CN113980940B - 一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用 - Google Patents
一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113980940B CN113980940B CN202111585620.2A CN202111585620A CN113980940B CN 113980940 B CN113980940 B CN 113980940B CN 202111585620 A CN202111585620 A CN 202111585620A CN 113980940 B CN113980940 B CN 113980940B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gly
- thr
- ala
- cellulase
- asn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用。本发明以GH5‑5家族Bispora sp.MEY‑1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Thr100对酶的双功能特性有着重要的影响。突变为Thr100Asn与Thr100Cys后，可获得纤维素酶活性提高突变体；突变为Thr100Ile、Thr100Leu、Thr100Val和Thr100Ser后，可获得的甘露聚糖酶活性提高的突变体。在此改造条件下，纤维素酶突变体对纤维素底物的比活力最高比突变前提高了150%，甘露聚糖酶比活力最多提高了81%。突变体更为优越的双功能的特性比野生型有着更为广阔的应用空间，也奠定了其在工业生产领域的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用。
背景技术
非淀粉多糖（non-starch polysaccharide, NSP）是植物中除了淀粉之外的碳水化合物的总称，包括纤维素、半纤维素和果胶类等。饲料纤维中含有大量的NSP，不仅会影响动物的正常消化功能，妨碍动物吸收营养，还严重降低了饲料的利用效率。非淀粉多糖酶，包括纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等，可以有效将饲料中的NSP降解成小分子，降低NSP的抗营养作用，提高饲料营养价值并改善动物生长性能。一般情况下，饲料中非淀粉多糖的降解需要纤维素酶、半纤维素酶（β-1,3-1,4-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶）共同作用，所以非淀粉多糖酶在饲料中需要复合使用，但这无疑增加了饲料成本，成为限制其广泛应用的一个重要因素。因此，双功能NSP酶（一种酶同时具有两种或以上功能）的研究与应用是简化饲料加工工艺、降低饲料成本的有效途径，获得功能多样性且高效的双功能酶对工业应用更是意义巨大。
催化活性作为衡量酶工业化应用价值的重要指标，也是研究工作者的重点。许多单结构域的双功能酶都共享着催化通道内的催化残基与大部分底物结合位点，由于这些底物结合位点之间在功能上存在着平衡与制约，因此，双功能酶催化活性的改造存在着更大的挑战，如何有选择性的提高一种活性或者多种活性是研究者不断追求的目标。在当前的蛋白质工程领域研究中，提高催化效率的方法主要为理性设计、半理性设计与定向进化。由于随机突变具有太大的随机性，因此不适合这种精确的靶向改造。
发明内容
本发明提供了一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法。
本发明再一目的是提供双功能纤维素酶突变体。
本发明再一目的是提供双功能纤维素酶突变体的编码基因。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备催化效率提高的双功能纤维素酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述双功能纤维素酶突变体的应用。
本发明以GH5-5家族Bispora sp. MEY-1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Thr100对酶的双功能特性有着重要的影响。突变为Thr100Asn与Thr100Cys后，可获得纤维素酶活性提高突变体；突变为Thr100Ile、Thr100Leu、Thr100Val和Thr100Ser后，可获得的甘露聚糖酶活性提高的突变体。在此改造条件下，纤维素酶突变体对纤维素底物的比活力最高比突变前提高了150%，甘露聚糖酶比活力最多提高了81%。突变体更为优越的双功能的特性比野生型有着更为广阔的应用空间，也奠定了其在工业生产领域的应用前景。
GH5-5家族Bispora sp. MEY-1来源的双功能纤维素酶BsCel5B的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 GH5-5家族Bispora sp. MEY-1来源的双功能纤维素酶BsCel5B的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M1（T100N，Thr100Asn）氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M1核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M2(T100I，Thr100Ile)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
所述催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M2核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M3(T100L，Thr100Leu)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M3氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M4(T100V，Thr100Val)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M4氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M5(T100C，Thr100Cys)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M5氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M6(T100S，Thr100Ser)氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M6氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示。
根据本发明的具体实施方式，对野生型的双功能纤维素酶BsCel5B 的T100位点实施定点突变，获得T100N、T100I、T100L、T100V、T100C和T100S突变体，将包含突变体基因的重组载体转化毕赤酵母GS115，通过对小管水平的发酵液进行酶活测定初步筛选阳性转化子。对酶活最高的转化子进行大瓶诱导，并对粗酶液进行蛋白浓缩及纯化。利用SDS-PAGE电泳检测纯化后突变体和野生型的纯度。以纯化后的蛋白为对象，利用DNS法测定野生型与突变体的基本酶学性质。结果表明，与野生型相比，突变体酶促反应的最适pH值、最适温度并未发生变化；以羧甲基纤维素钠为底物时，突变体M1与M5的比活力比BsCel5B提高了150%和30%，突变体M2、M3、M4与M6的甘露聚糖比活力较野生型提高了12%、81%、38%和56%。
本发明还提供了一种制备催化效率提高的双功能纤维素酶的方法，包括以下步骤：
1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
3）回收并纯化所表达的催化效率提高的纤维素酶。
本发明证明并确认了所提供的纤维素酶突变体催化效率更高，对于研究材料BsCel5B的催化活性改良提供了重要的新方法，同时对于提高该家族的其他纤维素酶的分子改良提供了参考。
附图说明
图1显示催化活性提高的纤维素酶突变体与BsCel5B的最适pH；
图2显示催化活性提高的纤维素酶突变体与BsCel5B的最适温度；
