CN102816752B - 一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用。本发明提供的蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维二糖水解酶活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明从木霉（Trichoderma sp.）菌株BM48-3中克隆得到了一个新的纤维二糖水解酶基因Tccel7A/cTccel7A，可在宿主细胞中表达该基因以生产纤维二糖水解酶，用于纤维素的降解。

Description

一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用。

背景技术

纤维素主要是植物利用二氧化碳和水在太阳光能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素（Zhang PYH,Lynd LR.2004.Toward an aggregated understanding of enzymatichydrolysis of cellulose:noncomplexed cellulase systems.Biotechnology andBioengineering,88:797-824)。

纤维素的降解通过纤维素酶的作用实现。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶[cellobiohydrolase,EC3.2.1.91;又叫外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase)]和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3.2.1.21)（Zhang PYH,Himmel ME,Mielenz JR.2006.Outlook for cellulase improvement:screening and selectionstrategies.Biotechnol Advan,24:452-481）。

内切-1,4-β-D-葡聚糖酶（以下简称内切葡聚糖酶）作用于纤维素分子内部，随机水解纤维素分子内的β-1,4-糖苷键，产生短的纤维素链，暴露出新的纤维素末端。纤维二糖水解酶以有序方式（processive manner），沿着纤维素末端（还原端或非还原端）由外向内水解β-1,4-糖苷键，释放纤维二糖；此外，纤维二糖水解酶也作用于结晶纤维素，将纤维素长链从结晶区中剥离出来（Teeri TT.1997.Crystalline cellulosedegradation:new insight into the function of cellobiohydrolase.Trends Biotechnol，1997,15:160-167）。β-葡萄糖苷酶将纤维二糖或其它可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子，可消除纤维二糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的反馈抑制。在这三类酶的协同作用下，纤维素最终被水解为葡萄糖(Lynd LR,Weimer PJ,Willem H Z,et al.2002.Microbialcellulose utilization:fundamentals and biotechnology.Microbiol Mol Biol Rev，66：506-577；Zhang YH,Lynd LR.2004.Toward an aggregated understanding of enzymatichydrolysis of cellulose:noncomplexed cellulase systems.Biotechnology andBioengineering,88:797-824)。

微生物是纤维素酶最主要的来源。目前,用于生产纤维素酶较多和研究最透彻的微生物是丝状真菌（孟雷,陈冠军,王怡等.2002,纤维素酶的多型性.纤维素科学与技术,10:47-55）。其中纤维素酶活力较强的主要为来自曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、木霉（Trichoderma）和青霉（Pinicielium）属的菌株，尤以木霉属菌株居多、活力最高,较为典型的有瑞氏木霉（Trichoderma reesei)、绿色木霉（Trichoderma viride）、康宁木霉（Trichoderma koningii)，其中瑞氏木霉Rut-C30是目前公认的最好的纤维素酶生产菌株(Martins LF,Kolling D,Camassola M,et al.2008.Comparison of Penicillium echinulatum and Trichoderma reesei cellulases in relationto their activity against various cellulosic substrates.Bioresource Technology，99:1217-1224;Gusakov AV.2011.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production.Trends Biotechnology，29:419-425;Le Crom S,Schackwitz W，Pennacchio L,et al.2009.Tracking the roots of cellulase hyperproduction by the fungus Trichoderma reesei usingmassively parallel DNA sequencing.Proc NatlAcad Sci USA,106:16151-16156)。

在木霉的天然纤维素酶系中，纤维二糖水解酶占的比重很大，占到60%～80%。其中纤维二糖水解酶I（cellobiohydrolase I，CBH Ⅰ）占50～60%，纤维二糖水解酶II（cellobiohydrolase Ⅱ,CBH Ⅱ）占20%左右（Markov AV，Gusakov AV，Kondratyeva EG，etal.2005.New effective method for analysis of the component composition of enzymecomplexes from Trichoderma reesei.Biochemistry，70:657-663）。纤维二糖水解酶在纤维素酶对结晶纤维素的水解过程中起非常重要的作用（Lynd LR,Weimer PJ,Willem HZ,et al.2002.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology.MicrobiolMol Biol Rev，66:506-577）。对纤维二糖水解酶I的研究，对于高效地降解天然纤维素中的结晶纤维素具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因。

本发明提供的蛋白，为纤维二糖水解酶，命名为Tccel7A，来源于奶油木霉（Trichoderma cremeum）菌株BM48-3，是如下（a）或（b）或（c）的蛋白质：

（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3自N末端第18-509位氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维二糖水解酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列3由509个氨基酸残基组成，为了便于蛋白质的分泌表达，还可在蛋白的氨基末端添加上信号肽序列。该蛋白自氨基末端（N端）第1-17位氨基酸残基为信号肽（signal peptide）序列。

上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使（a）中的TcCel7A便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.为标签的序列

上述（b）或（c）中的Tccel7A可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的Tccel7A的编码基因可通过将序列表中序列2的自5端第1至1527位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因Tccel7A/cTccel7A也属于本发明的保护范围。

