CN104031913A - 一种用于在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的表达设备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于在枯草芽孢杆菌内分泌表达外源蛋白的表达设备，依次包括以下元件：（1）P43启动子；（2）SD序列；（3）信号肽；（4）多克隆位点；（5）蛋白纯化标签。本发明提供的枯草芽胞杆菌表达设备可实现异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。由于枯草芽孢杆菌培养条件简单、菌种安全并且发酵生产方便，其适用于固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生内毒素及热源性脂多糖，符合国际食品安全认证。因此，本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌可应用于制备工业酶制剂、饲料酶和蛋白质药物等蛋白产品。

Description

一种用于在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的表达设备

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种用于在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的表达设备。

背景技术

革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人知。在所有革兰氏阳性菌中，芽孢杆菌载体因有其优良性状尤为引人瞩目。芽孢杆菌表达系统是在70年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始，逐步扩展至其它种的。枯草芽孢杆菌是仅次于大肠杆菌，在遗传上和生理、生化上研究较为详尽的一种原核生物。枯草芽孢杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。Spizizen于1958年发现枯草芽孢杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草芽孢杆菌的遗传学工作不断深入和发展。美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心（BGSC，http://www.bgsc.org）至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个，包含了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。

与其他原核生物表达系统相比，枯草芽孢杆菌表达系统具有如下优势：（1）非致病性。除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害。（2）转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA。（3）质粒和噬菌体都可以作为克隆的载体。（4）细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。（5）能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。（6）具有良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。

迄今，已经在枯草芽孢杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩，但是仍然存在着一些外源蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量低、分泌较差、分离纯化困难的问题。

启动子可以激活基因的转录（通过使全酶与模板的结合并使RNA聚合酶活化），RNA聚合酶识别启动子序列（一般利用σ因子）并与其结合来激活转录。根据转录模式和控制转录水平的高低可将启动子分别分为组成型和诱导型及强和弱启动子。枯草芽孢杆菌含有多于17种σ因子。启动子的区别主要是保守区域的不同，枯草芽孢杆菌σ^A因子识别启动子的-35区的“TTGACA”保守序列及-10区的“TATAAT”保守序列，σ^B因子则分别识别“AGGATT”和“GGAATTGTTT”保守序列。

发明内容

本发明针对外源蛋白表达量低、分泌较差、分离纯化困难的不足，提供一种可进行分泌表达、操作简便的用于枯草芽孢杆菌细胞内表达外源蛋白的质粒、表达设备及其基因工程菌，可高效分泌表达来源于细菌等的异源蛋白。

本发明的第一个目的在于提供用于在枯草芽孢杆菌内分泌表达外源蛋白的表达设备，所述表达设备依次包括以下元件：（1）P43启动子；（2）SD序列；（3）信号肽；（4）多克隆位点；（5）蛋白纯化标签。

根据本发明，所述启动子是能够控制外源基因在枯草芽孢杆菌中起始转录的基因片段，优选地，所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6283位至第6587位所示。

根据本发明，所述SD序列来源于大肠杆菌，优选地，所述SD序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6594位至第6613位所示。

根据本发明，所述信号肽可以是相关菌种中能够控制外源蛋白在枯草芽孢杆菌中分泌表达的信号肽，包括如SEQ ID NO：1的第6614位至第6704位或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。优选地，所述信号肽为芽孢杆菌的α-淀粉酶的信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6614位到第6704位所示。

根据本发明，所述多克隆位点可以是表达质粒中各种常规的多克隆位点，包括如SEQ ID NO：1的第6710位至第6745位、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。优选地，所述多克隆位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6710位至第6745位所示。

根据本发明，所述蛋白纯化标签可以用于纯化外源重组蛋白，包括His-Tag或c-Myc Tag。优选地，所述His-Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6746位至第6769位所示，所述c-Myc Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

根据本发明的优选实施例，所述表达设备的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6283位至第6769位所示。

本发明的第二个目的在于提供一种含有上述任何一种表达设备的载体。

根据本发明的优选实施例，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第三个目的在于提供一种含有上述载体和外源蛋白的编码序列的重组载体。

