CN101870956A - 产纤维素酶的菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产纤维素酶的菌剂及其应用。该产纤维素酶的菌剂，其活性成分为毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526；所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515是将外切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌。发酵本发明的产纤维素酶的菌剂可生产纤维素酶。
Description
技术领域
本发明涉及产纤维素酶的菌剂及其应用。
背景技术
传统的纤维素酶生产方法主要是在自然界中筛选优良产酶菌株，再通过一定的诱变手段，获得工业化大规模生产的产酶菌种。但自然环境中纤维素的降解是多种微生物协同完成的，这些微生物相互共生，形成一个降解纤维素的微生态体系。在特定的生态系统中，微生物之间互相协同作用，也互相制约，使得产生的水解纤维素的酶之间的比例处于一种最适降解纤维素的状态，而产生纤维素酶的微生物一旦从其小生态中分离出来，就会破坏这个最佳比例。筛选优良菌株时无疑是将其从其生态环境中分离出来，所以其产酶能力很难有所突破。目前工业用纤维素酶的来源主要是好氧丝状真菌木霉，如里氏木霉、绿色木霉、康宁木霉，但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面木霉产的β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累，最终影响酶解效率。微生物合成纤维素酶受诱导和葡萄糖阻遏这两种机制调控，β-葡萄糖苷酶分解纤维二糖产生寡糖，产生的寡糖属于微生物易利用的碳源，其又会阻遏纤维素酶的合成。真菌虽然可以分泌大量纤维素酶，其产酶能力较高，酶系较全，但真菌发酵周期长，易染细菌且不易扩大生产；细菌生产速度虽然快，但产酶水平低。微生物自身会分泌大量非目的酶蛋白，而纤维素酶又难于纯化，因此不利于工业化的生产及应用。传统的纤维素酶生产方法已经达到了一个瓶颈。
随着基因工程技术的发展，越来越多的纤维素酶编码基因得到克隆，并成功的在大肠杆菌及毕赤酵母等多种表达系统中表达。但由于纤维素的完全水解需要三种酶成分的协同作用，而常规的基因工程手段通常可以高效表达一种酶，所以基因工程纤维素酶功能略显单薄。现有的重组纤维素酶的生产主要有两种方式，其一是将上述三种纤维素酶单独生产，应用时再进行组合，其二是构建鸡尾式表达体系直接生产复合纤维素酶，不过这两种方法都有一定的局限性。前一种方法需要将三种酶分别单独生产，其整个发酵周期长，仪器设备及占地面积都有较高的要求。而第二种方法同时在一个毕赤酵母中表达三种不同的酶蛋白，其表达量及产量得不到保证，仅有理论研究价值而无实际应用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种产纤维素酶的菌剂及其应用。
本发明所提供的产纤维素酶的菌剂，其活性成分为毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526；所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515是将外切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌。
其中，所述内切葡聚糖酶可是如下1)或2)的蛋白；所述外切葡聚糖酶可是如下3)或4)的蛋白；所述β-葡萄糖苷酶可是如下5)或6)的蛋白；
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由1)衍生的蛋白质；
3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
4)在序列表中序列4的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由3)衍生的蛋白质；
5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
6)在序列表中序列6的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由5)衍生的蛋白质。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。
为了使序列表中序列2、4或6所示的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2、4或6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述带有标签的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述带有标签的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1、3或5所示的DNA分子中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述内切葡聚糖酶基因可是如下a)或b)或c)的DNA分子；所述外切葡聚糖酶基因可是如下d)或e)或f)的DNA分子；所述β-葡萄糖苷酶基因可是如下g)或h)或i)的DNA分子；
a)其核苷酸序列是序列表中序列1；
b)在严格条件下与a)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
c)与a)或b)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
d)其核苷酸序列是序列表中序列3；
e)在严格条件下与d)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
f)与d)或e)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
g)其核苷酸序列是序列表中序列5；
h)在严格条件下与g)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
i)与g)或h)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子。
所述c)、f)或i)中的基因，与a)、d)或g)的基因最好有95％以上的同源性。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526的集落形成单位数目比为(3-10)∶(1-5)∶(1-3)。
所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526可分别独立包装，也可混合在一起。
本发明的产纤维素酶的菌剂可为液体制剂，也可为固体制剂。在液体制剂中加入吸附剂即可获得固体制剂，如加入轻质碳酸钙或草炭等。
所述毕赤酵母1413具体可为将内切葡聚糖酶基因导入巴斯德毕赤酵母GS115中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515具体可为将外切葡聚糖酶基因导入巴斯德毕赤酵母GS115中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526具体可为将β-葡萄糖苷酶基因导入巴斯德毕赤酵母GS115中获得的重组菌。
本发明的产纤维素酶的菌剂可用来生产纤维素酶。
本发明的另一个目的是提供一种生产纤维素酶的方法。
本发明所提供的生产纤维素酶的方法，是发酵所述的菌剂生产纤维素酶。
本发明的产纤维素酶的菌剂的活性成分为表达内切葡聚糖酶的毕赤酵母、表达外切葡聚糖酶的毕赤酵母和表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母。毕赤酵母表达系统采用甲醇作为诱导物，不会阻遏毕赤酵母产纤维素酶的能力。本发明的产纤维素酶的菌剂的活性均为毕赤酵母生物，彼此间不存在竞争，且其表达的酶之间也无抑制作用，彼此之间不存在影响。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法。
下述实施例中所用试剂均可从商业途径获得。下述实施例所用到的生物材料如下：
解淀粉芽孢杆菌CICC 22947于2008年1月，获取自保藏机构中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。解淀粉芽孢杆菌CICC 22947的原始来源不清楚。
