CN101463330A

CN101463330A - 产纤维素酶的菌剂及其应用

Info

Publication number: CN101463330A
Application number: CNA2009100766518A
Authority: CN
Inventors: 吴培均; 李卓夫; 李富伟; 段文娟
Original assignee: BEIJING CHALLENGE BIO-TECHNOLOGY Ltd Co
Current assignee: BEIJING CHALLENGE BIO-TECHNOLOGY Ltd Co
Priority date: 2009-01-12
Filing date: 2009-01-12
Publication date: 2009-06-24
Also published as: CN101870956B; CN101870956A

Abstract

本发明公开了一种产纤维素酶的菌剂及其应用。该产纤维素酶的菌剂，其活性成分为毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526；所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515将外切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β－葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌。发酵本发明的产纤维素酶的菌剂可生产纤维素酶。

Description

产纤维素酶的菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及产纤维素酶的菌剂及其应用。

背景技术

传统的纤维素酶生产方法主要是在自然界中筛选优良产酶菌株，再通过一定的诱变手段，获得工业化大规模生产的产酶菌种。但自然环境中纤维素的降解是多种微生物协同完成的，这些微生物相互共生，形成一个降解纤维素的微生态体系。在特定的生态系统中，微生物之间互相协同作用，也互相制约，使得产生的水解纤维素的酶之间的比例处于一种最适降解纤维素的状态，而产生纤维素酶的微生物一旦从其小生态中分离出来，就会破坏这个最佳比例。筛选优良菌株时无疑是将其从其生态环境中分离出来，所以其产酶能力很难有所突破。目前工业用纤维素酶的来源主要是好氧丝状真菌木霉，如里氏木霉、绿色木霉、康宁木霉，但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面木霉产的β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累，最终影响酶解效率。微生物合成纤维素酶受诱导和葡萄糖阻遏这两种机制调控，β-葡萄糖苷酶分解纤维二糖产生寡糖，产生的寡糖属于微生物易利用的碳源，其又会阻遏纤维素酶的合成。真菌虽然可以分泌大量纤维素酶，其产酶能力较高，酶系较全，但真菌发酵周期长，易染细菌且不易扩大生产；细菌生产速度虽然快，但产酶水平低。微生物自身会分泌大量非目的酶蛋白，而纤维素酶又难于纯化，因此不利于工业化的生产及应用。传统的纤维素酶生产方法已经达到了一个瓶颈。

随着基因工程技术的发展，越来越多的纤维素酶编码基因得到克隆，并成功的在大肠杆菌及毕赤酵母等多种表达系统中表达。但由于纤维素的完全水解需要三种酶成分的协同作用，而常规的基因工程手段通常可以高效表达一种酶，所以基因工程纤维素酶功能略显单薄。现有的重组纤维素酶的生产主要有两种方式，其一是将上述三种纤维素酶单独生产，应用时再进行组合，其二是构建鸡尾式表达体系直接生产复合纤维素酶，不过这两种方法都有一定的局限性。前一种方法需要将三种酶分别单独生产，其整个发酵周期长，仪器设备及占地面积都有较高的要求。而第二种方法同时在一个毕赤酵母中表达三种不同的酶蛋白，其表达量及产量得不到保证，仅有理论研究价值而无实际应用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种产纤维素酶的菌剂及其应用。

本发明所提供的产纤维素酶的菌剂，其活性成分为毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526；所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515将外切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌。

其中，所述内切葡聚糖酶可是如下1)或2)的蛋白；所述外切葡聚糖酶可是如下3)或4)的蛋白；所述β-葡萄糖苷酶可是如下5)或6)的蛋白；

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由1)衍生的蛋白质；

3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4)在序列表中序列4的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由3)衍生的蛋白质；

5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

6)在序列表中序列6的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能水解多糖的由5)衍生的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。

