CN102363772A - 一种酸性纤维素酶egi及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性纤维素酶EGI及其基因和应用。本发明提供了一种新的酸性纤维素酶EGI，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述酸性纤维素酶EGI的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的纤维素酶EGI作用pH范围广(pH 2.0～6.0)，最适pH 2.5～4.0，最适温度50℃，在酸性条件下具有良好的稳定性和耐热性，可应用于饲料、食品等多种工业。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性纤维素酶EGI及其基因和应用。
背景技术
纤维素(cellulose)是存在于自然界中最丰富的可再生的生物质资源，由几百到几万个吡喃型D-葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接形成纤维素链，纤维素链之间又通过氢键相互缔合，形成纤维素束，是不溶于水的同聚多糖(Beguin.J Microbiol，1990，44：219～248)。将这些巨大的可再生性资源转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义(王建平等，浙江水产学院院报，1996，15(2)：140～144)。这些可再生资源的利用，纤维素酶(cellulase)的降解是很重要的一部分。
纤维素酶是指所有参与降解纤维素最终转化为葡萄糖的各种酶的总称。它是一类复杂的复合物，故而又被称为纤维素酶系。根据各酶的功能可分为三大类：内切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EG，EC3.2.1.4，又称内切纤维素酶)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶(exo-1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91，简称外切葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC2.1.21，也称CB酶或纤维二糖酶)。在纤维素酶系中，三种酶相互协同催化纤维素酶的降解(闫会平等，2007)，尤其是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，作用于纤维素、纤维素衍生物、地衣多糖和其他含有纤维素部分的植物材料中的1，4-β-D-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维。内切葡聚糖酶有着非常重要的工业用途，在饲料、食品、采油、医药、化工、洗涤、纺织等方面有巨大的潜在市场(刘燕等.饲料工业，2007，28(18)：11～14.谷嵩等.安徽农业科学，2007，35(25)：7736～7737)。
纤维素酶可由大量的植物和微生物合成，这些微生物包括细菌、放线菌和各类真菌。随着对纤维素生物降解和纤维素酶系的深入认识，纤维素酶基因的克隆和表达，定向突变，结构改造，以及作用机理的研究，近年来逐渐成为研究热点。目前为止已有几百种来自真菌和细菌的纤维素酶基因被克隆出来。根据序列的相似性，可以将纤维素酶分为不同家族(Henrissat et al.Biochem J，1993，293：781～788)，目前已知的纤维素酶属于糖苷水解酶第5-12，26，44，45、48、60和61家族(www.cazy.org)。
纤维素酶基因的克隆具有两方面的意义，一方面是为了能够在外源宿主或原宿主细胞内进行高效表达，另一方面便于在分子水平上研究纤维素酶的结构和作用机制。由于纤维素酶工业化生产的需要，要求根据不同情况提高酶的产量，改善外分泌性、耐热性和耐低温、耐酸碱性等性状。这些要求促使科研工作者一方面筛选天然优质的产酶菌株，一方面改造已知的纤维素酶。多种纤维素酶基因已经成功实现了表达(Saloheimo et al.Eur.J.Biochem，1991，249：584～591；刘燕等.饲料工业，2007，28(18)：11～14)，但其在表达量及性质方面仍然不能完全满足工业化生产的需要，比如：饲料用纤维素酶需要最适pH值为酸性而同时在酸性、中性范围内有高活性，热稳定性好，而在常温下又具有高活性的特点。所以发现新酶，提高纤维素酶的表达量仍然是研究的重点。
本发明提供了一种新颖的来自青霉的酸性纤维素酶，其最适pH为酸性，而且在pH2.0到6.0这一范围内均能维持高活性，并在毕赤酵母中实现高效表达，具有非常重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种酸性纤维素酶EGI。
本发明的另一目的是提供编码上述酸性纤维素酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述酸性纤维素酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述酸性纤维素酶基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供制备上述酸性纤维素酶的方法。
本发明的另一目的是提供上述酸性纤维素酶的应用。
本发明分离筛选出一种生产上述酸性纤维素酶EGI的青霉Penicillium sp.，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5120。
本发明提供了一种纤维素酶EGI，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MATRPLAFAA IAALIHQAAS QQAPTPDNLA SLPTWKCTTS GGCVQQSTSI
VVDWVYHWIH 60