上述基因可为如下1）-5）中任一所示的基因：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列2自5′末端第52-1527位核苷酸所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码具有纤维二糖水解酶活性蛋白的DNA分子；

5）与1）或2）或3）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有纤维二糖水解酶活性蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。

上述序列表中的序列1由1653个脱氧核糖核苷酸组成，为Tccel7A的基因组基因，含有3个外显子和2个内含子，自5′端的第1至451位核苷酸为Tccel7A的外显子1，自5′端的第452至512位核苷酸为Tccel7A的内含子1，自5′端的第513至1207位核苷酸为Tccel7A的外显子2，自5′端的第1208至1269位核苷酸为Tccel7A的内含子2，自5′端的第1270至1651位核苷酸为Tccel7A的外显子3，自5′端的第1651至1653位核苷酸为Tccel7A的终止密码子TAA。

上述序列表中的序列2由1530个脱氧核糖核苷酸组成，为Tccel7A的cDNA基因(cTccel7A)，自5′端的第1至1530位核苷酸为cTccel7A的开放阅读框（Open ReadingFrame，ORF），自5′端的第1-3位核苷酸为cTccel7A的起始密码子ATG，自5′端的第1528-1530位核苷酸为cTccel7A的终止密码子TAA，自5′端的第1-51位核苷酸为编码信号肽的核苷酸。

含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

上述重组表达载体为将编码上述蛋白的基因插入表达载体，得到表达所述蛋白的重组表达载体；上述表达载体可为在巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达的pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。重组表达载体具体为在pPIC9K的AvrⅡ和NotⅠ酶切位点间插入序列表中的序列2的自5′端第52至1527位脱氧核苷酸得到的重组表达载体pGXN9K4831。

上述重组菌为将所述重组表达载体导入宿主菌中，得到的重组菌；所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌；所述酵母菌具体可为巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115，KM71（可购自美国Invitrogen公司）或SMD1168（可购自美国Invitrogen公司）。本实施例为GXN9K4831-16，宿主菌为巴氏毕赤酵母GS115。

扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白在作为纤维二糖水解酶中的应用也是本发明保护的范围。

上述基因或上述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备纤维二糖水解酶中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备纤维二糖水解酶的方法。

本发明提供方法，为发酵上述的重组菌，即得到纤维二糖水解酶。

上述方法中，所述发酵的培养基为BMMY培养基；

所述发酵为在甲醇诱导下进行，甲醇在发酵体系中的终浓度可为0.5-1.0％（体积百分含量）。

所述发酵具体为将重组菌GXN9K4831-16在BMMY培养基中28℃、250rpm振荡培养；且每12h向培养产物中加入甲醇，前24h加入甲醇至终浓度1%（体积百分含量），24h以后加入甲醇至终浓度1.5%（体积百分含量）；共振荡培养60h，得到纤维二糖水解酶Tccel7A。

本发明的实验证明，本发明从奶油木霉（Trichoderma cremeum）菌株BM48-3中克隆得到了一个新的纤维二糖水解酶基因Tccel7A/cTccel7A，可在宿主细胞中表达该基因以生产纤维二糖水解酶Tccel7A，用于纤维素的降解。对该纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活相关分析，其酶促反应的最适pH为5.0、最适温度为45℃；在最适pH和最适温度下，该酶对底物对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(p-nitrophenyl β-D-cellobioside,pNPC)的比活力为0.62U/mg；而且1mMol/L的Ca²⁺可以把纤维二糖水解酶Tccel7A的活性提高16.08%，达到0.72U/mg。

附图说明

图1为提取的木霉BM48-3基因组DNA电泳图。

图2为含有木霉BM48-3的全长Tccel7A基因的PCR产物电泳图。

图3为提取的木霉BM48-3的总RNA电泳图。

图4为含有木霉BM48-3的全长Tccel7A cDNA基因(cTccel7A)的PCR产物的电泳图。

图5为重组质粒pGXN9K4831的Sal I酶切线性化产物的电泳图。

图6为重组毕赤酵母GXN9K4831鉴定的菌落PCR产物电泳图。

图7为重组毕赤酵母GXN9K4831在含800μg/mL抗生素G418的YPD培养基平板上长出的单菌落。

图8为纯化的纤维二糖水解酶TcCel7A的SDS-PAGE分析和酶谱分析。

图9为纤维二糖水解酶TcCel7A的最适作用pH曲线。

图10为纤维二糖水解酶TcCel7A的最适作用温度曲线

图11为纤维二糖水解酶TcCel7A的pH耐受性曲线

图12为纤维二糖水解酶TcCel7A的温度耐受性曲线

图13为纤维二糖水解酶TcCel7A的酶反应动力学常数Km和Vmax的确定。

图14为纤维二糖水解酶TcCel7A水解滤纸的产物的HPLC分析图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的百分比%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值或平均值±标准差。以下实施例中的转速，均为在半径为4.5-5.5cm的离心半径下的转速。