产黄青霉CICC 40209于2008年1月，获取自保藏机构中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。产黄青霉CICC 40209的原始来源不清楚。
黑曲霉CICC 40613于2008年1月，获取自保藏机构中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。黑曲霉CICC 40613的原始来源不清楚。
中国工业微生物菌种保藏管理中心的联系方式如下：北京市朝阳区霄云路32号邮编：100027；电话：010-64666552；传真：010-64616613
实施例1、产纤维素酶的菌剂
一、内切葡聚糖酶基因的克隆
解淀粉芽孢杆菌CICC 22947在LB培养基(0.5g/100ml酵母提取物，1.0g/100ml蛋白胨，1.0g/100ml NaCl，pH7.0)中培养12h，获得解淀粉芽孢杆菌新鲜菌液，用该菌液进行菌液PCR扩增内切葡聚糖酶基因，所用引物的核苷酸序列如下：
5’引物P1：GAATTCGCAGGGACAAAAACGCCA(下划线是EcoR I识别位点)；
3’引物P2：GCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCC(下划线是Not I识别位点，斜体是终止密码子)。
PCR反应体系如下：
解淀粉芽孢杆菌CICC 22947菌液 1ul
P1 1ul
P2 1ul
10×PCR buffer 2.5μL
Taq Plus(北京天根) 1ul
dNTP mix(2.5mmol/L) 4μL
ddH2O 14.5μL
总体积 25μL
PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s、53.5℃ 30s、72℃ 1min30s，共28个循环；72℃ 10min。
PCR扩增得到1413bp的片段，将该片段克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组载体pEASY-T3-1413，pEASY-T3-1413送北京奥科进行测序，测序结果表明1413bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列表中序列2所示的蛋白。
二、外切葡聚糖酶基因的克隆
产黄青霉CICC 40209(中国工业微生物菌种保藏管理中心)在察氏培养基(3g/100ml NaNO3，1g/100ml K2HPO4，0.5g/100ml MgSO4·7H2O，0.5g/100ml KCl，0.01g/100ml FeSO4，30g/100ml蔗糖)中培养5天，收集菌体，用超纯水洗涤菌体后在液氮中研磨成粉末，加入冰预冷的0.4mL提取液(pH8.0的50mmol/LTris-HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0的100mmol/L EDTA)，振荡混匀，加入50μL 10g/100ml SDS，37℃保温1h，再加入75μL 5mol/L NaCl，轻轻混匀，再加入65μLCTAB/NaCl混合液(10g/100ml CTAB，0.7mol/L NaCl)，65℃下保温20min，用等体积的酚∶氯仿混合物抽提，吸取上清液，用终浓度75％的异丙醇沉淀，沉淀用200μl 75％乙醇洗涤2次后，真空干燥，得到产黄青霉CICC 40209基因组DNA。
设计引物PCR扩增外切葡聚糖酶基因，所用引物的核苷酸序列如下：
5’引物P3：GAATTCCAGCAGGTTGGCACAAGCAC(下划线是EcoR I识别位点)；
3’引物P4：GCGGCCGCCTACAGGCACTGCGAGTAGT(下划线是Not I识别位点，斜体是终止密码子)。
PCR反应体系如下：
产黄青霉CICC 40209基因组DNA(0.25μg/ul) 1ul
P3 1ul
P4 1ul
10×PCR buffer 2.5μL
Taq Plus(北京天根) 1ul
dNTP mix(2.5mmol/L) 4μL
ddH2O 14.5μL
总体积 25μL
PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s、57.5℃ 30s、72℃ 1min30s，共28个循环；72℃ 10min。
PCR扩增得到1515bp的片段，将该片段克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组载体pEASY-T3-1515，pEASY-T3-1515送北京奥科进行测序，测序结果表明1515bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，编码序列表中序列4所示的蛋白。
三、β-葡萄糖苷酶基因的克隆
用Promega总RNA提取试剂盒提取黑曲霉CICC 40613(中国工业微生物菌种保藏管理中心)的总RNA。
将在1％麸皮培养基(10g麸皮/L去离子水)中培养54h的菌体离心，称取100mg湿菌体，用1mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗三次，在液氮中研磨成粉末，加入到冰预冷的600uL变性液(26mmol/L醋酸钠，pH4.0的0.5g/100ml十二烷基肌氨酸，0.125mol/L β-巯基乙醇，4mol/L硫氰酸胍)中，然后依次加入60uL 2mol/L醋酸钠(pH4.0)，混匀，加入600uL酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1，pH4.7)，剧烈振荡，在冰上放置15min，4℃下10000×g离心20min，将上清吸出，加入等体积的异丙醇，-20℃放置30min，4℃下10000×g离心10min，弃去上清，沉淀加入1mL冰预冷的75％乙醇洗涤后，沉淀RNA自然干燥，用无RNA酶的水溶解，得到黑曲霉CICC 40613的总RNA。然后用反转录试剂盒将黑曲霉CICC 40613的总RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因。该PCR扩增中所采用的引物的核苷酸序列如下：
5’引物P5：GAATTCGATGAATTGGCCTACTCC(下划线是EcoR I识别位点)
3’引物P6：GCGGCCGCTTAGTGAACAGTAGGCAGAG(下划线是Not I识别位点，斜体是终止密码子)。
PCR反应体系：
10×PCR buffer 2.5μL
dNTP mix(2.5mmol/L) 3μL
MgSO4(50mmol/L) 0.5μL
GIBCO Pfx polymerase(2.5U) 0.5μL
P5(10μmol/L) 1μL
P6(10μmol/L) 1μL
模板(0.125μg/μL) 2μL
ddH2O 14.5μL
总体积 25μL
PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 2min30s，共28个循环；72℃ 10min。
PCR扩增得到2526bp的片段，将该片段克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组载体pEASY-T3-2526，pEASY-T3-2526送北京奥科进行测序，测序结果表明2526bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示，编码序列表中序列6所示的蛋白。
四、毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526的构建
毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526的构建过程中所用试剂如下：
下述百分含量均为质量百分含量。
RDB固体培养基：1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，1.34％YNB，0.00004％生物素，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，1.5％琼脂。
LB培养基：0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨，1.0％NaCl，pH7.0。
LB固体培养基：0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨，1.0％NaCl和1.5％琼脂，pH7.0。
YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
MM固体培养基：1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇，1.5％琼脂。
MD固体培养基：1.34％YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂。
BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％生物素，1ml/100ml甘油。
BMMY培养基：除以0.5ml/100ml甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。
分别用EcoR I和Not I双酶切pEASY-T3-1413、pEASY-T3-1515和pEASY-T3-2526，然后分别与用同样酶双酶切的载体pPIC9(invitrogen公司)连接，获得含有内切葡聚糖酶基因的重组表达载体pPIC9-1413、含有外切葡聚糖酶基因的重组表达载体pPIC9-1515和含有β-葡萄糖苷酶基因的重组表达载体pPIC9-2526。
按照如下方法制备毕赤酵母感受态细胞：
挑取巴斯德毕赤酵母GS115(invitrogen公司)的单菌落接种于10mlYPD培养基中，30℃摇床过夜。以1ml/100ml接种量转接100mlYPD液体培养基，30℃摇床培养过夜至OD600＝1.3。4℃离心5000rpm离心5min，弃上清。用100ml冰预冷无菌水将菌体重悬。4℃离心5000rpm离心10min，弃上清。用50ml冰预冷无菌水将菌体重悬。4℃离心5000rpm离心10min，弃上清。再用20ml 1mol/L的山梨醇洗涤1次。溶于200ul 1mol/L的预冷的山梨醇中，获得毕赤酵母GS115感受态细胞。
80μl上述获得的毕赤酵母GS115感受态细胞中分别加入用BglII酶切线性化的pPIC9-1413、pPIC9-1515和pPIC9-2526 1μg冰上放置15分钟，迅速加入到冰预冷0.2cm电击杯(MicroPulser Bio-Rad 165-2100)中，电击转化酵母感受态细胞(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，混匀后，以每板200μl菌液涂布到RDB平板上，30℃培养至长出转化子。以转入载体pPIC9的毕赤酵母GS115作为对照。
将RDB平板上生长的转化菌落按先后顺序分别点种于酵母选择培养基MM和MD平板的相应位置，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好且经PCR鉴定为阳性的转化子作为阳性重组子。
将在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好、并以P1、P2为引物进行PCR扩增得到1413bp片段的转pPIC9-1413的毕赤酵母命名为毕赤酵母1413；将在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好、并以P3、P4为引物进行PCR扩增得到1515bp片段的转pPIC9-1515的毕赤酵母命名为毕赤酵母1515；将在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好、并以P5、P6为引物进行PCR扩增得到2526bp片段的转pPIC9-2526的毕赤酵母命名为毕赤酵母2526。
五、产纤维素酶的菌剂
A)产纤维素酶的菌剂的制备
毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526分别接种于YPD培养基中在28℃培养48小时，获得毕赤酵母1413菌液、毕赤酵母1515菌液和毕赤酵母2526菌液。
将毕赤酵母1413菌液、毕赤酵母1515菌液和毕赤酵母2526菌液混合，获得产纤维素酶的菌剂1，产纤维素酶的菌剂1中毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526集落形成单位数目比为3∶1∶1。
将毕赤酵母1413菌液、毕赤酵母1515菌液和毕赤酵母2526菌液混合，获得产纤维素酶的菌剂2，产纤维素酶的菌剂2中毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526集落形成单位数目比为10∶5∶3。
B)产纤维素酶的菌剂的活性
取制备好的产纤维素酶的菌剂1 400μl(毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526的数目分别为3.7×106cfu、1.2×106cfu和1.0×106cfu)接种于40mlYPD培养基中在28℃培养48小时，然后转接于200ml新鲜的YPD培养基中再在28℃培养12h作为发酵种子液。转接入5L发酵罐中培养，接种量为5-10％，温度28-30℃，pH5.0-6.0，溶氧(DO)控制在30％-60％，并用甲醇进行诱导发酵132小时，每隔12小时取样(发酵上清液)，按照如下方法测定酶活。
内切葡聚糖酶活性测定方法：采用CMCNa-DNS方法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml 0.8％的羧甲基纤维素钠溶液(0.8g CMC-Na溶于100mlpH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。
一个酶活力单位(U)定义为：每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μg葡萄糖所需酶量。
外切葡聚糖酶活性测定方法：采用微晶纤维素法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml 0.8％的微晶纤维素溶液(0.8g微晶纤维素溶于100mlpH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。
一个酶活力单位(U)定义为：每分钟水解微晶纤维素产生1μg葡萄糖所需酶量。
β-葡萄糖苷酶活性测定方法：采用β-水杨苷法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml 0.8％的β-水杨苷溶液(0.8g β-水杨苷溶于100mlpH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。
一个酶活力单位(U)定义为：每分钟水解β-水杨苷产生1μg葡萄糖所需酶量。
上述方法重复五次，结果如表1所示。表1中的数据为每ml发酵培养基所产生的酶活的平均值±标准差。
表1.产纤维素酶的菌剂1的纤维素酶酶活
| 发酵时间(小时) | 内切葡聚糖酶活性(U/ml) | 外切葡聚糖酶活性(U/ml) | β-葡萄糖苷酶活性(U/ml) |
| 12 | 892.13±4.16 | 48.89±2.23 | 73.57±2.56 |
| 24 | 1395.67±9.60 | 96.15±2.78 | 126.81±2.92 |
| 36 | 1945.72±15.72 | 155.42±2.51 | 195.73±3.05 |
| 48 | 2627.67±26.11 | 214.33±2.90 | 274.28±2.88 |
| 60 | 3222.34±28.92 | 347.10±3.11 | 368.35±3.19 |
| 72 | 3802.19±27.66 | 502.92±3.62 | 470.21±3.31 |
| 84 | 4352.46±28.17 | 554.61±4.05 | 547.36±4.23 |
| 96 | 4698.15±30.09 | 588.76±4.57 | 552.19±4.72 |
| 108 | 4901.49±32.58 | 592.18±4.32 | 557.42±4.49 |
| 120 | 5073.12±30.12 | 600.23±5.18 | 545.66±5.15 |
| 132 | 5032.38±29.13 | 604.47±4.96 | 535.08±4.84 |
按照上述相同的方法测定产纤维素酶的菌剂2的生产纤维素酶的能力，制备好的产纤维素酶的菌剂2 400μl菌剂2中含毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526的数目分别为3.6×106cfu、1.8×106cfu和1.0×106cfu，五次重复实验的结果如表2所示。表2中的数据为每ml发酵培养基所产生的酶活的平均值±标准差。