图3显示催化活性提高的纤维素酶突变体与BsCel5B的电泳图；
图4显示催化活性提高的纤维素酶突变体与BsCel5B的纤维素与甘露聚糖比活比较图。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存；
2、生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司，连接酶购自Promaga公司，点突变试剂盒购自全式金公司，羧甲基纤维素钠购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）；
3、培养基：
LB培养基：0.5% 酵母提取物，1% 蛋白胨，1% NaCl， pH 7.0 ，
YPD培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖 ，
MD固体培养基：2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34% YNB，0.00004% Biotin ，
BMGY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1% 甘油(V/V)，1.34% YNB，0.00004%Biotin，
BMMY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，0.5%甲醇(V/V)。
本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1催化活性提高的纤维素酶突变体重组载体的制备
将野生型纤维素酶去除信号肽，克隆到表达载体pPIC-9r上，以重组载体pPIC9r- BsCel5B为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为pPIC9r-BsCel5B-M1、pPIC9r-BsCel5B-M2、pPIC9r-BsCel5B-M3、 pPIC9r- BsCel5B-M4、pPIC9r-BsCel5B-M5和pPIC9r-BsCel5B-M6。携带突变位点的引物包括：
引物BsCel5B-T100N-fw：SEQ ID NO:15；
BsCel5B-T100N-rv：SEQ ID NO:16 ；
BsCel5B -T100I-fw：SEQ ID NO:17；
BsCel5B -T100I-rv：SEQ ID NO:18；
BsCel5B -T100L-fw：SEQ ID NO:19；
BsCel5B -T100L-rv：SEQ ID NO:20；
BsCel5B -T100V-fw：SEQ ID NO:21；
BsCel5B -T100V-rv：SEQ ID NO:22；
BsCel5B -T100C-fw：SEQ ID NO:23；
BsCel5B -T100C-rv：SEQ ID NO:24；
BsCel5B -T100S-fw：SEQ ID NO:25；
BsCel5B -T100S-rv：SEQ ID NO:26。
本发明以GH5-5家族Bispora sp. MEY-1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Thr100对酶的双功能特性有着重要的影响。突变为Thr100Asn与Thr100Cys后，可获得纤维素酶活性提高突变体；突变为Thr100Ile、Thr100Leu、Thr100Val和Thr100Ser。
实施例2 催化活性提高的纤维素酶突变体的制备。
（1）催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B-M1、BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4、BsCel5B-M5和BsCel5B-M6在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达。
将获得的含有催化活性提高的突变体基因BsCel5B-M1、BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4、BsCel5B-M5和BsCel5B-M6的重组质粒pPIC9r-BsCel5B-M1、pPIC9r-BsCel5B- M2、pPIC9r-BsCel5B-M3、 pPIC9r-BsCel5B-M4、pPIC9r-BsCel5B-M5和pPIC9r-BsCel5B-M6转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/BsCel5B-M1、GS115/BsCel5B-M2、GS115/ BsCel5B-M3、GS115/BsCel5B-M4、GS115/BsCel5B-M5和GS115/BsCel5B-M6。 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，置于30 ℃，220 rpm摇床培养48 h；培养液4000 g离心5 min，弃上清，沉淀用200 mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30 ℃，220 rpm条件下诱导培养。每隔12 h补加1 mL甲醇，同时取上清用于酶活性检测。
（2）重组蛋白酶的纯化
收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10 kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，最后剩余约20 ml蛋白浓缩液。浓缩到一定倍数的重组纤维素酶BsCel5B-M1，利用离子交换层析法进行纯化。具体地，取纤维素酶BsCel5B及突变体BsCel5B-M1浓缩液10.0 mL经预先用10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡过的HiTrap Q HP阴离子柱，然后用含有1 mol/L NaCl的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)进行线性梯度洗脱，利用DNS法对梯度洗脱的蛋白液进行酶活性检测，同时利用SDS-PAGE凝胶电泳对梯度洗脱的蛋白液进行纯度的检测，结果如图3所示。
实施例3 重组催化活性提高的纤维素酶突变体和野生型的活性分析
采用二硝基水杨酸(DNS) 法测定重组内切纤维素酶及甘露聚糖酶的基本酶学性质。具体方法如下：在pH 4.0，80 ℃条件下，1 mL的反应体系包括100 µL适当的稀释酶液，900 µL底物，反应10 min，加入1.5 mL DNS终止反应；沸水浴煮5 min后冷却至室温，在540nm波长下测定OD值。内切纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 葡萄糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 甘露糖糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。酶学性质研究所用酶液均需达到电泳纯。
（1）最适pH分析比较
经纯化的实施例2表达的纤维素酶突变体BsCel5B及突变体BsCel5B-M1、BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4、BsCel5B-M5和BsCel5B-M6在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲体系。纯化的纤维素酶突变体BsCel5B及突变体BsCel5B-M1、BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4、BsCel5B-M5和BsCel5B-M6在不同pH的缓冲体系、80 ℃下测定的最适pH，结果如图1所示，BsCel5B和BsCel5B-M1、BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4、BsCel5B-M5和BsCel5B-M6的最适pH均为4.0。
（2）最适温度分析比较
纯化的内切纤维素酶在pH 4.0、以羧甲基纤维素钠为底物的条件下，测定30-90℃不同温度下的酶活性，以确定重组酶最适温度。如图2所示，结果表明，该酶的最适反应温度为80℃。
（3）催化效率分析比较