下述实施例中所用到的材料包括：表达载体pPIC9K(购自Invitrogen公司，产品目录号为V17520)；巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115(购自Invitrogen公司，产品目录号为C18100)；限制性内切酶AvrⅡ、NotⅠ和SalⅠ，DNA聚合酶,PrimerStar等试剂购自Takara公司。

下述实施例中BMMY培养基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，100mL1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，5mL甲醇。

1M磷酸钾缓冲液（K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH 6.0）：132mL 1M K₂HPO₄溶液与868mL1 M KH₂PO₄溶液混合，调节pH至6.0。配制好后高压灭菌。

10×YNB即13.4%YNB：100m L水中加入13.4gYNB。500×生物素即0.002%生物素：100mL水中加入20mg生物素。

10×YNB、500×生物素需单独配制并过滤除菌并4℃保存。配制BMMY时先将20g胰蛋白胨和10g酵母提取物溶于700mL去离子水并高压灭菌，待用之前添加其它成分。

下述实施例中纤维二糖水解酶的酶活检测方法如下：以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（p-nitrophenyl-β-D-cellobioside,pNPC）为底物测定纤维二糖水解酶的活力，参照Odoux等所描述的方法（Odoux E,Escoute J,Verdeil L，et al.2003.Localization ofβ-glucosidase activity and glucovanillin in vanilla bean.Ann Botany，92:437-444）。具体步骤如下：

1）、用去离子水配制10mM的对硝基苯酚（p-NP，p-Nitrophenol）标准液，进行5个梯度稀释（10^-1-10^-5）；取140μl每个稀释度的p-NP溶液，分别加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液，用移液器小心吸打混匀，避免出现气泡。取200μl混合液，加入96孔酶标板，410nm处测定光吸收值；得到光吸收值和p-NP浓度的标准曲线，标准曲线的函数式为y=9.363x+0.0271(R²=0.9988),y为光吸收值(OD₄₁₀)，x为p-NP浓度（mM）。

2）、用去离子水配制25mM的p-NPC溶液作为底物，用小管分装，管外用铝箔包裹避光，保存于-20℃冰箱。

3）、向1.5ml EP管中加入58μl特定pH值的缓冲液和14μl 25mM的p-NPC溶液，放置于一定温度的水浴锅中预热5min，加入68μl酶液，一定温度下保温反应一段时间，加入70μl 0.4M的Na₂CO₃溶液以终止酶促反应，取200μl反应液，加入到96孔酶标板，用酶标仪于410nm处测定光吸收值；根据制作的p-NP标准曲线和光吸收值，计算反应体系中产生p-NP的量和酶活力。纤维二糖水解酶活力单位（U）的定义：一定条件下，酶水解pNPC，每min催化产生1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。比酶活定义：每mg蛋白质所含的酶活力（U/mg）。

实施例1、蛋白Tccel7A的基因组DNA和cDNA的获得

一、奶油木霉（Trichoderma cremeum）菌株BM48-3的获得

1、土壤样品的采集

采集中国云南省迪庆藏族自治州白马雪山国家自然保护区奔子栏辖区约5-20cm浅土层的土壤。

2、菌株的分离筛选

（1）用蒸馏水配制分离培养基；每升分离培养基中含有:KH₂PO₄ 2.0g、(NH₄)₂SO₄1.4g、尿素0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、CaCl₂ 0.3g、FeSO₄·7H₂O 5.0mg、MnSO₄·H₂O1.56mg、ZnSO₄·7H₂O 1.4mg、CoCl₂ 2.0mg、Avicel（Sigma PH101）10g、琼脂15g；pH5.0；121℃湿热灭菌20min；灭菌后冷却至45-50℃时倒平板。

（2）取10g土样放入250ml三角烧瓶，加入90ml无菌水并加入适量的玻璃珠，于磁力搅拌器上搅拌30min,使土样与水充分混合，将细胞分散。取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的指形瓶中充分混匀，然后从中取1ml至另一盛有9ml无菌水的指形瓶中，混匀，以此类推制成10^-1、10^-2、10^-3不同稀释度的土壤溶液，各取100μl涂布在分离培养基平板上，28℃培养。

（3）3-5天后，观察真菌菌落生长情况，挑选单菌落，转接到新的分离培养基上，划线分离纯化。

（4）配制pH 5.0的基本培养基（液体）。每升基本培养基中含有:KH₂PO₄ 2.0g、(NH₄)₂SO₄ 1.4g、尿素0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、CaCl₂ 0.3g、FeSO₄·7H₂O 5.0mg、MnSO₄·H₂O 1.56mg、ZnSO₄·7H₂O 1.4mg、CoCl₂ 2.0mg、Tween-80 2ml、蛋白胨1.0g、麸皮20g、Avicel（结晶纤维素，Sigma PH101）10g；用800ml去离子水溶解，然后调节pH值至5.0（用1M HCl水溶液或1M NaOH水溶液调节）；用去离子水定容至1L；121℃湿热灭菌20min。

（5）将步骤（3）得到的产纤维素酶的真菌菌株接种至基本培养基（液体）中，28℃、180rpm培养5-7天，取上清液，以结晶纤维素（Avicel）为底物进行纤维素酶活力测定，从中筛选出产纤维素酶活力较高的菌株BM48-3。

