CN102268448A

CN102268448A - 一种用于在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌

Info

Publication number: CN102268448A
Application number: CN2011101778115A
Authority: CN
Inventors: 魏东芝; 王玮; 吕丹丹
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: Baikaisheng Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: CN102268448B

Abstract

本发明公开了一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌。该表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；(3)多克隆位点；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。将外源基因插入上述表达设备中，经T-DNA二元载体转化根瘤农杆菌，和里氏木霉接合，所得里氏木霉基因工程菌可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因，从中获得外源蛋白的大量生产。该里氏木霉培养条件粗放，适合固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，产生的胞外蛋白质易于分离纯化，成本低廉。

Description

一种用于在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于在里氏木霉(Trichodermareesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌。

背景技术

里氏木霉是在二战时期从所罗门群岛的棉制油布中分离得到的一种嗜温腐生性丝状真菌，具有良好的降解纤维素材料的能力。由于该菌由ReeseE.T.博士筛选鉴定，因此被命名为Trichoderma reesei。作为工业菌株，T.reesei能够生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶等，其中一些里氏木霉突变株的胞外酶蛋白产量可达60g/L，而最主要的纤维素酶CBHI(cellobiohydrolase I，纤维二糖水解酶I)，可以达蛋白分泌总量的50％(约30g/L)。里氏木霉作为工业生产菌株生产纤维素酶、半纤维素酶已有多年的历史，这些酶类被广泛应用于纺织、造纸、制浆等工业领域。除具有极好的合成和分泌蛋白的能力以外，T.reesei还具有真核的蛋白分泌机制和与哺乳动物系统相似的蛋白质翻译后修饰、加工性能，如高甘露糖型和N-糖基化。由于其适于蛋白生产的诸多优点，而且对人类没有毒性，里氏木霉也已成为相关研究人员开展真菌细胞学、遗传学和生理生化研究的重要生物材料。美国能源部(NOE)资助支持了里氏木霉基因组的测序工作，目前全基因组序列已经完成并公布。里氏木霉全基因组测序的完成为利用功能基因组学方法研究具有重要生物学意义的功能基因奠定了基础。

农杆菌介导转化法是利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA将外源基因转移到真菌基因组中的方法。根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法，与传统的转化方法相比，该方法操作简便，可导入大片段的DNA，转化效率高，导入基因大多是单拷贝，表达效果好，稳定遗传。基于上述优点，农杆菌介导的转化技术已成为目前真菌分子生物学研究中快速发展的转化方法，成为真菌系统突变分析的有效工具。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对外源蛋白表达量低，分离纯化困难的不足，提供一种操作简便快捷的用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备及其应用和所获得的里氏木霉基因工程菌，可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因。

本发明的第一方面提供一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备，其中，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；(3)多克隆位点；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。

本发明中，所述的启动子是能够控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子，较佳的为里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I启动子(P_cbhI)，更佳的启动子的序列是序列表中SEQ ID NO：18所示。

本发明中，所述的信号肽可以是本领域中能够控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的任何信号肽(分泌肽)，较佳的信号肽的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明中，所述的多克隆位点可以是本领域各种常规的多克隆位点，较佳的多克隆位点序列是序列表中SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

本发明中，所述的终止子是能够控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子(T_cbhI)，较佳的是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I终止子，更佳的终止子的序列是序列表中SEQ ID NO：19所示。

较佳的，所述的表达设备还包括以下元件：(5)筛选标记基因的表达盒，其位于元件(1)启动子的上游或元件(4)终止子的下游。

本发明中，所述的筛选标记基因的表达盒能够在里氏木霉中表达各种本领域的常规筛选标记，较佳的，所述的筛选标记是新霉素磷酸转移酶、庆大霉素乙酰基转移酶、或潮霉素磷酸转移酶，较佳的筛选标记是潮霉素磷酸转移酶，其基因序列较佳的是GeneBank的登录号为Z32698.1的第1437位位至第4057位所示。

较佳的，所述的在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进一步包括外源蛋白的编码序列，其位于第(3)元件多克隆位点之中、之前或之后。所述的外源蛋白是指来源于里氏木霉以外的蛋白，包括动物、植物和真菌的蛋白。

本发明中，较佳的，所述的表达设备还进一步包括第二个多克隆位点，该第二个多克隆位点位于第(4)元件终止子和第(5)元件筛选标记基因的表达盒之间。

本发明第二方面提供一种含有上述任何一种表达设备的载体，较佳的是根瘤农杆菌二元载体，如T-DNA表达载体pPZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、或pPK2，但不限于这些载体，更佳的选自pPZP201BK、pBI121、或pCAMBIA。