TVNGSTSCTT SSGLDSTLCG TEEECYTNCE ISPATYDGLG IKTSGNALTL
NQYVTSNGTT 120
SNASPRVYLL DPAGKNYEML QLLGQEISFD VDASNLPCGE NGALYLSEMD
ATGGRSQYNP 180
AGASYGSGYC DAQCGSSSWF NGSINSAGLG SCCNEMDLWE
ANGEATALTP HPCSVDGPYG 240
CSGSACGSTG VCDKNGCGFN PYALGDQSYY GPGLTVDTSK PFTVTTQFVT
NDGTKTGTLT 300
EIRRSYTQNG KVIANAVASA SSGFSGQSSI TESFCTAMDS EAGTLGGLTT
MGEALGRGMV 360
LIFSIWNDAG GYMNWLDSGS SGPCSSTAGI PSTIQANDPG TSVTFSNIKW
GDIGSTGSGT 420
GGSSSSSSST STSPKTTSTT TTSATTKTSA TTTTTSTGAT QTHYGQCGGM
SYTGPTVCAS 480
PYTCQVQNPY YSQCL 495
其中，该酶全长495个氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MATRPLAFAA IAALIHQAAS”。
因此，成熟的酸性纤维素酶EGI的理论分子量为48.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：
QQAPTPDNLA SLPTWKCTTS GGCVQQSTSI VVDWVYHWIH TVNGSTSCTT
SSGLDSTLCG 60
TEEECYTNCE ISPATYDGLG IKTSGNALTL NQYVTSNGTT SNASPRVYLL
DPAGKNYEML 120
QLLGQEISFD VDASNLPCGE NGALYLSEMD ATGGRSQYNP AGASYGSGYC
DAQCGSSSWF 180
NGSINSAGLG SCCNEMDLWE ANGEATALTP HPCSVDGPYG CSGSACGSTG
VCDKNGCGFN 240
PYALGDQSYY GPGLTVDTSK PFTVTTQFVT NDGTKTGTLT EIRRSYTQNG
KVIANAVASA 300
SSGFSGQSSI TESFCTAMDS EAGTLGGLTT MGEALGRGMV LIFSIWNDAG
GYMNWLDSGS 360
SGPCSSTAGI PSTIQANDPG TSVTFSNIKW GDIGSTGSGT GGSSSSSSST
STSPKTTSTT 420
TTSATTKTSA TTTTTSTGAT QTHYGQCGGM SYTGPTVCAS PYTCQVQNPY
YSQCL 475
本发明提供了编码上述酸性纤维素酶的基因egI，该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：
atggcgacta gaccattggc ttttgcagct attgctgctc ttattcacca ggctgcctct 60
cagcaagctc ccaccccaga taatttagct tccctaccga cctggaaatg tacaacttcc 120
ggtggctgcg tgcaacagtc gacatctatt gtcgtggatt gggtgtatca ctggatccac 180
acagtcaatg ggagcacatc gtgcaccaca tccagcggat tggactcaac tctatgtgga 240
acggaagagg aatgctatac aaactgtgaa atctcacctg ccacctacga tggccttggt 300
ataaaaactt ctgggaacgc tctaaccctc aatcaatacg tcacaagcaa cggaacgacg 360
agtaacgcct ctccgcgtgt atatcttcta gatccagccg gcaagaatta tgagatgttg 420
caacttctcg gtcaagagat tagctttgat gtagatgcct ccaacttacc atgtggtgaa 480
aacggggctc tttatctctc tgagatggat gcgactggag gtcgaagcca gtacaaccct 540
gccggagctt catacggttc cggttactgt gatgctcagt gtggaagtag cagctggttc 600
aatggctcga ttaacagcgc tggccttggc tcttgctgca acgaaatgga tctctgggaa 660
gcaaatggcg aggcaactgc tttgacacct catccatgca gtgtcgatgg tccttatggt 720
tgctctggta gtgcctgtgg ttcaactgga gtgtgtgaca agaacggttg tggatttaat 780
ccatatgccc ttggggacca gagctactac ggtccaggtc ttacagtgga cacaagtaag 840
ccttttacag ttacaacaca gtttgtgacc aacgatggca ccaagaccgg caccttgacc 900
gaaattcgtc gatcttacac ccagaatggc aaggttattg cgaatgccgt tgcgtccgcg 960
tcgtcaggct tttcaggtca aagttccatc acagagtcgt tctgtactgc gatggactcc 1020
gaggccggga cactaggggg tctgactaca atgggtgagg cccttggccg tggcatggtt 1080
cttatcttca gcatttggaa tgatgcaggt ggatacatga actggctaga cagtggaagc 1140
tcgggtcctt gcagtagtac tgcaggaatt ccgtccacca ttcaggcgaa tgaccccggt 1200
acttcggtta ctttctcaaa catcaagtgg ggtgatattg gatctacagg gtctggcact 1260
ggaggaagca gttcatcatc gtcgtcgact tcgacttcac caaaaactac cagcaccacc 1320
acaacttcag cgacgaccaa aacatcagca acgacaacta caaccagcac cggggcaact 1380
cagactcact atggtcaatg tggaggcatg tcttacactg gccctactgt ttgtgcctct 1440
ccgtacacct gtcaagtaca gaatccgtac tattcacagt gcctttag 1488
本发明通过PCR的方法分离克隆了这一酸性纤维素酶基因egI，DNA全序列分析结果表明，纤维素酶EGI的结构基因全长1,488bp。经RT-PCR克隆得到其mRNA序列，经序列比对分析表明，该基因没有内含子，cDNA长1,488bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：
atggcgacta gaccattggc ttttgcagct attgctgctc ttattcacca ggctgcctct 60
cagcaagctc ccaccccaga taatttagct tccctaccga cctggaaatg tacaacttcc 120
ggtggctgcg tgcaacagtc gacatctatt gtcgtggatt gggtgtatca ctggatccac 180
acagtcaatg ggagcacatc gtgcaccaca tccagcggat tggactcaac tctatgtgga 240
acggaagagg aatgctatac aaactgtgaa atctcacctg ccacctacga tggccttggt 300
ataaaaactt ctgggaacgc tctaaccctc aatcaatacg tcacaagcaa cggaacgacg 360
agtaacgcct ctccgcgtgt atatcttcta gatccagccg gcaagaatta tgagatgttg 420
caacttctcg gtcaagagat tagctttgat gtagatgcct ccaacttacc atgtggtgaa 480
aacggggctc tttatctctc tgagatggat gcgactggag gtcgaagcca gtacaaccct 540
gccggagctt catacggttc cggttactgt gatgctcagt gtggaagtag cagctggttc 600
aatggctcga ttaacagcgc tggccttggc tcttgctgca acgaaatgga tctctgggaa 660
gcaaatggcg aggcaactgc tttgacacct catccatgca gtgtcgatgg tccttatggt 720
tgctctggta gtgcctgtgg ttcaactgga gtgtgtgaca agaacggttg tggatttaat 780
ccatatgccc ttggggacca gagctactac ggtccaggtc ttacagtgga cacaagtaag 840
ccttttacag ttacaacaca gtttgtgacc aacgatggca ccaagaccgg caccttgacc 900
gaaattcgtc gatcttacac ccagaatggc aaggttattg cgaatgccgt tgcgtccgcg 960
tcgtcaggct tttcaggtca aagttccatc acagagtcgt tctgtactgc gatggactcc 1020
gaggccggga cactaggggg tctgactaca atgggtgagg cccttggccg tggcatggtt 1080
cttatcttca gcatttggaa tgatgcaggt ggatacatga actggctaga cagtggaagc 1140
tcgggtcctt gcagtagtac tgcaggaatt ccgtccacca ttcaggcgaa tgaccccggt 1200
acttcggtta ctttctcaaa catcaagtgg ggtgatattg gatctacagg gtctggcact 1260
ggaggaagca gttcatcatc gtcgtcgact tcgacttcac caaaaactac cagcaccacc 1320
acaacttcag cgacgaccaa aacatcagca acgacaacta caaccagcac cggggcaact 1380
cagactcact atggtcaatg tggaggcatg tcttacactg gccctactgt ttgtgcctct 1440
ccgtacacct gtcaagtaca gaatccgtac tattcacagt gcctttag 1488
其中，信号肽的碱基序列为：atggcgacta gaccattggc ttttgcagct attgctgctc ttattcacca ggctgcctct，所以编码成熟纤维素酶蛋白的核苷酸序列全长1,428bp，如SEQ ID NO.5所示：
cagcaagctc ccaccccaga taatttagct tccctaccga cctggaaatg tacaacttcc 60
ggtggctgcg tgcaacagtc gacatctatt gtcgtggatt gggtgtatca ctggatccac 120
