CN101818161A

CN101818161A - 一种纤维二糖酶基因

Info

Publication number: CN101818161A
Application number: CN201010104729A
Authority: CN
Inventors: 王冰冰; 杜风光; 夏黎明
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2010-09-01

Abstract

本发明公开了一种来自黑曲霉的新型纤维二糖酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，本发明还公开了含上述纤维二糖酶基因的表达盒、重组载体和转化子。本发明基因能够在里氏木霉中进行高效表达，转化子的纤维二糖酶活力可达到原始菌株的19.4倍。

Description

一种纤维二糖酶基因

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种纤维二糖酶基因。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)是常用的纤维素酶生产菌种，它所生产的纤维素酶复合体系中包括：内切-β-葡聚糖酶(endoglucanase，EG，EC3.2.1.4)、外切-β-葡聚糖酶(exoglucanase)或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)、纤维二糖酶(EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶β-glucosidase)等组分(Nevalainen，H.and

M.1995)。纤维素酶在将纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠不同组分之间的协同作用才能完成。

里氏木霉的cbh1基因受强启动子调控，其表达水平较高，通常CBHI酶蛋白在总分泌蛋白中的比例约占60％以上(Durand，Clanet et al.1988)。cbh1启动子的这一特点，在外源真核基因的表达调控方面具有重要的应用价值(Johan Karlsson，Markku Saloheimo，Matti Siika-aho，Maija Tenkanen，Merja Penttila，Folke Tjerneld.Eur J Biochem.2001.ArjaMiettinen-Oinonen，Pirkko Suominen.2002)。

里氏木霉的不足之处是产纤维二糖酶的能力较低，在利用里氏木霉纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，由于纤维二糖酶活力的匮乏，反应体系中常常出现纤维二糖的累积，而纤维二糖的累积对内切型-β-葡聚糖酶及外切型-β-葡聚糖酶的水解反应具有很强的反馈抑制作用。在纤维素酶的反应体系中补加纤维二糖酶，或利用固定化纤维二糖酶的协同作用可以明显提高纤维素的糖化效率(Xueliang Shen，Liming Xia 2003，2005)，但酶解成本也随之提高。

提高现有里氏木霉纤维素酶制剂中纤维二糖酶的活力，对于增强纤维素酶的协同降解性能，促进纤维素酶在生物质能源产业化中的应用等具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种编码纤维二糖酶的基因，该基因可以在里氏木霉中高效表达，解决了里氏木霉产纤维二糖酶的能力较低的问题。

一种纤维二糖酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

一种包含上述纤维二糖酶基因的纤维二糖酶表达盒，包含信号肽、纤维二糖酶基因以及两端的启动子和终止子。

优选地，维素二糖酶表达盒的启动子和终止子分别为里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I启动子(Pcbh1)和终止子(Tcbh1)。

里氏木霉分泌的纤维素酶蛋白中，纤维二糖水解酶CBHI占据了总蛋白的60％以上(Durand，Clanet et al.1988)。可以得知，该蛋白酶的启动子Pcbh1是强启动子，将优化后的纤维二糖酶基因装入Pcbh1和Tcbh1之间进行表达，可以增加表达效率。

一种包含上述纤维二糖酶基因的重组载体。

优选地，该重组载体的原始载体一般选择PUC18或PUC19。该类载体拷贝数较高，自我复制能力较强。

优选地，上述重组载体含有潮霉素B磷酸转移酶表达盒，所述的潮霉素B磷酸转移酶表达盒由依次连接的里氏木霉丙酮酸激酶的启动子(Ppkil)和潮霉素B磷酸转移酶基因构成。潮霉素B磷酸转移酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，转化子可以通过潮霉素B进行筛选。

