CN109022476A

CN109022476A - 一种地衣芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用

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Publication number: CN109022476A
Application number: CN201810774798.3A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 周翠霞; 张会图; 李玉; 刘逸寒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN109022476B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种应用于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709的CRISPR‑Cas9基因编辑系统及其应用。所述基因编辑系统是以穿梭质粒pWH1520为载体，将所有调控元件构建于该载体上并经甲基化修饰后所得，所述调控元件包括由pS启动子控制的cas9蛋白、由pLY‑2启动子控制的sgRNA转录盒子，以及上、下游同源臂修复序列HA。所述基因编辑系统应用于地衣芽孢杆菌2709工业菌株存在效率高、设计简单、成本低等优点，基因敲除效率达到90.6％。

Description

一种地衣芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种应用于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)2709的CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用。

背景技术：

地衣芽孢杆菌是一类分布于土壤等自然环境的革兰氏阳性菌，已经被多个国际机构认定为GRAS(generally recognized as safe)工业菌株。由于地衣芽孢杆菌营养要求简单、极端环境抵抗能力强、产酶种类多、产量高、耐热性强、抑菌且安全无毒，被广泛应用于工业生产许多活性物质及酶制剂。随着生物技术的发展，尤其是基因编辑技术的发展，人们对地衣芽孢杆菌的认识不断提升，为满足实际生产需求，地衣芽孢杆菌的分子改造和遗传操作不断增多，相关工程菌被不断构建并成功应用。

基因组编辑技术作为新兴分子生物学技术，针对基因组中特定目的基因片段实现插入、删除、替换或修饰，在地衣芽孢杆菌的遗传改造方面发挥着极其重要的功能。但是传统的基因组编辑技术，如同源重组技术，效率极低(10^-6-10^-9)，且依赖于筛选标记，可能给宿主菌基因组带来不同程度的“疤痕”，极大地限制了其广泛应用。近年来发展起来的锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator like effectornucleases，TALENs)为基因靶向修饰研究，提供了有效的技术手段；但由于其依赖蛋白和基因的相互作用，蛋白的组装繁琐，费时费力费钱，对实验室的技术要求仍是一个重大挑战，这严重制约着该类技术的应用与发展。此外，虽然地衣芽孢杆菌作为表达系统性能优良，但遗传操作困难，如遗传转化效率极低、可用载体少且稳定性差。以上原因阻碍了能有效应用于地衣芽孢杆菌基因编辑技术的开发。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR associated protein 9)是2012年发展起来的由RNA介导的基因编辑技术，其融合了经典遗传学和反向遗传学的研究思路，存在设计简单、效率高、重复性好和周期短等优势，可实现连续无痕的基因编辑，迅速发展为一种应用前景广阔的基因编辑工具。但是，应用于地衣芽孢杆菌的CRISPR/Cas9系统鲜有报道，现有技术的研究思路、使用载体和应用菌株等均有差异：见表1。本发明将为充分发挥CRISPR/Cas9先进技术的作用，完善该系统的应用范围，重要工业微生物的改造，做出积极贡献。

地衣芽孢杆菌发酵工艺和产物回收技术比较成熟，是良好的外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大的应用潜力。以往表达外源蛋白主要以枯草芽孢杆菌为主，但研究发现，作为蛋白表达宿主地衣芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌有更多优势。地衣芽孢杆菌生长温度高，既节省生产能源，也可降低那些酶对结合在胞壁上的蛋白酶敏感性；此外，地衣芽孢杆菌生长速率适中，容易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分折叠。作为表达外源基因的宿主菌，地衣芽孢杆菌提供了外源基因高效稳定的细胞微环境，表达产物较稳定，适合大规模工业化生产，且在酶产量方面，其比枯草芽孢杆菌更具优势，具有成为生产工业用酶宿主菌的巨大潜力。

发明内容：

本发明将提供一种应用于地衣芽孢杆菌2709的高效基因编辑系统——CRISPR/Cas9系统，有效解决该重要工业微生物的遗传改造困难的问题，显著提高其基因编辑的效率。