acagtcaatg ggagcacatc gtgcaccaca tccagcggat tggactcaac tctatgtgga 180
acggaagagg aatgctatac aaactgtgaa atctcacctg ccacctacga tggccttggt 240
ataaaaactt ctgggaacgc tctaaccctc aatcaatacg tcacaagcaa cggaacgacg 300
agtaacgcct ctccgcgtgt atatcttcta gatccagccg gcaagaatta tgagatgttg 360
caacttctcg gtcaagagat tagctttgat gtagatgcct ccaacttacc atgtggtgaa 420
aacggggctc tttatctctc tgagatggat gcgactggag gtcgaagcca gtacaaccct 480
gccggagctt catacggttc cggttactgt gatgctcagt gtggaagtag cagctggttc 540
aatggctcga ttaacagcgc tggccttggc tcttgctgca acgaaatgga tctctgggaa 600
gcaaatggcg aggcaactgc tttgacacct catccatgca gtgtcgatgg tccttatggt 660
tgctctggta gtgcctgtgg ttcaactgga gtgtgtgaca agaacggttg tggatttaat 720
ccatatgccc ttggggacca gagctactac ggtccaggtc ttacagtgga cacaagtaag 780
ccttttacag ttacaacaca gtttgtgacc aacgatggca ccaagaccgg caccttgacc 840
gaaattcgtc gatcttacac ccagaatggc aaggttattg cgaatgccgt tgcgtccgcg 900
tcgtcaggct tttcaggtca aagttccatc acagagtcgt tctgtactgc gatggactcc 960
gaggccggga cactaggggg tctgactaca atgggtgagg cccttggccg tggcatggtt 1020
cttatcttca gcatttggaa tgatgcaggt ggatacatga actggctaga cagtggaagc 1080
tcgggtcctt gcagtagtac tgcaggaatt ccgtccacca ttcaggcgaa tgaccccggt 1140
acttcggtta ctttctcaaa catcaagtgg ggtgatattg gatctacagg gtctggcact 1200
ggaggaagca gttcatcatc gtcgtcgact tcgacttcac caaaaactac cagcaccacc 1260
acaacttcag cgacgaccaa aacatcagca acgacaacta caaccagcac cggggcaact 1320
cagactcact atggtcaatg tggaggcatg tcttacactg gccctactgt ttgtgcctct 1380
ccgtacacct gtcaagtaca gaatccgtac tattcacagt gcctttag 1428
本发明还提供了包含上述酸性纤维素酶基因egI的重组载体，优选为pPIC9-egI将本发明的酸性纤维素酶基因egI插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作地与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的酸性纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaB I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组毕赤酵母表 达质粒。
本发明还提供了包含上述纤维素酶基因egI的重组菌株，优选为毕赤酵母重组菌株。
本发明还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及
3)回收并纯化所表达的纤维素酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组毕赤酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)，得到重组毕赤酵母菌株。
本发明还提供了上述纤维素酶的应用。
本发明提供的一个新的纤维素酶基因，其在pH 2.5～4.0，温度40～55℃之间具有高活性，作用pH范围广(pH 2.0～6.0)，具有良好的pH稳定性和耐热性，可作为添加剂应用于饲料、食品等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产酸性纤维素酶。
附图说明
图1重组纤维素酶EGI的SDS-PAGE分析，1：蛋白质Marker；2：发酵液上清；3：纯化的纤维素酶；4：脱糖基化处理的重组纤维素酶。
图2纤维素酶EGI的最适pH。
图3纤维素酶EGI的pH稳定性。
图4纤维素酶EGI作用的最适温度。
图5纤维素酶EGI的热稳定性。
本发明分离筛选出一种生产上述酸性纤维素酶EGI的青霉Penicillium sp.，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5120。
具体实施方式
实验材料及一般实验方法：