表2.产纤维素酶的菌剂2的纤维素酶酶活
| 发酵时间(小时) | 内切葡聚糖酶活性(U/ml) | 外切葡聚糖酶活性(U/ml) | β-葡萄糖苷酶活性(U/ml) |
| 12 | 858.47±3.69 | 50.16±2.44 | 72.46±2.29 |
| 24 | 1304.20±6.15 | 100.39±2.57 | 122.92±2.41 |
| 36 | 1872.19±10.86 | 162.54±2.48 | 199.44±3.35 |
| 48 | 2648.11±23.72 | 227.96±2.81 | 278.57±3.10 |
| 60 | 3176.75±25.04 | 355.21±3.06 | 362.84±3.22 |
| 72 | 3775.28±21.47 | 509.47±3.25 | 465.09±2.96 |
| 84 | 4309.55±24.31 | 559.73±3.66 | 550.23±4.17 |
| 96 | 4622.36±25.92 | 596.20±4.72 | 562.72±3.98 |
| 108 | 4883.62±28.19 | 613.89±4.64 | 560.15±4.62 |
| 120 | 4912.81±28.68 | 607.11±4.95 | 557.31±5.83 |
| 132 | 4925.06±27.59 | 606.35±4.88 | 549.64±4.55 |
序列表
<110>北京挑战生物技术有限公司
<120>产纤维素酶的菌剂及其应用
<130>CGGNARW92020
<160>6
<210>1
<211>1413
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.Amyloliquefaciens)
<400>1
gcagggacaa aaacgccagt agccaagaat gggcagctta gcataaaagg aacacagctc 60
gtaaaccggg acggcaaagc ggtacaattg aaagggatca gttcacatgg attgcaatgg 120
tatggcgatt ttgtcaataa agacagctta aaatggctga gagacgattg gggcataacc 180
gttttccgcg cggcgatgta tacggcagac ggcggttata ttgataatcc gtccgtgaaa 240
aataaagtaa aagaagcggt tgaagcggca aaagaacttg ggatatatgt catcattgac 300
tggcatatct taaatgacgg caacccaaac caaaataaag agaaggcaaa agattttttt 360
aaggaaatgt caagtcttta cggaaacacg ccaaacgtca tttatgaaat tgcaaacgaa 420
ccaaacggtg atgtgaactg gaagcgtgat attaaaccgt atgcggaaga agtgatttcc 480
gttatccgca aaaatgatcc agacaacatc atcattgtcg gaaccggtac atggagccaa 540
gatgtgaatg atgcagccga tgatcagcta aaagatgcaa acgtcatgta cgcgcttcat 600
ttttatgccg gcacacacgg ccaatcttta cgggataaag caaactatgc actcagtaaa 660
ggagcgccta ttttcgtgac ggaatgggga acaagcgacg cgtctggaaa tggcggtgta 720
ttccttgacc agtcgcggga atggctgaat tatctcgaca gcaagaacat cagctgggtg 780
aactggaatc tttctgataa gcaggaatca tcctcagcgt taaagccggg agcatctaaa 840
acaggcggct ggccgcttac aaatttaact gcttcaggaa cattcgtaag agaaaacatt 900
cacggcagca aagattcaac gaaagaacgc cctgaaacgc cagcacaaga taaccccgca 960
caggaaaacg gcatttctgt acaatacaaa gcaggggatg ggggtgtgaa cagcaaccaa 1020
atccgcccgc agcttcacat aaaaaataac ggcaatgcga cggttgattt aaaagatgtc 1080
actgcccgtt actggtataa cgcgaaaaac aaaggccaaa actttgactg tgactacgcg 1140
cagattggat gcggcaatct gacccacaaa tttgtgacgc tgcataaacc taagcaaggt 1200
gcagatacct atctggaact gggttttaaa acaggaacgc tgtcaccggg agcaagcaca 1260
gggaatattc agcttcgtct tcacaatgat gactggagta attatgcaca aagcggcgat 1320
tattcctttt ttcaatcaaa tacgtttaaa acaacgaaaa aaattacatt atatcatcaa 1380
ggaaaacaga tttggggaac agaaccaaat tag 1413
<210>2
<211>470
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.Amyloliquefaciens)
<400>2
Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys
1 5 10 15
Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly
20 25 30
Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Asp Phe Val Asn Lys Asp
35 40 45
Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala
50 55 60
Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys
65 70 75 80
Asn Lys Val Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr
85 90 95
Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn
100 105 110
Lys Glu Lys Ala Lys Asp Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly
115 120 125
Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp
130 135 140
Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser
145 150 155 160
Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly
165 170 175
Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp
180 185 190
Ala Asn Val Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln
195 200 205
Ser Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile
210 215 220
Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val
225 230 235 240
Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu Asn Tyr Leu Asp Ser Lys Asn
245 250 255
Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser
260 265 270
Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Pro Leu Thr Asn
275 280 285
Leu Thr Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile His Gly Ser Lys
290 295 300
Asp Ser Thr Lys Glu Arg Pro Glu Thr Pro Ala Gln Asp Asn Pro Ala
305 310 315 320
Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr Lys Ala Gly Asp Gly Gly Val
325 330 335
Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu His Ile Lys Asn Asn Gly Asn
340 345 350
Ala Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala
355 360 365
Lys Asn Lys Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys
370 375 380
Gly Asn Leu Thr His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly
385 390 395 400
Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe Lys Thr Gly Thr Leu Ser Pro
405 410 415
Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp
420 425 430
Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Gln Ser Asn Thr
435 440 445
Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu Tyr His Gln Gly Lys Gln Ile
450 455 460
Trp Gly Thr Glu Pro Asn
465 470
<210>3
<211>1515
<212>DNA
<213>青霉属产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>3
cagcaggttg gcacaagcac tgccgaagtt catccatcct tgacttggca aaagtgtacc 60
gcggggggca gctgcacttc ccaaagcggc aaggttgtca tcgattccaa ctggcgctgg 120
gttcacaaca ctggcggcta caccaattgc tatactggca atgactggga tagaactctc 180
tgcccggacg atgtcacatg tgccaccaac tgcgccctgg atggtgccga ctacaagggc 240
acctatggtg ttaccgccag cggcagctct ttgcggctga acttcgtcac tcaagcatct 300
caaaagaaca tcggctcacg tctctacctg atggcggacg atagcaagta cgaaatgttc 360
cagctgctca accaggagtt caccttcgat gtcgatgtct cgaacctacc ctgtggcttg 420
aacggtgcgc tgtactttgt ggctatggac gaagatggtg gcatggcacg gtatcctacc 480
aacaaagctg gtgcgaaata cggtaccggt tactgcgacg cgcaatgccc gcgcgatctc 540
aagttcatca acggccaggc caacgtggaa ggctgggagc cgtcttccag cgatgttaac 600
ggtggtactg gcaattatgg ttcttgctgt gctgagatgg atatttggga ggccaactcc 660
atctccaccg cattcacacc ccatccctgc gatgacccag cccagacccg gtgcactgga 720
gattcctgtg gcggcacata cagcagtgac cgctatggtg gtacttgtga ccccgatgga 780
tgtgatttca acccttatcg catgggcaac cagtccttct atggcccgag caagatcgtt 840
gataccgaat cccctttcac tgtggtgact cagtttatca ccaacgatgg cacgtccacc 900
ggcaccctct cggaaatcaa gcgcttctac gtgcagaatg gcaaggttat cccccagtct 960
gtgtccacca tcagcgctgt gactggcaat tccatcaccg actccttctg ctccgctcag 1020
aagactgcat ttaaggacac ggacgtattc gccaaacacg gcggtatggc gggcatgggg 1080
gccggtcttg cagagggcat ggttctggtc atgagtctct gggatgatca cgcggccaac 1140
atgctgtggc tcgacagcac ctacccaacc agcgcctctt cgactactcc cggtgctgct 1200
cgtggtagct gcgacatttc ctctggcgag ccttcagatg ttgaagctaa ccattcgaac 1260
gcctacgttg tctattcgaa catcaaggtc ggtcctctcg gctcgacttt cggctcgacc 1320
gactcaggct ccggcaccac caccaccaag gtgaccacca ctactgcgac caagaccacc 1380
accacaactg gaccaagcac caccggcgct gctcactatg cgcagtgtgg tggacagaac 1440
tggaccggtc caaccacttg cgccagccca tacacctgcc agaagcaggg tgattactac 1500
tcgcagtgcc tgtag 1515
<210>4
<211>504
<212>PRT
<213>青霉属产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>4
Gln Gln Val Gly Thr Ser Thr Ala Glu Val His Pro Ser Leu Thr Trp
1 5 10 15
Gln Lys Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Ser Gln Ser Gly Lys Val
20 25 30
Val Ile Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Asn Thr Gly Gly Tyr Thr
35 40 45
Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Asp Trp Asp Arg Thr Leu Cys Pro Asp Asp
50 55 60
Val Thr Cys Ala Thr Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Lys Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Ala Ser Gly Ser Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val
85 90 95