3、菌株的鉴定

菌株BM48-3的分子鉴定；具体鉴定步骤如下：提取菌株BM48-3的总DNA并作为模板，利用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATG3′），PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条606bp的核苷酸序列。ITS同源性比对分析表明：其与Hypocrea cremea菌株GJS 91-125的ITS(GenBank登录号:AY737760)的比对得分最高，序列覆盖度为100%，一致性为99%。根据分子鉴定结果，参照木霉属菌株的无性型和有性型命名，将菌株BM48-3初步鉴定为奶油木霉（Trichoderma cremeum）。

二、蛋白Tccel7A的基因组DNA的克隆

1、木霉菌株BM48-3的基因组DNA的提取

参考周小玲等人的方法（周小玲,沈微,饶志明,等.2004.一种快速提取真菌染色体DNA的方法.微生物学通报,31:89-92.）。具体步骤如下：

（1）在PDA平板上活化低温保存的木霉菌株BM48-3，28℃培养3至5天。

（2）将活化好的木霉菌株BM48-3转接入液体培养基（每升含有蛋白胨3g、酵母提取物0.5g、葡萄糖10g、K₂HPO₄4g、(NH₄)₂SO₄2g、CaCl₂0.35g、MgSO₄·7H₂O0.3g）中，28℃、200rpm振荡培养3天。

（3）先用八层无菌纱布过滤培养物以收集菌体，冲洗菌丝，再用无菌吸水纸吸取菌丝的水分，尽量使菌体干燥，便于研磨。

（4）将菌丝体倒入已灭菌并用液氮预冷的研钵内，不断迅速加入液氮，快速有力研磨。需始终保持研钵内有少量液氮，使菌丝体一直处于低温环境。

（5）待菌丝体被研磨至粉末状，将大约100μL体积的粉末移至1.5mL离心管中，立刻加入600μL真菌DNA提取液（200mM Tris-HCl，10mM EDTA，1%SDS，500mMNaCl，pH8.0），吹打混匀，室温放置10min。

（6）加入等体积的苯酚/氯仿混合液，用力振荡混合，10,000rpm离心10min。

（7）吸取400μL上清液至新的1.5mL离心管中，重复步骤（6）。

（8）吸取上清液至新的1.5mL离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，-20℃放置30min。

（9）12,000rpm离心15min，轻轻将液体倒出，加入75%乙醇洗涤沉淀，13,000rpm离心2min。再用75%乙醇重复洗涤沉淀一次。

（10）室温晾干沉淀至呈半透明色，加入20μL 1×TE溶液溶解沉淀。

（11）电泳检测提取的总DNA（图1）。

2、扩增蛋白Tccel7A的基因组DNA的引物

分析了4个已经发表的木霉属菌株的cbhⅠ基因的核苷酸序列：绿色木霉（Hypocrea virens）菌株UKM1的cbhⅠ(GenBank登录号EU872026)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的cbhⅠ(GenBank登录号AF223252)、木霉属菌株XST1的cbhⅠ(GenBank登录号AY368686)和绿色木霉（Trichoderma viride）菌株AS3.3711的cbhⅠ(GenBank登录号AB021656)，借助网站http://blocks.fhcrc.org/codehop.html设计出PCR扩增Tccel7A基因（DNA）的简并引物cbh1-3f和cbh1-3r，引物cbh1-3f的序列为：5′-ATGTATCRGAARTTGGCCGTCA-3′，引物cbh1-3r的序列为：5′-AGGCACTGAG AGTAGWATGGGTTC-3′。

3、蛋白Tccel7A的基因组DNA的克隆

以菌株BM48-3基因组DNA为模板，以引物cbh1-3f和cbh1-3r为引物，PCR扩增得到1653bp PCR产物（图2）。将PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布在表面涂有X-gal和IPTG的含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB琼脂培养基平板上，37℃培养过夜，随机挑取平板上长出的白色菌落，提取质粒，用EcoRI和PstI双酶切验证重组质粒，将双酶切验证正确的重组质粒进行DNA序列测定。

将酶切验证正确的重组质粒寄送上海生物工程有限公司采用双脱氧核苷酸法对该基因进行双向双链测序。用NCBI（National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的软件Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对序列进行分析，该质粒上克隆的PCR产物的基因具有序列表中序列1所示的核苷酸，该基因命名为Tccel7A。序列表中序列1自5′端的第1-3位核苷酸为Tccel7A的起始密码子ATG，自5′端的第1651-1653位核苷酸为Tccel7A的终止密码子TAA。Tccel7A基因的完整DNA序列长度为1653bp，其中包含3个外显子和2个内含子。第一个内含子长度为61bp，第二个内含子长度为62bp。该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列3，该蛋白命名为Tccel7A。