1、菌株及载体：大肠杆菌菌株(Escherichia coli)JM109、载体pEASY-T3购自全式金公司；毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115及pPIC9质粒购自invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶购自 TakaRa公司，DNA提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司，RNA提取试剂盒购自Promega公司，逆转录试剂盒购自东洋纺公司(ReverTra Ace，TOYOBO)。羧甲基纤维素钠、大麦葡聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
Penicillium sp.TZ1产纤维素酶诱导选择培养基：0.2％ MgSO4·7H2O，0.1％KH2PO4，0.1％ CuSO4·5H2O，0.1％ CaCl2，0.5％蛋白胨，1％玉米芯粉，1％麸皮，pH5.0。
标准的分子操作技术如DNA提取、RNA提取、反转录、凝胶电泳、大肠杆菌转化、酵母转化均使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手册)进行。
实施例1青霉Penicillium sp.TZ1菌株的分离
真菌TZ1分离自云南森林土壤。根据形态及ITS序列鉴定为Penicillium属，命名为Penicillium sp.TZ1。该菌株于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5120。
将青霉TZ1经马铃薯汁培养基培养后，接种于诱导培养基中((NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2 0.2g/L，玉米芯粉1％，麸皮1％，1.5％琼脂糖，pH 5.0)平板上，30℃培养5～6d，测定其产纤维素半纤维素酶的活性。经测定该菌为高产纤维素酶菌株。
实施例2青霉Penicillium sp.TZ1菌株的基因组DNA的分离
将马铃薯汁培养基培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，采用CTAB方法提取基因组DNA(Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版2001))。
实施例3青霉Penicillium sp.TZ1纤维素酶编码基因的克隆
通过Pfam数据库、ClustalW软件和已发表的糖苷水解酶第7家族纤维素酶的相关信息确定第7家族纤维素酶保守序列，同时结合发表的丝状真菌相关序列特征信息，确定保守的氨基酸序列为GYCDAQC和GCGFNPY，再依据物种的遗传密码子反向推导出相应的核苷酸序列。
根据以上信息设计出的简并引物EG7F(5′-GGYTACTGYGAYGCNCARTG-3′)和EG7R(5′-TATGGGRTTRAANCCRCANCC-3′，Y＝C/T，R＝A/G，N＝A/T/C/G)。
以Penicillium sp.TZ1基因组DNA为模板，EG7F和EG7R为引物进行PCR扩增。然后将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，得到的长约250bp的片段，经回收试剂盒回收后连接到pEASY-T3载体上，连接产物热激转化到大肠杆菌感受态细胞，筛选重组转化子，将含有目的片段的转化子送到北京博迈德生物技术公司测序。
根据测序结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTx对序列进行比对，初步判定获得的片段为糖苷水解酶第七家族纤维素酶的基因片段。
根据已获得纤维素酶的部分序列，分别设计三条上游和三条下游特异性引物，采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法分别获取目的基因的上游和下游序列，再对上、下游序列进行比对拼接从而获得完整的目的基因序列。TAIL-PCR特异引物序列见表1。
表1纤维素酶基因egI TAIL-PCR特异性引物
通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后与pEASY-T3载体相连并送三博生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到egI全长基因。经序列分析表明，该基因DNA全长1,488bp。
实施例4从青霉Penicillium sp.TZ1分离总RNA并合成cDNA
利用纤维素酶诱导培养基培养Penicillium sp.TZ1，基于对培养基上清中纤维素酶活力的测定，在几个时间点上通过过滤收获菌丝体并立即用液氮冷冻，用研钵研磨，并按照Promega公司RNA提取试剂盒的操作说明提取Penicillium sp.TZ1的总 RNA。
使用购自东洋纺公司逆转录试剂盒并按操作说明进行cDNA第一链的合成。然后设计的引物EGIcom F：5′-ATGGCGACTAGACCATTGGCTTTTGCAGCTATTG-3′，和EGIcom R：5′-CTAAAGGCACTGTGAATAGTACGGATTCTGTAC-3′获得编码纤维素酶EGI的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。
编码纤维素酶EGI的基因组序列和cDNA序列分析结果表明，egI的结构基因全长1,488bp，没有内含子序列，cDNA长1,488bp。N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列，C端有一个纤维素结合区CBM1。纤维素酶基因egI编码的成熟蛋白序列与GeneBank上的序列进行同源比较发现，EGI同Talarmyces stipitatus ATCC 10500来源假定蛋白的序列一致性最高为84％，与已进行功能验证的来源于Bispora sp.MEY-1的葡聚糖酶的序列一致性为59％。
实施例5重组表达载体的构建与重组菌株的获得
