CN105018448B - 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种来源于真菌的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。

Description

一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种来源于真菌的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用。

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。纤维素是一种重要的多糖，它是植物细胞支撑物质的材料,是自然界最丰富的生物质资源，纤维素的结构确定为β-D-葡萄糖单元经β－(1→4)糖苷键连接而成的直链多聚体，结构中没有分支，其能够被纤维素酶降解为葡萄糖。

纤维素酶是指能够水解葡萄糖苷键，将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。其对纤维素的水解过程主要包括三步：第一步是内切型纤维素酶作用于纤维素内部的无定形区，随即水解β－(1→4)糖苷键将纤维素分子截短，随后外切型纤维素酶，作用于纤维素线状分子末端，水解β－(1→4)糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，最后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

近年来，随着绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对纤维素酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。

纤维素酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。不同的微生物产生的纤维素酶，其结构和功能差异较大，纤维素酶按作用的最适pH不同可分为：酸性纤维素酶(最适pH约为4.8)，它是目前研究较多和应用最广泛的纤维素酶，主要由康氏木霉，里氏木霉，绿色木霉，黑曲霉，青霉等产生；中性纤维素酶(最适pH6-8，)，主要由长梗木霉，腐殖菌，芽孢杆菌等产生；碱性纤维素酶(最适pH8-11)，主要由嗜热芽孢杆菌，腐殖菌等产生。自然界中存在的纤维素资源来源复杂，其结构和功能差异较大，不同来源的纤维素酶对它们的降解效果也不尽相同，针对不同来源的纤维素寻找降解效果较高的纤维素酶，是当前纤维素酶领域的热点之一。目前国内外，虽然许多纤维素酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到新的能够满足实际应用需求的纤维素酶，从而能够进一步推广纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中应用。

本发明从Bispora sp.MEY-1菌株中得到了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有以下几个优点：耐热、酸性、广泛的底物特异性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，更有应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热、酸性、底物特异性比较广泛的纤维素酶。

本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，该酶全长428个氨基酸，N端17个氨基酸为信号肽序列“MKAVLFTITAAAGSAYA”。

因此，成熟的纤维素酶Cel5的理论分子量为43.3kDa，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2：

该纤维素酶的最适pH为3.5，在pH2.5-pH4.5范围内，该酶能够维持其60％以上的酶活力；最适温度70℃，在80℃时依然具有30％的酶活力，在60℃下处理60min，酶活基本不损失，在70℃下处理10min，依然能够保持40％的酶活力，具有良好的稳定性。

本发明还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了这个纤维素酶基因Cel5，DNA全序列分析结果表明，纤维素酶Cel5结构基因全长1435bp，含有3个内含子，+74～120bp，+617～665，+844～895为其内含子序列，cDNA长1287bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：

其中，信号肽的碱基序列为：

“ATGAAGGCTG TTCTATTCAC CATCACGGCA GCAGCTGGTT CTGCTTACGC T”

因此，成熟基因的编码序列为

SEQ ID NO.5所示：

成熟蛋白理论分子量为43.3kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基因Cel5cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，确定Cel5是一种新的纤维素酶。

本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为pPIC9-cel5。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel5。

本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/cel5。

本发明还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的纤维素酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel5。

本发明还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素酶。

本发明提供了一个新的纤维素酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。

附图说明

图1Cel5在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析

图2本发明重组纤维素酶的最适pH值。

图3本发明纤维素酶的pH稳定性。

图4本发明纤维素酶最适反应温度。

图5本发明纤维素酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L CaCl₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。

(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1纤维素酶编码基因cel5的克隆

提取Bispora sp.MEY-1基因组DNA

将液体培养3天的菌，12,000rpm离心10min，收集的菌丝体并提取DNA，用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量dd H₂O溶解，置于-20℃备用。

设计简并引物，以Bispora sp.MEY-1总DNA为模板进行PCR扩增。得到一约451bp片段，将该片段回收后测序。

根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物uspl，usp2，us3；dspl，dsp2，dsp3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。

表1本实验所需的引物

提取Bispora sp.MEY-1总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物F和R(见表1)，扩增该单链cDNA，获得纤维素酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序。

通过对纤维素酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有3个内含子，cDNA长1287bp，编码428个氨基酸和一个终止密码子，N端17个氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从Bispora sp.MEY-1中分离克隆得到的编码纤维素酶的基因为新基因。

实施例2纤维素酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的纤维素酶Cel5的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物F和R(见表1)，对Cel5的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen,San Diego)，纤维素酶Cel5成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-cel5，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样的方式构建含Cel5信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。

(2)高纤维素酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高纤维素酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例3重组纤维素酶的制备

(1)纤维素酶基因Cel5在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

(2)重组纤维素酶的纯化

收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组Cel5，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取Cel5浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。

实施例4重组纤维素酶部分性质分析

采用DNS法对本发明的纤维素酶进行活性分析。具体方法如下：在pH 5.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0rnin，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解羧甲基纤维素生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

(1)纤维素酶Cel5的最适pH及pH稳定性

经纯化的实施例3表达的纤维素酶Cel5在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.2～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液，pH 8.0～9.0Tris-HC缓冲液，lpH9.0～12甘氨酸-NaOH系列缓冲液。纯化的纤维素酶Cel5在不同pH的缓冲体系.70℃下测定的pH适性结果(图2)表明：Cel5的最适pH为3.5，在pH2.5-pH4.5范围内，该酶能够维持其60％以上的酶活力。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，分析结果表明pH2.0-pH12.0之间能够维持50％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

(2)纤维素酶Cel5反应最适温度及热稳定性

纯化的纤维素酶在pH 3.5条件下，测定不同温度(40-90℃)下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为70℃，在80℃时依然具有30％以上的酶活力(图4)。耐温性测定为纤维素酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该纤维素酶在60℃下处理60min，基本不损失，即使该酶在70℃下处理20min，依然能够保持20％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性(图5)。

(3)比较广泛的底物特异性

在最适PH与最适温度下，将该纤维素酶与不同种类的底物反应相同时间，分析实验结果表明，该酶能够降解大麦葡聚糖(2835U/mg)，羧甲基纤维素钠(1128U/mg)，地衣多糖(1023U/mg)，魔芋粉(109U/mg)。另外，过夜反应12h后，能检测到微弱的PGA，昆布多糖，角豆胶，以及微晶纤维素的酶活。结果表明，对于纤维素半纤维素类的底物，该酶均可以降解，这使得该酶更适合应用于工业生产。

Claims (9)

1.一种纤维素酶Cel5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的一种纤维素酶Cel5。

3.根据权利要求2所述的纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组表达载体pPIC9-Cel5。

6.包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组菌株。

7.包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组菌株GS115/Cel5。

8.一种制备纤维素酶Cel5的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞；

(2)培养宿主细胞；

(3)分离纯化获得纤维素酶Cel5。

9.权利要求1所述纤维素酶Cel5的应用。