一种CRISPR/Cas9基因敲除系统，是以穿梭质粒pWH1520为载体，将所有调控元件构建于该载体上并经甲基化修饰后所得，所述调控元件包括由pS启动子控制的cas9蛋白、由pLY-2启动子控制的sgRNA转录盒子，以及上、下游同源臂修复序列HA；

所述的甲基化修饰是将构建好的CRISPR/Cas9基因敲除系统转化入大肠杆菌EC135/pM.Bam后获得；所述pS启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述pLY-2启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述sgRNA转录盒子包括pLY-2启动子、sgRNA识别的靶序列N20，以及gRNAscaffold(gRNA支架)；

优选地，所述sgRNA scaffold如序列表SEQ ID NO.3所示；

本发明还提供上述CRISPR/Cas9基因敲除系统的构建方法，步骤如下：

(1)将pS启动子和cas9基因进行融合；

(2)根据目的基因设计N20，基因合成包含pLY-2启动子、sgRNA识别的靶序列N20，以及gRNA scaffoldsgRNA的转录盒子；

(3)根据目的基因设计上、下游同源臂修复序列，并融合；

(4)将步骤(1)-(3)获得的基因片段重组连接至pWH1520载体；

优选地，采用无缝克隆的方法将上述片段连接至pWH1520载体；

(5)将步骤(4)构建好的载体转至E.coli EC135感受态细胞，验证后将构建好的基因敲除载体转化入EC135/pM.Bam感受态，提取转化子质粒DNA并验证；

(6)挑取验证正确的转化子采用阿拉伯糖进行诱导培养，培养后提取重组载体质粒DNA，此即为本发明所述的CRISPR/Cas9基因敲除系统，该CRISPR/Cas9基因敲除系统经过了芽孢杆菌限制-修饰系统中质粒pM.Bam的甲基化修饰。

优选地，阿拉伯糖诱导培养的方法如下：

单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养，待OD₆₀₀达到0.2-0.3时，加入终体积分数为0.2％的阿拉伯糖诱导，30℃、220r/min振荡培养12-14h，提取经芽孢杆菌限制-修饰系统中质粒pM.Bam甲基化修饰后的重组载体质粒DNA。

本发明还提供包含上述基因敲除系统的重组菌及其应用。

将上述基因敲除系统转化入地衣芽孢杆菌2709感受态细胞，并于Tet抗性筛选平板进行培养，挑取阳性克隆进行验证，验证正确即得包含上述基因敲除系统的重组菌2709，可用于后续基因敲除等操作；

此系统在初次构建后，如需改变敲除的目的基因，只需通过更换系统中的N20和上、下游同源臂修复序列HA即可实现。

有益效果：

(1)本发明筛选了多种可电转化进入地衣芽孢杆菌2709的质粒，包括穿梭质粒pWH1520、pKSV7和枯草芽孢杆菌来源的pUB110，研究发现，三者的电转化效率分别为2272cfu/μg、13cfu/μg和215cfu/μg，三者差异明显。因此，本发明选择穿梭质粒pWH1520用于地衣芽孢杆菌2709的遗传操作载体。为验证穿梭质粒pWH1520的应用范围，进一步验证了穿梭质粒pWH1520电转化进入解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的效率，发现分别为12cfu/μg和68cfu/μg，效率远远低于进入地衣芽孢杆菌2709的转化率，说明穿梭质粒pWH1520非常适用于地衣芽孢杆菌2709的遗传操作。

(2)本研究验证和计算基因编辑情况时，采用的方法是直接从电转后Tet抗性平板上挑取单克隆，进行菌落PCR，回收测序验证敲除情况。计算四个敲除载体的基因编辑效率发现，敲除载体1和2编辑效率分别为73.3％和71.6％，敲除载体3和4的敲除效率分别为90.6％和81.7％，差异显著。以上数据说明本发明所使用的载体3取得了预料不到的技术效果。