也可人工合成序列1。

三、蛋白Tccel7A的cDNA的克隆

1、木霉菌株BM48-3总RNA的提取

用Trizol法提取菌株BM48-3的总RNA。具体步骤如下：

（1）将菌株BM48-3接种至RNA提取液体培养基内，该培养基每升含有：酵母提取物1g、Avicel PH-101 30g、(NH₄)₂SO₄ 2.8g、K₂HPO₄ 4g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂0.5g、Urea 0.6g、Tween-80 2mL、微量元素0.1mL，pH调至5.0。微量元素每升含有：FeSO₄·7H₂O 10g、MnSO₄·H₂O 3.2g、ZnSO₄·7H₂O 2.8g、CoCl₂ 4.0g。28℃、200rpm振荡培养3天。

（2）收集菌体，用DEPC水冲洗菌丝，灭菌纱布过滤。用灭菌的吸水纸吸去菌丝体表面水分，使菌丝团尽量干、薄。

（3）将菌丝体倒入已灭菌并用液氮预冷的研钵内，不断迅速加入液氮，快速有力研磨。研磨大约三次左右，按50-100mg菌丝体加入1mL Trizol的量加入60℃预热的Trizol。

（4）吹打混匀，室温放置5min，4℃、12000rpm离心10min。

（5）吸取上清液至新的1.5mL离心管中，按每mL Trizol加入200μL氯仿，振荡混匀至液体呈乳白色，室温放置10min。

（6）4℃、12,000rpm离心10min，吸取上层水相至新的离心管中。

（7）按每mL Trizol加入500μL的异丙醇，混匀，室温放置10min。4℃、12,000rpm离心10min，轻轻弃去上清液。

（8）加入1mL 75%乙醇，涡旋离心管，使沉淀悬浮。4℃、8000rpm离心5min，尽量吸干上清。

（9）真空干燥或室温晾干5~10min。加入30~50μL DEPC处理水溶解RNA。

（10）TBE琼脂糖凝胶电泳检测RNA，测量OD值判断总RNA的浓度和纯度（OD_260/280）。

（11）加入适量无RNaseⅠ活性的DNaseⅠ（Takara公司），消化掉溶液中残余的DNA，操作步骤、反应体系按Takara公司说明书进行和配制，得到总RNA（图3）。

2、cDNA第一链的合成

使用Takara公司的PrimeScript 1st Strand cDNA synthesis试剂盒合成cDNA的第一链，操作步骤及反应体系按该公司的说明书进行和配制。

3、蛋白Tccel7A的cDNA的克隆

根据Tccel7A基因的完整DNA序列，设计引物cbh1-48f（5′-CACATGTATCGGAAGTTGGCC-3′）和cbh1-48r（5′-CTATTACAGGCACTGAGAGTAG-3′），以上述合成的cDNA第一链为模板，PCR扩增得到1530bp PCR产物（图4）。

将上述扩增得到PCR产物寄送上海生物工程有限公司采用双脱氧核苷酸法对该PCR产物进行双向双链测序。用NCBI（National Center for BiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的软件Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对序列进行分析，该PCR产物的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸，该基因命名为cTccel7A。序列表中序列2的DNA自5′端的第1-3位核苷酸为cTccel7A的起始密码子ATG，自5′端的第1528-1530位核苷酸为cTccel7A的终止密码子TAA，自5′端的第1-51位核苷酸为编码信号肽的核苷酸。cTccel7A基因的完整DNA序列长度为1530bp。

该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列3（509个氨基酸），其中自N’末端第1-17位为信号肽，该蛋白命名为Tccel7A。

序列2可人工合成。

实施例2、蛋白Tccel7A及其编码基因cTccel7A的功能验证

一、含有cTccel7A基因重组质粒pGXN9K4831的构建

为了在pPIC9K系统中表达cTccel7A，人工合成cTccel7A基因的除了编码信号肽和终止密码子以外的全部编码序列（即自序列表中序列2的5＇端第52-1527位核苷酸。

以人工合成的序列表中序列2的5＇端第52-1527位所示的核苷酸为模板，以48hf1（5′-TACCTAGGCATCATCATCATCATCATCAGTCGGCCTGCACCCTAACA-3′）和48hr1（5′-CCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCAGGCACTGAGAGTAGTATG-3′）(斜体序列编码组氨酸标签)为引物，得到1479bp PCR产物。

该1479bp PCR产物表达的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列3自N’末端第18-509位氨基酸残基。

将上述PCR产物用AvrⅡ和NotⅠ酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pPIC9K载体骨架连接，得到重组表达质粒pGXN9K4831。经过测序，该pGXN9K4831为将序列表中序列2的5＇端第52-1527位所示的核苷酸插入pPIC9K的AvrⅡ和NotⅠ位点间得到的重组表达载体；其中起始密码子和终止密码子由表达载体pPIC9K提供。表达产物的N端和C端都有一个由表达载体提供的His标签（6×His Tag）。

二、含有cTccel7A基因重组毕赤酵母的构建

用SalⅠ酶线性化含cTccel7A的质粒pGXN9K4831以及对照空载体pPIC9K，用线性化的质粒DNA电击转化毕赤酵母菌株GS115，具体如下：

1、毕赤酵母GS115感受态的制备

（1）挑取1~2个生长良好、直径约为2mm的毕赤酵母GS115单菌落，接种至含5mL YPD培养基（每升培养基中含有：胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g）的指形瓶中。28℃、250rpm振荡培养过夜。

