CN101402964B - 一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种新的碱性木聚糖酶及其编码基因。本发明公开所述基因的序列及其编码区。包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α/Mn22/6p/Kxyn，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208201。经过生物学验证，证明该木聚糖酶Kxyn具有强耐碱性和热稳定性，可专门降解木聚糖。本发明的木聚糖酶Kxyn可用于造纸等相关领域。

Description

一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其基因的克隆。

技术背景

木聚糖是一种杂合多聚五碳糖，主链绝大部分都是都是D型吡喃木糖通过β-1，4糖苷键连接，主要的侧链取代基有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、4-0-甲基葡萄糖醛酸、乙酰基、半乳糖基等。木聚糖是半纤维素的主要成分，占植物碳水化合物的1/3，是继纤维素之后的第二大可再生资源。所以，水解木聚糖是利用半纤维素的重要步骤。木聚糖酶广泛用做饲料工业的添加剂、食品工业的改良剂、和造纸工业中纸浆的生物漂白剂等(Polizeli等，2005)。

木聚糖酶最早应用于饲料工业。木聚糖酶能破坏植物细胞壁，将营养物质释放出来，提高养分的利用率(Kim等，2005)。另外木聚糖酶能降低食糜的粘度，提高饲料的表观代谢能(Eun等，2006)。总之，木聚糖酶作为饲料添加剂，能有效的解除木聚糖的抗营养作用。食品工业方面，木聚糖酶能改善面包的质量；降解木聚糖生成具有保健功能的低聚木糖；在酿酒工业中，木聚糖酶降解木聚糖，能提高发酵效率，改善口感等。

木聚糖酶在工业中最重要的应用是作为造纸工业中纸浆的生物漂白剂。木聚糖酶能降解凝结于纤维表面的半纤维素，增加漂白剂与纤维的接触面积，提高漂白效率。但是，在利用木聚糖酶进行预漂白时，纸浆为温度较高的碱性浆，PH值在8.0以上，温度在60℃左右，这就要求所用的木聚糖酶具有耐碱和耐高温的特性(Ahlawat等，2007)。同时，造纸工业中使用的木聚糖酶不能同时具有纤维素酶活性，以免降解纸浆中的纤维，影响成浆质量(Subramaniyan and Prema，2000)。

到目前为止，国内外已有300余种不同来源的木聚糖酶基因的报道，细菌、真菌、链霉菌、植物和原生动物中均有报道(Srivastava等，1991；Suzuki等，2002；Devillard等，1999)，其中100多种基因在合适的宿主中被克隆和表达(Wamalwa等，2007)。但是，由于木聚糖酶产量不高或酶的耐受性不够等问题，以至于酶在工业上的大规模使用受到限制。而解决这一问题的方法主要有：1、对现有的木聚糖酶进行遗传改造，提高酶的性质；2、从极端环境中筛选优良的木聚糖酶产生菌，并获取优良理化性质的木聚糖酶基因。尤其是后者，已成为广泛应用木聚糖酶降低生产成本的突破口之一。

随着时间的推移，陆地资源日渐贫瘠，而世界海洋占据了地表面积的70％以上，是一个巨大的生物资源的宝库。海洋环境包括了高压、低温、无光照、局部的高温、高盐等生命极限环境，以及从营养丰富区到只有少数微生物能生存的营养馈乏区等等，生态环境非常复杂而多样。在这样的生态环境下，海洋的微生物在长期的进化中，发展了一些独特的结构和功能，以维持其生命活动。海洋微生物的复杂多样使其产生的代谢产物也具有多样性、复杂性和特殊性，因而海洋微生物成为重要的基因库和开发新颖生物活性物质的极好的天然资源。

因此，利用海洋微生物生态环境的复杂和多样性，从中筛选耐受高压、高盐、低温等极端性质的木聚糖酶类是海洋微生物研究与开发的一个很好的方向。海洋微生物的木聚糖酶在环境保护、食品加工和其它生物技术过程中具有很大的应用潜能。

发明内容

本发明的目的是提供一种性质优良、适合于在造纸工业中应用的木聚糖酶及其编码基因，为进一步通过基因工程的方法，利用重组生物反应器来工业化生产廉价木聚糖酶提供很好的基因资源。