Thr Gln Ala Ser Gln Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Met Ala
100 105 110
Asp Asp Ser Lys Tyr Glu Met Phe Gln Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr
115 120 125
Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu
130 135 140
Tyr Phe Val Ala Met Asp Glu Asp Gly Gly Met Ala Arg Tyr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys
165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp
180 185 190
Glu Pro Ser Ser Ser Asp Val Asn Gly Gly Thr Gly Asn Tyr Gly Ser
195 200 205
Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr Ala
210 215 220
Phe Thr Pro His Pro Cys Asp Asp Pro Ala Gln Thr Arg Cys Thr Gly
225 230 235 240
Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys
245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Gln Ser
260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Ser Lys Ile Val Asp Thr Glu Ser Pro Phe Thr Val
275 280 285
Val Thr Gln Phe Ile Thr Asn Asp Gly Thr Ser Thr Gly Thr Leu Ser
290 295 300
Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Gln Ser
305 310 315 320
Val Ser Thr Ile Ser Ala Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Asp Ser Phe
325 330 335
Cys Ser Ala Gln Lys Thr Ala Phe Lys Asp Thr Asp Val Phe Ala Lys
340 345 350
His Gly Gly Met Ala Gly Met Gly Ala Gly Leu Ala Glu Gly Met Val
355 360 365
Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu
370 375 380
Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Ala Ser Ser Thr Thr Pro Gly Ala Ala
385 390 395 400
Arg Gly Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Glu Pro Ser Asp Val Glu Ala
405 410 415
Asn His Ser Asn Ala Tyr Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro
420 425 430
Leu Gly Ser Thr Phe Gly Ser Thr Asp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Thr
435 440 445
Thr Lys Val Thr Thr Thr Thr Ala Thr Lys Thr Thr Thr Thr Thr Gly
450 455 460
Pro Ser Thr Thr Gly Ala Ala His Tyr Ala Gln Cys Gly Gly Gln Asn
465 470 475 480
Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Lys Gln
485 490 495
Gly Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
500
<210>5
<211>2526
<212>DNA
<213>曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>5
gatgaattgg cctactcccc tccgtattac ccctcccctt gggccaatgg ccagggtgac 60
tgggcggaag cataccagcg cgctgttgat atcgtctcgc agatgacatt ggctgagaag 120
gtcaatttga ctacgggaac tggatgggaa ttggaattat gtgttggtca gactggaggt 180
gttccccgat tgggagttcc gggaatgtgt gcacaggata gccctctggg tgttcgtgac 240
tccgactaca actctgcgtt ccccgccggt gtcaacgtgg ccgcaacctg ggacaagaat 300
ctggcttacc tgcgtggcca ggctatgggt caggagttta gtgacaaggg tgctgatatc 360
caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg acggcggtcg taactgggag 420
ggcttctccc ccgacccggc cctcagtggt gtgctctttg cagagacaat caagggtatt 480
caggatgctg gtgtggttgc aacggctaag cactacatcg cctacgagca ggagcatttc 540
cgtcaggcgc ctgaagctca aggctacgga ttcaatatta ccgagagtgg aagcgcgaac 600
ctcgacgata agactatgca tgagctgtac ctctggccct tcgcggatgc catccgtgca 660
ggtgccggtg ctgtgatgtg ctcgtacaac cagatcaaca acagctatgg ctgccagaac 720
agctacactc tgaacaagct gctcaaggct gagctgggtt tccagggctt tgtcatgagt 780
gattgggcgg ctcaccatgc cggtgtgagt ggtgctttgg cgggattgga catgtctatg 840
ccgggagacg tcgattacga cagtggcacg tcttactggg gtaccaactt gaccatcagt 900
gtgctcaacg ggacggtgcc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg catcatggcc 960
gcctactaca aggtcggccg tgaccgtctg tggactcctc ccaacttcag ctcatggacc 1020
agagatgaat acggcttcaa gtactactat gtctcggggg gaccgtatga gaaggtcaac 1080
cagttcgtga atgtgcaacg caaccatagc gagttgatcc gccgtattgg agcagacagc 1140
acggtgctcc tcaagaacga tggcgctctt cccttgactg gaaaggagcg cttggtcgcc 1200
cttatcggag aagatgcggg ttccaatcct tatggtgcca acggctgcag tgaccgtggg 1260
tgcgacaatg gaacattggc gatgggctgg ggaagtggca ctgccaactt tccctacttg 1320