纯化后的实施例2的纤维素酶突变体BsCel5B，与突变体BsCel5B-M1、BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4、BsCel5B-M5和BsCel5B-M6在pH4.0、80 ℃件下进行酶促反应以测定其酶活性及动力学参数。比活测定结果如表1和图4所示。
表1
由表1可知，野生酶BsCel5B以羧甲基纤维素钠为底物时的比活为941±18 U/mg，突变体BsCel5B-M1的比活为2367±70 U/mg，BsCel5B-M5的比活为1221±3，相较于野生型，突变体BsCel5B-M1和BsCel5B-M5的比活力较野生型提高了151%和30%。
BsCel5B的Km值为6.89±0.4 mg/ml，突变体BsCel5B-M1和BsCel5B-M5的Km值为4.83±0.4 mg/ml和6.60±0.4 mg/ml。BsCel5B的Vmax为1445±126 μmol/min/mg，突变体BsCel5B-M1和BsCel5B-M5分别提高至3583±156 μmol/min/mg， 1633±117 μmol/min/mg。野生型的转换数为842±73 S-1，BsCel5B-M1 和BsCel5B-M5分别提高至2090±89 S-1和952±68 S-1，kcat/Km由野生型的122±10提高至BsCel5B-M1的433±19 ml/s/mg，BsCel5B-M5的144±16 ml/s/mg。与野生型相比，突变体BsCel5B-M1和BsCel5B-M5对纤维素酶底物CMC-Na的催化效率分别是野生型的3.54倍和1.18倍。由上述动力学参数值可以看出，Km值的降低反映了突变体对纤维素底物的亲和力的增强，Vmax与转换数的提高表明突变体加快了产物释放的速度，因此，综合来看突变体较野生型的催化效率显著提高。
测定以角豆胶为底物的甘露聚糖酶比活力，野生型为1718±24 U/mg，突变体BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4和BsCel5B-M6比活力分别为1908±22 U/mg、3257±146 U/mg、2368±14 U/mg和2574±86 U/mg，相较于野生型分别提高了12%、81%、38%和56%。BsCel5B的Km值为2.32±0.1 mg/ml，突变体BsCel5B-M1的Km值为2.32±0.1 mg/ml，Vmax为2445±131 μmol/min/mg，突变体BsCel5B-M2、BsCel5B-M3、BsCel5B-M4和BsCel5B-M6的Km值分别为2.26±0.1 mg/ml、2.37±0.2 mg/ml、2.45±0.32 mg/ml和3.06±0.2 mg/ml，Vmax分别为2520±126 μmol/min/mg、4545±186 μmol/min/mg、3930±167 μmol/min/mg、3831±152 μmol/min/mg，因此野生型的转换数由1426±76 S-1分别提高至1470±73 S-1、2652±108 S-1、2292±97 S-1、2235±88 S-1、1486±83 S-1，最终kcat/Km由614±53 ml/s/mg提高为652±41 ml/s/mg、1118±87 ml/s/mg、935±78 ml/s/mg和730±51ml/s/mg。与野生型相比，突变体的催化效率分别提高了6%、82%、53%和19%。因此，双功能酶BsCel5B突变体相较于野生型有着更好的应用前景。
以上为本申请的具体实施方式，仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 322
<212> PRT
<213> 嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)
<400> 1
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Thr Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 2
<211> 969
<212> DNA
<213> 嗜酸真菌(Bispora sp. MEY-1)
<400> 2
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatcact 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 3
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Asn Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 4
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatcaat 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 5
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Ile Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 6
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatcatt 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 7
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Leu Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 8
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatcctt 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 9
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Val Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 10
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatcgtt 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 11
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Cys Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 12
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatctgt 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 13
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Pro Thr Asn Ser Lys Thr Lys Arg Asn Lys Lys Met Arg Phe Ala
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Asp Asn Ile Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Tyr Asn Thr Thr Ala Met Gly Glu
35 40 45
Phe Ile Ser Gln Gly Met Asn Ile Phe Arg Leu Asn Leu Leu Met Glu
50 55 60
Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Pro Met Asn Ala Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Asn Leu Thr Lys Asp Val Asn Tyr Val Thr Asp Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Ala Met Ile Ser Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile
100 105 110
Asn Ser Thr Ser Asp Phe Glu Ala Phe Trp Lys Thr Val Ala Gly Ala