本发明第三方面提供一种含有上述任何一种载体的宿主细胞，较佳的是根瘤农杆菌LBA4404、GV2260、C58C1、GV3100、A136、GV3101、GV3850、AGL-1、EHA101、EHA105，更佳的是根瘤农杆菌GV3101。

本发明第四方面提供一种表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其基因组中含有任何一种如上所述的表达设备。所述的里氏木霉属于里氏木霉种，较佳的是里氏木霉Trichoderma reesei QM6a、QM9414、QM 9123、Sa28、QM 9136、NRRL 3653、ME-446、DB746、4065MG4、4065MG5、NRRL 3652、或NRRL 11236，更佳的是里氏木霉Trichoderma reesei RUT C30。

本发明第五方面提供一种该表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制备方法包括，将上述含有外源蛋白基因的表达设备的根瘤农杆菌二元载体转化根瘤农杆菌，将所得的根瘤农杆菌转化子和里氏木霉接合，挑选基因组中整合有外源蛋白基因的表达设备的接合子，即为表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。该里氏木霉基因工程菌可高效分泌表达来源于动物、植物和真菌等的异源基因。

本发明第六方面提供一种生产蛋白的方法，包括培养所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，从培养物中获得该外源蛋白。

本发明的里氏木霉基因工程菌可应用于制备工业酶制剂、饲料添加剂和蛋白质药物。所述酶制剂为中性纤维素内切酶、纤维二糖酶、β葡萄糖苷酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的里氏木霉表达设备在一环化质粒上，易于保存和DNA操作。

2、本发明的里氏木霉表达设备利用农杆菌结合转移技术，可提高转化效率，缩短操作时间和工作量。

3、本发明的里氏木霉表达设备具有优化的分泌表达能力，适合大多数异源基因的分泌表达。

4、本发明的里氏木霉表达设备的多克隆位点中含有稀有接口，兼容绝大多数异源基因的连接，节约操作时间提高工作效率。

5、本发明的基因工程菌可以作为纤维素酶诱导剂筛选的灵敏指示剂。

6、本发明的基因工程菌可高效表达中性纤维素酶，在造纸业和纺织业具有很重要的应用。

7、本发明提供的表达设备，可实现来源于动物、植物和真菌的异源蛋白质基因在丝状多细胞真核微生物里氏木霉中的高效分泌表达。由于里氏木霉培养条件粗放，适用于固体培养和液体深层发酵；里氏木霉本身没有毒性，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，符合国际食品安全认证；里氏木霉产生的胞外蛋白质易于分离纯化，成本低廉。因此本发明可以为洗涤、纺织、饲料、食品、造纸、医药等酶制剂行业提供基因工程生产菌株，提高酶制剂的生产效率降低生产成本。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为里氏木霉表达设备WEF的物理图谱。Pcbh I：cbh I启动子；leader：分泌肽；MCS：多克隆酶切位点；Tcbh I：cbh I终止子；Hgy Box：潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒。

图2为里氏木霉表达载体pWE32F00的构建图。。

图3为含红色荧光蛋白的重组表达载体pWE32F01的构建图。

图4为含中性纤维素内切酶Wg1的重组表达载体pWE32F02的构建图。

图5为含中性纤维素内切酶Eg13的重组表达载体pWE32F03的构建图。

图6为红色荧光蛋白在里氏木霉中的表达。A.诱导培养的菌丝在普通光源下观察；B.诱导培养的菌丝在红色荧光光源下观察。

图7为不同纤维素酶诱导剂诱导红色荧光蛋白胞外分泌表达。1.乳糖；2.纤维二糖；3.CMC；4.微晶纤维素；5.滤纸纤维。

图8为里氏木霉中的中性纤维素酶酶活。A.原始里氏木霉；B.FG1；C.FG2。

具体实施方式

一、里氏木霉异源表达设备

本发明提供了一种里氏木霉异源表达设备。该表达设备通过农杆菌结合转移里氏木霉细胞。宿主菌属于里氏木霉种，较佳的是里氏木霉Trichodermareesei RUT C30。被表达的基因是与里氏木霉异源的任何外源基因。

本发明的里氏木霉表达设备的制备方法：

(1)通过PCR扩增，分别得到里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I启动子(P_cbhI)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶I终止子(T_cbhI)、潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒各自DNA序列。

(2)将启动子(P_cbhI)、分泌肽、多克隆位点、终止子(T_cbhI)、潮霉素B筛选标记盒依次连接到表达载体中，构建得到重组表达载体1，即pWE32F00。这里的表达载体主要起大量拷贝本表达设备和提供农杆菌结合转移位点的作用，所以可以选择任何一种农杆菌二元载体，如PZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、pPK2，但不限于这些载体。

(3)将外源目的基因插入到上述表达载体1中，使外源基因位于分泌肽和T_cbhI之间，得到重组表达质粒2，即pWE32F01、pWE32F02和pWE32F03。

上述步骤(2)中，分泌肽和多克隆位点为人工合成；将启动子、分泌肽、多克隆位点、终止子和筛选标记连接，可用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将各个元件连入表达载体，所述的限制性内切酶酶切和连接酶连接都是本领域常规做法。

上述步骤(3)中，将外源基因插入到上述表达载体1中，可用限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法将外源基因连入表达载体1中，所述的限制性内切酶酶切和连接酶连接都是本领域常规做法。

二、里氏木霉基因工程菌

本发明提供了一种里氏木霉基因工程菌，该基因工程菌是将本发明的表达设备通过农杆菌接合转移入里氏木霉细胞，培养筛选转化子制备而得，具体制备步骤如下：

(1)将本发明的含有表达设备的载体电转化根癌农杆菌；再利用接合转移机制转化里氏木霉细胞。

(2)将上述转化后的细胞进行筛选、鉴定，得到表达红色荧光蛋白的重组里氏木霉菌株，和高效表达中性纤维素内切酶的重组里氏木霉菌株。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的下述实施例中，

PDA培养基配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。

Luria Bertani(LB)培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g。

马丁氏培养基的配方如下：PePtone 1g，YE 0.3g，乳糖20g，(NH₄)₂SO₄1.4g，Urea 0.3g，KH₂PO₄2.0g，CaCl₂0.34g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，Mandels微量元素液1mL。

Mandels微量元素液(1000×)：

FeSO₄·7H₂O 5g，MnSO₄·H₂O 1.6g，ZnSO₄·7H₂O 1.4g，CoCl·6H₂O2g，水定容至1L。

结合转移用的培养基：

a.MM salts(1L)

KH₂PO₄3.625g，K₂HPO₄5.125g，NaCl 0.375g，MgSO₄·7H₂O 1.250g，CaCl₂·2H₂O 0.165g，FeSO₄·7H₂O 0.0062g，(NH₄)₂SO₄1.250g.

b.1M MES

21.32g定容到100mL，pH5.3(5M KOH调节)需要过膜除菌。

c.5M KOH

7.013g定容到25mL。

d.M-100Trace(0.5L)

H₃BO₃30mg，MnCl₂·4H₂O 70mg，ZnCl₂200mg，Na₂MoO₄·2H₂O 20mg，FeCl₃·6H₂O 50mg，GuSO₄·5H₂O 200mg.

e.M-100Salt(1L)

KH₂PO₄16g，Na₂SO₄4g，KCl 8g，MgSO₄·7H₂O 2g，CaCl₂1g，M-100Trace 8mL.

f.Induction Medium

MM salts 80mL，葡萄糖0.36g，甘油1.26g，24mLx8分装8瓶，水定容至192mL，接种时每瓶加1mL(1M MES，过膜除菌)调节pH值，起到缓冲的作用。

g.Induction Medium Plates

MM salts 160mL，葡萄糖0.36g，甘油2.52g，水定容至384mL，96mLx4分装4瓶，每瓶中加入1.5g琼脂，115℃，20min灭菌。倒平板前每瓶加入4mlL1M MES(过膜除菌)。

h.M-100plates

葡萄糖10g，KNO₃3g，M-100Salt solution 62.5mL，水定容至1L，100mLx10瓶分装，每瓶加入0.75g琼脂。115℃，20min灭菌。

i.乙酰丁香酮(AS)

0.01962使用DMSO溶解定容至0.5mL。

DNA提取液的配方如下：Tris-HCl(pH7.5)0.2mol/L，NaCl 0.5mol/L，EDTA0.01mol/L，SDS 1％。

在本发明的下述实施例中使用的里氏木霉是Trichoderma reesei RUTC30(购自ATCC)。

质粒提取试剂盒购自Invitrogen(USA)，胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

实施例1包含本发明的里氏木霉表达设备的表达载体的构建

1.1、里氏木霉基因组的提取及检验

将里氏木霉Trichoderma reesei RUT C30接种于PDA培养基上，于28℃下恒温培养7天至孢子成熟。制备适量孢子悬液接种于马丁氏培养基液体种子培养基中，于30℃180rpm条件下培养2天至菌丝体浓度达到4～5g/L用于提取基因组。

本实施例采用本领域常用的真菌快速提取基因组法提取里氏木霉的基因组DNA，提取完毕后使用琼脂糖凝胶电泳电泳检验所提取的基因组DNA。

1.2、里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I启动子(P_cbhI)的分离

根据GeneBank上发布的cbhI启动子的序列，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物进行特异的PCR扩增分离P_cbhI。

上游引物P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其中含有EcoRV酶切位点。

下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其中含有SacII酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参照试剂盒说明书，PCR的扩增产物大小为1490bp，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和DNA序列分析，结果表明所获得的扩增产物为目的片段。

1.3、外切葡聚糖纤维二糖水解酶I终止子(T_cbhI)的分离

根据GeneBank上发布的cbh I终止子的序列，以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物进行特异的PCR扩增分离T_cbhI。

上游引物P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，其中含有StuI酶切位点。

下游引物P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中含有HpaI酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参照试剂盒说明书，PCR的扩增产物大小为1100bp，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和DNA序列分析，结果表明所获得的扩增产物为目的片段。

1.4、分泌肽leader和多克隆位点MCS合成

利用DNA基因合成技术，人工合成分泌肽leader，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。利用DNA基因合成技术，人工合成多克隆位点MCS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用DNA基因合成技术，人工合成多克隆位点MCS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

1.5、潮霉素B筛选标记盒的获得

以质粒pAN7-1(NCBI gi：475166)为模板，使用引物经PCR扩增得到了潮霉素磷酸转移酶筛选标记盒。

上游引物P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中含有SacI酶切位点；

下游引物P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中含有XbaI酶切位点。

PCR扩增反应条件以及反应体系参照试剂盒说明书，PCR的扩增产物大小为2643bp，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和DNA序列分析，结果与质粒pAN7-1的GeneBank中保留序列Z32698.1一致，所获得的扩增产物为目的片段。

1.6、里氏木霉pWE32F00表达载体的构建

用两种限制性内切酶的组合体系(EcoRV和SacII，SacII和PacI，PacI和StuI，StuI和HpaI，HpaI和SacI，SacI和XbaI，及EcoRV和XbaI)分别双酶切上述实例1.2、1.3、1.4、1.5得到的P_cbhI、T_cbhI、分泌肽、多克隆位点、潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒片段和农杆菌二元载体pPZP201BK(取自新泽西州立大学的瓦克斯曼研究所的Peter Hajdukiewicz)。再用DNA连接酶将上述多个双酶切片段相连。DNA连接反应完成将连接液转入大肠杆菌感受态DH5a(天根公司)，然后涂布含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板。挑出单克隆，接入含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基，菌液用plasmidextraction kit(Omega，USA)提质粒。测序验证出阳性转化子，获得表达载体PWE32F00，即得到用于表达外源基因的里氏木霉表达载体。表达载体PWE32F00如图2所示。插入序列结构示意图如图1所示。插入序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：20所示，其中第1-1490位是P_cbhI，第1485-1565位是分泌肽，第1558-1578位是多克隆位点，第1573-2706位是T_cbhI，第2701-2723位是多克隆位点，第2718-5372位是潮霉素磷酸转移酶基因筛选标记盒。

实施例2利用里氏木霉表达设备表达红色荧光蛋白

2.1、红色荧光蛋白基因Red的获得

以质粒pDSRed2-N1(Clontech公司，货号632406)为模板，使用引物经PCR扩增得到了697bp的红色荧光蛋白Red基因。

上游引物P7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中含有PacI酶切位点；

下游引物P8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，其中含有EcoRV酶切位点。

扩增产物的长度为697bp，长度及序列分析的结果均与预期相符。

2.2、Red与表达设备的对接

将上述扩增产物(red基因)经过PacI，EcoRV限制性酶切，使用T4连接酶连接到经过PacI，EcoRV限制性酶切的表达载体PWE32F00中，得到了含P_cbhI-Red-T_cbhI表达设备的重组载体PWE32F01(如图3所示)。将PWE32F01转化DH5a(天根公司)，然后涂布含有卡那霉素(50ug/ml)的LB平板。挑出单克隆，接入含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基，菌液用plasmid extraction kit(Omega，USA)提质粒。测序验证出阳性转化子，获得表达载体PWE32F01，即得到用于表达外源基因的里氏木霉表达载体PWE32F01(表达载体如图3所示)。