(3)本发明将敲除载体的所有调控元件(cas9表达启动子、cas9基因、sgRNA转录盒子、同源修复序列)构建于同一载体，操作方便快捷；所用载体为穿梭质粒，电转化进入地衣芽孢杆菌2709效率较高，构建后载体可实现200-300cfu/μg，完全可满足CRISPR基因编辑系统的需要；本发明所构建的CRISPR/Cas9基因编辑体系，与应用于地衣芽孢杆菌2709工业菌株的其他基因编辑方法相比，存在效率高、设计简单、成本低等优点。

附图说明：

图1敲除载体构建流程；

图2uprT基因序列及N20位点；

图3sgRNA转录盒子设计；

图4验证结果；

其中，图4-1为质粒pS-cas9-pWH1520酶切验证结果；M：marker；1：质粒pS-cas9-pWH1520；2：SpeI单酶切；3：BglII单酶切；4：SpeI/BglII双酶切；5.NotI/BglII双酶切；

图4-2为sgRNA转录盒子PCR验证结果；M：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3～5：实验组；

图4-3为同源修复序列PCR验证结果；M：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3～5：实验组。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明筛选了几种可电转化进入地衣芽孢杆菌2709的质粒，包括穿梭质粒pWH1520、pKSV7和枯草芽孢杆菌来源的pUB110，研究发现，三者的电转化效率分别为2272cfu/μg、13cfu/μg和215cfu/μg，三者差异明显，因此本发明选择穿梭质粒pWH1520用于地衣芽孢杆菌2709的遗传操作载体。

为获取穿梭质粒pWH1520的应用范围，进一步验证了穿梭质粒pWH1520电转化进入解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的效率，发现分别为12cfu/μg和68cfu/μg，效率远远低于进入地衣芽孢杆菌2709的转化率。这说明穿梭质粒pWH1520非常适用于地衣芽孢杆菌2709的遗传操作。

地衣芽孢杆菌2709是本领域常用菌株，在各种文献中多次出现，如马永强，尹永智，杨春华，刘颖，孙冰玉。地衣芽孢杆菌2709产碱性蛋白酶的发酵动力学研究。《食品工业科技》,2010,31(6):159-161。公众可从申请人实验室获得，也可从商业机构购买获得。

本发明所使用的E.coli EC135菌株和E.coli EC135/pM.Bam菌株均来源于中国科学院微生物研究所，且已在以下文献中公开发表：Guoqiang Zhang,Wenzhao Wang,AihuaDeng,Zhaopeng Sun,Yun Zhang,Yong Liang,Yongsheng Che,Tingyi Wen.A Mimicking-of-DNA-Methylation-Patterns Pipeline for Overcoming the Restriction Barrierof Bacteria.PLOS Genetics,8:e1002987,2012。公众可从申请人实验室获得。其中E.coliEC135/pM.Bam菌株是将带有甲基转移酶(MTases)的pM.Bam质粒转化入E.coli EC135菌株获得。

以下实施例将以敲除upp编码基因uprT基因为例，构建基因敲除系统及基因敲除重组菌。

实施例1一种CRISPR/Cas9基因敲除系统及其构建

基因敲除系统构建过程见图1，具体步骤如下：

(1)将pS启动子和cas9基因通过重叠PCR进行融合；

将pS启动子和Cas9基因(SEQ ID NO.18)分别用引物pS-F/pS-R和Cas9-F/Cas9-R以质粒DNA为模板PCR扩增纯化回收后，通过重叠PCR将两片段融合在一起，再通过无缝克隆酶，重组至已双酶切(SpeI/BglII)回收的pWH1520载体，连接产物热击化转至大肠杆菌EC135。阳性克隆的酶切验证结果如图4-1，表明Cas9表达元件构建成功，进一步测序确认后，获得重组载体pS-cas9-pWH1520。

(2)基因合成sgRNA转录盒子，序列如SEQ ID NO.4所示；

所述sgRNA转录盒子包括pLY-2启动子、sgRNA识别的靶序列N20，以及gRNAscaffold；

地衣芽孢杆菌2709的upp编码基因为uprT基因(SEQ ID NO.5所示)，开放阅读框(ORF)全长630bp，为实现Cas9核酸内切酶对uprT基因内部的有效剪切，选择靠近起始密码子ATG的目标位点，通过网站Crispr RGEN Tools在线设计sgRNA识别的靶序列N20(图2)，设计时以网站上枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)数据为参考，数据分析见表1。sgRNA转录盒子(图3、SEQ ID NO.4所示)在苏州金唯智基因合成，并且转录启动子pLY-2不含RBS，启动子转录起始位点的选择通过网站BPROM Prediction of bacterial promoters分析确定。

表1靶序列分析

根据已设计合成的sgRNA转录盒子序列(图3、SEQ ID NO.4所示)，用引物sgRNA-F/sgRNA-R，以合成的基因为模板，进行PCR扩增，纯化回收后，通过无缝克隆酶连接至BglIⅠ单酶切回收的载体pS-cas9-pWH1520，连接产物热击化转至大肠杆菌EC135。阳性克隆的PCR验证结果如图4-2，表明sgRNA转录盒子构建成功，进一步测序确认后，获得重组载体pS-cas9-sgRNA-pLY-pWH1520。阳性克隆的PCR验证结果如图4-2，大小为600bp，表明sgRNA转录元件构建成功，获得重组载体pS-cas9-sgRNA-pLY-pWH1520。

(3)上、下游同源臂修复序列通过重叠PCR进行融合；

设计上下游同源臂同源修复序列时，在靶序列3’端人为丢掉2个碱基(AC)，使得uprT基因发生移码突变，进而实现uprT基因沉默敲除。以基因组为模板，分别以引物up-F/up-R和down-F/down-R将上、下游同源臂PCR扩增得到，纯化回收后，通过重叠PCR将二者融合在一起，通过无缝克隆酶，重组至已SpeI单酶切回收的pS-cas9-sgRNA-pLY-pWH1520载体，连接产物热击化转至大肠杆菌EC135。阳性克隆的PCR验证结果如图4-3，表明同源修复序列构建成功，进一步测序确认后，获得重组载体pS-cas9-HA-sgRNA-pLY-pWH1520载体。

构建成功的载体，通过热击法转化将其转入提前制备的EC135/pM.Bam感受态，并将转化后的感受态细胞涂布于100μg/mL Amp+50μg/mL Spc的抗性筛选平板，37℃倒置培养，提取转化子质粒DNA并验证。挑取新活化的验证正确的转化子单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养，待OD600达到0.2-0.3时，加入终体积分数为0.2％的阿拉伯糖诱导，30℃、220r/min振荡培养过夜，提取经芽孢杆菌限制-修饰系统中质粒pM.Bam修饰后的重组表达载体质粒，至此upp基因敲除载体构建成功。

步骤(1)-(3)连接体系和条件为：无缝克隆酶2μL，载体4μL，片段1μL，超纯水3μL，50℃反应15min。

此系统在初次构建后，如需改变敲除的目的基因，只需通过更换系统中的N20和上、下游同源臂修复序列HA即可实现，具体操作方法如下：

更换N20时，以设计好的目标位点的基因序列为模板，合成1对单链寡聚核苷酸片段，直接退火，利用Apa I和Sma I两端的同源序列分别重组连入基因敲除质粒，引导Cas9蛋白对基因组中新的目的基因的特异性切割；

更换同源修复序列(HA)时，根据基因编辑要求，合理设计上下游同源臂引物，以基因组为模板，分别将上、下游同源臂PCR扩增得到，纯化回收后，通过重叠PCR将二者融合在一起，通过无缝克隆酶，重组至已SpeI单酶切回收的pS-cas9-sgRNA-pLY-pWH1520载体，连接产物热击化转至大肠杆菌EC135。