一种含有上述纤维二糖酶基因的转化子，宿主细胞为丝状真菌，最好为里氏木霉(Trichoderma reesei)，里氏木霉产纤维素酶的能力较高。

本发明基因能够在里氏木霉中进行高效表达，转化子的纤维二糖酶活力可达到原始菌株的19.4倍。

附图说明

图1为含潮霉素B磷酸转移酶表达盒的PUC18-HB的物理图谱；

图2为含黑曲霉纤维二糖酶基因表达盒的PUC18-CB的物理图谱；

图3为本发明里氏木霉高效表达载体PUC18-HB-CB的物理图谱。

图4为检验重组菌株为阳性菌株的的电泳图谱。

具体实施方式

实施例1黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆

1、黑曲霉总RNA的提取

将黑曲霉(Aspergillus niger CBS 513.88)接种于PDA培养基上，于30℃培养7天至孢子成熟。制备孢子悬液接种于液体产酶培养基中，30℃，180rpm条件下培养2天，制得菌悬液，用于提取总RNA。

液体产酶培养基：麦麸50g/L，加热煮沸约1h，用4-8层纱布过滤，取其滤液加入(NH4)₂5O₄ 10g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/l。

提取步骤如下：1.1.5ml离心管测重后，将菌悬液倒入离心(10000rpm，30s)，弃上清，测重至菌体重100mg。2.用灭菌的玻璃棒将菌体转入预冷研钵中，倒入液氮进行研磨，至菌体呈粉末状，研磨过程中不断补充液氮。加入1ml TRNzol混匀，待溶化后继续研磨至透明状，用枪头吸入EP管中，振荡器振荡混匀。3.在15-30℃放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。4.12000rpm，离心10min，取上清。5.加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s(不用振荡器)，室温放置3min。6.12000rpm，离心15min，取上清，体积约0.5-0.6ml。7.加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min。8.12000rpm，离心10min，去上清，收集RNA胶状沉淀。9.加入75％乙醇，洗涤，12000rpm离心5min，去上清。10.室温晾干5-10min，加入0.05ml DEPC水，55-60℃放置10min。

2、c-DNA的合成

采用生工AMV第一链cDNA合成试剂盒，具体步骤如下：首先，将上步提取的RNA模板1微升和随机引物1微升混匀，加入无RNA酶去离子水9微升后，70℃水浴5分钟，再冰浴30秒。然后将5×反应缓冲液4微升、RNA酶抑制剂1微升、dNTP Mix 2微升加入上述反应液中，37℃水浴5分钟后，加入2微升AMV逆转录酶，终体积20微升。最后，将该混合液于25℃温育10分钟，37℃水浴60分钟，再于70℃加热10分钟结束反应，得到第一链c-DNA取出冷冻保存。

3、PCR扩增纤维二糖酶基因(CB)

以上述合成的c-DNA为模板，利用上游引物B1和下游引物B2进行PCR扩增。

上游引物B1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中含有Xho I酶切位点；

下游引物B2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中含有Xba I酶切位点。

PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 50s，55℃ 50s，72℃2min30s，30个循环；72℃10min。测序结果显示，PCR产物的碱基序列如SEQ IDNO：1所示，并且与GeneBank上发布的黑曲霉(CBS 513.88)纤维二糖酶基因CB(GI：145254957)序列具有98％的同源性。

实施例2里氏木霉高效表达盒的构建

1、里氏木霉基因组DNA的提取

将里氏木霉(ATCC 56765)接种于PDA培养基上，于30℃培养7天至孢子成熟。制备孢子悬液接种于液体种子培养基中，30℃，180rpm条件下培养2天，用于提取基因组DNA。

上述种子培养基配方为：含(g/l)葡萄糖20、(NH4)₂SO₄ 5、KH₂PO₄ 15、MgSO₄ 0.6、CaCl₂ 0.6、FeSO₄·7H₂O 0.005、MnSO₄·H₂O 0.0016、ZnSO₄·7H₂O 0.0014、CoCl₂ 0.002(pH5.5)。

本实施例采用CTAB法提取里氏木霉基因组DNA，首先将培养好的里氏木霉菌体离心收集，用生理盐水洗涤3次，除去色素。将菌丝转移进研钵中，液氮研磨，每100mg菌丝加入400微升CTAB提取液，涡旋混匀，65℃保温45～60min后，加入等体积酚氯仿混匀，12000rpm离心10min，取上清加入等体积异丙醇沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤，干燥后加入20微升dd水和1微升RNase，37℃保温1h，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