（2）吸取500μL菌液，接至含100mL YPD培养基的250mL三角瓶中。28℃、250rpm振荡培养10h左右至OD₆₀₀=0.8~1.3。

（3）将菌液移至40mL圆底离心管中，4℃、2500rpm离心3min，轻轻拍打管底，用30mL预冷的无菌水将沉淀重悬。

（4）4℃、2500rpm离心3min，用30mL预冷的1M 山梨醇将沉淀重悬。

（5）重复步骤（4）。

（6）4℃、2500rpm离心3min，轻轻倒掉上清，利用离心管里残余的1M山梨醇重悬沉淀的菌体，制备成毕赤酵母感受态细胞。

（7）将毕赤酵母感受态细胞按每管100μL分装到预冷的离心管中并尽快用于后续的电击转化。

2、重组质粒pGXN9K4831和空载体pPIC9K电击转化毕赤酵母GS115

（1）分别用SalⅠ酶酶切线性化重组质粒pGXN9K4831和空载体pPIC9K，纯化酶切产物（图5，其中1为空载体pPIC9K酶切产物电泳图，2为重组质粒pGXN9K4831酶切产物电泳图）。

（2）将10μL（约5μg）线性化后的质粒与100μL毕赤酵母感觉态细胞轻轻混匀，置于冰水混合物中。

（3）设置电转仪参数为：电压1.5kV、电容25μF、电阻200Ω、电击时间为4~10mSec，进行电击。

（4）电击完毕后，迅速加入900μL预冷的1M 山梨醇溶液，混匀，将菌悬液均匀涂布于MD平板上（按100μL涂布1个平板）。

（5）将平板倒置于28℃恒温培养箱中培养，直至2~4天后单菌落出现；得到转pGXN9K4831的单菌落和转空载体pPIC9K的对照单菌落。

3、重组毕赤酵母的筛选与鉴定

将MD平板上长出的转pGXN9K4831的单菌落和转空载体pPIC9K的对照单菌落（保证单菌落在1000个以上）分别用液体MD培养基全部洗下，通过G418浓度梯度筛选带多拷贝的重组子。将洗下的菌落稀释至一定浓度，均匀地涂在G418浓度为100、200、500、800、1000、1200、1500μg/mL的系列YPD平板上。

在高浓度G418平板上挑取单菌落和对照单菌落进行菌落PCR鉴定；所用引物为5′AOX（5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′）和3′AOX（5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）。

PCR反应体系为:10×Ex Taq缓冲液2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，两种引物各1μL，毕赤酵母细胞适量，Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH₂O 18.25μL。反应条件为：95℃预变性5分钟，92℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，35个循环，最后，72℃延伸5分钟。

转化pGXN9K4831得到的单菌落的PCR结果见图6，得到2000bp的PCR产物的为阳性重组菌，从G418浓度为800、1000、1200μg/mL的YPD平板上长出的多个酵母单菌落中共得到30个阳性重组菌，分别命名为GXN9K4831-1~30。

转化空载体pPIC9K得到的对照单菌落得到500bp的PCR产物，其为阴性对照重组菌，命名为GXN9K。

转化pGXN9K4831单菌落在含800μg/mL抗生素G418的YPD培养基平板上长出的单菌落如图7所示。

三、诱导重组毕赤酵母中cTccel7A基因表达纤维二糖水解酶

1、重组毕赤酵母GXN9K4831-1~30的cTccel7A基因的诱导表达

（1）挑取上述验证得到的30个直径约2mm、生长良好的GXN9K4831-1~30，分别接种至含5mL YPG培养基的指形瓶中，28℃、250rpm振荡培养12h。

（2）吸取适量菌液接种至含有45mL YPG培养基的500mL三角瓶中，使瓶内培养基OD₆₀₀≈0.6~0.8，覆盖八层无菌纱布，28℃、250rpm振荡培养12~16h。

（3）待菌液生长至OD₆₀₀≈15~20，移至灭菌50mL圆底离心管中，室温，2500rpm离心3min，收集菌体，加入45mL BMMY培养基，轻轻拍打管底，重悬沉淀的菌体。

（4）将重悬的菌液转移至新的灭菌的500mL三角瓶中，覆盖六层无菌纱布，28℃、250rpm振荡培养。每12h向培养液中加入甲醇，前24h加入甲醇至终浓度1%，24h以后加入甲醇至终浓度1.5%。

（5）每12h测定菌液OD₆₀₀并取适量培养液，4℃、12000rpm离心10min，吸取上清液即为发酵液。

以GXN9K为对照，采用同样的方法，得到对照发酵液。

2、重组毕赤酵母发酵液的纤维二糖水解酶活力测定

将得到的各个重组毕赤酵母发酵液和对照发酵液分别进行纤维二糖水解酶活力检测，以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶活力定义：酶水解pNPC，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