本发明所使用的引物见下表：

表2主要引物及核苷酸序列

实施例2一种包含CRISPR/Cas9基因敲除系统的重组菌

将实施例1构建成功的upp基因敲除载体转化入地衣芽孢杆菌2709感受态细胞(吸取感受态细胞与DNA的混合物至2mm预冷的电转杯中，冰浴静置3min，电击(电压2500V)，迅速加入1mL溶液C，混匀，37℃、220r/min复苏3h；)4 000r/min离心5min，取适量涂布于20μg/mL Tet抗性筛选平板，37℃倒置培养，12h后挑取转化子单菌落于5mL LB试管，培养后通过Plasmid Mini Kit提取质粒DNA并验证，将验证正确的克隆接种至无Tet抗性的液体LB培养基中，37℃，220r/min的摇床中培养数代以丢失质粒，最终筛选Tet抗性敏感的菌株，并进行PCR验证确认，获得包含上述基因敲除系统的重组菌2709。

实施例3大肠杆菌、地衣芽孢杆菌感受态制备及转化方法

1、E.coli EC135感受态制备及转化

感受态制备：

(1)挑取新活化的EC135单菌落于5mL LB种子培养基中，37℃、220r/min，振荡培养12h；

(2)取1mL的菌液于装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃、220r/min振荡培养，使细胞达到生长对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.5)；

(3)将三角瓶中菌液冰浴10min；

(4)将菌液转移至预冷的无菌50mL离心管中，4℃冷冻离心机离心10min，转速4000r/min；

(5)无菌条件下倒掉上清液，将离心管倒置，使培养液流尽；

(6)立即用10mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞，冰浴30min，4℃冷冻离心机4 000r/min离心10min，无菌条件下弃上清；

(7)用2mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)重新悬浮细胞，在无菌条件下分装到灭菌的、预冷的1.5mL EP管中，每管80μL，于-80℃保存备用。

热击法转化EC135感受态

(1)将实施例1所得基因敲除载体在无菌条件下加入提前制备的EC135感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)42℃水浴中保温90s，立即取出置于冰上2min；

(3)每管加入提前配制的，灭菌的800μL LB复苏液，37℃、220r/min培养1h，4000r/min离心5min，取适当体积已转化的感受态细胞涂布于100μg/mL Amp抗性筛选平板，待菌液充分吸收后，37℃倒置培养；

(4)培养10h-12h长出单菌落后，挑取转化子于5mL LB试管培养后通过PlasmidMiniKit提取质粒DNA并验证。

2、地衣芽孢杆菌感受态制备及转化方法

(1)挑取新活化的地衣芽孢杆菌2709单克隆菌株于20mL LB液体培养基，37℃、220r/min摇床振荡培养12h；

(2)取600μL培养物分别接种至含有不同Gly浓度(0、0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％)的30mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养16h，测定OD600，计算不同浓度Gly对菌体生长的抑制率；

(3)取Gly抑制率在60％-75％的菌悬液2.0mL转接至50mL含相同浓度Gly的LB培养基，37℃、220r/min继续培养至OD₆₀₀＝0.5-0.6；

(4)将上述培养好的菌液冰浴10min，4℃、6 000r/min离心10min，弃上清，倒置，使培养液流尽；

(5)用预冷的溶液A重悬菌体，轻轻混匀，4℃、6 000r/min离心10min，重复3次；

(6)用预冷的溶液B重新悬浮细胞，无菌条件下分装于预冷的1.5mL EP管中，每管80μL，-80℃保存备用；

(7)取制备好的地衣芽孢杆菌2709感受态细胞，无菌条件下加入本实施例1验证正确的基因敲除载体，轻轻吹吸混匀；

(8)吸取感受态细胞与DNA的混合物至2mm预冷的电转杯中，冰浴静置3min，电击(电压2500V)，迅速加入1mL溶液C，混匀，37℃、220r/min复苏3h；

