CN111733149B - 一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用 - Google Patents

一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用 Download PDF

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用。本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的野生型纤维素酶的N105位点实施定点突变获得N100V突变体，该以两种底物测定时，酶促反应的最适pH值不变，最适温度提高5℃；以角豆胶为底物时，突变体的甘露聚糖比活力比野生型提高了约630%。

Description

一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因 和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用。
背景技术
非淀粉多糖(non-starch polysaccharide, NSP) 是植物中除了淀粉之外的碳水化合物的总称，包括纤维素、半纤维素和果胶类等。非淀粉多糖是饲料纤维的主要成分，由于这些纤维将饲料中的营养物质包围在细胞内部，在一定程度上抑制了动物的对营养物质的降解与吸收。自然界中广泛存在着可以降解非淀粉多糖的酶类，包括纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶等，这些酶可以有效降解饲料中的NSP，提高饲料营养价值并改善动物生长性能。多糖酶解产生寡糖可以进一步刺激和增强动物的免疫反应，调控动物胃肠道微生态环境。饲料中非淀粉多糖的降解往往需要多种酶的复合作用，比如纤维素酶(CMCase)、半纤维素酶(β-1,3-1,4-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶)共同作用。但是，复合酶的添加增加了饲料使用的成本，成为限制其广泛应用的一个重要因素。多功能酶(一种酶同时具有两种或以上功能)的研究与应用无疑是简化饲料加工工艺、降低饲料成本的有效途径。获得单催化域酶催化两种甚至多种底物的多功能酶，或者利用分子改良拓宽酶高效作用底物的范围，获得功能多样性的高效NSP酶意义重大。
截至目前，研究人员利用各种策略尝试获得多功能酶。除了通过大量筛选获得具有多种降解功能的天然酶外，利用蛋白质工程手段对酶分子进行改良也是目前酶工程领域的研究热点。然而，虽然“随机”的突变方式不需要研究者充分了解蛋白质的结构与性质，但通常工作量巨大，且阳性突变率较低。并且，在对大多数酶的结构与功能关系认知有限的情况下，对酶突变位点的设计收到制约。
发明内容
本发明的目的是提供一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体。
本发明的再一目的是提供编码上述转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
野生型纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。野生型纤维素酶基因的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。对氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的野生型纤维素酶的N100位点实施定点突变获得N100V突变体，所述转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
编码上述突变体的基因的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还是提供一种制备转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体的方法，包括以下步骤：
1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
3）回收并纯化所表达的底物特异性改变的纤维素酶RMX-M。
本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的野生型纤维素酶的N105位点实施定点突变获得N100V突变体，将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，通过对小管水平的发酵液进行酶活测定初步筛选阳性转化子。对酶活最高的转化子进行大瓶诱导，并对粗酶液进行蛋白浓缩及纯化。利用SDS-PAGE电泳检测纯化后突变体和野生型的纯度。以纯化后的蛋白为对象，利用DNS法测定野生型与突变体的基本酶学性质。结果表明，以两种底物测定时，酶促反应的最适pH值不变，最适温度提高5℃；以角豆胶为底物时，突变体的甘露聚糖比活力比野生型提高了约630%。
本发明证明并确认了所提供的甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体，对于研究材料RMX的底物特异性改良提供了重要的线索，同时对于提高该家族的其他纤维素酶的分子改良提供了参考。
附图说明
图1显示甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体与野生型的最适pH；
图2显示甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体与野生型的最适温度；
图3为甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体与野生型的比活比较图；
图4显示野生型甘露聚糖酶的序列；
图5显示甘露聚糖酶突变体的序列。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。
2、生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司，连接酶购自Promaga公司，点突变试剂盒购自全式金公司，羧甲基纤维素钠购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3、培养基：
LB培养基：0.5% 酵母提取物，1% 蛋白胨，1% NaCl， pH 7.0
YPD培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖
MD固体培养基：2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34% YNB，0.00004% Biotin
BMGY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1% 甘油(V/V)，1.34% YNB，0.00004%Biotin。
BMMY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，0.5%甲醇(V/V)。
4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1底物特异性改变的纤维素酶突变体重组载体pPIC9r-RMX-M的制备
将纤维素酶野生型（突变前）序列片段（去除信号肽）克隆到表达载体pPIC-9r上，重组载体命名pPIC9r-RMX；以重组载体pPIC9r-RMX为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为pPIC9r-RMX-M。图4显示野生型甘露聚糖酶的序列；图5显示甘露聚糖酶突变体的序列。
表1. 底物特异性改变的纤维素酶突变体RMX-M特异性引物
Primers Sequences (5'®3') <sup><i>a</i></sup> Size (bp)
RMX-N105V-F TGCTTACATGATGATTgtcCCACACAACTACG 32
RMX-N105V-R gacAATCATCATGTAAGCACCCTTACCAGTA 31
实施例2底物特异性改变的纤维素酶突变体的制备。
（1）甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体RMX-M在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
将获得的含有底物特异性改变的突变体基因RMX-M的重组质粒pPIC9r-RMX-M转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/RMX-M。 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，置于30℃，220 rpm摇床培养48 h；培养液4000 g离心5min，弃上清，沉淀用200 mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220 rpm条件下诱导培养。每隔12 h补加1 mL甲醇，同时取上清用于酶活性检测。
（2）重组纤维素酶的纯化
收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10 kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，最后剩余约20 ml蛋白浓缩液。浓缩到一定倍数的重组纤维素酶RMX-M，利用离子交换层析法进行纯化。具体地，取纤维素酶RMX及突变体RMX-M浓缩液10.0mL经预先用10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡过的HiTrap Q HP阴离子柱，然后用含有1mol/L 的NaCl的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)进行线性梯度洗脱，利用DNS法对梯度洗脱的蛋白液进行酶活性检测，同时利用SDS-PAGE凝胶电泳对梯度洗脱的蛋白液进行纯度的检测。
实施例3重组甘露聚糖酶活提高的纤维素酶突变体和野生型的活性分析
采用二硝基水杨酸（DNS）法测定重组纤维素酶RMX及突变体RMX-M的基本酶学性质。具体方法如下：在pH 5.0，75 ℃条件下，1 mL的反应体系包括100 µL适当的稀释酶液，900 µL底物，反应10 min，加入1.5 mL DNS终止反应；沸水浴煮5 min后冷却至室温，在540nm波长下测定OD值。甘露聚糖酶测定方法同纤维素酶。内切纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 葡萄糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 甘露糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。酶学性质研究所用酶液均需达到电泳纯。
（1）最适pH分析比较
经纯化的(实施例2)表达的纤维素酶RMX及突变体RMX-M在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-7.0的柠檬酸—磷酸氢二钠系列缓冲体系。纯化的纤维素酶RMX及突变体RMX-M在不同pH的缓冲体系、75 ℃下以羧甲基纤维素钠及角豆胶为底物，测定的最适pH结果（图1）表明：RMX和RMX-M的最适pH均为5.0。
（2）最适温度分析比较
纯化的纤维素酶在各自最适pH条件下，以羧甲基纤维素钠及角豆胶为底物，测定不同温度（20-80℃）下的酶活性，分析实验结果（图2）表明显示，RMX和RMX-M最适温度分别为75℃和70℃。
（3）比活分析比较
纯化后（实施例2）的纤维素酶野生型RMX与突变体RMX-M在pH5.0，75℃和pH5.0，80℃件下以羧甲基纤维素钠及角豆胶进行酶促反应以测定其酶活性。
比活测定结果如图3所示，在以羧甲基纤维素钠为底物时，野生型RMX的纤维素比活为1214 U/mg，突变体RMX-M的比活为229 U/mg，较野生型降低约80%；在以角豆胶为底物时，野生型RMX的甘露聚糖比活为251 U/mg，突变体RMX-M的比活为1579 U/mg，较野生型提高了约630%，实现了纤维素与甘露聚糖酶活的转换。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种转换纤维素与甘露聚糖活力的纤维素酶突变体及其基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Pro Glu Ser Ser Leu Asp Lys Arg Ala Gly Asn Phe Lys Phe Phe
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ala Gly Pro Glu Phe Gly Asn Gln Asn Leu Pro Gly
20 25 30
Val Tyr Asn Lys Asp Tyr Val Phe Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Asp Thr
35 40 45
Phe Ile Ser Lys Gly Phe Asn Thr Phe Arg Leu Asn Ile Gln Met Glu
50 55 60
Arg Leu Ala Pro Asn Ala Ile Asn Gly Asn Leu Asp Thr Thr Tyr Leu
65 70 75 80
Asn Met Ile Lys Glu Gln Val Asn Tyr Val Thr Gly Lys Gly Ala Tyr
85 90 95
Met Met Ile Asn Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Gln Ile Tyr
100 105 110
Arg Asp Thr Gln Ser Phe Gly Gln Phe Trp Ala His Leu Ala Gln Glu
115 120 125
Phe Lys Ser Asn Ser Arg Val Ile Phe Asp Thr Asp Asn Glu Phe His
130 135 140
Asp Glu Pro Gly Gln Leu Val Ala Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn
145 150 155 160
Ala Ile Arg Ala Thr Gly Ala Thr Asn Gln Tyr Ile Ala Val Glu Gly
165 170 175
Asn Ala Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ala Lys Gly Thr Asp
180 185 190
Gly Leu Thr Asn Ala Gln Thr Met Gly Asn Leu Lys Asp Pro Ser Asn
195 200 205
Lys Ile Leu Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Thr Thr Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Ser Glu Arg Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ala Thr Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Leu Leu Gly
245 250 255
Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asn Pro Thr Cys Gln Ala Ala Val Lys Asp
260 265 270
Met Leu Ser Tyr Met Val Lys Asn Lys Asp Val Trp Glu Gly Ala Val
275 280 285
Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Phe Ser Ile Glu
290 295 300
Pro Thr Asn Gly Pro Ala Tyr Asn Thr Tyr Val Pro Leu Ile Thr Gln
305 310 315 320
Tyr Ala
<210> 2
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgctccag ctccagaatc ttctttggat aagagagccg gcaactttaa gtttttcggc 60
gtcaacgaag ctggtccaga atttggtaac caaaacttgc caggtgttta caacaaggat 120
tacgttttcc caaccttgtc tacttacgac acctttatct ctaagggctt caacaccttt 180
cgtttgaaca tccagatgga aagattggct ccaaacgcta ttaacggtaa cttggacact 240
acttacttga acatgattaa ggagcaggtc aactacgtta ctggtaaggg tgcttacatg 300
atgattaacc cacacaacta cggtagatac tacggtcaaa tctacagaga tactcagtcc 360
tttggtcagt tttgggctca tttggcccaa gaatttaagt ctaactcccg tgtcattttt 420
gacactgaca acgagtttca tgatgaacca ggtcaattgg ttgctgattt gaaccaagct 480
gccattaacg ctattagagc tactggtgct actaaccaat acattgctgt tgaaggtaac 540
gcttggactg gtgcttggac ttggactact gctaagggta ctgatggttt gactaacgct 600
caaactatgg gtaacttgaa ggatccatcc aacaagatat tgtacgagat gcaccaatac 660
ttggattctg atggttctgg tacttctact acttgtgtct cctctactat cggttctgaa 720
agattgaagg ctgctactca atggttgaga gctaacggta agaagggttt gttgggtgaa 780
tacgctggtg ctgttaaccc aacttgtcaa gctgctgtta aggatatgtt gtcctacatg 840
gtcaagaaca aggatgtttg ggaaggtgct gtttggtggg ctgctggtcc atggtggggt 900
gattacatgt tctccattga accaactaac ggtccagctt acaacactta cgttccattg 960
atcactcaat acgcc 975
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Claims (8)

1.一种纤维素酶突变体，其特征在于，通过定点突变氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶100位Asn为 Val得到所述突变体。
2.一种纤维素酶基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的纤维素酶突变体。
3.根据权利要求2所述的纤维素酶基因，其特征在于，所述纤维素酶基因的核酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.包含权利要求2所述的纤维素酶基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述的纤维素酶基因的重组菌株。
6.一种制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
以权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞；
诱导表达纤维素酶；
分离并纯化所述纤维素酶。
7.权利要求1所述的纤维素酶突变体用于水解角豆胶或羧甲基纤维素钠的应用。
8.权利要求1所述的纤维素酶突变体作为饲料添加剂的应用。
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