2.3、pWE32F01电转根瘤农杆菌

质粒PWE32F01电转根瘤农杆菌GV3101感受态细胞(购买于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)，涂布在含Gen+Kan的LB平板上，确保细胞浓度稀释到全部根瘤农杆菌均以单克隆形式出现。在30℃下培养48h。挑取单克隆的根瘤农杆菌接种到加了Gen+Kan的LB培养基中，放在30℃，200rpm的摇床中培养24h。使用引物对做菌落PCR，筛选阳性转化子。

2.4、根瘤农杆菌结合转移

倒Induction Medium Plates平板，并将醋酸纤维素膜覆盖在培养基的上面。将里氏木霉T.reesei RUT C30的孢子稀释成合适的浓度。把上述步骤3电转后的阳性根瘤农杆菌和该里氏木霉孢子等体积混合，点到上述醋酸纤维素膜上。放在27℃下共培养48h后，把加了潮霉素和头孢的M-100培养基倒在膜上，即为上层培养基。将平板放在30℃下培养。

2.5、转化子的鉴定及目的基因的表达

提取上述步骤4所得的阳性转化子的基因组DNA作为模板，用引物P7(其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)和P8(其核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示)进行PCR扩增。结果显示，抗性转化子的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为697bp的red基因的特异带，而用原始菌株T.reeseiRUT C30的基因组DNA为模板进行同样的PCR反应，没有出现扩增产物。使用引物P1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)和P4(其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)扩增出3365bp的片段，对应于表达设备P_cbhI-Red-T_cbhI的大小。

将获得的重组里氏木霉菌株接种于马丁氏液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养72h后，取发酵液点到载玻片上，放到荧光显微镜下观察，红色荧光蛋白的激发光557nm，发射光579nm。结果如图6所示，重组里氏木霉菌丝体在荧光显微镜下发出红色荧光，而原始的里氏木霉菌丝体在荧光显微镜下没有红色荧光。

2.6、探究红色荧光蛋白的表达与纤维素酶诱导剂的关系

将步骤2.4得到的重组里氏木霉基因工程菌的孢子接种到添加了2％葡萄糖的马丁氏液体培养基中，于30℃，200rpm振荡培养48h，菌体生长至生长旺盛期后，用没有添加任何糖的马丁氏液体培养基洗涤菌体3次，离心收集菌体用没有添加任何糖的马丁氏液体培养基复溶，然后以相同体积分装到添加不同底物的诱导产酶培养基(马丁氏培养基)中，在30℃，200rpm的条件下继续培养，定时取样使用荧光酶标仪测定在激发光535nm，发射光595nm处的荧光吸收值，结果见图7所示。可见，最佳碳源依次是微晶纤维素，滤纸纤维，CMC，乳糖，纤维二糖。

实施例3利用本发明表达设备表达中性纤维素酶

3.1、中纤纤维素酶基因wg1、egl3的分离

wg1基因的分离

wg1基因是Bicillus subtilis W168(ATCC)菌株中纤维素内切酶，其最适pH值在中性，wg1基因的NCBI保存号为M16185.1。

以Bicillus subtilis W168菌株(ATCC 23857)的基因组DNA为模板，以P9、P10引物进行PCR扩增，得到wg1基因。

上游引物P9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，其中含有PacI酶切位点；

下游引物P10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，其中含有StuI酶切位点。

扩增产物经琼脂糖电泳检测，其分子大小为1428bp，与预期结果相符合；经DNA序列分析，其序列与GeneBank上发布的序列一致。

egl3基因的分离

egl3基因为Humicola grisea var.thermoidea菌株中纤维素内切酶，egl3基因的NCBI保存号为AB003107.1。

以人工合成egl3基因(序列见NCBI：AB003107.1)为模板，以P11、P12引物进行PCR扩增，得到egl3基因。

上游引物P11，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，其中含有PacI酶切位点；

下游引物P12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，其中含有StuI酶切位点。

扩增产物经琼脂糖电泳检测，其分子大小为867bp，与预期结果相符合；经DNA序列分析，其序列与GeneBank上发布的序列一致。

2、wg1、egl3与表达设备对接

分别将上述所获得的wg1、egl3基因经PacI和StuI酶切后与经同样酶切的表达载体PWE32F00连接，经转化大肠杆菌DH5α，获得含表达设备P_cbhI-wg1-T_cbhI和P_cbhI-egl3-T_cbhI的重组质粒，分别是质粒pWE32F02、pWE32F03，如图4、5所示。将重组质粒中的表达设备进行DNA测序分析，结果表明表达设备中各元素包括启动子、目的基因以及终止子的结构完全正确。

3、电转

分别将质粒pWE32F02、pWE32F03电转根瘤农杆菌感受态细胞，涂布在含Gen+Kan的LB平板上，确保细胞浓度稀释到全部根瘤农杆菌均以单克隆形式出现。在30℃下培养48h。挑取单克隆的根瘤农杆菌接种到加了适量Gen+Kan的LB培养基中，放在30℃，200rpm的摇床中培养24h。通过测序验证筛选阳性转化子。

4、结合转移

倒Induction Medium Plates平板，并将醋酸纤维素膜覆盖在培养基的上面。将里氏木霉T.reesei RUT C30的孢子稀释成合适的浓度。把上述步骤3电转后的阳性根瘤农杆菌和该里氏木霉孢子等体积混合，点到膜上。放在27℃下共培养48h后，把加了潮霉素B和头孢噻唑的M-100培养基倒在膜上，即为上层培养基。将平板放在30℃下培养。

5、筛选及鉴定

从上述步骤4所得的平板上挑取的单个菌落，即重组菌株，进行基因型鉴定。以重组菌株的基因组DNA为模板，使用引物P9(其核苷酸序列如SEQID NO：12所示)和P10(其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示)扩增出1428bp的片段，对应于基因wg1的大小。使用引物P1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)和P4(其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)扩增出4096bp的片段，对应于表达设备大小P_cbhI-wg1-T_cbhI的大小，该重组菌株命名为FG1。

以重组菌株的基因组DNA为模板，使用引物P11(其核苷酸序列如SEQID NO：14所示)和P12(其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)扩增出867bp的片段，对应于基因egl3的大小。使用引物P1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)和P4(其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)扩增出3535bp的片段，对应于表达设备大小P_cbhI-egl3-T_cbhI的大小，该重组菌株命名为FG2。

6、重组菌株表达产物分析

将在含潮霉素的PDA平板上生长良好的重组菌株FG1、FG2接种于含有2％葡萄糖的液体马丁氏培养基中，培养一定时间后，按照合适的接种量转接到含有2％乳糖的液体马丁氏培养基中。培养2d后。取发酵液测中性纤维素内切酶活。其中，酶活力单位定义为每毫升酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠(CMC)产生1μg还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位。结果见图8，可见，中性纤维素酶wg1，egl3在里氏木霉菌株已经表达。

Claims

1.一种用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞内表达外源蛋白的表达设备，其特征在于，所述的表达设备从5’至3’依次包括以下元件：(1)控制外源基因在里氏木霉中转录的启动子；(2)控制外源蛋白在里氏木霉中分泌表达的信号肽的编码序列；(3)多克隆位点；(4)控制外源基因在里氏木霉中终止转录的终止子。

2.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述的启动子是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I启动子(P_cbhI)；所述的终止子是里氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶I终止子。

3.如权利要求1或2所述的表达设备，其特征在于，所述的表达设备还包括以下元件：(5)筛选标记基因的表达盒，(5)筛选标记基因的表达盒，其位于元件(1)启动子的上游或元件(4)终止子的下游。

4.如权利要求1～3任一项所述的表达设备，其特征在于，所述的在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备还进一步包括外源蛋白的编码序列，其位于第(3)元件多克隆位点之中、之前或之后。

5.一种含有如权利要求1～4任一项所述表达设备的载体。

6.一种含有如权利要求5所述载体的转化子。

7.一种表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，其特征在于，其基因组中含有如权利要求4所述的表达设备。

8.一种如权利要求7所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括将含有如权利要求5所述的表达设备的根瘤农杆菌二元载体转化根瘤农杆菌，将所得的根瘤农杆菌转化子和里氏木霉接合，挑选基因组中整合有外源蛋白基因表达设备的接合子，即为表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌。

9.一种生产蛋白的方法，其特征在于，包括培养如权利要求7所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌，从培养物中获得外源蛋白。

10.如权利要求7所述的表达外源蛋白的里氏木霉基因工程菌在制备工业酶制剂、饲料添加剂或蛋白质药物中的应用。