CN102628056A - 一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用 - Google Patents
一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用，该β-甘露聚糖酶基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，该酶还具有SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。本发明还包括所述耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用。本发明之β-甘露聚糖酶的最适pH值和温度分别为4.6和70℃，具有一定的耐酸、耐高温特性，特别适于应用在在食品、饲料、造纸、印染、纺织等行业中。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体地说，是涉及一种耐酸、耐高温β-甘露聚糖酶基因及其在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用。
背景技术
β-甘露聚糖酶 (β-1,4-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78)，又称为β-D-甘露聚糖酶或β-1,4-D-甘露聚糖酶，是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的内切水解酶[Zhimin
He, Jun Zhang , Dongpo Huang. A kinetic correlation for konjac powder
hydrolysis by β -mannanase from
Bacillus licheniformis[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23: 389-393.]。它属于半纤维素酶类，具有纤维素酶活性的广谱诱导型多功能酶，广泛存在于动植物和微生物中[Vendula Val á Val áš kov á ,kov á ,
Petr Baldrian. Estimation of bound and free fractions of
lignocellulose-degrading enzymes of wood-rotting fungi Pleurotus ostreatus,
Trametes versicolor and Piptoporus betulinus [J]. Research in Microbiology,
2006, 157:119-124.]。
分解甘露聚糖的酶的最初报道是在20世纪初，直到50年代，陆续发现报道了许多产甘露聚糖酶的生物，β-甘露聚糖酶早期的研究工作主要是产酶微生物菌株的选育，发酵条件优化、酶的纯化和理化性质、酶水解作用机理等方面[Araujo,
A., Ward, O.P., Hemicellulases of Bacillus species: preliminary comparative
studies on production and properties of mannanases and galactanases [J].
J. Appl. Bacteriol., 1990, 68:253-261.]。随着基因和蛋白质工程技术的广泛应用，β-甘露聚糖酶的研究开始转向基因的克隆表达和活性位点等方面的研究[Anna M. Larsson1, Lars
Anderson, Bingze Xu, et al. Three-dimensional Crystal Structure and Enzymic
Characterization of b-Mannanase Man5A from Blue Mussel Mytilus edulis [J]. J.
Mol. Biol., 2006, 357:1500-1510.]。特别是近来随着对自然界半纤维素资源的开发及甘露寡糖药用价值的发现，β-甘露聚糖酶研究更加令人瞩目，β-甘露聚糖酶的开发和利用正在进入一个新时代。
β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中都有发现。从微生物中提取的β-甘露聚糖酶活性高、成本低、提取方便，比从动植物中提取的β-甘露聚糖酶有更广的作用pH、温度范围，底物专一性更好，已在工业生产和理论研究中得到了广泛的应用。20世纪60、70年代对产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-50、巨曲霉、黑曲霉和沃特曼青霉等菌株的研究工作着重于产酶菌株的筛选、酶的分离纯化和酶学性质以及作为工具酶用于对天然多糖类物质糖链结构的分析[田亚平,金其荣. 黑曲霉β-甘露聚糖酶酶学性质及其化学组成[J].无锡轻工大学学报, 1998, 17(3):31-35]。80年代随着日本、法国、前苏联、美国等国家先后开展了对嗜水气单孢菌F-25、卡塞尔黄肠球菌FL2121、嗜碱芽孢杆菌AM001等产β-甘露聚糖酶的细菌研究，人们发现经β-甘露聚糖酶水解的植物胶如魔芋粉、角豆胶、瓜儿豆胶等产生的低聚甘露糖能促进双歧杆菌的增殖[昊襟,何秉旺.微生物β-甘露聚糖酶[J].微生物学通报,1999,26(2):134-136.]。
随着分子生物学技术的发展以及β-甘露聚糖酶的广泛利用，对细菌β-甘露聚糖酶的研究成为热点。1999年Jonathan等通过筛选高温厌气热梭杆菌 (Clostridium thermocellum) 基因组文库获得甘露聚糖酶基因manA，其ORF长1767bp，编码一个589个氨基酸的蛋白质(Man26A)，分子量为66.816kDa，N-端有一个原核生物的信号肽，酶催化结构域与另外一些糖苷水解酶家族26的甘露聚糖酶同源性只有32%，此酶的最适作用温度为65℃，最适pH为6.5[Jonathan
R. Halstead, Philip E. Vercoe, Harry J. Gilbert, et al. A family 26 mannanase
produced by Clostridium thermocellum as a component of the cellulosome contains
a domain which is conserved in mannanases from anaerobic fungi [J].