上述CTAB的配方为：2％(质量分数)CTAB，100mM Tris-HCl(PH8.0)，1.4M NaCl，20mM EDTA。

2、里氏木霉Pcbh1启动子(含信号肽序列)的分离

根据GeneBank上发布的cbh1启动子(GI：1405332)及信号肽序列(GI：34582631)，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物P1和下游引物P2为引物，进行PCR扩增。

上游引物P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中含有BamH I酶切位点；

下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中含有Xho I，Xba I酶切位点。

PCR反应条件为94℃5min；94℃50s，70℃2min，30个循环；72℃10min。PCR扩增得到的产物大小为880bp，测序结果显示，该PCR产物与GeneBank中的序列比较，有一个碱基的移码突变，其碱基序列如SEQID NO.7所示。

3、里氏木霉Tcbh1终止子序列的分离

根据专利(CN1831131A)上发布的cbh1终止子序列，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，通过上游引物T1和下游引物T2进行PCR扩增，分离Tcbh1。

上游引物T1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中含有Xba I酶切位点；

下游引物T2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中含有Spe I，Sph I酶切位点。

PCR反应条件为94℃ 5min；94℃ 50s，70℃ 1min30s，30个循环；72℃10min。PCR扩增得到的产物大小为681bp，测序结果显示，该PCR产物与上述专利中的序列不完全一致，有两个碱基的突变，该终止子序列如SEQ ID NO.10所示。

然后用限制性内切酶BamH I，Xba I酶切Pcbh1片段和PUC18质粒，经过T4连接酶连接后得到PUC18-P，再用限制性内切酶Xba I，Sph I酶切Tcbh1和PUC18-P质粒，经过T4连接酶连接后得到PUC18-PT。

上述的酶切体系为：

DNA 50μl

dd水 35μl

buffer 10μl

酶I 2.5μl

酶II 2.5μl

37℃ 3h

连接体系为：

DNA片段： 4μl

载体片段：4μl

T4连接酶：0.4μl

Buffer：2μl

dd水9.6μl

16℃连接过夜

实施例3潮霉素B磷酸转移酶表达盒的构建

1、里氏木霉Ppki1启动子序列的分离

根据GeneBank上发布的Ppki1启动子序列(GI：170552)，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，通过上游引物P3和下游引物P4进行PCR扩增，分离Ppki1。

上游引物P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11示，其中含有EcoR I，Bgl II酶切位点；

下游引物P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12，其中含有Sac I酶切位点。

PCR反应条件为94℃5min；94℃50s，70℃1min30s，30个循环；72℃10min。PCR扩增得到的产物大小为758bp，测序结果显示，该PCR产物与GeneBank中的序列比较，有一个碱基的移码突变，该启动子的碱基序列如SEQ ID NO.13所示。

2、潮霉素B磷酸转移酶基因的克隆

根据GeneBank发布的潮霉素B磷酸转移酶基因序列，设计潮霉素基因的上下游引物H1、H2，以含潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pCAMBIA1301为模板进行PCR扩增，分离潮霉素B磷酸转移酶基因。

上游引物H1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14中含有Sac I酶切位点；

下游引物H2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15中含有Mlu I，BamH I酶切位点。

PCR反应条件为94℃5min；94℃50s，70℃2min，30个循环；72℃10min。PCR扩增得到的产物大小为1024bp，测序结果显示，该PCR产物与GeneBank中的序列比较，有两个碱基的突变，该基因序列如SEQ IDNO.2示。

3、潮霉素B磷酸转移酶表达盒的构建

首先用限制性内切酶EcoR I，Sac I酶切Ppki1片段和PUC18质粒，经过T4连接酶连接后得到PUC18-K，再用限制性内切酶BglII，Sac I酶切潮霉素B磷酸转移酶基因(HygB)和PUC18-K质粒，经过T4连接酶连接后得到PUC18-HB。(酶切体系和连接体系同实施例2)

实施例4含纤维二糖酶基因的新型重组质粒的构建(PUC18-HB-CB)