纤维素酶的成熟蛋白(即去除信号肽序列的蛋白)的cDNA编码序列通过引物EGI F-s(5′-GTCTACGTACAG CAAGCTCCCACCCCAGATAATTTAGCTTC-3′，划线部分为SnaB I酶切位点)和EGI R-s
(5′-ACTGCGGCCGCCTAAAGGCACTGTGAATAGTACGGATTCTGTAC-3′划线部分为Not I酶切位点)扩增获得，并通过酶切位点与表达载体pPIC9连接，获得含有编码纤维素酶基因的重组质粒pPIC9-egI。
重组质粒pPIC9-egI转化毕赤酵母P.pastoris GS115，转化和筛选主要操作流程参照Invitrogen公司的毕赤表达操作手册。重组质粒pPIC9-egI用BglII进行线性化通过电击转化毕赤酵母P.pastoris GS115，转化细胞涂布到固体MD平板上，30℃培养至转化子长出。将在MD上生长的转化子用牙签挑取按先后顺序分别点到MM和MD平板上，30℃培养2天。
重组酵母在3mL BMGY培养基中于30℃摇床培养48小时，离心收集菌体，加入1mL BMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体，继续30℃诱导培养，48小时后取样检测各菌株上清液的纤维素酶活性，从中筛选出表达纤维素酶的转化子。
测定纤维素酶的活力。重组纤维素酶摇床水平的表达量为28U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组纤维素酶在毕赤酵母中得到了表达。
实施例6纤维素酶的活性分析
酶活性测定方法采用DNS法。在pH 3.0，50℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物(羧甲基纤维素钠)，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
实施例7重组纤维素酶EGI的制备
挑取纤维素酶活性高的重组子进行发酵表达，每24小时取样测定纤维素酶活性，并在诱导表达120小时后收集发酵上清液用于重组纤维素酶的纯化，进行SDS-PAGE分析(图1)。发酵120小时后，纤维素酶的酶活达到270U/ml发酵液。在60kDa左右有一条清晰的特异表达的蛋白条带。
毕赤酵母表达的纤维素酶纯化方法如下：收集的菌液首先通过中空纤维和膜包进行脱盐和浓缩，再经阴离子交换柱层析纯化。经SDS-PAGE分析纯化后的电泳条带大小约为60KDa左右，将SDS-PAGE中的目的蛋白条带回收，送至中科院动物所经LC-ESI-MS/MS分析，得到的多肽片段与EGI中的氨基酸序列完全吻合，证明纯化的蛋白确实为EGI。
以达到电泳纯的收集液作为表达纤维素酶酶学性质研究的样品。利用Bradford法测定纯化后酶液的蛋白质含量，计算出酶的比活为120U/mg酶蛋白。
实施例8重组纤维素酶EGI的性质测定
1、重组纤维素酶EGI的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
经纯化的纤维素酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液和pH 9.0～12.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的纤维素酶在不同pH的缓冲体系，50℃下测定的pH适性结果(图2)表明：该纤维素酶的作用pH范围广，低于pH 6.5时表现出水解活性，最适pH为pH2.5～4.0。在pH 2.5到5.0之间，酶活能达到最高酶活的70％以上。
将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，该纤维素酶在pH范围为2.5～7.0间均有很好的稳定性。
2、重组纤维素酶的最适温度和热稳定性的测定
最适温度的测定为在pH3.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度(20～80℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明，纤维素酶的最适作用温度50℃(图4)。
测定纤维素酶EGI在50℃和60℃下分别保温不同时间相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在50℃下处理1h纤维素酶活力没有损失，在60℃下处理60min，剩余酶活在50％以上(图5)。
Claims (10)
1.一种酸性纤维素酶EGI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示。
2.一种酸性纤维素酶基因egI，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性纤维素酶EGI。
3.根据权利要求2所述的酸性纤维素酶基因egI，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示。
4.包含权利要求2或3所述酸性纤维素酶基因egI的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-egI。
6.包含权利要求2或3所述酸性纤维素酶基因egI的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。
8.一种制备酸性纤维素酶EGI的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组酸性纤维素酶EGI的表达；以及
3)回收并纯化所表达的酸性纤维素酶EGI。
9.权利要求1所述酸性纤维素酶EGI的应用。
10.青霉属真菌Penicillium sp.TZ1，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.5120。
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