本发明人从国家海洋局第三研究所提供的深海细菌中筛到一株被命名为Kocuria sp.Mn22的天然菌株，它所产生的木聚糖酶(简称为Kxyn)适合在造纸工业中使用。该木聚糖酶具有高活性，良好的耐碱性和热稳定性、对十二烷基磺酸钠(SDS)也有一定耐受性，而且没有纤维素酶活性，只特异性降解木聚糖。Kxyn最适pH为8.5，在不同pH缓冲液中4℃过夜处理后，在pH7.5-12的范围内维持80％以上的酶活性；最适温度为55℃，在60℃处理一小时，酶活为30％左右；5mM SDS处理后还有90％的酶活。以羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、槐豆胶、桦木木聚糖和燕麦木聚糖为底物测定Kxyn的底物特异性，Kxyn只降解木聚糖，酶活分别为132±1IU/mg和22±2IU/mg，对桦木木聚糖的Km为5.4mgml^-1，Vmax为272μmol min^-1mg^-1。

本发明克隆到此木聚糖酶的编码基因，它具有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过鸟枪法(Charles等，2005)构建DNA文库，得到了这个木聚糖酶基因Kxyn。序列分析结果表明，该基因全长为1170bp，编码390个氨基酸。其完整的氨基酸序列与GeneBank上各种木聚糖酶的氨基酸序列同源性比较，最高的仅为63％，属于第10家族糖苷水解酶中的一种新木聚糖酶。Kxyn的氨基酸序列中只有活性催化区，没有纤维素结合区或其他功能区。

申请人已将包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/Mn22/6p/Kxyn，于2008年11月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M208201号。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的耐碱、高活性的碱性木聚糖酶Kxyn基因序列，序列全长为1170bp，其中1-1170位bp处为编码区。

图1：纯化后的重组木聚糖酶Kxyn的SDS-PAGE分析

图中：1.标准蛋白分子量2.纯化的木聚糖酶Kxyn

图2：木聚糖酶的最适PH值。

图3：木聚糖酶的PH稳定性。

图4：木聚糖酶的最适反应温度。

图5：木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

实施例1  产木聚糖酶的天然菌株的筛选方法

将由中国海洋微生物菌种保藏中心(地址：福建省厦门市中国海洋局三所)提供的海洋菌株(共计100个菌株)在高盐LB(1％的蛋白胨，0.5％酵母培养物和2％氯化钠，pH7.0)平板上活化后，挑出单菌落在产酶培养基(1％木聚糖，1％蛋白胨，1％酵母培养物，2％氯化钠(NaCl)，0.2％磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，0.03％硫酸镁(MgSO₄)，0.02％氯化钙(CaCl₂)和1.5％的琼脂糖，pH7.0)平板上，28℃培养36小时后，用1％刚果红染色10-15分钟，然后1M的NaCl脱色，挑取产生较大透明圈的菌株。经此实验，筛选得到一株属于放线菌属的考克氏菌，将该菌株命名为Kocuria sp.Mn22进行后续实验。

实施例2  DNA文库的构建和木聚糖酶阳性克隆的筛选

1、提取细菌染色体DNA：

(1)将实施例的筛选的Kocuria sp.Mn22菌株，用实施例1所述的高盐LB液体培养基于28℃培养24小时后，取1.5ml菌液于一灭菌Ep管中，12000转/分钟离心1分钟，弃上清，收集菌体；

(2)用TE buffer(50mmol/LTris-HCl pH8.0，10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次，之后加入50μl100μg/ml溶菌酶(购于sigma公司)悬浮菌体，37℃水浴一小时；

(3)加入520μl TE buffer，30μl 10％SDS和3μL 20mg/ml的蛋白酶K(购于sigma公司)混匀后，37℃水浴一小时；

(4)然后加入100μl 5mol/L的氯化钠溶液充分混匀，再加溴代十六烷基三甲胺(CTAB)/氯化钠(10％CTAB，0.7M NaCl)溶液80μL混匀，70℃水浴10分钟；