gtgacccccg agcaggccat ctcgaacgag gtgctcaaga acaagaatgg cgtattcact 1380
gcgaccgata actgggctat tgatcagatt gaggcgcttg ctaagaccgc cagtgtctct 1440
cttgtctttg tcaacgccga ctctggtgag ggttatatca atgtcgacgg aaacctgggt 1500
gaccgcagga acctgaccct gtggaggaac ggcgacaatg tgatcaaggc tgctgctagc 1560
aactgcaaca acacgatcgt tattattcac tctgtcggcc cagtcttggt taacgagtgg 1620
tacgacaacc ccaatgttac cgctattctc tggggtggtc ttcccggtca ggagtctggc 1680
aactccctcg ccgacgtgct ctacggccgt gtcaaccccg gtgccaagtc gcccttcacc 1740
tggggcaaga ctcgtgaggc ctaccaagat tacttgtaca ccgagcccaa caacggcaac 1800
ggagcgcccc aggaagactt cgtcgagggc gtcttcattg actaccgcgg atttgacaag 1860
cgcaacgaga ctcctatcta tgagttcggc tatggtctga gctacactac cttcaactac 1920
tcgaaccttc aggtggaggt tctgagcgcc cctgcgtacg agcctgcttc gggcgagact 1980
gaggcagcgc cgactttcgg agaggtcgga aatgcgtcgg attacctcta ccccgatgga 2040
ctgcagagaa tcaccaagtt catctacccc tggctcaaca gtaccgatct tgaggcgtct 2100
tctggggatg ctagctatgg gcaggatgcc tcagactatc ttcccgaggg agccaccgat 2160
ggctctgcgc aaccgatcct gcctgccggt ggtggtgctg gcggcaaccc tcgcctgtac 2220
gacgagctca tccgcgtgac ggtgactatc aagaacaccg gcaaggttgc gggtgataaa 2280
gttcctcaac tgtatgtttc tcttggcggc cctaacgaac ccaagatcgt gctgcgtcaa 2340
ttcgagcgta tcacgctgca gccgtcggaa gagacgcagt ggagcacgac tctgacgcgc 2400
cgtgaccttg cgaactggaa tgttgagacg caggactggg agattacgtc gtatcccaag 2460
atggtgtttg tcggaagctc ctcgcggaag ctgccgctcc gggcgtctct gcctactgtt 2520
cactaa 2526
<210>6
<211>841
<212>PRT
<213>曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>6
Asp Glu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asn
1 5 10 15
Gly Gln Gly Asp Trp Ala Glu Ala Tyr Gln Arg Ala Val Asp Ile Val
20 25 30
Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly
35 40 45
Trp Glu Leu Glu Leu Cys Val Gly Gln Thr Gly Gly Val Pro Arg Leu
50 55 60
Gly Val Pro Gly Met Cys Ala Gln Asp Ser Pro Leu Gly Val Arg Asp
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val Ala Ala Thr
85 90 95
Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met Gly Gln Glu
100 105 110
Phe Ser Asp Lys Gly Ala Asp Ile Gln Leu Gly Pro Ala Ala Gly Pro
115 120 125
Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser Pro
130 135 140
Asp Pro Ala Leu Ser Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile
145 150 155 160
Gln Asp Ala Gly Val Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Ala Tyr Glu
165 170 175
Gln Glu His Phe Arg Gln Ala Pro Glu Ala Gln Gly Tyr Gly Phe Asn
180 185 190
Ile Thr Glu Ser Gly Ser Ala Asn Leu Asp Asp Lys Thr Met His Glu
195 200 205
Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ala
210 215 220
Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Gln Asn
225 230 235 240
Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln Gly
245 250 255
Phe Val Met Ser Asp Trp Ala Ala His His Ala Gly Val Ser Gly Ala
260 265 270
Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Asp Tyr Asp Ser
275 280 285
Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val Leu Asn Gly
290 295 300
Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Trp Thr Pro Pro Asn Phe
325 330 335
Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Lys Tyr Tyr Tyr Val Ser
340 345 350
Gly Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn Gln Phe Val Asn Val Gln Arg Asn
355 360 365
His Ser Glu Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Asp Ser Thr Val Leu Leu
370 375 380
Lys Asn Asp Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg Leu Val Ala
385 390 395 400
Leu Ile Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Tyr Gly Ala Asn Gly Cys
405 410 415
Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly Trp Gly Ser
420 425 430
Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Ser
435 440 445
Asn Glu Val Leu Lys Asn Lys Asn Gly Val Phe Thr Ala Thr Asp Asn
450 455 460
