15 isolated from the gut ofEisenia fetida.Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2010,62(1):32-39.

[3]KIM H M,LEE KH,KIM KH,et al.Efficient function and characterizationof GH10 xylanase (Xyl10g)from Gloeophyllum trabeum in lignocellulosedegradation.Journal of Biotechnology,2014,172(1):38-45.

[4]HUNG K S,LIU S M,TZOU W S,et al.Characterization of a novel GH10thermostable,halophilic xylanase from the marine bacteriumThermoanaerobacterium saccharolyticum,NTOU1.Process Biochemistry,2011,46(6):1257-1263.

[5]MICKAEL L,ALEXANDRA T,D,et al.GH10 xylanase D fromPenicillium funiculosum:biochemical studies and xylooligosaccharideproduction.Microbial Cell Factories,2011,10(1):20.

[6]DAE-SEOK L,KWANG-HO L,EUN-JIN C,et al.Characterization and pH-dependent substrate specificity of alkalophilic xylanase from Bacillusalcalophilus.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2012,39(10):1465-1475.

表3:重组木聚糖酶rXyn2441GH10动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 一种新型木聚糖酶及其制备方法

<120> 江南大学

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Met Ile Ser Lys Phe Pro Ala Glu Asn Asn Thr Pro Pro Ser Thr

1 5 10 15

Pro Thr Pro Val Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Gln Gly Thr Ala Leu

20 25 30

Tyr Gln Leu Ala Ala Ala Lys Gly Lys Tyr Phe Gly Ala Cys Ile Asn

35 40 45

Ser Pro Trp Phe Asn Asn Gln Thr Asn Ser Thr Tyr Asn Asn Ile Leu

50 55 60

Arg Thr Glu Phe Gly Met Val Val Ala Glu Asn Glu Met Lys Phe Asp

65 70 75 80

Ala Leu Glu Pro Ser Gln Asn Asn Phe Asn Trp Ser Lys Ala Asp Lys

85 90 95

Met Met Asp Phe Ala Arg Ser Asn Asn Met Lys Val Arg Gly His Thr

100 105 110

Leu Val Trp His Ser Gln Asn Pro Gly Trp Val Thr Ser Gly Arg Trp

115 120 125

Asn Arg Asp Ser Leu Ile Ser Val Met Asn Asn His Ile Asn Lys Val

130 135 140

Leu Gly Arg Tyr Lys Gly Gln Ile Leu Glu Trp Asp Val Val Asn Glu

145 150 155 160

Val Ile Asp Asp Gly Asn Gly Trp Gly Leu Arg Asn Asn Ser Val Trp

165 170 175

Lys Ser Asn Ile Gly Asn Asp Phe Val Glu Ile Ala Phe Arg Thr Ala

180 185 190

Arg Gln Ala Asp Pro Asp Ala Leu Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile

195 200 205

Glu Asp Leu Gly Gly Lys Ala Asn Ala Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ser

210 215 220

Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Phe Gln Ser His

225 230 235 240

Phe Ile Ser Gly Met Ser Asp Gln Thr Phe Arg Asp Ile Asp Thr Asn

245 250 255

Val Lys Arg Tyr Ala Ala Leu Gly Val Lys Val Ser Phe Thr Glu Ile

260 265 270

Asp Ile Arg Ile Pro Asp Asn Ala Asn Gln Tyr Gln Ala Phe Gln Thr

275 280 285

Gln Ala Asn Glu Tyr Arg Lys Leu Met Glu Ile Cys Leu Asn Asn Asp

290 295 300

Asn Val Thr Thr Phe Val Leu Trp Gly Phe Thr Asp Gln His Thr Trp

305 310 315 320

Val Pro Gln Val Phe Pro Gly Tyr Gly Arg Pro Leu Ile Tyr Asp Asn

325 330 335

Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Ala Tyr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Leu Met

340 345 350

Gln

<210> 2

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtatgatat caaaattccc tgcagaaaat aatacacctc cttcaacacc aactcctgtt 60

aagactccac ctccatcacc gcaaggtaca gcattgtatc aattagctgc agcaaaaggt 120

aaatattttg gtgcatgtat aaacagtcct tggtttaaca accaaactaa tagcacatac 180

aataacattc tcagaacaga gttcggtatg gttgttgctg aaaacgaaat gaagttcgat 240

gctttagagc catctcagaa taacttcaac tggtcaaaag ctgataaaat gatggatttt 300

gctagaagca acaatatgaa agtacgtgga catacacttg tatggcatag ccagaaccca 360

ggttgggtta caagcggaag atggaaccgt gattcattga tttcagttat gaacaaccat 420

attaataaag ttttgggacg ttataaagga caaatcttag aatgggacgt tgttaatgag 480

gttatagacg atggaaacgg ttggggactc agaaacaaca gtgtttggaa gagcaatatc 540

ggtaacgatt tcgtagaaat agcattcaga actgcaagac aggctgaccc agatgcactt 600

ctctattata acgattataa tattgaagac ttgggtggaa aagctaacgc tgcttacaat 660

ttggttaaga gcttgaaaga aaaaggagta cctatcgatg gtataggatt ccagagccac 720

tttatcagcg gaatgagcga ccaaacattt agagacatag acacaaatgt taagagatat 780

gcagctttag gagtaaaggt atcctttact gaaatagata taagaatacc tgataatgca 840

aatcaatatc aggcattcca gacacaggca aacgaatata ggaagttaat ggaaatttgc 900

ctcaataatg acaacgttac tacattcgta ttgtggggat tcactgacca gcatacttgg 960

gttccacaag tattccctgg ttacggaaga ccattgattt atgacaacaa ctacaatcca 1020

aaaccagctt acaacgcatt gaaagaaata ttaatgcagt aa 1062

<210> 3

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgacgctta ctaataatgc tacaggaaca tatcagggtt atgactatga atactggaaa 60