115 120 125
Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr
130 135 140
Gly Met Ala Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Val Asn Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Glu Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr His Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Ser Thr Cys Val Asn Ser Thr Ile Gly Ala Thr Arg Leu Met
225 230 235 240
Asp Ala Thr Ala Trp Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ile Ala Ile Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Glu Ala Val Glu Gly
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Val Glu
290 295 300
Pro Asp Asn Gly Pro Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp Pro Ile Ile Leu Glu
305 310 315 320
Tyr Ser
<210> 14
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcacccacca acagcaagac caaacgcaac aagaagatgc gcttcgctgg agtcaatgaa 60
tctggcgccg aatttgggtc tgacaacatc cccggcgtct atggcacaga ttatacgtgg 120
tacaacacca cagccatggg tgaattcatc tcccaaggga tgaatatctt ccggctcaac 180
ctgctaatgg agcgtctggt tcccaacacc atgactggcc ccatgaacgc ggactacttg 240
ggcaatttga ccaaggacgt gaactatgtt actgataaag gcgcctatgc catgatcagt 300
ccgcataatt atggacgcta ctacggcaac atcatcaata gcacctccga ctttgaggcc 360
ttctggaaaa ccgtcgcggg agcatttaaa gacaatgact tagtcatgtt cgacacaaat 420
aatgagtact atgggatggc tggccagctc gtggcagatt tgaaccaagc ggctataaac 480
ggtattcgag cggcgggggc aacgagccag tatgtaaacg tggaaggaaa ttcatatacg 540
ggtgcctgga cgtggacgac agctgaagga acggatggat tgacaaatgc acagacgatg 600
ggaaatctga cggatcctga ggataaaata ttatatcata tgcatcagta cctcgactct 660
gacgggtcgg gcacatcatc aacgtgtgtc aacagcacta tcggcgccac gcgtctaatg 720
gatgccacag cttggttgaa gtcgaacaac aagatagcta ttttgggtga gtacgccgga 780
gcggtcaata gcgtctgtga agaggccgtg gagggtatgt tagattacat cgacgagaat 840
agtgatgttt ggactggagc catctggtgg gcggcaggcc cgtggtgggg cgattacatg 900
tttagtgttg aaccggacaa tggcccagcg tacagcacat acgatcctat tatcttggaa 960
tattcataa 969
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcctatgcca tgatcaatcc gcataattat ggac 34
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
attgatcatg gcataggcgc ctttatca 28
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcctatgcca tgatcattcc gcataattat ggac 34
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aatgatcatg gcataggcgc ctttatca 28
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcctatgcca tgatccttcc gcataattat ggac 34
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaggatcatg gcataggcgc ctttatca 28
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcctatgcca tgatcgttcc gcataattat ggac 34
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacgatcatg gcataggcgc ctttatca 28
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcctatgcca tgatctgtcc gcataattat ggac 34
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acagatcatg gcataggcgc ctttatca 28
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcctatgcca tgatcagtcc gcataattat ggac 34
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actgatcatg gcataggcgc ctttatca 28
Claims (9)
1.一种提高双功能纤维素酶对纤维素底物的催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型的双功能纤维素酶的第100位氨基酸由Thr突变为Asn，或者由Thr突变为Cys的步骤。
2.一种提高双功能纤维素酶对甘露聚糖底物的催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型的双功能纤维素酶的第100位氨基酸由Thr突变为Ile、Leu、Val或者Ser的步骤。
3.一种催化效率提高的双功能纤维素酶突变体，其特征在于，所述纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO： 11或SEQ ID NO. 13所示。
4.一种纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求3所述的催化效率提高的双功能纤维素酶突变体。
5.根据权利要求4所述的纤维素酶基因，其特征在于，所述纤维素酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO： 4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO： 8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO： 12或SEQ ID NO.14所示。
6.含有权利要求4所述纤维素酶基因的重组表达载体。
7.含有权利要求4所述纤维素酶基因的重组细胞。
8.一种制备催化效率提高的双功能纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