Trp Ala Ile Asp Gln Ile Glu Ala Leu Ala Lys Thr Ala Ser Val Ser
465 470 475 480
Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val Asp
485 490 495
Gly Asn Leu Gly Asp Arg Arg Asn Leu Thr Leu Trp Arg Asn Gly Asp
500 505 510
Asn Val Ile Lys Ala Ala Ala Ser Asn Cys Asn Asn Thr Ile Val Ile
515 520 525
Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Glu Trp Tyr Asp Asn Pro
530 535 540
Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Gly Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly
545 550 555 560
Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Ala Lys
565 570 575
Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gln Asp Tyr Leu
580 585 590
Tyr Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Glu Asp Phe Val
595 600 605
Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Lys Arg Asn Glu Thr
610 615 620
Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asn Tyr
625 630 635 640
Ser Asn Leu Gln Val Glu Val Leu Ser Ala Pro Ala Tyr Glu Pro Ala
645 650 655
Ser Gly Glu Thr Glu Ala Ala Pro Thr Phe Gly Glu Val Gly Asn Ala
660 665 670
Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Asp Gly Leu Gln Arg Ile Thr Lys Phe Ile
675 680 685
Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu Ala Ser Ser Gly Asp Ala
690 695 700
Ser Tyr Gly Gln Asp Ala Ser Asp Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Thr Asp
705 710 715 720
Gly Ser Ala Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Asn
725 730 735
Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Thr Val Thr Ile Lys Asn
740 745 750
Thr Gly Lys Val Ala Gly Asp Lys Val Pro Gln Leu Tyr Val Ser Leu
755 760 765
Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Ile Val Leu Arg Gln Phe Glu Arg Ile
770 775 780
Thr Leu Gln Pro Ser Glu Glu Thr Gln Trp Ser Thr Thr Leu Thr Arg
785 790 795 800
Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asn Val Glu Thr Gln Asp Trp Glu Ile Thr
805 810 815
Ser Tyr Pro Lys Met Val Phe Val Gly Ser Ser Ser Arg Lys Leu Pro
820 825 830
Leu Arg Ala Ser Leu Pro Thr Val His
835 840
Claims (9)
1.产纤维素酶的菌剂，其活性成分为毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526；所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515是将外切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述内切葡聚糖酶是如下1)或2)的蛋白；所述外切葡聚糖酶是如下3)或4)的蛋白；所述β-葡萄糖苷酶是如下5)或6)的蛋白；
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由1)衍生的蛋白质；
3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
4)在序列表中序列4的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由3)衍生的蛋白质；
5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
6)在序列表中序列6的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由5)衍生的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于：所述内切葡聚糖酶基因是如下a)或b)或c)的DNA分子；所述外切葡聚糖酶基因是如下d)或e)或f)的DNA分子；所述β-葡萄糖苷酶基因是如下g)或h)或i)的DNA分子；
a)其核苷酸序列是序列表中序列1；
b)在严格条件下与a)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
c)与a)或b)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
d)其核苷酸序列是序列表中序列3；
e)在严格条件下与d)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
f)与d)或e)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
g)其核苷酸序列是序列表中序列5；
h)在严格条件下与g)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；
i)与g)或h)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526的集落形成单位数目比为(3-10)∶(1-5)∶(1-3)。
5.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526的集落形成单位数目比为3∶1∶1或10∶5∶3。
6.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526分别独立包装。
7.根据权利要求1至6中任一所述的菌剂，其特征在于：所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入巴斯德毕赤酵母GS115中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515是将外切葡聚糖酶基因导入巴斯德毕赤酵母GS115中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β-葡萄糖苷酶基因导入巴斯德毕赤酵母GS115中获得的重组菌。
8.权利要求1至7中任一所述菌剂在生产纤维素酶中的应用。
9.一种生产纤维素酶的方法，是发酵权利要求1至8中任一所述的菌剂生产纤维素酶。
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