Microbiology, 1999, 145:3101-3108.]。Anwar等通过基因组步查PCR技术获得一个来自嗜纤维杆菌（Caldibacillus
cellulovorans）的4567bp核苷酸序列，它含有三个ORF，其中ORF1一部分编码一个C-端纤维素结合域（CBD），ORF2编码β-甘露聚糖酶，ORF3编码一个功能未知的蛋白质。ORF2编码的酶具有多个结构域，包括一个功能未知的N-端结构域（D1），一个内部CBD（D2），一个β-甘露聚糖酶的催化结构域（D3）和一个C-端CBD（D4）。D3与糖苷水解酶家族5有一定的同源性，将D3的基因克隆并表达重组酶ManAd3，发现它的最适作用温度和pH分别为85℃和6.0，在70℃具有极高的热稳定性[Anwar
Sunna,Moreland D.Gibbs,Charles W.J.Chin, et al. A Gene Encoding a Novel
Multidomain β -1,4-Mannanase
from Caldibacillus cellulovorans and Action of the Recombinant. E nzyme on
Kraft Pulp [J]. Applied And Environment Microbilogy, 2000, 2:664-670.]。2004年Ma等从碱性枯草芽孢杆菌N16-5中纯化出一种碱性β-甘露聚糖酶，该酶的最适作用温度和pH分别为75℃和9.5，通过SDS-PAGE推断该酶为单体酶，分子量为55kDa，等电点pI为4.3，能有效地将半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖水解成一系列的低聚糖和单糖，该酶的基因(manA)包括一个1479bp的ORF，与糖苷水解酶家族5的基因具有高度同源性[Yanhe
Ma,Yanfen Xue,Yuetan Dou, et al. Characterization and gene cloning of a novel β -mannanase from alkaliphilic Bacillus sp. N16-5 [J].
Extremophiles, 2004, 8:447-454.]。
通过对各种来源的β-甘露聚糖酶的长期研究和开发，这类酶已在医药、食品、饲料、造纸、印染、纺织、石油开采及生物技术等方面得到了广泛的应用[Petr
Baldrian , Vendula Val áš kov á ,kov á ,
Vera Merhautov á , et al.
Degradation of lignocellulose by Pleurotus ostreatus in the presence of copper,
manganese, lead and zinc [J]. Research in Microbiology, 2005, 156:670-676.]。我国对β-甘露聚糖酶的研究从八十年代就己开始，但到目前为止，仍然没能实现大规模的生产利用。这主要是由于β-甘露聚糖酶的性质不够优良，酶活低，生产成本高，使其应用范围及应用程度受到了很大的限制。微生物生产β-甘露聚糖酶的种类繁多，不同来源的β-甘露聚糖酶具有不同的性质，从而导致各具特色的应用范围。但利用基因工程手段来产业化生产耐酸、耐热β-甘露聚糖酶的产品还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因。
本发明进一步要解决的技术问题是，提供一种应用所述耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，从枯草杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No1.1628（购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所）中获得β-甘露聚糖酶基因，它由1083bp的DNA组成，编码一个360个氨基酸组成的蛋白质。
本发明之耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因，其序列为SEQ ID NO.1：
atgcttaaaa agttagcagt ctgcctgtct atcgttttat tactcttagg
agccgccagt 60
ccgatagagg ctcacaccgt ttatcccgtc aacccaaatg cccagcagac
gacaaaagat 120
atcatgaact ggctggccca cctgcccaac cgttcagaaa acagggtcct
gtccggagcg 180
ttcggcgggt acagtgatgt cactttttca atgacagagg caaaccgctt
gaaaaacgcg 240
acgggacagt ctcccgccat ctacggctgt gactatggga gagcgtggct
ggaaacagcg 300
gatatcaccg atactatcga ttacagctgc aacagcagct taatctcata
ctggaaaagc 360
ggcggcctcc ctcaggtcag cctgcatctc gcaaatccgg cctttccatc
cggaaactat 420
aaaacgccca tctcaaacag ccagtacaaa aacatccttg acccttcaac
tgtggaagga 480
aaacggcttg aggcgctgct cagcaaaatc gccgacggcc ttactcagct
gaaaaatcaa 540
ggcgtcaccg ttctgttcag accgctgcat gaaatgaacg gcgagtggtt
ctggtggggg 600
ctgacaggct acaaccaaaa agacaatgag agaatctcgc tgtacaaaga
gctttacaag 660
aagatatacc actatatgac agagacaaga ggattggata accttttgtg