为了使序列表中序列2、4或6所示的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2、4或6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述带有标签的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述带有标签的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1、3或5所示的DNA分子中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述内切葡聚糖酶基因可是如下a)或b)或c)的DNA分子；所述外切葡聚糖酶基因可是如下d)或e)或f)的DNA分子；所述β-葡萄糖苷酶基因可是如下g)或h)或i)的DNA分子；

a)其核苷酸序列是序列表中序列1；

b)在严格条件下与a)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；

c)与a)或b)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；

d)其核苷酸序列是序列表中序列3；

e)在严格条件下与d)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；

f)与d)或e)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；

g)其核苷酸序列是序列表中序列5；

h)在严格条件下与g)限定的DNA片段杂交且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子；

i)与g)或h)的基因具有90％以上的同源性，且编码能水解多糖的蛋白的DNA分子。

所述c)、f)或i)中的基因，与a)、d)或g)的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526的集落形成单位数目比为(3-10)：(1-5)：(1-3)。

所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526可分别独立包装，也可混合在一起。

本发明的产纤维素酶的菌剂可为液体制剂，也可为固体制剂。在液体制剂中加入吸附剂即可获得固体制剂，如加入轻质碳酸钙或草炭等。

本发明的产纤维素酶的菌剂可用来生产纤维素酶。

本发明的另一个目的是提供一种生产纤维素酶的方法。

本发明所提供的生产纤维素酶的方法，是发酵所述的菌剂生产纤维素酶。

本发明的产纤维素酶的菌剂的活性成分为表达内切葡聚糖酶的毕赤酵母、表达外切葡聚糖酶的毕赤酵母和表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母。毕赤酵母表达系统采用甲醇作为诱导物，不会阻遏毕赤酵母产纤维素酶的能力。本发明的产纤维素酶的菌剂的活性均为毕赤酵母生物，彼此间不存在竞争，且其表达的酶之间也无抑制作用，彼此之间不存在影响。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法。

下述实施例中所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、产纤维素酶的菌剂

一、内切葡聚糖酶基因的克隆

解淀粉芽孢杆菌CICC 20467(中国工业微生物菌种保藏管理中心)在LB培养基(0.5g/100ml酵母提取物，1.0g/100ml蛋白胨，1.0g/100ml NaCl，pH7.0)中培养12h，获得解淀粉芽孢杆菌新鲜菌液，用该菌液进行菌液PCR扩增内切葡聚糖酶基因，所用引物的核苷酸序列如下：

5’引物：GAATTC GCAGGGACAAAAACGCCA(下划线是EcoR I识别位点)；

3’引物：GCGGCCGC CTA ATTTGGTTCTGTTCCCC(下划线是Not I识别位点，斜体是终止密码子)。

PCR反应体系如下：

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s、53.5℃ 30s、72℃ 1min30s，共28个循环；72℃ 10min。

PCR扩增得到1413bp的片段，将该片段克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组载体pEASY-T3-1413，pEASY-T3-1413送北京奥科进行测序，测序结果表明1413bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列表中序列2所示的蛋白。

二、外切葡聚糖酶基因的克隆

产黄青霉CICC 40209(中国工业微生物菌种保藏管理中心)在察氏培养基(3g/100ml NaNO₃，1g/100ml K₂HPO₄，0.5g/100ml MgSO₄·7H₂O，0.5g/100ml KCl，0.01g/100ml FeSO₄，30g/100ml蔗糖)中培养了5天，收集菌体，用超纯水洗涤菌体后在液氮中研磨成粉末，加入冰预冷的0.4mL提取液(pH8.0的50mmol/LTris-HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0的100mmol/L EDTA)，振荡混匀，加入50μL 10g/100ml SDS，37℃保温1h，再加入75μL 5mol/L NaCl，轻轻混匀，再加入65μLCTAB/NaCl混合液(10g/100ml CTAB，0.7mol/L NaCl)，65℃下保温20min，用等体积的酚：氯仿混合物抽提，吸取上清液，用终浓度75％的异丙醇沉淀，沉淀用200μl 75％乙醇洗涤2次后，真空干燥，得到产黄青霉CICC 40209基因组DNA。

设计引物P1和P2，PCR扩增外切葡聚糖酶基因，引物的核苷酸序列如下：

P1：GAATTCCAGCAGGTTGGCACAAGCAC(下划线是EcoR I识别位点)；

P2：：GCGGCCGCCTACAGGCACTGCGAGTAGT(下划线是Not I识别位点，斜体是终止密码子)。

PCR反应体系如下：

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s、57.5℃ 30s、72℃ 1min30s，共28个循环；72℃ 10min。