结果是重组毕赤酵母第16号转化子即GXN9K4831-16降解pNPC的酶活力最高，产酶最高的培养时间即最佳收获时间为60h。在最佳收获时间其发酵上清液对底物pNPC酶活力为0.035±0.001U/mL。选取重组毕赤酵母GXN9K4831-16来表达纤维二糖水解酶Tccel7A。

对照发酵液检测不到酶活力。

上述结果说明，cTccel7A基因表达的蛋白Tccel7A为纤维二糖水解酶。

3、纤维二糖水解酶Tccel7A的纯化

将上述1得到的GXN9K4831-16发酵液使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，洗涤缓冲液为：洗涤缓冲液Ⅰ：50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mM Imidazole、1mMPMSF,pH8.0。洗涤缓冲液Ⅱ~Ⅴ：除了Imidazole分别为20、40、60、80、100mM以外，其它成分浓度与洗涤缓冲液Ⅰ一致。依次用洗涤缓冲液Ⅰ~Ⅴ对柱子进行洗脱，收集洗脱液并进行测定。

测定为采用SDS-PAGE、自然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）和酶谱分析；酶谱分析为将酶液进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE），将凝胶置于干净的培养皿中，加入1mL 2.5mM的pNPC水溶液，用玻棒涂匀，保鲜袋包裹培养皿，37℃放置1至2小时。直接在凝胶上观察条带的颜色变化。

结果如图8所示，A为TcCel7A的SDS-PAGE分析，其中M为蛋白质分子量标准；泳道1为纯化的TcCel7A；B为TcCel7A的自然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）图，其中泳道1为纯化的TcCel7A；C为和B中泳道1相对应的纯化的TcCel7A的酶谱分析；从该图可以看出，经过Ni-NTA柱纯化后的产物在SDS-PAGE上只显示出一条大小约为57kDa的主要的蛋白质条带(图8A泳道1)，在自然PAGE上也只显示出一条主要的蛋白质条带(图8B泳道1)；自然PAGE上的纯化的表达产物降解pNPC显示黄色（图8C泳道1）。

证实纯化的表达产物Tccel7A具有纤维二糖水解酶的活性，得到纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A。

四、纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A的酶学特性

1、最适作用pH值

将上述得到的纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），0.1M Tris-HCl缓冲液（pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 8.5、9.0、9.5、10.0），反应温度采用37℃，以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶酶活力定义：37℃条件下，酶水解pNPC，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

以最高酶活力为100%，其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图9。结果表明，纤维二糖水解酶Tccel7A酶促反应的最适作用pH值为5.0。

2.最适作用温度

将纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用不同的反应温度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃），反应缓冲液采用pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶酶活力定义：pH5.0条件下，酶水解pNPC，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

以最高酶活力作为100%，其它温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图10。结果表明，纤维二糖水解酶Tccel7A酶促反应的最适作用温度为45℃。

3.pH耐受性

将纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），0.1M Tris-HCl缓冲液（pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 8.5、9.0、9.5、10.0），参照Eckert和Schneider所描述的方法（EckertK，Schneider E.2003.A thermoacidophilicendoglucanase(CelB)from Alicyclobacillus acidocaldarius displays high sequencesimilarity to arabinofuranosidases belonging to family 51 of glycoside hydrolases.Eur JBiochem,270:3593-3602），将酶保存于不同pH值的缓冲液中，于4℃放置24小时后在最适pH值（pH5.0）和最适温度（45℃）下测定酶活。以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶活力定义：pH5.0、45℃条件下，酶水解pNPC，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

以最高酶活力为100%，其它pH值保存液的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存液的pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图11。结果表明，纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A在最适pH5.0的条件下，pH耐受性最强，酶活力最高。pH4.5时酶活力与最适pH5.0条件下接近，pH4.0和5.5的条件下，能够保持60%以上的酶活力。

4.温度耐受性

将纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用不同的保存温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃），参照Inoue等所描述的方法（Inoue T,Moriya S,Ohkuma M,et al.2005.Molecular cloning andcharacterization of a cellulase gene from a symbiotic protist of the lower termite,Coptotermes formosanus.Gene,349:67-75），将酶保存于不同温度下，放置1小时后在最适pH值（pH5.0）和最适温度（45℃）下测定酶活力。以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶活力定义：pH5.0、45℃条件下，酶水解pNPC，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

以最高酶活力为100%，其它保存温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图12。结果表明，纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A在45℃及以下的温度条件下，酶活稳定性较好，能够保持90%以上的酶活。

5、TcCel7A的酶反应动力学常数Km、Vmax的测定

在该酶的最适作用条件（pH5.0、45℃）下，以pNPC作为底物，在不同底物浓度（0.1~1mM）、相同酶蛋白质浓度（0.061μg/μl）条件下测定TcCel7A酶活力，图13A为pNPC的浓度对反应速度的影响曲线，看出底物pNPC浓度越大，酶反应速度越快，在底物pNPC浓度为0.2～0.8mM范围内，底物pNPC浓度和酶反应速度基本呈线性关系。绘制了底物浓度和反应速度的双倒数图，见图13B。根据双倒数图得出TcCel7A的K_m为2.43mM，V_max为1.32μmol pNP/min.mg。