ggtgtattcg 720
ccggatgcca acagagactt taaaacagac ttctacccag gctcatctta
tgtggatatt 780
accggtctgg acgcttactt cactgatccg tatgcgatat caggctatga
tgaaatgctg 840
tctctgaaaa aaccgtttgc ctttgccgaa accggtccgt ccggcaatat
cggaagcttt 900
gattatgctg cttttattaa tgcgatcagg caaaaatacc ctcagaccgc
gtactttttg 960
acatgggatg aacaattaag tccggcggcc aatcaaggcg cgcaaagcct
ttatcaagat 1020
agctggacgc tgaacaaggg cgaaatatgg aacggcgggt ccttgacgcc
gatcgcggaa 1080
taa 1083
本发明之耐酸耐高温β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ
ID NO.2：
Met Leu Lys Lys Leu Ala Val Cys Leu Ser Ile Val Leu Leu Leu
Leu
1
5 10 15
Gly Ala Ala Ser Pro Ile Glu Ala His Thr Val Tyr Pro Val Asn
Pro
20
25 30
Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Asp Ile Met Asn Trp Leu Ala His
Leu
35
40 45
Pro Asn Arg Ser Glu Asn Arg Val Leu Ser Gly Ala Phe Gly Gly
Tyr
50
55 60
Ser Asp Val Thr Phe Ser Met Thr Glu Ala Asn Arg Leu Lys Asn
Ala
65
70 75 80
Thr Gly Gln Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Gly Arg Ala
Trp
85 90 95
Leu Glu Thr Ala Asp Ile Thr Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn
Ser
100
105 110
Ser Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Ser Gly Gly Leu Pro Gln Val Ser
Leu
115
120 125
His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Pro Ser Gly Asn Tyr Lys Thr Pro
Ile
130
135 140
Ser Asn Ser Gln Tyr Lys Asn Ile Leu Asp Pro Ser Thr Val Glu
Gly
145
150 155 160
Lys Arg Leu Glu Ala Leu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Thr
Gln
165 170 175
Leu Lys Asn Gln Gly Val Thr Val Leu Phe Arg Pro Leu His Glu
Met
180 185 190
Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys
Asp
195 200 205
Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Tyr
His
210 215 220
Tyr Met Thr Glu Thr Arg Gly Leu Asp Asn Leu Leu Trp Val Tyr
Ser
225
230 235 240
Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser
Ser
245 250 255
Tyr Val Asp Ile Thr Gly Leu Asp Ala Tyr Phe Thr Asp Pro Tyr
Ala
260 265 270
Ile Ser Gly Tyr Asp Glu Met Leu Ser Leu Lys Lys Pro Phe Ala
Phe
275 280 285
Ala Glu Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ile Gly Ser Phe Asp Tyr Ala
Ala
290 295 300
Phe Ile Asn Ala Ile Arg Gln Lys Tyr Pro Gln Thr Ala Tyr Phe
Leu
305
310 315 320
Thr Trp Asp Glu Gln Leu Ser Pro Ala Ala Asn Gln Gly Ala Gln
Ser
325 330 335
Leu Tyr Gln Asp Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asn
Gly
340 345 350
Gly Ser Leu Thr Pro Ile Ala Glu *
355 360
耐酸耐高温β-甘露聚糖酶全长360个氨基酸，其理论分子量为40.2 kDa。
所述耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因的表达产物β-甘露聚糖酶在酸性条件和高温条件下显示活性。
通过分子生物学技术将本发明之耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因克隆到其它受体菌株中，可以生产耐酸耐高温β-甘露聚糖酶。