(5)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10分钟。12000rpm离心10分钟，抽提两次，得到上清；

(6)取步骤(5)的上清加入2/3体积的异丙醇轻轻混匀，12000转/分钟离心10分钟；

(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50μl TE溶液中，置-20℃保存备用。

部分酶解Kocuria sp Mn22染色体DNA

染色体DNA用限制性内切酶Sau3AI(购自TAKARA公司)部分酶解，酶解反应(50μl)为：5μl10×酶解缓冲液(购自TAKARA公司)，30μl染色体DNA，0.5U限制性内切酶Sau3AI，加水至终体积为50μl，在37℃下酶解5分钟后，每两分钟取样5μl终止酶解，琼脂糖电泳确定最佳酶解时间，然后放大体系酶解酶解最佳时间后，琼脂糖电泳酶解产物，根据DNA marker切胶回收4-9Kb片段。

纯化酶解产物：

按Qiagen公司琼脂糖胶DNA纯化试剂盒(QIAquick gel purification kit)及操作程序进行.具体过程是：取600μl PB缓冲液(购自Qiagen公司)，与150mg含有酶解产物的琼脂糖胶于50℃加热溶胶，待琼脂糖胶充分熔解后，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50μl无离子水，用12000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA。

酶解、脱磷pUC18载体：

用限制性内切酶BamHI(购自TAKARA公司)充分酶解质粒载体pUC18(购自TAKARA公司)，酶解反应(150μl)为：15μl10×酶解缓冲液(购自TAKARA公司)，100μl染色体DNA，1-2μl限制性内切酶BamHI，加水至终体积为150μl，在37℃下酶解2-3小时后，再加1μl CIAP(购自TAKARA公司)37℃反应1小时。琼脂糖电泳酶解产物，根据DNA marker切胶回收2.7Kb左右片段。

连接：20μl连接反应含有：2μl l0X连接缓冲液(购自TAKARA公司)，2-4μl预先用BamHI酶解和CIAP脱磷的pUC18载体(购自TAKARA公司)，7-10μl酶解PCR产物，1μl T₄DNA连接酶(购自TAKARA公司)，加水至终体积20μl，放4℃保温过夜。

转化：取2μl连接混合物与20μl大肠杆菌感受态细胞DH10B(购自Invitrogen公司)混合，加入到预冷的1mm的电转杯(购自BioRad公司)，1.5KV电击，然后迅速加入800μl液体LB培养基(其中含1％胰蛋白胨，1％Nacl，0.5％酵母粉pH7.0)，37℃保温1小时。与40μl 2％X-gal和4μl20％的IPTG(均购自sigma公司)混匀，铺含100μg/ml氨苄青霉素固体LB培养基(配方如下：1％胰蛋白胨，1％Nacl，0.5％酵母粉，1.5％琼脂糖，pH7.0)平皿，37℃保温14小时，获得蓝白斑筛选的Kocuria sp.Mn22的DNA文库。

筛选木聚糖酶阳性克隆：

用灭菌牙签将白斑挑出同时接种在含100μg/ml氨苄青霉素固体木聚糖平板和LB平板上，培养过夜后，用0.5％刚果红染色木聚糖平板10-15分钟，然后用1M NaCl脱色，筛选产生透明圈的克隆，并在LB平板上保存相对应的克隆。根据这种方法，我们从3000个转化子中挑出一个能在木聚糖平板上产生透明圈的阳性克隆，插入的质粒被命名为pUC-Kxyn。

插入木聚糖酶基因的重组质粒的制备：

将产生透明圈的阳性克隆从LB固体平板上接种到含100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中37℃培养过夜，取1.5ml菌液于一灭菌Ep管中，12000分钟/转离心1分钟，弃上清液，收集菌体。加入100μl溶液I(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，核糖核酸酶A 100μg/ml)充分混匀，然后加入溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)轻轻混匀，室温静置3-5分钟，最后加入溶液III快速混匀，12000转/分钟离心5分钟，收集上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10分钟，12000转/分钟离心5分钟；再次收集上清，加2/3倍体积的异丙醇混匀后12000转/分钟离心5分钟沉淀DNA；弃上清，沉淀用70％乙醇洗1次；置于室温干燥后，溶于50μl TE溶液中，置-20℃保存备用