用限制性内切酶Xho I，Xba I酶切质粒PUC18-PT和CB片段，得到大片段PUC18-PT和小片段CB，再经过T4连接酶连接后得到PUC18-CB，可在里氏木霉中高效表达黑曲霉纤维二糖酶基因。

将该表达载体经过BamH I，Spe I酶切，得到片段纤维二糖酶表达盒，再同经过相同酶切的潮霉素B磷酸转移酶表达质粒PUC18-HB连接，得到新型表达载体PUC18-HB-CB。(酶切体系和连接体系同实施例2)

实施例5高效表达纤维二糖酶基因的里氏木霉重组菌株的获得

1、里氏木霉原生质体的制备

首先新鲜里氏木霉(ATCC56765)孢子悬液接种于20ml液体基本培养基，孢子接种量依据孢子悬液的浓度来加，使终浓度为1×10⁷个/ml。30℃振荡培养10-18h。待孢子萌发率达90％时，4000g离心10min收集沉淀。加入5ml 1.2M硫酸镁-10mM磷酸钾缓冲液(pH5.8，含5～10mg/mlLysing Enzymes)中，30℃温浴45min到1.5h，并不时镜检酶解情况。待80％萌发的孢子成为原生质体后，4000rpm离心15min收集沉淀。并用1.2M山梨醇-10mM Tris·HCl(pH7.5)洗涤2次。同样的用4000rpm离心15min。最后重悬于1M山梨醇-10mM CaCl₂-10mM Tris·HCl(pH7.5)中，使原生质体浓度为5×10⁷～5×10⁸个/ml

2、里氏木霉原生质体的转化

将PUC18-HB-CB质粒5μg(最多20μl)与里氏木霉原生质体(100μl)混合，加入50μl 25％(质量分数)PEG6000-50mM CaCl₂-10mMTris·HCl(pH7.5)，冰浴20min，后加入1ml 60％(质量分数)PEG4000-50mMCaCl₂-10mM Tris·HCl(pH7.5)，室温放置5min。最后加入2ml 1M山梨醇-10mM CaCl₂-10mM Tris·HCl(pH7.5)，混匀。将适量的上述转化液涂布于含潮霉素B的再生平板上，30℃培养5-7d，挑选潮霉素抗性转化子。同时对于没有加入质粒的原生质体按同样的方法进行，按相同的量涂布在不含潮霉素B和含有潮霉素B的山梨醇基本培养基上分别作为原生质体再生情况以及阴性对照的观察。转化子经过7d的再生，最终可以得到约10个转化子/微克DNA，共45个转化子。

上述的再生平板配方为：PDA+1M山梨醇+100微克/ml潮霉素B

3、转化子表型的鉴定

将得到的5个转化子按实施例2的方法提取基因组DNA，通过上游引物B1和下游引物B2进行PCR，以未转化的里氏木霉基因组做对照，结果显示，如图4所示，转化子的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳得到大小约为2.5kb的目的片段(第1～4和6道)，而阴性对照无PCR产物，证实目的基因已经整合到染色体DNA上。

实施例6重组菌株纤维二糖酶活力的检测

接种1株经验证为阳性转化子的重组菌株进入里氏木霉种子培养基中，30℃培养2d，按照10％(V/V)的接种量接入产酶培养基，诱导72h取样测纤维二糖酶活力，并同未转化的原始菌株进行比较。其中每个转化子取三个平行样进行检测。

上述种子培养基配方为：含(g/l)葡萄糖20、酵母膏20、(NH4)₂SO₄ 5、KH₂PO₄ 15、MgSO₄ 0.6、CaCl₂ 0.6、FeSO₄·7H₂O 0.005、MnSO₄·H₂O 0.0016、ZnSO₄·7H₂O 0.0014、CoCl₂ 0.002(pH5.5)。

上述产酶培养基配方为：含(g/l)乳糖40、酵母膏35、(NH4)₂SO₄ 2、KH₂PO₄ 6、MgSO₄ 0.6、CaCl₂ 0.6、FeSO₄·7H₂O 0.005、MnSO₄·H₂O 0.0016、ZnSO₄·7H₂O 0.0014、CoCl₂ 0.002(pH5.5)。