构建包含权利要求4所述纤维素酶基因的重组表达载体；
以获得的重组表达载体转化宿主细胞；
诱导被转化的宿主细胞表达纤维素酶；
回收并纯化表达的纤维素酶。
9.权利要求3所述的催化效率提高的双功能纤维素酶突变体作为饲料添加剂的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111585620.2A CN113980940B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111585620.2A CN113980940B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113980940A CN113980940A (zh) | 2022-01-28 |
| CN113980940B true CN113980940B (zh) | 2022-03-25 |
Family
ID=79734078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111585620.2A Active CN113980940B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113980940B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116286751B (zh) * | 2023-05-15 | 2023-07-25 | 北京市科学技术研究院 | 催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018448A (zh) * | 2015-08-19 | 2015-11-04 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用 |
| CN111676209A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-09-18 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体rmx-m和应用 |
| CN111733149A (zh) * | 2020-08-13 | 2020-10-02 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用 |
-
2021
- 2021-12-23 CN CN202111585620.2A patent/CN113980940B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018448A (zh) * | 2015-08-19 | 2015-11-04 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用 |
| CN111676209A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-09-18 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体rmx-m和应用 |
| CN111733149A (zh) * | 2020-08-13 | 2020-10-02 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| glycoside hydrolase family 5 protein[Acidomyces sp."richmondensis"GenBank:KXL42266.1;Mosier，A.C.等;《NCBI》;20160224;全文 * |
| Improvement of the catalytic performance of a Bispora antennata cellulase by replacing the N-terminal semi-barrel structure;Fei Zheng等;《Bioresour Technol.》;20160625;第218卷;第279-285页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113980940A (zh) | 2022-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111676210B (zh) | 一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5i77-m和应用 | |
| US9890371B2 (en) | Thermophilic ethanol-resistant β-glucosidase and encoding gene and application thereof | |
| CN113862237B (zh) | 提高植酸酶的热稳定性的方法及突变体、基因和应用 | |
| CN113684198B (zh) | 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2 | |
| CN111676209B (zh) | 一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体rmx-m和应用 | |
| CN111733149B (zh) | 一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用 | |
| CN113980940B (zh) | 一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用 | |
| CN111690629B (zh) | 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用 | |
| CN107129976B (zh) | 一种木聚糖酶及其编码基因和其应用 | |
| CN114107262B (zh) | 一种高比活木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN114381448B (zh) | 一种葡聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN114317495A (zh) | 一种热稳定性提高的葡聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN107022536B (zh) | 高催化效率的纤维素酶突变体及其基因和应用 | |
| CN110564748B (zh) | 一种茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白 | |
| CN113755473A (zh) | 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m5及其基因和应用 | |
| CN114517191B (zh) | 热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN110724676B (zh) | 一种植酸酶突变体及其载体与应用 | |
| CN114317500B (zh) | 木聚糖酶Scxyn5及其编码基因和应用 | |
| CN111826367B (zh) | 酶活性提升的纤维素酶 | |
| CN107988182B (zh) | 一种嗜热毁丝菌外切葡聚糖苷酶突变体及其应用 | |
| CN113774045B (zh) | 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m3及其基因和应用 | |
| CN114107258B (zh) | 嗜热甘露聚糖酶ManBK突变体及其应用 | |
| CN116286751B (zh) | 催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用 | |
| CN113943723B (zh) | 热稳定提高的木聚糖酶突变体、其制备及其应用 | |
| CN115029335B (zh) | 一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |