CN107488221A

CN107488221A - 真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用

Info

Publication number: CN107488221A
Application number: CN201710269769.7A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 罗会颖; 郑菲; 涂涛; 苏小运; 黄火清; 王苑; 柏映国; 王亚茹; 孟昆
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-04-24
Also published as: CN107488221B

Abstract

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及真菌来源的膨胀素及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一个新的膨胀素蛋白，其具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产适合工业应用的膨胀素蛋白。

Description

真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及真菌来源的膨胀素及其基因和应用。

背景技术

纤维素酶在降解纤维素时首先通过其内部的结合结构域结合在纤维素上，然后通过纤维素内切和外切酶进行降解。

膨胀素(Expansin)能缓释细胞壁结构网中的张力，使细胞壁变得松弛。里氏木霉中的膨胀素是真菌中最早确认的膨胀因子，具有在微生物宿主中异源表达的优势，能够通过微生物发酵提高Swollenin的产量，从而满足应用需要。研究表明，Swollenin并不水解纤维素分子内的糖苷键，但具有类似纤维素酶的CBD结合结构域和类似植物膨胀素的序列。为了利用Swollenin对纤维素的膨胀和崩解效应，提高纤维素酶的作用效率，越来越多的微生物来源的Swollenin被表达并进行深入研究。

丝状真菌的Swollenin通过与纤维素酶之间的协同作用，在有效转化木质纤维素类生物质底物，提高发酵生产的经济效益方面，将会有重要作用。Swollenin的发现与研究，将为微生物降解木质纤维素的机制的研究与纤维素降解理论提供了新的视角，同时也将为蛋白质的结构与功能的研究提供一个新的例子。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸性、广泛底物特异性的膨胀素蛋白。

本发明的再一目的是提供上述膨胀素蛋白的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述膨胀素蛋白的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述膨胀素基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备膨胀素蛋白的方法。

本发明的再一目的是提供上述膨胀素蛋白的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的膨胀素的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，该酶全长503个氨基酸，N端21个氨基酸为信号肽序列“MSRLLLGIGLCGLLAHVAVAQ”。

因此，成熟的膨胀素蛋白的理论分子量为51.1kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

该膨胀素蛋白的最适pH为3.0，在pH 2.2-pH 5.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力；最适温度50℃，在70℃时依然具有30％以上的酶活力，在37℃和50℃下处理60min，剩余酶活在80％以上，在60℃下处理60min，依然能够保持65％的酶活力，具有良好的稳定性。

本发明还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了这个膨胀素基因swo，DNA全序列分析结果表明，膨胀素蛋白SWO结构基因全长1908bp，含有6个内含子，+84～151bp,+258-312,+665-766,+814-867,+1078-1040,+1325-1378为其内含子序列，cDNA长1512bp，其cDNA序列如SEQ IDNO.4所示：

其中，信号肽的碱基序列为：

“ATGTCTCGCC TCTTGCTTGG GATCGGCCTA TGCGGCCTGC TCGCTCACGT TGCAGTCGCT CAG”

因此，成熟基因的编码序列为

SEQ ID NO.5所示：

成熟蛋白理论分子量为51.1kDa。将膨胀素基因sow cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，确定SWO是一种新的膨胀素蛋白。

本发明还提供了包含上述膨胀素基因的重组载体，优选为pPIC9-swo。将本发明的膨胀素基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将膨胀素基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-swo。

本发明还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/swo。

本发明还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的纤维素酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/swo。

本发明还提供了上述膨胀素蛋白的应用。运用基因工程手段来产业化生产膨胀素蛋白。本发明提供了一个新的膨胀素基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的膨胀素蛋白。

附图说明

图1本发明重组膨胀素蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图2本发明的膨胀素蛋白基本性质图。

图3本发明膨胀素蛋白对聚糖降解的HPLC图。

图4本发明膨胀素蛋白对纤维寡糖降解的HPLC图。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L CaCl₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。

(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1膨胀素蛋白编码基因swo的克隆

提取Talaromyces leycettanus JCM12802基因组DNA，以提取的基因组为模板，以swo-F和swo-R(见表1)为引物扩增膨胀素基因。获得swo的DNA序列，扩增得到产物回收后送睿博生物技术有限公司测序。

表1本实验所需的引物

实施例2膨胀素基因cDNA的获得

提取Talaromyces leycettanus JCM12802总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物swo-F和swo-R(见表1)，扩增该单链cDNA，获得纤维素酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送睿博生物技术有限公司测序。

通过对膨胀素蛋白的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有6个内含子，cDNA长1512bp，编码503个氨基酸和一个终止密码子，N端21个氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从Talaromyces leycettanus JCM12802中分离克隆得到的膨胀素蛋白的基因为新基因。

实施例3纤维素酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的膨胀素蛋白SWO的cDNA为模板，设计合成了带有SnaB I和Not I限制性酶切位点的引物swo-f和swo-r(见表1)，对SWO的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用SnaB I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen,San Diego)，膨胀素成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-swo，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样的方式构建含SWO信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。

(2)高活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例4重组膨胀素蛋白的制备

(1)膨胀素蛋白SWO在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

(2)重组膨胀素蛋白的纯化

收集摇瓶表达的重组膨胀素蛋白上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组SWO，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取SWO浓缩液2.0mL经预先用10mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测活性和进行蛋白浓度的测定。

SDS-PAGE结果(图1)表明，重组膨胀素蛋白在毕赤酵母中得到了表达。所表达的重组膨胀素蛋白经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例5重组膨胀素蛋白性质分析

采用DNS法对本发明的膨胀素蛋白进行活性分析。具体方法如下：在pH 3.0，50℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0rnin，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。

(1)膨胀素蛋白SWO的最适pH及pH稳定性

经纯化的实施例4表达的膨胀素蛋白SWO在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.2～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液。所用底物为CMC-Na。纯化的膨胀素蛋白SWO在不同pH的缓冲体系，50℃下测定的pH适性结果(图2，a)表明：SWO的最适pH为3.0，在pH 2.2-pH 5.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。所用缓冲液为pH 1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH 3.0～8.0柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液,pH 8.0～l0.0Tris-HCl系列缓冲液,pH 9.0～l2.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。结果表明(图2，b)，分析结果表明pH 2.0-pH 12.0之间能够维持60％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

(2)膨胀素蛋白SWO反应最适温度及热稳定性

纯化的膨胀素蛋白在pH 3.0条件下，测定不同温度(30-90℃)下的蛋白活性，分析实验结果表明显示，该蛋白的最适反应温度为50℃，在70℃时依然具有35％以上的酶活力(图2，c)。耐温性测定为膨胀素蛋白在不同温度下处理不同时间，再在最适温度下测定剩余活力。热稳定性实验表明：该蛋白在37℃和50℃下处理60min，剩余酶活在80％以上，即使该酶在60℃下处理60min，依然能够保持60％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性(图2，d)。

(3)膨胀素蛋白SWO底物特异性

纯化的膨胀素蛋白SWO在pH 3.0，37℃条件下与CMC-Na,大麦葡聚糖，昆布多糖，地衣多糖，葡甘露聚糖，可溶性淀粉，木聚糖，微晶纤维素，角豆胶，木葡聚糖等不同的底物混合孵育12小时，发现SWO能够降解CMC-Na,大麦葡聚糖，昆布多糖，葡甘露聚糖，地衣多糖，木葡聚糖。将反应产物进行HPLC分析。HPLC结果(图3)表明，SWO能将将CMC-Na，葡甘露聚糖降解成纤维二糖，将大麦葡聚糖、地衣多糖主要降解成纤维二糖、五糖。

(4)膨胀素蛋白SWO对纤维寡糖的降解产物分析

纯化的膨胀素蛋白SWO在pH 3.0，37℃条件下纤维二糖、三糖、四糖、五糖、六糖分别反应30min和12h，利用HPLC对产物进行分析。HPLC结果(图4)表明，SWO能将纤维四糖主要降解成二糖；将纤维五糖主要降解成二糖和三糖；将纤维六糖主要降解成二，三，四糖。综上，该膨胀素蛋白展现出较高的内切酶活性，同时具有微弱的外切酶活性。

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120>真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用

<160>5

<210> 1

<211> 503

<212> PRT

<213> Talaromyces leycettanus JCM12802

<400> 1

MSRLLLGIGL CGLLAHVAVA QSSCAGTWAQ CGGINFSGPT CCQSGSICVS VNPYYYQCTP 60

GTQAPTSSTS TTVSTSTRTS SVSTTSVPTS HTTSTTSVTS SVSSVAGSSI YTTSTTFASP 120

TATQVPYPSA DPSTCGDWAL VDNVCCPYYC LSNNQSETCT SPCSGGCGSP DSSMCKSGTM 180

WGEQHTVGTD EEWHYSRSTH FGLTSGGACG FGLYALCTSS SESWVDTMLG TTCEAFCTAY 240

PLLCQDPANV TMRGNFAAPN GDYYTQFWPS LATEGNPDNY LSCGECFELV RTKPDGTDYA 300

VGEDGYTDPI YLEVVDSCPC DANSKWCCGS GADHCGEIDF TYGCPLPEGS HHMDLSDIAM 360

GRLQGNGSLA EGVIPIRYKR VPCPKPGNVY IWLRDGGGPY YFALTAVNTN GVGSVTSIEV 420

KGAGQTTWTP LEHDPNYTSS RPQERYGAWV IPQGSGPFNP PIGVRLTSPN GQQIVNEAAI 480

TSFTPPASAI TGYWYIDIGV QFT 503

<210> 2

<211> 483

<212> PRT

<213> Talaromyces leycettanus JCM12802

<400> 2

QSSCAGTWAQ CGGINFSGPT CCQSGSICVS VNPYYYQCTP GTQAPTSSTS TTVSTSTRTS 60

SVSTTSVPTS HTTSTTSVTS SVSSVAGSSI YTTSTTFASP TATQVPYPSA DPSTCGDWAL 120

VDNVCCPYYC LSNNQSETCT SPCSGGCGSP DSSMCKSGTM WGEQHTVGTD EEWHYSRSTH 180

FGLTSGGACG FGLYALCTSS SESWVDTMLG TTCEAFCTAY PLLCQDPANV TMRGNFAAPN 240

GDYYTQFWPS LATEGNPDNY LSCGECFELV RTKPDGTDYA VGEDGYTDPI YLEVVDSCPC 300

DANSKWCCGS GADHCGEIDF TYGCPLPEGS HHMDLSDIAM GRLQGNGSLA EGVIPIRYKR 360

VPCPKPGNVY IWLRDGGGPY YFALTAVNTN GVGSVTSIEV KGAGQTTWTP LEHDPNYTSS 420

RPQERYGAWV IPQGSGPFNP PIGVRLTSPN GQQIVNEAAI TSFTPPASAI TGYWYIDIGV 480

QFT 483

<210> 3

<211> 1908

<212> DNA

<213> Talaromyces leycettanus JCM12802

<400> 3

atgtctcgcc tcttgcttgg gatcggccta tgcggcctgc tcgctcacgt tgcagtcgct 60

cagagcagct gtgcagggac ctggtgagtt gcggcccttc gatacaccgt cgatcgatcg 120

atctctctgc taaagggtgc tttctggcca gggctcaatg cggtggaatc aatttcagcg 180

gaccgacttg ttgccagagt ggcagcatct gcgtgtcagt caatccgtac tactaccagt 240

gtactccagg gacccaggta cgcacgtagt caacacccaa catatatcat ggcgttatct 300

cacagggcct aggcaccgac ctcgtcgacg tccaccaccg tgtccacctc gacgagaact 360

tcttcagttt ccacaactag tgtgccaacc tctcacacaa cttccaccac gtcagtgaca 420

agttctgtaa gttctgtggc cggctcgtcc atctacacta cgtcgacgac tttcgccagt 480

ccgacggcaa cacaggtgcc atacccatcg gcggacccca gcacgtgtgg cgactgggct 540

cttgtcgata atgtctgctg cccgtattac tgcctttcca acaaccaatc cgaaacctgc 600

accagtccct gcagcggtgg atgtggaagt cccgactcgt ccatgtgcaa atccggaacc 660

atgtgtgagt cttgagcttt gctccttgat accctcacgt cctttcccgt cttccaccat 720

ctggttatac tgctggaact gtacatgaga tctaacagtc atgtaggggg agagcagcat 780

acagtaggga cggatgaaga gtggcactac agtgtaagcg gtcatgatcc gaaatcagag 840

catccttccg tactgatatg aacgcagcgt tcgacccatt tcggtctcac tagcggcggt 900

gcctgtggct ttggacttta tgcattatgc accagttcat cagagagctg ggttgacacg 960

atgctgggaa ccacctgcga agccttttgc acggcgtacc cgcttctctg ccaagatccc 1020

gccaatgtca ccatgagagg caactttgcc gctccaaatg gtgattacta cactcaggta 1080

cgtagccgtt cagcagcgtc cggtctctga aacccccctg tcctaacctg cctgtcacag 1140

ttctggccat cgcttgccac tgaaggcaac ccggataact atctctcctg cggcgaatgc 1200

ttcgaactgg tccgcaccaa gccggacggc acggactacg ctgttggtga ggatggatat 1260

accgatccca tctacctcga ggtcgtcgat agctgtccct gcgatgcgaa ttcgaagtgg 1320

tgctgtaagt aacccagcgt catccagtcg tgattgcctg ccgctaactc ttgaccaggc 1380

ggctccggtg ccgatcattg cggagaaatc gacttcacat acggctgccc gctgcccgag 1440

gggagccatc atatggacct ttccgacatc gccatgggcc gattgcaagg aaacggaagc 1500

ctggcggaag gcgtcatccc catccggtat aagcgcgttc cctgccccaa gcccggcaac 1560

gtctatatct ggctgcgcga cggcggtgga ccgtattact ttgcgctcac cgccgtcaac 1620

acgaatggcg tcgggtcggt gaccagcatt gaagtcaagg gagccggaca gaccacctgg 1680

accccgcttg agcatgaccc gaactacacc agcagccggc cacaggaacg atacggtgct 1740

tgggtgattc cccagggctc cgggccattc aacccaccca tcggggttcg actgacttct 1800

ccgaacgggc agcagattgt caatgaggct gccatcacct catttacacc gccagcgagc 1860

gccatcaccg gatactggta tatcgatatc ggggtgcagt ttacctga 1908

<210> 4

<211> 1512

<212> DNA

<213> Talaromyces leycettanus JCM12802

<400> 4

atgtctcgcc tcttgcttgg gatcggccta tgcggcctgc tcgctcacgt tgcagtcgct 60

cagagcagct gtgcagggac ctgggctcaa tgcggtggaa tcaatttcag cggaccgact 120

tgttgccaga gtggcagcat ctgcgtgtca gtcaatccgt actactacca gtgtactcca 180

gggacccagg caccgacctc gtcgacgtcc accaccgtgt ccacctcgac gagaacttct 240

tcagtttcca caactagtgt gccaacctct cacacaactt ccaccacgtc agtgacaagt 300

tctgtaagtt ctgtggccgg ctcgtccatc tacactacgt cgacgacttt cgccagtccg 360

acggcaacac aggtgccata cccatcggcg gaccccagca cgtgtggcga ctgggctctt 420

gtcgataatg tctgctgccc gtattactgc ctttccaaca accaatccga aacctgcacc 480

agtccctgca gcggtggatg tggaagtccc gactcgtcca tgtgcaaatc cggaaccatg 540

tggggagagc agcatacagt agggacggat gaagagtggc actacagtcg ttcgacccat 600

ttcggtctca ctagcggcgg tgcctgtggc tttggacttt atgcattatg caccagttca 660

tcagagagct gggttgacac gatgctggga accacctgcg aagccttttg cacggcgtac 720

ccgcttctct gccaagatcc cgccaatgtc accatgagag gcaactttgc cgctccaaat 780

ggtgattact acactcagtt ctggccatcg cttgccactg aaggcaaccc ggataactat 840

ctctcctgcg gcgaatgctt cgaactggtc cgcaccaagc cggacggcac ggactacgct 900

gttggtgagg atggatatac cgatcccatc tacctcgagg tcgtcgatag ctgtccctgc 960

gatgcgaatt cgaagtggtg ctgcggctcc ggtgccgatc attgcggaga aatcgacttc 1020

acatacggct gcccgctgcc cgaggggagc catcatatgg acctttccga catcgccatg 1080

ggccgattgc aaggaaacgg aagcctggcg gaaggcgtca tccccatccg gtataagcgc 1140

gttccctgcc ccaagcccgg caacgtctat atctggctgc gcgacggcgg tggaccgtat 1200

tactttgcgc tcaccgccgt caacacgaat ggcgtcgggt cggtgaccag cattgaagtc 1260

aagggagccg gacagaccac ctggaccccg cttgagcatg acccgaacta caccagcagc 1320

cggccacagg aacgatacgg tgcttgggtg attccccagg gctccgggcc attcaaccca 1380

cccatcgggg ttcgactgac ttctccgaac gggcagcaga ttgtcaatga ggctgccatc 1440

acctcattta caccgccagc gagcgccatc accggatact ggtatatcga tatcggggtg 1500

cagtttacct ga 1512

<210> 5

<211> 1452

<212> DNA

<213> Talaromyces leycettanus JCM12802

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tgttgccaga gtggcagcat ctgcgtgtca gtcaatccgt actactacca gtgtactcca 120

gggacccagg caccgacctc gtcgacgtcc accaccgtgt ccacctcgac gagaacttct 180

tcagtttcca caactagtgt gccaacctct cacacaactt ccaccacgtc agtgacaagt 240

tctgtaagtt ctgtggccgg ctcgtccatc tacactacgt cgacgacttt cgccagtccg 300

acggcaacac aggtgccata cccatcggcg gaccccagca cgtgtggcga ctgggctctt 360

gtcgataatg tctgctgccc gtattactgc ctttccaaca accaatccga aacctgcacc 420

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tggggagagc agcatacagt agggacggat gaagagtggc actacagtcg ttcgacccat 540

ttcggtctca ctagcggcgg tgcctgtggc tttggacttt atgcattatg caccagttca 600

tcagagagct gggttgacac gatgctggga accacctgcg aagccttttg cacggcgtac 660

ccgcttctct gccaagatcc cgccaatgtc accatgagag gcaactttgc cgctccaaat 720

ggtgattact acactcagtt ctggccatcg cttgccactg aaggcaaccc ggataactat 780

ctctcctgcg gcgaatgctt cgaactggtc cgcaccaagc cggacggcac ggactacgct 840

gttggtgagg atggatatac cgatcccatc tacctcgagg tcgtcgatag ctgtccctgc 900

gatgcgaatt cgaagtggtg ctgcggctcc ggtgccgatc attgcggaga aatcgacttc 960

acatacggct gcccgctgcc cgaggggagc catcatatgg acctttccga catcgccatg 1020

ggccgattgc aaggaaacgg aagcctggcg gaaggcgtca tccccatccg gtataagcgc 1080

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tactttgcgc tcaccgccgt caacacgaat ggcgtcgggt cggtgaccag cattgaagtc 1200

aagggagccg gacagaccac ctggaccccg cttgagcatg acccgaacta caccagcagc 1260

cggccacagg aacgatacgg tgcttgggtg attccccagg gctccgggcc attcaaccca 1320

cccatcgggg ttcgactgac ttctccgaac gggcagcaga ttgtcaatga ggctgccatc 1380

acctcattta caccgccagc gagcgccatc accggatact ggtatatcga tatcggggtg 1440

cagtttacct ga 1452

Claims

1.一种膨胀素蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种膨胀素基因，其特征在于，编码权利要求1所述的膨胀素蛋白。

3.根据权利要求2所述的膨胀素基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述膨胀素基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述膨胀素基因的重组表达载体pPIC9-sow。

6.包含权利要求2所述膨胀素基因的重组菌株。

7.包含权利要求2所述膨胀素基因的重组菌株GS115/Cel5。

8.一种制备膨胀素蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞；

(2)培养宿主细胞；

(3)分离纯化获得膨胀素蛋白。

9.权利要求1所述膨胀素蛋白的应用。