用IUPAC推荐的国际标准方法(Ghose T K.Measurement of cellulaseactivities.Pure and Appl.Chem.1987，59(2)：257-268.)测定发酵上清液中的纤维二糖酶活力。

通过上述方法，检测得到原始菌株的纤维二糖酶活力为0.18IU/ml，重组菌株的纤维二糖酶活力可达到3.5IU/ml。经过基因重组，重组里氏木霉的纤维二糖酶活力为原始菌株的19.4倍。

实施例7重组菌株稳定性检测

将重组菌株在PDA平板上连续传代7次以上后，提取基因组DNA进行PCR验证，并测定重组菌株在产酶培养基中的产酶活性，结果显示，PCR验证结果并无变化，产酶能力也基本稳定，说明得到的转化子可以稳定遗传。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>一种纤维二糖酶基因

<130>

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2546

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>1

ttactcgagc tgatgaattg gcctactccc cgccgtatta cccatcccct tgggccaatg 60

gccagggtga ctgggcggaa gcataccaac gcgctgttga tatcgtctcg cagatgacat 120

tggctgagaa ggtcaatttg actacgggaa ctggatggga attggaatta tgtgttggtc 180

agactggagg tgttccgcgg ttgggaattc cgggaatgtg tgcacaggat agccctctgg 240

gtgttcgtga ctccgactac aactctgcgt tccctgccgg tgtcaacgtg gccgcaacct 300

gggacaagaa tctggcttac cttcgtggcc aggctatggg tcaggagttt agtgacaagg 360

gtgctgatat ccaattgggt ccagctgccg gccctctcgg tcgtagtcct gacggcggtc 420

gtaactggga gggcttctcc ccagacccgg ccctcagtgg tgtgctcttt gcagagacaa 480

tcaagggtat tcaggatgct ggtgtggttg caacggctaa gcactacatc gcctacgagc 540

aggagcattt ccgtcaggcg cctgaagctc aaggctacgg attcaatatt accgagagtc 600

ggagcgcgaa cctcgacgat aagactatgc atgagctgta cctctggccg ttcgcggatg 660

ccatccgtgc aggtgccggt gctgtgatgt gctcgtacaa ccagatcaac aacagctatg 720

gctgccaaaa cagctacact ctgaacaagc tgctcaaggc tgagctgggt ttccagggct 780

ttgtcatgag tgattgggcg gctcaccatg ccggtgtgag tggtgctttg gcgggattgg 840

acatgtctat gccgggagac gtcgattacg acagtggcac gtcttactgg ggtaccaact 900

tgaccatcag tgtgctcaac gggacggcgc cacaatggcg tgttgatgac atggctgtcc 960

gcatcatggc cgcctactac aaggtcggcc gtgaccgtct gtggactcct cctaacttca 1020

gctcatggac ccgtgatgaa tacggcttca agtactacta tgtctcggag ggaccgtatg 1080

agaaggtcaa ccagttcgtg aacgtgcaac gcaaccatag cgagttgatc cgccgtattg 1140

gagcagacag cacggtgctc ctcaagaacg atggcgctct tccattgact ggaaaggagc 1200

gcttggtcgc ccttatcgga gaagatgcgg gttccaatcc ttatggtgcc aacggctgca 1260

gtgaccgtgg gtgcgacaat ggaacattgg cgatgggctg gggaagtggc actgccaact 1320

ttccgtactt ggtgacccct gagcaggcca tctcgaacga ggtgctcaag aacaagaatg 1380

gcgtattcac tgcgaccgat aactgggcta ttgatcagat tgaggcgctt gctaagaccg 1440

ccagtgtctc tcttgtcttt gtcaacgccg actctggtga gggttatatc aatgtcgacg 1500

gaaacctggg tgaccgccgg aacctgaccc tgtggcgtaa cggcgacaat gtgatcaagg 1560

ctgctgctag caactgcaac aacacgatcg ttattattca ctctgtcggc ccagtcttgg 1620

ttaacgagtg gtacgacaac ccaaatgtta ccgctattct ctggggtggt cttccgggtc 1680

aggagtctgg caactccctc gccgacgtgc tctacggccg tgtcaaccct ggtgccaagt 1740

cgccattcac ctggggcaag actcgtgagg cctaccaaga ttacttgtac accgagccga 1800

acaacggcaa cggagcgcct caggaagact tcgtcgaggg cgtcttcatt gactaccgcg 1860

gatttgacaa gcgcaacgag actcctatct atgagttcgg ctatggtctg agctacacca 1920

ccttcaacta ctcgaacctt caggtggagg ttctgagcgc ccctgcgtac gagcctgctt 1980

cgggcgagac tgaggcagcg ccgactttcg gagaggtcgg aaatgcgtcg gattacctct 2040

accctgatgg actgcagcgg atcaccaagt tcatctaccc atggctcaac agtaccgatc 2100

ttgaggcgtc ttctggggat gctagctatg ggcaggatgc ctcagactat cttccggagg 2160

gagccaccga tggctctgcg caaccgatcc tgcctgccgg tggtggtgct ggcggcaacc 2220

ctcgcctgta cgacgagctc atccgcgtgt cggtgactat caagaacacc ggcaaggttg 2280

cgggtgatga agttcctcaa ctgtatgttt ctcttggcgg ccctaacgaa cctaagatcg 2340

tgctgcgtca attcgagcgt atcacgctgc agccgtcgaa agagacgcag tggagcacaa 2400

ctctgacgcg ccgtgacctt gcgaactgga atgttgagac gcaggactgg gagattacgt 2460

cgtatccaaa gatggtgttt gccggaagct cctcgcggaa gctgccgctc cgggcgtctc 2520

tgcctactgt tcactaatct agacgc 2546

<210>2

<211>1044

<212>DNA

<213>大肠杆菌(E.coli)

<400>2

gagctcatga aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag 60

ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc 120

ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac 180

aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt 240

gacattgggg agtttagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgttc acagggtgtc 300

acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tacaaccggt cgcggaggct 360

atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg 420

caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat 480

gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc 540

gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat 600

ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc 660

gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg 720

ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga 780

tcgccacgac tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg 840

gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga 900

tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcacggc cgtctggacc 960

gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg 1020

gcaaagaaat agacgcgtgg atcc 1044

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttactcgagc tgatgaattg gcctact 27

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgtctagat tagtgaacag taggcaga 28

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

acctgtaaag ccgcaatgca gcatcact 28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ctatctagaa gctcgagcag tagccaag 28

<210>7

<211>880

<212>DNA

<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400>7

acctgtaaag ccgcaatgca gcatcactgg aaaatacaaa ccaatggcta aaagtacata 60

agttaatgcc taaaggagtc atataccagc ggctaataat tgtacaatca agtggctaaa 120

cgtaccgtaa tttgccaacg gcttcttcac tcagtccaat ctcagctggt gatcccccaa 180

ttgggtcgct tgtttgttcc ggtgaagtga aagaagacag aggtaagaat gtctgactcg 240

gagcgttttg catacaacca agggcagtga tggaagacag tgaaatgttg acattcaagg 300

agtatttagc cagggatgct tgagtgtatc gtgtaaggag gtttgtctgc cgatacgacg 360

aatactgtat agtcacttct gatgaagtgg tccatattga aatgtaagtc ggcactgaac 420

aggcaaaaga ttgagttgaa actgcctaag atctcgggcc ctcgggcctt cggcctttgg 480

gtgtacatgt ttgtgctccg ggcaaatgca aagtgtggta ggatcgaaca cactgctgcc 540

tttaccaagc agctgagggt atgtgatagg caaatgttca ggggccactg catggtttcg 600

aatagaaaga gaagcttagc caagaacaat agccgataaa gatagcctca ttaaacggaa 660

tgagctagta ggcaaagtca gcgaatgtgt atatataaag gttcgaggtc cgtgcctccc 720

tcatgctctc cccatctact catcaactca gatcctccag gagacttgta caccatcttt 780

tgaggcacag aaacccaata gtcaaccgcg gactggcatc atgtatcaaa agttggccct 840

catctcggcc ttcttggcta ctgctcgagc ttctagatag 880

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgctctagat gaacccttac tactctcagt g 31