gatagaggta atggaacaat gactcttaca ggaggaggta cttttacttg ttcctggaac 120

aacattaaca acattctgtt ccgtaccggt aaaaaactcg gatcacaaaa aacatatcag 180

gaatacggaa atatatacat agaatatgct tgtgactaca gaccaaatgg taactcatat 240

ctttccgttt atggatggac ccagggtcct cttgtagagt attatatcat tgagagctat 300

ggtacctgga agccaccagg aagcaatcag gtaaaaggtt atgttaacgc tgacggcggt 360

acatacgaaa tttatcaaac aaccagatac aatgctccat ccattgaagg agacaaaact 420

ttcgatcagt attggagtgt tcgtacacag aaacgtacaa gcggaaccat atctgttcac 480

gagcacttta agcaatggga agccagaggc atgagaatgg gtaggcttta tgaagtttcc 540

atggttgttg aaggatatca gagtagcggt caagctaaca tgacaaaaat ggaccttatt 600

attggcggac aaccatctac aacttcagcg ccagcaactt ctaaaccagt aactgaaaaa 660

aatgctttc 669

<210> 4

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgacgctta ctaataatgc tacaggaaca tatcagggtt atgactatga atactggaaa 60

gatagaggta atggaacaat gactcttaca ggaggaggta cttttacttg ttcctggaac 120

aacattaaca acattctgtt ccgtaccggt aaaaaactcg gatcacaaaa aacatatcag 180

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ggcaccggca gccctgttcc tactaattct ggaaatcctg gttcaaggaa a 1071

<210> 5

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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gatagaggta atggaacaat gactcttaca ggaggaggta cttttacttg ttcctggaac 120

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<210> 6

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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ccgcaaggta cagcattgta tcaattagct gcagcaaaag gtaaatattt tggtgcatgt 360

ataaacagtc cttggtttaa caaccaaact aatagcacat acaataacat tctcagaaca 420

gagttcggta tggttgttgc tgaaaacgaa atgaagttcg atgctttaga gccatctcag 480

aataacttca actggtcaaa agctgataaa atgatggatt ttgctagaag caacaatatg 540

aaagtacgtg gacatacact tgtatggcat agccagaacc caggttgggt tacaagcgga 600

agatggaacc gtgattcatt gatttcagtt atgaacaacc atattaataa agttttggga 660

cgttataaag gacaaatctt agaatgggac gttgttaatg aggttataga cgatggaaac 720

ggttggggac tcagaaacaa cagtgtttgg aagagcaata tcggtaacga tttcgtagaa 780

atagcattca gaactgcaag acaggctgac ccagatgcac ttctctatta taacgattat 840

aatattgaag acttgggtgg aaaagctaac gctgcttaca atttggttaa gagcttgaaa 900

gaaaaaggag tacctatcga tggtatagga ttccagagcc actttatcag cggaatgagc 960

gaccaaacat ttagagacat agacacaaat gttaagagat atgcagcttt aggagtaaag 1020

gtatccttta ctgaaataga tataagaata cctgataatg caaatcaata tcaggcattc 1080

cagacacagg caaacgaata taggaagtta atggaaattt gcctcaataa tgacaacgtt 1140

actacattcg tattgtgggg attcactgac cagcatactt gggttccaca agtattccct 1200

ggttacggaa gaccattgat ttatgacaac aactacaatc caaaaccagc ttacaacgca 1260

ttgaaagaaa tattaatgca gtaa 1284

<210> 7

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaaaaattg aagcagaaga ctatgatgag ttggttggtt ctgaagcaag atccattggt 60

atgggtatag gatatataaa caatggtgac tatgctgcat ataagagtgt gaattttgga 120

aacggtgcaa gttctttcaa agcatatgtt gcaaacggta ataatagcaa cacaactatt 180

caattaagat taggtggtcc aaacggaact cttatcggtt cattgtccgt accgtatact 240

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gtattgtggg gattcactga ccagcatact tgggttccac aagtattccc tggttacgga 1560

agaccattga tttatgacaa caactacaat ccaaaaccag cttacaacgc attgaaagaa 1620

atattaatgc agtaa 1635

Claims

1.一种表达木聚糖酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)质粒为载体。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述木聚糖酶的核苷酸序列是SEQID BO.2所示的序列。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法是扩增得到SEQ ID NO.2所示的基因序列，然后将基因序列连接到表达载体pET28a(+)上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到基因工程菌BL21(DE3)/pET28a(+)-2441GH10。

5.应用权利要1-4任一所述基因工程菌在木聚糖酶制备方面的应用。

6.一种木聚糖酶制备方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：将权利要求1-4任一所述基因工程菌以2-4％的接种量转接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，35-38℃、150-200r/min培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，向培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，24-26℃、150-200r/min条件下诱导表达8-10h，离心收集菌体，破碎菌体得到粗酶液，纯化得到聚糖酶。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的加入终浓度为0.3-0.4mM。

8.应用权利要求6或7所述方法得到的木聚糖酶。

9.权利要求8所述木聚糖酶在降解木质纤维素方面的应用。

10.权利要求8任一所述突变体在纺织、食品、饲料、造纸、木质纤维素生物质领域的应用。