本发明通过分子生物学技术获得了含有该基因的重组质粒，并转化大肠杆菌，从而获得表达β-甘露聚糖酶的重组菌株。
研究表明，枯草杆菌（Bacillus subtilis）能产生一种新的耐高温（最适温度 70℃）、耐酸性环境（最适pH 4.6）的β-甘露聚糖酶，利用PCR介导的定点突变技术将此β-甘露聚糖酶基因第2号密码子CUU突变为GUU，构建突变表达载体pET-28a-manA*，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，可将酶表达活力从62.1 U/mL提升到298.3 U/mL。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种应用所述耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶的方法，即通过分子生物学技术将本发明之β-甘露聚糖酶基因克隆到其它更有利于生产应用的受体菌上，由其它菌株或在其它培养条件下生产本发明之耐酸耐高温β-甘露聚糖酶，具体包括以下步骤：
（1）枯草杆菌CGMCC
No1.1628总DNA的提取：将枯草杆菌CGMCC
No1.1628单克隆菌落（购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所）接种至LB培养基中在30-38℃（优选35℃）下培养10-15h（优选12h），采用参考文献中的方法提取基因组DNA[姚斌,袁铁铮,王元火,等. 来源于Bacillus
subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].生物工程学报, 2000, 17(1):11-15];
（2）β-甘露聚糖酶重组菌株的构建：根据pET-28a表达载体及β-甘露聚糖酶基因序列特点，进行非融合表达，设计引物：
P1：5’-CGCCATATGCTTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’，
P2：5'-CCGGAATTCTTATTCCGCGATCGGCGTC-3'；
定点突变引物：P3：5’-CGCCATATGG*TTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’（G*为突变碱基），下游引物共用P2；以步骤（1）所得枯草杆菌CGMCC No1.1628基因组DNA为模板，通过PCR技术克隆β-甘露聚糖酶基因；用限制性内切酶Nde I和限制性内切酶EcoR I对β-甘露聚糖酶基因和表达载体pET-28a进行双酶切，然后将酶切后的β-甘露聚糖酶基因和酶切后的表达载体pET-28a连接，获得重组质粒pET-28a-manA和pET-28a-manA*,将重组质粒转化大肠杆菌E.
coli BL21 (DE3)，并筛选阳性克隆，从而获得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli (pET-28a-manA)和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E.
coli (pET-28a-manA*);
（3）β-甘露聚糖酶基因的表达：将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli (pET-28a-manA)和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E.
coli (pET-28a-manA*)接种至LB液体培养基中，在35-40℃（优选37℃）下振荡培养至 OD600nm=0.6-1.0（优选0.8），并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.5-2.5 mmol/L（优选1
mmol/L）诱导β-甘露聚糖酶基因的表达；
（4）β-甘露聚糖酶酶学活性的检测：将经步骤（3）异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后的重组菌上清液用纯水进行10倍稀释，取1mL稀释后上清液与1mL槐豆胶溶液（0.5wt%）混合，55℃反应10min，然后用DNS法测定水解产生的还原糖，在此反应条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需酶量为1个酶活力单位；表达的β-甘露聚糖酶分别在不同的pH值和温度下进行酶促反应，测定其最适pH和最适温度；
所述槐豆胶溶液用pH为7.0的磷酸缓冲液配制。
本发明提供了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的β-甘露聚糖酶在酸性环境下具有最高酶活性（pH 4.6），其最适作用温度是70℃，具有较好的耐热性，可以应用于食品、饲料、造纸、印染、纺织等工业。
本发明利用PCR介导的定点突变技术将此β-甘露聚糖酶基因第2号密码子CUU突变为GUU，使β-甘露聚糖酶定点突变后的重组菌株比未突变的重组菌所产生的β-甘露聚糖酶的酶活力提高了4.8倍。
附图说明
图 1 是重组表达质粒pET-28a-manA和pET-28a-manA*结构示意图；
图 2是重组表达质粒pET-28a-manA的测序鉴定图；
图 3是重组表达质粒pET-28a-manA*的测序鉴定图；
图 4 是本发明实施例重组β-甘露聚糖酶的最适作用pH值测试结果图；
图 5 是本发明实施例重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度测试结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本实施例包括以下步骤：
（1）枯草杆菌CGMCC
NO1.1628菌总DNA的提取
1) 挑取枯草杆菌CGMCC NO1.1628菌株一单菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养12h；2) 吸取1.4 mL菌液至离心管中，10000 rpm离心30s，倒去培养基，重复多次直至菌液收集完全；3)将细菌重悬于480μL STE溶液（0.1 mol/L NaCl，10
mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）中，室温放置30 min；4) 加入20μL溶菌酶和RNase A，37℃放置1h；5) 加入1/10体积的10% SDS、0.1 mg/mL 蛋白酶K（最终浓度）于55℃放置2h；6) 冷却至室温后加入1/3体积5mol/L NaCl和1体积氯仿，室温下放置30min，每隔5 min上下颠倒一次；7) 13000 r/m离心30min，并将上清液移至新管中；8) 加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，于-20℃放置1h；9) 10 000 rpm离心10min，倒去上清液；10) 加入70%乙醇洗涤沉淀，10000 rpm离心5min；11) 倒去上清液，于室温下干燥；12) 将基因组DNA悬浮于50μL 的无菌水中，-20℃储存备用。
（2）β-甘露聚糖酶重组菌株的构建
正常引物的设计：根据pET-28a表达载体及目的基因序列的特点，选择Nde I与EcoR I的酶切位点处作为目的基因的插入位置；引物设计如下：
上游引物P1（下划线为Nde I酶切位点）：
5’—CGC CATATGCTTAAAAAGTTAGCAGTGAC—3’；
下游引物P2（下划线为EcoR
I酶切位点）：
5 '—CCG GAATTC TTATTCCGCGATCGGCGTC—3'；
引物由上海生物工程技术公司合成；
定点突变引物的设计：根据氨基酸的性质，由于亮氨酸(CUU)是中性氨基酸，它和中性氨基酸缬氨酸(GUU)分子结构相差一个亚甲基，密码子仅相差一个碱基，所以设计点突变引物将C突变成G，最终使氨基酸序列发生改变；再结合pET-28a表达载体的特点，设计突变引物：
上游引物P3（下划线为Nde I酶切位点,G*为突变碱基）：
5’-CGC CATATGG*TTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’；
下游引物P2（下划线为EcoRI酶切位点）：
5 '-CCG GAATTC TTATTCCGCGATCGGCGTC-3'；
引物由上海生物工程技术公司合成；
用合成的正常引物P1和P2和定点突变引物P3和P2分别对步骤（1）所得枯草杆菌CGMCC NO1.1628基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃最后延伸合成15min。PCR 产物经电泳检测，得到一条1100bp的DNA条带,切胶回收后，分别用限制性内切酶 Nde I与限制性内切酶EcoR
I进行双酶切，再与经过同样双酶切的pET-28a表达载体进行连接；从而成功构建重组质粒pET-28a-manA（正常表达质粒）和pET-28a-manA*（定点突变质粒）；在200μL的 E. coli BL21(DE3)感受态细胞中加入1μL（约10ng）重组质粒pET-28a-manA和pET-28a-manA*，冰浴30min后，迅速放入42℃ 水浴中热激90s，取出后，冰上放置2min；然后加入800μL LB，37℃ 培养1h；最后7000
rpm离心2min，弃去800μL培养基，将剩余200μL菌液涂布于含有卡那霉素的LB的平板上，37℃ 培养过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定；
（3）β-甘露聚糖酶基因的表达
1) 挑取重组菌E. coli (pET-28a-manA) 和 E. coli (pET-28a-manA*) 的单菌落接种至4mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm=0.6-1.0，加入1.0
mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至培养基中，在28℃条件下，继续培养6h-7h，每隔1h取1 mL菌液，12000 rpm离心30s，菌体与培养基分离，于-20℃保存；
（4）β-甘露聚糖酶酶学活性的检测
采用DNS（3,5-二硝基水杨酸溶液）法对本发明的β-甘露聚糖酶进行活性分析，具体方法如下：取0.025mL经纯水10倍稀释的酶液与1mL槐豆胶溶液（0.5wt% pH 7.0磷酸缓冲液配制）混合，55℃反应10min，加入1.5mL DNS试剂，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，混匀，在分光光度计上进行比色；在540nm处测其光吸收值，在标准曲线上读出其毫克数；β-甘露聚糖酶活性单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解甘露聚糖产生1μmol还原糖所需酶量为1个酶活力单位（U）。
β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli
(pET-28a-manA)和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli
(pET-28a-manA*)不同诱导时间后酶活力比较如表1所示：
表1 β-甘露聚糖酶未突变重组菌株E. coli
(pET-28a-manA)和β-甘露聚 糖酶定点突变重组菌株E. coli (pET-28a-manA*)酶活力分析结果
从表1 可以看出，诱导9h后β-甘露聚糖酶定点突变后的重组菌株比未突变的重组菌所产生的β-甘露聚糖酶的酶活力提高了4.8倍
β-甘露聚糖酶的最适pH和最适温度
取表达的β-甘露聚糖酶液在不同的pH值下进行酶促反应测定其最适pH，底物槐豆胶用不同pH的0.2 mmo1/L缓冲液配制(pH
2.0为HCl-KCl缓冲液；pH
3.0为HCl-甘氨酸缓冲液；pH