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

attgcatgca ctagtgtcct cggctacgtt gtcatc 36

<210>10

<211>681

<212>DNA

<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400>10

cgctctagat gaacccttac tactctcagt gcctgtaaag ctccgtggcg aaagcctgac 60

gcaccggtag attcttggtg agcccgtatc atgacggcgg cgggagctac atggccccgg 120

gtgatttatt ttttttgtat ctacttctga cccttttcaa atatacggtc aactcatctt 180

tcactggaga tgcggcctgc ttggtattgc gatgttgtca gcttggcaaa ttgtggcttt 240

cgaaaacaca aaacgattcc ttagtagcca tgcattttaa gataacggaa tagaagaaag 300

aggaaattaa aaaaaaaaaa aaaacaaaca tcccgttcat aacccgtaga atcgccgctc 360

ttcgtgtatc ccagtaccac ggcaaaggta tttcatgatc gttcaatgtt gatattgttc 420

ccgccagtat ggctccaccc ccatctccgc gaatctcctc ttctcgaacg cggtagtggc 480

gcgccaattg gtaatgaccc atagggagac aaacagcata atagcaacag tggaaattag 540

tggcgcaata attgagaaca cagtgagacc atagctggcg gcctggaaag cactgttgga 600

gaccaacttg tccgttgcga ggccaacttg cattgctgtc aagacgatga caacgtagcc 660

gaggacacta gtgcatgcaa t 681

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

agaattcaga tctgcagcac gagataacgg tg 32

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gctcggttaa gagggttctt ccg 23

<210>13

<211>758

<212>DNA

<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400>13

gaattcgatc tgcagcacga gataacggtg agactagcgg ccggtccctt atcccagctg 60

ttccacgttg gcctgcccct cagttagcgc tcaactcaat gcccctcact ggcgaggcga 120

gggcaaggat ggaggggcag catcgcctga gttggagcaa agcgacctgc catgggagca 180

gcgaaccaac ggagggatgc cgtgctttgt cgtggctgct gtggccaatc cgggcccttg 240

gttggctcac agagcgttgc tgtgagacca tgagctatta ttgctaggta cagtatagag 300

agaggagaga gagagagaga gtgtgagagg gaaaaggtga ggttgaagtg aggtagtaag 360

tgaaaaaaaa aaaaaaaatc aacactgacg gctgccgtct gccaccctcc tccacccagc 420

cacctgcaca ctcagcgcgc agcatcacct aatcttggct cgccttccgc agctcaggtt 480

gttttttttt tttctctctc ctcgtcgaag ccgcccttgt tcccttattt atttccctct 540

cctaccttgt ctgcctttgg tccatctgcc cctttgtctg catctctttt gcacgcatcg 600

ccttatcgtc gtctcttttt tcactcacgg gagcttgacg aagacctgac tcgtgagcct 660

cacctgctga tttctctccc cccctcccga ccggcttgac ttttgtttct cctccagtac 720

cttatcgcga agccggaaga accctcttaa ccgagctc 758

<210>14

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gagctcatga aaaagcctga actcaccgcg acg 33

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ggatccacgc gtctatttct ttgccctcgg ac 32

Claims

1.一种纤维二糖酶基因，其特征在于：碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含权利要求1所述的纤维二糖酶基因的纤维二糖酶表达盒。

3.根据权利要求2所述的纤维二糖酶表达盒，其特征在于：纤维二糖酶表达盒的启动子和终止子分别为里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I的启动子和终止子。

4.一种含权利要求1所述的纤维二糖酶基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：含有潮霉素B磷酸转移酶表达盒，所述的潮霉素B磷酸转移酶表达盒由依次连接的里氏木霉丙酮酸激酶的启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因构成。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其特在于：重组载体的原始载体为PUC18或PUC19。

7.一种含权利要求1所述的纤维二糖酶基因的转化子。

8.根据权利要求7所述的转化子，其特征在于：宿主细胞为丝状真菌。

9.根据权利要求8所述的转化子，其特征在于：宿主细胞为里氏木霉。