序列分析：

根据pUC18/M13通用引物为测序引物(引物1：AGTCA CGACG TTGTA；引物2：CCCAG TCACG ACGTT)，以pUC-Kxyn重组质粒为模板，由北京华大生物公司测序。测序结果通过BLAST比对发现，插入片段确实含有木聚糖酶基因，基因全长为1170bp，编码390个氨基酸，其完整的氨基酸序列与GeneBank上各种木聚糖酶的氨基酸序列同源性比较，最高的仅为63％，属于第10家族木聚糖酶。

实施例3  大肠杆菌中克隆、表达和纯化木聚糖酶Kxyn的方法

构建重组表达载体pGEX-6P-Kxyn：

根据测序结果，设计引物，该引物对的序列如下：

正向引物(F)：5’-(BamHI)-ACCGGATCCATGAGCAGACGAGCCCCCCT

反向引物(R)：5’-(EcoRI)-GCGGAATTCTCAGCGGAACGCGGGGT

以pUC-Kxyn为模板，PCR扩增Kxyn。PCR体系如下：

10×PCR缓冲液(购自TAKARA公司)                   5μl

Mncl₂(5mM)                                      3μl

dNTP(10mM)                                      1μl

模板质粒pUC-Kxyn                                1μl

正向引物F(10μM)                                 1μl

反向引物R(10μM)                                 1μl

Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TAKARA，2.5U/μl)   1μl

加无离子水至                                          50μl

PCR条件：95℃预变性4分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃5分钟结束。

酶解PCR产物和质粒载体pGEX-6P-1：

PCR产物用限制性内切酶Bam HI/EcoRI(购自TAKARA公司)酶解，酶解反应(100μl)含有：10μl10X酶解缓冲液(购自TAKARA公司)，70μl PCR产物，3μl限制性内切酶Bam HI/EcoRI，加水至终体积为100μl，在37℃下保温3-5小时。质粒载体pGEX-6P-1酶解条件和体系同上一致。

纯化酶解产物：

按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification kit)及试剂盒说明书介绍的操作程序进行。具体过程是：取400μl PB缓冲液(购自Qiagen公司)，与100μl PCR产物充分混匀后，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750μl PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50μl无离子水，用12000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA。

纯化质粒pGEX-6P-1酶解产物方法参照实施例中“纯化酶解产物”的方法。

连接：

20μl连接体系含有：

10X连接缓冲液(购自TAKARA公司)                                2μl

Bam HI/EcoRI酶解pGEX-6P-1                                    2μl

Bam HI/EcoRI酶解PCR产物                                      8μl

T₄DNA连接酶(购自TAKARA公司)                                  1μl

加无离子水至                                                 20μl

4℃保温过夜。

转化：将连接混合物与100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800μl LB培养基(其中1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，pH7.0)，37℃保温1小时，铺含100μg/ml氨苄青霉素固体LB平皿，37℃保温14小时，挑取转化子抽提质粒。

质粒制备方法同实施例2中“带有木聚糖酶基因的重组质粒的制备”

序列测定：以pGEX-6P-Kxyn重组质粒为模板，以pGEX-6P-1的通用引物为测序引物，交由北京华大生物公司测序。结果与pUC-Kxyn的木聚糖酶核苷酸序列完全一致。

表达纯化木聚糖酶：

将重组质粒pGEX-6P-Kxyn转化致大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化木聚糖酶。具体步骤是：转化：将质粒pGEX-6P-Kxyn与100μl大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800μl LB培养基(其中1％胰蛋白胨，1％Nacl，0.5％酵母粉，pH7.0)，37℃保温1小时，铺含100μg/ml氨苄青霉素固体LB平皿，37℃保温14小时，挑取转化子诱导表达木聚糖酶。

重组木聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达：

将过夜活化的转化子以1％的接种量转接至1L含100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃培养2-3hrs，使A600达到0.6-0.7，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，18℃200转/分钟培养10小时。离心收集菌体，然后用PBS缓冲液(pH7.4，140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾)洗涤一次，再用50ml PBS悬浮，然后用高压细胞破碎仪破碎细胞，收集细胞破碎液。于4℃、12000转/分钟离心30分钟，收集上清。对上清进行初步活性实验和SDS-PAGE检测上清是否有目的蛋白表达。

亲和层析纯化木聚糖酶：

根据GST融合蛋白纯化试剂盒(购自Pharmacia公司)及试剂盒说明书操作。

(1)装柱：取1mL柱材料GSH Sepharose 4 B至层析柱中，用50ml PBS(pH 7.4，140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾)缓冲液过柱，平衡柱材料。

(2)上样：将细胞破碎液的上清以0.5ml/min的流速过柱

(3)洗脱：再用200mlPBS缓冲液过柱，洗脱没有结合的蛋白

(4)酶解：取10μl浓度为10个单位/μl的3C蛋白酶(购自Pharmacia公司)与1ml的PBS缓冲液混匀，加入层析柱酶切，在4℃酶解16小时。

(5)收集蛋白：收集上次添加的PBS缓冲液，然后再加1mlPBS缓冲液第二次洗脱收集。PBS缓冲液中即溶有目的蛋白Kxyn。

SDS-PAGE检测重组木聚糖酶纯度：

浓缩胶浓度为5％，配方如下：

H₂O                                    1.4ml

30％Acr-Bis(29:1)                                0.33ml

1M Tris-HCl，pH8.8                               0.25ml

10％SDS                                          0.02ml

10％过硫酸铵                                     0.02ml

TEMED                                            0.002ml

分离胶浓度为12％，配方如下：

H₂O                                              1.6ml

30％Acr-Bis(29:1)                                2ml

1M Tris-HCl，pH8.8                               1.3ml

10％ SDS                                         0.05ml

10％过硫酸铵                                     0.05ml

TEMED                                            0.002ml

取10μl纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2×)，沸水浴5-10min，然后上样10μl电泳检测。SDS-PAGE电泳检测结果(图1)表明，纯化的蛋白为单一条带，大小为40KDa。

测定木聚糖酶蛋白浓度：

根据Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)说明书测定木聚糖酶蛋白浓度。具体步骤是：

(1)取4μl蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)加PBS稀释至100μl，使终浓度为200μg/ml。

(2)取稀释后的标准品按0，1，2，4，6，8，10，15μl分别加到96孔板中，加PBS补足到20μl，每孔蛋白含量分别为0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3μg，每个梯度重复3次。

(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20μl，重复3次

(4)各孔加入200μl Bradford Reagent，混匀，室温放置5min。

(5)用预热的酶标仪(购自Thermo Scientific公司)测定A595读数。

(6)绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度

最后计算获得木聚糖酶浓度为0.17mg/ml。

实施例4  木聚糖酶的酶学性质的测定方法

木聚糖酶最适pH和pH稳定性测定方法如下：

采用常规的3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生还原糖含量。取10μl稀释了10倍的纯化的木聚糖酶加入90μl用不同pH值缓冲液配制1％的桦木木聚糖底物(pH3.0-8.0缓冲液为0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液；pH8.5-12缓冲液为50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，50℃反应30min，然后加入100μ1终止液(1L溶液：酒石酸钾钠182.0g，3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21.0g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g)终止反应，并于100℃反应10min，冷却后加双蒸水定容至1ml，再取200μl酶标仪测定A540读数，以最高酶活为100％，计算不同条件下的相对酶活。图2表明，Kxyn最适pH为8.5，在pH6.5-9.5酶活均维持在最大酶活的60％以上。木聚糖酶于上述不同pH值缓冲液中4℃放置24hrs，再在pH8.5的缓冲液中测定活性，以研究Kxyn的pH值耐受性，以未处理的木聚糖酶酶活为100％，计算相对酶活。结果见图3，图3表明，在pH7.5-12，残余酶活仍在80％以上，且在pH8.5-10.5时残余酶活为100％。说明此木聚糖酶Kxyn具有很好的耐碱性。

木聚糖酶最适温度和热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶最适温度的测定是在pH8.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中在不同温度下测定酶活。热稳定性的测定是木聚糖酶在60℃和70℃处理不同时间，再在最适温度下测定酶活。图4和图5结果分别表明Kxyn的最适温度为55℃，在60℃和70℃处理一小时后残余酶活为30％和15％左右。

木聚糖酶的Km和Vmax测定方法如下：

用PH8.5Gly-NaOH缓冲液配制不同浓度的桦木木聚糖底物(从0.5mg/ml to 15mg/ml)，在55℃测定酶活性，计算Kxyn55℃的Km和Vmax。经测定，Kxyn在55℃的Km为5.4mgml^-1，Vmax为2,720μmol min^-1mg^-1。

各种化学试剂对Kxyn酶活的影响测定如下：

各种金属离子(终浓度为1mm)和乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇和十二烷基磺酸钠(终浓度为5mm)与木聚糖酶混匀，然后按常规方法测定酶活。以对照酶活为100％，计算相对酶活。结果(表1)表明，Hg²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Pb²+和EDTA强烈抑制Kxyn的活性，而Mg²⁺，Na⁺，K⁺，Ca²⁺，β-巯基乙醇和DTT对Kxyn没有影响。但是Kxyn对SDS具有耐受性，加入SDS后，Kxyn仍有90％的酶活。

表1  各种化合物对本发明的木聚糖酶Kxyn的影响

木聚糖酶的底物特异性测定方法如下：

以浓度均为1％的羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、桦木木聚糖、燕麦木聚糖和槐豆胶(购自sigma公司)为底物，在pH8.5缓冲液中55℃测定Kxyn对各种底物的活性。结果如表2所示，由表2可以看出，本发明制备的木聚糖酶Kxyn只对木聚糖有活性，对纤维素或葡甘露聚糖没有活性。

表2  本发明的木聚糖酶Kxyn对各种底物的活性

参考文献：

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4.Ahlawat，S.，Battan，B.，Dhiman，S.S.，Sharma，J.，Mandhan，R.P.，2007.Production ofthermostable pectinase and xylanase for their potential application in bleaching of kraftpulp.J Ind Microbiol Biotechnol.34，763-770

5.Subramaniyan，S.，Prema，P.，2000.Cellulase-free xylanases from Bacillus and othermicroorganisms.FEMS Microbiol Lett.183，1-7

6.Srivastava，R.，Ali，S.S.，Srivastava，B.S.，1991.Cloning of xylanase gene of Streptomycesflavogriseus in Escherichia coli and bacteriophage λ-induced lysis for the release of clonedenzyme.FEMS Microbiology Letters.78，201-206.

7.Suzuki，M.，Kato，A.，Nagata，N.，2002.A xylanase，AtXyn1，is predominantly expressed invascular bundles，and four putative xylanase genes were identified in the Arabidopsisthaliana genome.Plant Cell Physiol.43，759-767.

8.Wamalwa，B.M.，Zhao，G.，Sakka，M.，et al.，2007.High-level heterologous expression ofBacillus halodurans putative xylanase xynlla(BH0899)in Kluyveromyces lactis.BiosciBiotechnol Biochem.71，688-693.

9.Devi l lard，E.，Newbold，C.J.，Scott，K.P.，et al.1999.A xylanase produced by the rumenanaerobic protozoan Polyplast ronmultivesiculatum shows close sequence similarity to family11xylanase from Grampositive bacteria.FEMS Microbiol Lett.181，145-152.

10.Charles C.L.，Rena E.K.，Kurt W.，et al.，2005.Cloning and characterization of a cold-activexylanase enzyme from an environmental DNA l ibrary.Extremophiles(2006)10：295-300.

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因

<130>

<141>2008-10-31

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1170

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia blattae)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1170)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1154)..(1170)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1170)

<223>

<400>1

<210>2

<211>389

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia blattae)

<400>2

Claims (2)

1.一种耐碱的碱性木聚糖酶Kxyn基因，它的编码序列如序列表SEQ ID NO：1中第1-1170位核苷酸对应的序列所示。

2.一种表达耐碱的碱性木聚糖酶Kxyn基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/Mn22/6p/Kxyn，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M208201。

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