6、TcCel7A的底物特异性检测

在该酶的最适作用条件（pH5.0、45℃）下，测定了TcCel7A对不同底物的酶活力，酶活力定义为：在pH5.0、45℃条件下，酶水解pNPC或pNPG(p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。或者，在pH5.0、45℃条件下，酶水解其它纤维素类底物，每min释放出1μmol还原糖（相当于等量的葡萄糖或木糖）所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

结果见表2，TcCel7A对包括结晶纤维素Avicel的各种底物（木聚糖除外）普遍有酶活力。对人工合成底物pNPC的酶活力最高，酶活力为0.72±0.04U/mg；对结晶纤维素Avicel有相当高的酶活力；对滤纸有较高的酶活力。

表2为纤维二糖水解酶TcCel7A的底物特异性检测分析

7、TcCel7A水解滤纸的产物鉴定与分析

准备5个无菌EP管，分别加入400μL 0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH5.0）、4μg滤纸和100μL上述纯化制备的TcCel7A，置于45℃摇床，150rpm振荡，分别反应10min、30min、1h和2h，沸水煮5min灭活纤维二糖水解酶TcCel7A，冷却；12,000rpm离心5min，取上清液，HPLC检测上清液中的糖组分，色谱仪器为岛津CBM-10A系统，检测器型号为RID-10A，色谱柱为Benson公司制造，型号为BP-800Pb，柱温保持在80℃，流动相为水，流速为0.8mL/min。标样为葡萄糖（glucose，G1)、纤维二糖（cellobiose，G2)、纤维三糖（cellotriose，G3)、纤维四糖（cellotetraose，G4)。

结果见图14所示，A.标准物葡萄糖(G1)、纤维二糖(G2)、纤维三糖(G3)、纤维四糖(G4)的HPLC分析图谱；B-E：纤维二糖水解酶TcCel7A水解滤纸不同时间后的产物的HPLC分析图谱，B、水解10分钟,C、水解30分钟，D、水解1小时，E、水解2小时；由图中可以看出，最初反应的10min，水解产物量非常少；反应30min，可以明显的看出水解产物为纤维二糖和纤维三糖；反应1h，水解产物为纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，分别占总水解产物量的68.5%、24.3%和7.2%；反应2h，水解产物同样为纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，分别占总水解产物量的77.3%、21.5%和1.2%。

随着反应时间的延长，水解产物量不断增加。其中，以纤维二糖产量提高幅度最大，纤维二糖为主要水解产物，纤维三糖和纤维四糖是水解反应的副产物，这与纤维二糖水解酶Ⅰ主要降解纤维素产生纤维二糖是相符的。水解产物中包含纤维二糖、纤维三塘和纤维四糖，可能是纤维二糖水解酶Ⅰ反复作用底物滤纸的结果：如经过该酶反复作用某一多糖链产生纤维六糖，再次作用又产生纤维二糖和纤维四糖；同理，该酶反复作用某一多糖链产生纤维五糖，再次作用产生纤维二糖和纤维三糖。

证实TcCel7A确实具有纤维二糖水解酶Ⅰ水解纤维素产生纤维二糖的能力。

8、金属离子对TcCel7A酶活力的影响

在最适作用条件（pH5.0、45℃）下，在酶反应体系中加入1mM的金属离子，测定以pNPC为底物的TcCel7A酶活力。酶活力定义：pH5.0、45℃条件下，酶水解pNPC，每min释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位（U）。以不加任何金属离子的酶反应体系为对照，比酶活为0.62±0.02U/mg，设定该酶活力为100%，计算其它加入金属离子的酶反应体系的相对酶活力，结果见表3。结果显示，终浓度为1mM的Ca²⁺对该酶的酶活有显著的促进作用。

表3为金属离子对TcCel7A酶活力的影响

Claims (15)

1.一种蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3自N末端第18-509位氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1）-3）中任一所示的基因：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列2自5‘末端第52-1527位核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：

所述重组表达载体为编码权利要求1所述蛋白的基因插入表达载体，得到表达所述蛋白的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：

所述重组菌为将权利要求4或5所述重组表达载体导入宿主菌中，得到的重组菌；所述宿主菌为巴氏毕赤酵母（Pichia  pastoris）。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：

所述巴氏毕赤酵母为巴氏毕赤酵母GS115。

10.权利要求1所述蛋白在作为纤维二糖水解酶中的应用。

11.权利要求2或3所述基因在制备纤维二糖水解酶中的应用。

12.权利要求4或5所述重组表达载体在制备纤维二糖水解酶中的应用。

13.权利要求6所述表达盒在制备纤维二糖水解酶中的应用。

14.权利要求7-9中任一所述重组菌在制备纤维二糖水解酶中的应用。

15.一种制备纤维二糖水解酶的方法，为发酵权利要求7-9中任一所述的重组菌，即得到纤维二糖水解酶。

Images