4.0、4.4、4.6、5.0、5.4、5.6为HAc-NaAc缓冲液；pH 6.0、6.4、6.6、7.0、7.4、7.6、8.0为0.2 mmo1/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；pH 9.0、10.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)，55℃测定酶活性。表达的β-甘露聚糖酶的最适温度测定在(pH 5.0) HAc-NaAc缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。β-甘露聚糖酶最适pH和温度的检测结果见图3和图4，未突变重组菌和突变重组菌表达的β-甘露聚糖酶，在55℃下其作用pH 都有pH 4.6 和pH 7.0两个峰值，最适作用pH 值都为4.6；在pH 5.0下，未突变和突变的β-甘露聚糖酶最适作用温度都为70℃，当温度达到90℃时，两组酶都没有完全失活，这表明两组酶都有一定的耐热性。
序列表
<110>
中南林业科技大学
<120>
一种耐酸耐高温β
-
甘露聚糖酶基因及其应用
<160> 2
<210> 1
<211>1083
<212> DNA
<213>
枯草杆菌（
Bacillus
subtilis
）
<400> 1
atgcttaaaa agttagcagt ctgcctgtct atcgttttat tactcttagg
agccgccagt 60
ccgatatcgg ctcacaccgt ttatcccgtc aacccaaatg cccagcagac
gacaaaagat 120
atcatgaact ggctggccca cctgcccaac cgttcagaaa acagggtcat
gtccggagcg 180
ttcggcgggt acagtgatgt cactttttca atgacagagg aaaaccgctt
gaaaaacgcg 240
acgggacagt ctcccgccat ctacggctgt gactatggga gagggtggct
ggaaacagcg 300
gatatcaccg atactatcga ttacagctgc aacagcagct taatctcata
ctggaaaagc 360
ggcggcctcc ctcaggtcag cctgcatctc gcaaatccgg cctttccatc
cggaaactat 420
aaaacggcca tctcaaacag ccagtacaaa aacatccttg acccttcaac
tgtggaagga 480
aaacggcttg aggcgctgct cagcaaaatc gccgacggcc ttactcagct
gaaaaatcaa 540
ggcgtcaccg ttctgttcag accgctgcat gaaatgaacg gcgagtggtt
ctggtggggg 600
ctgacaggct acaaccaaaa agacaatgag agaatctcgc tgtacaaaga
gctttacaag 660
aagatatacc gctatatgac agagacaaga ggattggata accttttgtg
ggtgtattcg 720
ccggatgcca acagagactt taaaacagac ttctacccag gctcatctta
tgtggatatt 780
accggtctgg acgcttactt cactgatccg tatgcgatat caggctatga
tgaaatgctg 840
tctctgaaaa aaccgtttgc ctttgccgaa accggtccgt ccggcaatat
cggaagcttt 900
gattatgctg cttttattaa tgcgatcagg caaaaatacc ctcagaccgc
gtactttttg 960
acatgggatg aacaattaag tccggcggcc aatcaaggcg cgcaaagcct
ttatcaaaac 1020
agctggacgc tgaacaaggg cgaaatatgg aacggcgggt ccttgacgcc
gatcgcggaa 1080
taa 1083
<210> 2
<211>360
<212> PRT
<213>
枯草杆菌（
Bacillus
subtilis
）
<400> 2
Met Leu Lys Lys Leu Ala Val Cys Leu Ser Ile Val Leu Leu Leu Leu
1
5
10
15
Gly Ala Ala Ser Pro Ile Glu Ala His Thr Val Tyr Pro Val Asn Pro
20
25
30
Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Asp Ile Met Asn Trp Leu Ala His Leu
35
40
45
Pro Asn Arg Ser Glu Asn Arg Val Leu Ser Gly Ala Phe Gly Gly Tyr
50
55
60
Ser Asp Val Thr Phe Ser Met Thr Glu Ala Asn Arg Leu Lys Asn Ala
65
70
75
80
Thr Gly Gln Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Gly Arg Ala Trp
85
90
95
Leu Glu Thr Ala Asp Ile Thr Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn Ser
100
105
110
Ser Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Ser Gly Gly Leu Pro Gln Val Ser Leu
115
120
125
His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Pro Ser Gly Asn Tyr Lys Thr Pro Ile
130
135
140