本发明的第四个目的在于提供一种表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌中含有上述重组载体。优选地，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌为枯草芽孢杆菌1A751。

本发明的第五个目的在于提供一种生产蛋白的方法，包括培养上述枯草芽孢杆菌基因工程菌，从培养物中获得外源蛋白。

本发明的第六个目的在于提供上述表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备工业酶制剂及蛋白质药物中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明的枯草芽胞杆菌表达设备在一环化质粒上，易于保存和DNA操作。

2、本发明的枯草芽胞杆菌表达设备可以利用化学转化和电转化的方法，可提高转化效率。

3、本发明的枯草芽胞杆菌表达设备具有良好的分泌表达能力，适合大多数异源基因的分泌表达。

4、本发明的枯草芽胞杆菌表达设备的多克隆位点中设计多个常用的酶切位点接口，兼容绝大多数异源基因的连接，节约操作时间提高工作效率。

5、本发明的枯草芽胞杆菌表达设备可以利用荧光蛋白基因检测启动子的启动强度。

本发明提供的表达设备及构建的相关载体和基因工程菌，可实现异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。由于枯草芽孢杆菌培养条件简单、菌种安全并且发酵生产方便，其适用于固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生内毒素及热源性脂多糖，符合国际食品安全认证。枯草芽孢杆菌产生的胞外蛋白质易于分离纯化，成本低廉。因此本发明可以为洗涤、纺织、饲料、食品、造纸、医药等酶制剂行业提供基因工程生产菌株，提高酶制剂的生产效率降低生产成本，有助于酶制剂生产过程中的能耗、提高底物的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为pBNS2表达载体的构建过程。

图2为pBNS1和pBNS2载体的双酶切鉴定结果。其中，1为pBNS1质粒用EcoRI和XbaI双酶切结果；2为pBNS2质粒用EcoRI和HindⅢ双酶切结果；M为DNA标准分子量。

图3为重组菌株pBNS2-gfp-1A751培养物的荧光显微镜观察结果。

图4为重组菌株pBNS2-gfp-1A751发酵上清液的SDS-PAGE分析。其中，图A中，M为蛋白标准分子量；1为空载菌株对照（12h）；2-4分别为培养不同的时间（4h、6h、8h）的重组菌株；图B中，1为重组菌株培养36h后浓缩的发酵上清液。

图5为重组菌株pBNS2-man-1A751发酵液的SDS-PAGE分析。其中，S为标准蛋白；1为空载菌株的发酵液上清；2为重组菌株的发酵液上清；3为重组菌株的细胞裂解液。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明的以下实施例中使用的菌株和质粒信息如下：

枯草芽孢杆菌AS.168购自http://www.bgsc.org/，枯草芽孢杆菌IA751购自http://www.bgsc.org/，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ATCC9945a购自http://www.bgsc.org/；pMD19-T载体购自日本Takara公司，pTM117质粒由Beth M.Carpenter惠赠（Expanding the Helicobacter pylori Genetic Toolbox:Modification of an Endogenous Plasmid for Use as a Transcriptional Reporter andComplementation Vector.Beth M.Carpenter et al.,Appl Environ Microbiol.2007December;73(23):7506-7514.）。

本发明的以下实施例中使用的培养基和试剂信息如下：

LB液体培养基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%、pH7.0。

LB固体培养基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%、琼脂1.7%、pH7.0。

SOC液体培养基：蛋白胨2%、酵母提取物0.5%、NaCl 0.05%、KCl 2.5mM、MgCl₂ 10mM、葡萄糖20mM，pH7.0。

Spizizen盐溶液（最低盐溶液）：K₂HPO₄·3H₂O1.834%，KH₂PO₄0.6%，(NH₄)₂SO₄0.2%，柠檬酸钠0.1%，MgSO₄·7H₂O0.02%。

GMI溶液：在Spizizen盐溶液中补加碱解酪素0.004%，酵母抽提液0.04%，葡萄糖0.5%，L-色氨酸50μg/ml。

GMII溶液：在Spizizen盐溶液中补加碱解酪素0.004%，酵母抽提液0.04%，葡萄糖0.5%，MgCl₂ 2.5mM，CaCl₂ 0.5mM，L-色氨酸50μg/ml。

HG溶液：10%甘油，1mM Hepes（pH7.0）。

本发明的以下实施例中使用的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的总DNA的抽提方法如下：

取100ml过夜培养的芽孢杆菌菌液，5000rpm离心10分钟。弃上清，菌体沉淀用10ml TE悬浮，并加0.5ml10%SDS和50μl蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时。加1.5ml5mol/L NaCl，混匀。再加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。用等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提，5000rpm离心10分钟，移取上清液至干净离心管。用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提，移取上清液移至干净管中。加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，10000rpm离心15分钟得到DNA沉淀。加入700μl70%乙醇，70μl3M NaAc漂洗DNA沉淀，加入1ml TE过夜溶解，DNA溶液于-20℃保存备用。

本发明的以下实施例中使用的引物均委托上海生工生物工程技术有限公司合成。测序均委托上海华大基因科技有限公司完成。质粒DNA的抽提、回收和纯化分别使用细菌质粒提取试剂盒（购自Axygen公司）和胶回收试剂盒（购自Axygen公司）完成。限制性内切酶均购自日本Takara公司。PCR扩增使用Taq DNA聚合酶（购自日本Takara公司）完成，反应体系和反应条件参照说明书设置。

本发明的以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件进行。

本发明的以下实施例中使用的原料或试剂除特别注明外，均市售可得。除特别注明外，%均代表重量体积百分比。

实施例1、枯草芽孢杆菌表达载体pBNS2的构建

1.1、P43组成型启动子的克隆

P43启动子是来源于枯草芽孢杆菌的组成型启动子，包含两个启动子并分别被σ^A和σ^B因子识别。根据GenBank中枯草芽孢杆菌的P43启动子基因序列，设计并合成引物P43F和P43R，其序列如下所示：

P43F：5’-CGCGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTT-3’（SEQ ID NO：6）

P43R：5’-CGCTCTAGATTCATGTGTACATTCCTC-3’（SEQ ID NO：7）

其中，在引物P43F上引入EcoRⅠ酶切位点，在引物P43R上引入XbaⅠ酶切位点。

以枯草芽孢杆菌AS.168菌株的总DNA为模板，使用P43F和P43R引物对进行PCR扩增，将获得的PCR产物克隆至pMD19-T载体，重组质粒命名为pMD19-P43。将pMD19-P43进行琼脂糖电泳检测和测序分析，结果表明，枯草芽孢杆菌AS.168菌株的启动子全长305bp，由两个叠加的启动元件组成，分别为σ55和σ37RNA聚合酶识别的位点，与GenBank中的枯草芽孢杆菌P43启动子的基因序列高度保守。

1.2、α-淀粉酶的信号肽amyQ的克隆

根据GenBank中地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因序列，设计并合成引物B.La-df-U和B.La-df-D，其序列如下所示：

B.La-df-U：5’-ATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTT-3’（SEQ IDNO：8）

B.La-df-D：5’-TACGGCTGATGTTTTTGTAATCGGCAA-3’（SEQ ID NO：9）

以地衣芽孢杆菌ATCC9945a的总DNA为模板，使用B.La-df-U和B.La-df-D引物对进行PCR扩增，将获得的PCR产物克隆至pMD19-T载体，重组质粒命名为pMD19-SP。将pMD19-SP进行琼脂糖电泳检测和测序分析，结果和预期一致。

1.3、表达载体pBNS2的构建

参照文献（枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.郭兴华等，生物工程学报，1991，7（3）：224-229）的方法构建基础载体pBE2，pBE2是一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，缺少枯草芽孢杆菌识别的启动子，不能用于枯草芽孢杆菌系统的外源蛋白表达。以pBE2作为出发载体，表达载体pBNS2的构建过程示意图如图1所示。

首先，将实施例1.1中获得的重组质粒pMD19-P43用EcoRI和XbaI双酶切，回收并纯化P43酶切产物片段，然后连接到同样用EcoRI和XbaI双酶切处理的基础质粒pBE2a载体片段上，获得的重组质粒命名为pBNS1（6623bp），经酶切鉴定正确（图2）。