PCR扩增得到1515bp的片段，将该片段克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组载体pEASY-T3-1515，pEASY-T3-1515送北京奥科进行测序，测序结果表明1515bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，编码序列表中序列4所示的蛋白。

三、β-葡萄糖苷酶基因的克隆

用Promega总RNA提取试剂盒提取黑曲霉CICC 40613(中国工业微生物菌种保藏管理中心)的总RNA。

将在1％麸皮培养基(10g麸皮/L去离子水)中培养54h的菌体离心，称取100mg湿菌体，用1mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗三次，在液氮中研磨成粉末，加入到冰预冷的600uL变性液(26mmol/L醋酸钠，pH4.0的0.5g/100ml十二烷基肌氨酸，0.125mol/L β-巯基乙醇，4mol/L硫氰酸胍)中，然后依次加入60uL 2mol/L醋酸钠(pH4.0)，混匀，加入600uL酚:氯仿:异戊醇(体积被为25:24:1，pH4.7)，剧烈振荡，在冰上放置15min，4℃下10000g离心20min，将上清吸出，加入等体积的异丙醇，-20℃放置30min，4℃下10000g离心10min，弃去上清，沉淀加入1mL冰预冷的75％乙醇洗涤后，沉淀RNA自然干燥，用无RNA酶的水溶解，得到黑曲霉CICC 40613的总RNA。然后用反转录试剂盒将黑曲霉CICC 40613的总RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因。

设计引物P3和P4，引物的核苷酸序列如下：

P3：GAATTCGATGAATTGGCCTACTCC(下划线是EcoR I识别位点)

P4：GCGGCCGC TTA GTGAACAGTAGGCAGAG(下划线是Not I识别位点，斜体是终止密码子)。

PCR反应体系：

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 2min30s，共28个循环；72℃ 10min。

PCR扩增得到2526bp的片段，将该片段克隆到pEASY-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组载体pEASY-T3-2526，pEASY-T3-2526送北京奥科进行测序，测序结果表明2526bp的片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示，编码序列表中序列6所示的蛋白。

四、毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526的构建

毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526的构建过程中所用试剂如下：

下述百分含量均为质量百分含量。

RDB固体培养基：1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，1.34％ YNB，0.00004％生物素，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，1.5％琼脂。

LB培养基：0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨，1.0％ NaCl，pH7.0。

LB固体培养基：0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨，1.0％ NaCl和1.5％琼脂，pH7.0。

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

MM固体培养基：1.34％ YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇，1.5％琼脂。

MD固体培养基：1.34％ YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂。

BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％生物素，1ml/100ml甘油。

BMMY培养基：除以0.5ml/100ml甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。

分别用EcoR I和Not I双酶切pEASY-T3-1413、pEASY-T3-1515和pEASY-T3-2526，然后分别与用同样酶双酶切的载体pPIC9连接，获得重组表达载体pPIC9-1413、pPIC9-1515和pPIC9-2526。

按照如下方法制备毕赤酵母感受态细胞：

挑取毕赤酵母GS115的单菌落接种于10ml YPD培养基中，30℃摇床过夜。以1ml/100ml接种量转接100ml YPD液体培养基，30℃摇床过夜至OD＝1.3。4℃离心5000rpm，5min，弃上清。用100ml冰预冷无菌水将菌体重悬。4℃离心5000rpm，10min，弃上清。用50ml冰预冷无菌水将菌体重悬。4℃离心5000rpm，10min，弃上清。再用20ml 1mol/L的山梨醇洗涤1次。溶于200ul 1mol/L的预冷的山梨醇中，获得毕赤酵母GS115感受态细胞。

80μl上述获得的毕赤酵母GS115感受态细胞中分别加入用Bgl II酶切线性化的pPIC9-1413、pPIC9-1515和pPIC9-2526 1μg冰上放置15分钟，迅速加入冰预冷0.2cm电击杯(MicroPulser Bio-Rad 165-2100)中，电击转化酵母感受态细胞(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，混匀后，以每板200μl菌液涂布到RDB平板上，30℃培养至长出转化子。以转入载体pPIC9的毕赤酵母GS115作为对照。