Ser Asn Ser Gln Tyr Lys Asn Ile Leu Asp Pro Ser Thr Val Glu Gly
145
150
155
160
Lys Arg Leu Glu Ala Leu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Thr Gln
165
170
175
Leu Lys Asn Gln Gly Val Thr Val Leu Phe Arg Pro Leu His Glu Met
180
185
190
Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Asp
195
200
205
Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Tyr His
210
215
220
Tyr Met Thr Glu Thr Arg Gly Leu Asp Asn Leu Leu Trp Val Tyr Ser
225
230
235
240
Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ser
245
250
255
Tyr Val Asp Ile Thr Gly Leu Asp Ala Tyr Phe Thr Asp Pro Tyr Ala
260
265
270
Ile Ser Gly Tyr Asp Glu Met Leu Ser Leu Lys Lys Pro Phe Ala Phe
275
280
285
Ala Glu Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ile Gly Ser Phe Asp Tyr Ala Ala
290
295
300
Phe Ile Asn Ala Ile Arg Gln Lys Tyr Pro Gln Thr Ala Tyr Phe Leu
305
310
315
320
Thr Trp Asp Glu Gln Leu Ser Pro Ala Ala Asn Gln Gly Ala Gln Ser
325
330
335
Leu Tyr Gln Asp Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asn Gly
340
345
350
Gly Ser Leu Thr Pro Ile Ala Glu *
355
360
Claims (8)
1.一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.一种如权利要求1或2所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）枯草杆菌CGMCC No1.1628总DNA的提取：将枯草杆菌CGMCC No1.1628单克隆菌落接种至LB培养基中在30-38℃下培养10-15h，提取基因组DNA;
（2）β-甘露聚糖酶重组菌株的构建：根据pET-28a表达载体及β-甘露聚糖酶基因序列特点，进行非融合表达，设计引物：
P1：5’-CGCCATATGCTTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’，
P2：5'-CCGGAATTCTTATTCCGCGATCGGCGTC-3'；
定点突变引物：P3：5’-CGCCATATGG*TTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’， G*为突变碱基，下游引物共用P2；以步骤（1）所得枯草杆菌CGMCC No1.1628基因组DNA为模板，通过PCR技术克隆β-甘露聚糖酶基因；用限制性内切酶Nde I和限制性内切酶EcoR I对β-甘露聚糖酶基因和表达载体pET-28a进行双酶切，然后将酶切后的β-甘露聚糖酶基因和酶切后的表达载体pET-28a连接，获得重组质粒pET-28a-manA和pET-28a-manA*,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)，并筛选阳性克隆，从而获得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*;
（3）β-甘露聚糖酶基因的表达：将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*接种至LB液体培养基中，在35-40℃下振荡培养至 OD600nm=0.6-1.0，并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.5-2.5 mmol/L诱导β-甘露聚糖酶基因的表达；
（4）β-甘露聚糖酶酶学活性的检测。
4.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（1）中，将枯草杆菌CGMCC No1.1628单克隆菌落接种至LB培养基中，培养温度为35℃。
5.根据权利要求3或4所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（1）中，将枯草杆菌CGMCC No1.1628单克隆菌落接种至LB培养基中，培养时间为12h。
6.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*接种至LB液体培养基中，培养温度为37℃。
7.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*接种至LB液体培养基中，振荡培养至 OD600nm=0.8。
8.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（3）中，所加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为1 mmol/L。
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