然后，设计并合成三对特异性引物F1/R1/R2/R3，其序列如下所示：

F1：5’-GGCTCTAGATTTAAGAAGGAGATATACATATGATTCAAA-3’（SEQ ID NO：10）

R1：5’-CTCGAGGAGCTCGTCGACGGATCCTACGGCTGAT-3’（SEQ IDNO：11）

R2：5’-GATGGTGATGGCATGCCTGCAGCTCGAGGAGCT-3’（SEQ IDNO：12）

R3：5’-GCCAAGCTTGTGATGGTGATGGTGATGGTGATG-3’（SEQ IDNO：13）

其中，F1中包含大肠杆菌SD序列，R2中包含多克隆位点（BamHI、SalI、SacI、XhoI、PstI、SphI），R3中包含枯草芽孢杆菌His-Tag序列。

以实施例1.2中构建的重组质粒pMD19-SP为模板，以引物F1和R1为引物对进行第一轮PCR扩增，从而在信号肽的上游引入一段大肠杆菌SD序列。然后以第一轮PCR扩增产物为模板，以引物F1和R2为引物对进行第二轮PCR扩增，从而在信号肽的下游插入一段多克隆位点（BamHI、SalI、SacI、XhoI、PstI、SphI）。然后以第二轮PCR扩增产物为模板，以引物F1和R3为引物对进行第三轮PCR扩增，从而在信号肽的下游插入枯草芽孢杆菌His-Tag标签，经过三轮连续PCR后，最终获得一段全长为188bp的片段，其中依次包含SD序列、信号肽、多克隆位点和His-Tag标签。将该片段连接到pMD19-T载体中，经测序分析正确后，用XbaI和HindIII双酶切，回收并纯化外源的片段，连接到同样用XbaI和HindIII双酶切处理的pBNS1质粒片段上，获得分泌表达载体pBNS2（6781bp，SEQ ID NO：1），经酶切鉴定正确（图2）。

实施例2、枯草芽孢杆菌的转化系统优化

2.1、枯草芽孢杆菌的化学转化

2.1.1、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备

将枯草芽孢杆菌甘油保存菌种以1%的接种量接到GMI溶液中，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。次日以10%的接种量转到新鲜的GMI中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时。再以10%的接种量接到GMII中，37℃慢摇床培养90分钟，4℃离心收集菌体。用1/10体积的上清液悬浮菌体，并加无菌甘油到10%的终浓度，混匀后分装到无菌离心管中，随即于-40℃保存。

2.1.2、枯草芽孢杆菌感受态细胞的化学转化

转化时，取出2.1.1中制备的枯草芽孢杆菌感受态细胞，放在45℃水浴中融化，加入10μl待转化的重组表达质粒。于37℃振荡保温30分钟后，将已转化的感受态细胞加到LB固体培养基（含筛选所需的抗生素）上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养过夜。

2.2枯草芽孢杆菌的电转化

2.2.1、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备

将枯草芽孢杆菌甘油保存菌以1%的接种量接到LB培养基中，37℃培养过夜。然后按10%的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，37℃下激烈震荡培养至OD₆₀₀=0.4-0.6（约1h）。将1ml培养液转移到无菌离心管中，在冰上放置30min。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，回收菌体，倒置离心管并用无菌枪头吸干上清培养液。用1ml预冷的无菌去离子水清洗菌体，4℃，4000rpm离心5min，弃上清。再用1ml预冷的无菌去离子水清洗菌体，4℃，4000rpm离心5min，弃上清。用1mlHG溶液再清洗菌体，4℃，4000rpm离心5min，弃上清。用200μl的HG溶液重悬菌体，即可用于电激或置于-20℃保存。

2.2.2、枯草芽孢杆菌感受态细胞的电转化和筛选

将待转化的重组表达质粒加入200μl的2.2.1中制备的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，4℃保温10min，在2.5KV/cm，25μF，720Ω条件下电击6ms进行电转化，然后4℃保温10min。加入500μlSOC培养基，于37℃下100rpm摇动复苏培养2h，取200μl涂布于LB（含筛选所需的抗生素）固体培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置培养皿，于37℃培养12-16h。

实施例3、利用枯草芽孢杆菌表达设备表达绿色荧光蛋白

3.1、用于表达绿色荧光蛋白的枯草芽孢杆菌工程菌的构建

为了检测实施例1.3中所构建的表达载体pBNS2对外源基因的表达效率，将绿色荧光蛋白编码区域作为报道基因克隆到所构建的表达载体中。

首先，设计并合成引物pBNS2-gfp-U/pBNS2-gfp-D用于扩增gfp基因，其序列如下所示：

pBNS2-gfp-U：5’-GCCGGATCCAGTAAAGGAGAAGAA-3’（SEQ ID NO：14）

pBNS2-gfp-D：5’-GCCCTCGAGTTTGTATAGTTCAT-3’（SEQ ID NO：15）

其中，在引物pBNS2-gfp-U和pBNS2-gfp-D上分别引BamHI和XhoI酶切位点。

以质粒pTM117为模板，使用pBNS2-gfp-U和pBNS2-gfp-D引物对分别进行PCR扩增，将获得的PCR产物克隆至pMD19-T载体，重组质粒命名为pMD19-gfp。将pMD19-gfp进行琼脂糖电泳检测和测序分析，结果表明其与NCBI中序列号为gbHM151400.1的序列有100%相似性。

然后，将pMD19-gfp用BamHI和XhoI双酶切，回收并纯化gfp酶切产物片段，连接到同样经BamHI和XhoI双酶切的pBNS2载体片段中，获得重组质粒pBNS2-gfp（7483bp）。

最后，将重组质粒pBNS2-gfp按实施例2.2描述的方法电转化到枯草芽孢杆菌1A751菌株中，在含有20μg/ml的卡那霉素平板上筛选获得所需的分泌重组菌株pBNS2-gfp-1A751。

3.2、绿色荧光蛋白表达产物的鉴定

3.2.1、重组菌株培养

将实施例3.1中构建的分泌重组菌株pBNS2-gfp-1A751单克隆菌落接入10ml含有15μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃过夜培养。次日将菌液以1%的接种量转接至50mlLB液体培养基中，于37℃过夜培养。

3.2.2、荧光显微镜观察结果

如图3所示，在荧光显微镜下观察显示，重组菌株pBNS2-gfp-1A751的培养物可见绿色荧光，说明在P43启动子的作用下，绿色荧光蛋白报告基因在宿主菌枯草芽孢杆菌1A751中能够正常地表达绿色荧光蛋白，具有较好的生物学活性。

3.2.3、荧光强度的测定

将重组菌株pBNS2-gfp-1A751在LB液体培养基中，37℃下分别培养24小时和48小时，用分光光度计测定培养液的菌体浓度，8000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。沉淀用100mM的磷酸盐缓冲液（pH7.0）悬浮并清洗2次，控制终浓度OD₆₀₀等于1，超声破碎。取200μL所得上清和菌体裂解液使用酶标仪（GENios Pro）在激发波长485nm和发射波长535nm来计算绿色荧光蛋白的表达水平。以包含空载质粒pBNS2的工程菌IA751菌体作为阴性对照，结果如表1所示。

表1、绿色荧光蛋白量的检测

从表1可以看出，与阴性对照相比，重组菌pBNS2-gfp-1A751能在胞内和发酵上清液中检测到荧光强度，说明绿色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌1A751工程菌中正常表达。并且，pBNS2-gfp-1A751表达的绿色荧光蛋白大部分分泌到发酵上清液中，说明在信号肽的作用下，pBNS2表达载体能够较好地介导外源蛋白分泌至胞外表达。

3.2.4、SDS-PAGE检测结果

将重组菌株pBNS2-gfp-1A751在LB液体培养基中，37℃下分别培养不同时间，用分光光度计测定培养液的菌体浓度，8000rpm离心10min，分别收集发酵上清液。以包含空载质粒pBNS2的枯草芽孢杆菌1A751作为阴性对照，将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳。

结果如图4所示，在约26.8kDa处看到清晰条带，与预期的绿色荧光蛋白大小吻合，说明重组菌株pBNS2-gfp-1A751在发酵上清液中可正常地表达绿色荧光蛋白目的产物。

综上所述，以pBNS2作为表达载体，绿色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌1A751工程菌中都能够正常表达，并且，绿色荧光蛋白主要分泌至胞外表达。

实施例4、利用枯草芽孢杆菌表达设备表达甘露聚糖酶

4.1、用于表达甘露聚糖酶（man）的枯草芽孢杆菌工程菌的构建

首先，设计并合成引物pBNS2-man-U和pBNS2-man-D用于扩增甘露聚糖酶编码基因，其序列如下所示：

pBNS2-man-U：5’-GTCTGGATCCCATACTGTGTCGCCTGTGAAT-3’（SEQ ID NO：16）

pBNS2-man-D：5’-GGCCCTCGAGCTCAACGATTGGCGTTAAA-3’（SEQ ID NO：17）

其中，在引物pBNS2-man-U上引入BamHⅠ酶切位点，在引物pBNS2-man-D上引入XhoⅠ酶切位点。

以地衣芽孢杆菌ATCC9945a的总DNA为模板，使用pBNS2-man-U和pBNS2-man-D引物对进行PCR扩增，重组质粒命名为pMD19-man。将pMD19-man进行琼脂糖电泳检测和测序分析，结果和预期一致。

然后，将pMD19-man用BamHI和XhoI双酶切，回收并纯化man酶切产物片段，连接到同样经BamHI和XhoI双酶切的pBNS2载体片段中，构建获得重组质粒pBNS2-man。

按照实施例2.1描述的方法将重组质粒pBNS2-man化学转化到枯草芽孢杆菌1A751菌株中，在含有20μg/ml的卡那霉素平板上筛选获得所需的重组菌株pBNS2-man-1A751。

4.2、甘露聚糖酶表达产物的鉴定

按照实施例3.2.1的方法培养实施例4.1中获得的重组菌株pBNS2-man-1A751，用分光光度计测定培养液的菌体浓度，8000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。沉淀用100mM的磷酸盐缓冲液（pH7.0）悬浮并清洗2次，控制终浓度OD₆₀₀等于5，超声破碎。取200μL所得上清和菌体裂解液进行SDS-PAGE检测。以包含空载质粒pBNS2的工程菌IA751菌体作为阴性对照，结果如图5所示。

SDS-PAGE检测结果显示，在约41.5kDa处看到清晰条带，与预期的甘露聚糖酶大小吻合，并且表达的蛋白产物集中于发酵液上清液中，说明以pBNS2作为表达载体，能够很好地将蛋白产物分泌至胞外表达，有利于简化后续的分离步骤和降低生产成本。

综上所述，本发明提供的枯草芽胞杆菌表达设备可实现异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。由于枯草芽孢杆菌培养条件简单、菌种安全并且发酵生产方便，其适用于固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生内毒素及热源性脂多糖，符合国际食品安全认证。因此，本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌可应用于制备工业酶制剂、饲料酶和蛋白质药物等蛋白产品。

Claims (11)

1.一种用于在枯草芽孢杆菌内分泌表达外源蛋白的表达设备，其特征在于，所述表达设备依次包括以下元件：（1）P43启动子；（2）SD序列；（3）信号肽；（4）多克隆位点；（5）蛋白纯化标签。

2.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6283位至第6587位所示，所述SD序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6594位至第6613位所示，所述信号肽的核苷酸序列选自：如SEQ ID NO：1的第6614位至第6704位所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述多克隆位点的核苷酸序列选自：如SEQID NO：1的第6710位至第6745位所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述蛋白纯化标签包括His-Tag或c-Myc Tag。

4.如权利要求3所述的表达设备，其特征在于，所述His-Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6746位至第6769位所示，所述c-Myc Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.如权利要求1所述的表达设备，其特征在于，所述表达设备的核苷酸序列如SEQ ID NO：1的第6283位至第6769位所示。

6.含有如权利要求1～5中任一项所述表达设备的载体。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

8.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求6所述的载体和外源蛋白的编码序列。

9.一种表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌中含有如权利要求8所述的重组载体。

10.一种生产蛋白的方法，其特征在于，包括培养如权利要求9所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌，从培养物中获得外源蛋白。

11.如权利要求9所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备工业酶制剂及蛋白质药物中的应用。