将RDB平板上生长的转化菌落按先后顺序分别点种于酵母选择培养基MM和MD平板的相应位置，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的重组子作为转化子。

在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的转pPIC9-1413的毕赤酵母命名为毕赤酵母1413，在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的转pPIC9-1515的毕赤酵母命名为毕赤酵母1515，在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的转pPIC9-2526的毕赤酵母命名为毕赤酵母2526。

毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526分别接种于3ml BMGY培养基，250rpm30℃摇床培养48h，5000rpm离心8min，弃去上清，用1ml BMMY甲醇诱导培养基重悬，继续在28℃诱导培养48h后，5000rpm离心8min取上清，测定上清酶活。

内切葡聚糖酶活性测定方法：采用CMCNa-DNS方法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml 0.8％的羧甲基纤维素钠溶液(0.8g CMC-Na溶于100mlpH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。

一个酶活力单位(u)定义为：每分钟水解纤维素产生1μmol葡萄糖所需酶量。

外切葡聚糖酶活性测定方法：采用微晶纤维素法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml 0.8％的微晶纤维素溶液(0.8g微晶纤维素溶于100ml pH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。

β-葡萄糖苷酶活性测定方法：采用β-水杨苷法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml 0.8％的β-水杨苷溶液(0.8g β-水杨苷溶于100ml pH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。

五、产纤维素酶的菌剂

A)产纤维素酶的菌剂的制备

毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526分别接种于YPD培养基中培养，获得毕赤酵母1413菌液、毕赤酵母1515菌液和毕赤酵母2526菌液。

将毕赤酵母1413菌液、毕赤酵母1515菌液和毕赤酵母2526菌液混合，获得产纤维素酶的菌剂1，产纤维素酶的菌剂1中毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526集落形成单位数目比为3：1：1。

将毕赤酵母1413菌液、毕赤酵母1515菌液和毕赤酵母2526菌液混合，获得产纤维素酶的菌剂2，产纤维素酶的菌剂2中毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526集落形成单位数目比为10：5：3。

序列表

<110>北京挑战生物技术有限公司

<120>产纤维素酶的菌剂及其应用

<130>CGGNARW92020

<160>6

<210>1

<211>1413

<212>DNA

<213>芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.Amyloliquefaciens)

<400>1

<210>2

<211>470

<212>PRT

<213>芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.Amyloliquefaciens)

<400>2

<210>3

<211>1515

<212>DNA

<213>青霉属产黄青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>3

<210>4

<211>504

<212>PRT

<213>青霉属产黄青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>4

<210>5

<211>2526

<212>DNA

<213>曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>5

<210>6

<211>841

<212>PRT

<213>曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>6

Claims

1、产纤维素酶的菌剂，其活性成分为毕赤酵母1413、毕赤酵母1515和毕赤酵母2526；所述毕赤酵母1413是将内切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母1515将外切葡聚糖酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌，所述毕赤酵母2526是将β-葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母中获得的重组菌。

2、根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述内切葡聚糖酶是如下1)或2)的蛋白；所述外切葡聚糖酶是如下3)或4)的蛋白；所述β-葡萄糖苷酶是如下5)或6)的蛋白；

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3、根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于：所述内切葡聚糖酶基因是如下a)或b)或c)的DNA分子；所述外切葡聚糖酶基因是如下d)或e)或f)的DNA分子；所述β-葡萄糖苷酶基因是如下g)或h)或i)的DNA分子；

a)其核苷酸序列是序列表中序列1；

d)其核苷酸序列是序列表中序列3；

g)其核苷酸序列是序列表中序列5；

4、根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526的集落形成单位数目比为(3-10)：(1-5)：(1-3)。

5、根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中，所述毕赤酵母1413、所述毕赤酵母1515和所述毕赤酵母2526分别独立包装。

6、权利要求1至5中任一所述菌剂在生产纤维素酶中的应用。

7、一种生产纤维素酶的方法，是发酵权利要求1至5中任一所述的菌剂生产纤维素酶。