(9)4 000r/min离心5min，取适量涂布于20μg/mL Tet抗性筛选平板，37℃倒置培养，12h后挑取转化子单菌落于5mL LB试管，培养后通过Plasmid Mini Kit提取质粒DNA并验证。

溶液A：D-山梨醇0.5mol/L，D-甘露醇0.5mol/L，甘油10％，加去离子水定容，121℃灭菌20min；

溶液B：D-山梨醇0.5mol/L，D-甘露醇0.5mol/L，甘油10％，聚乙二醇-6000 14％，加去离子水定容，121℃灭菌20min；

溶液C：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，D-山梨醇0.5mol/L，D-甘露醇0.38mol/L，加去离子水定容，121℃灭菌20min。

(10)质粒丢失：为了消除阳性克隆菌体内的基因敲除载体，将克隆接种至无Tet抗性的液体LB培养基中，37℃，220r/min的摇床中培养数代，最终筛选Tet抗性敏感的菌株，并进行PCR验证确认。

实施例4效果评价

本发明考察了3种cas9表达启动子，2种sgRNA转录启动子，共组合构建了4种敲除载体(构建方法同实施例1，仅启动子不同)，具体组合形式见表3，并采用上述实施例的方法将其转化至地衣芽孢杆菌2709，进行upp基因的敲除。

表3不同敲除载体元件组成表

构建重组菌株菌株后，本发明验证和计算基因编辑情况，采用的方法是直接从电转后Tet抗性平板上挑取单克隆，以YD-F/YD-R为引物进行菌落PCR，回收测序验证敲除情况。计算四个敲除载体的基因编辑效率发现，敲除载体1和2编辑效率分别为73.3％和71.6％，二者无显著差异，敲除载体3和4的敲除效率分别为90.6％和81.7％，差异显著。通过比较得出，载体3即本发明所述敲除载体对地衣芽孢杆菌2709的基因编辑优势显著。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种地衣芽孢杆菌CRISPR Cas9基因编辑系统及其应用

<130> 1

<141> 2018-07-12

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gtcacaatgc gccatcaaac cgttgacaag cgtccccgtc agatggccgg gagccggatg 60

aaccaccatt ccgcgcggct tgttgacgac aagaacgtcc tgatcttatt ataatataag 120

caaaaaactc ataaaaagga aaagcattga cctgaaaact tatcggtaaa gtatgatata 180

atacaaaaag accgattaga ggggagagag gaaac 215

<210> 2

<211> 596

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cattatgttt gaatttccgt ttaaagaatg ggctgcaagc cttgtgtttt tgttcatcat 60

tatcttatat tactgcatca gggctgcggc atccggaatg ctcatgccga gaatagacac 120

caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata gaatcaattg cggtcgcctt 180

tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc catacattct tcgcttggct 240

gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg tttctgcttc ggtatgtgat 300

tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata aaaaagaaat catctttttt 360

gtttggaaag cgagggaagc gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat 420

ttgtattcac tctgccaagt tgttttgata gagtgattgt gataatttta aatgtaagcg 480

ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaaga 596

<210> 3

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83

<210> 4

<211> 517

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agatctcatt atgtttgaat ttccgtttaa agaatgggct gcaagccttg tgtttttgtt 60

catcattatc ttatattact gcatcagggc tgcggcatcc ggaatgctca tgccgagaat 120

agacaccaaa gaagaactgc aaaaacgggt gaagcagcag cgaatagaat caattgcggt 180

cgcctttgcg gtagtggtgc ttacgatgta cgacaggggg attccccata cattcttcgc 240

ttggctgaaa atgattcttc tttttatcgt ctgcggcggc gttctgtttc tgcttcggta 300

tgtgattgtg aagctggctt acagaagagc ggtaaaagaa gaaataaaaa agaaatcatc 360

ttttttgttt ggaaagcgag ggaagcgttc acagtttcgg gcgggcccta catccgggac 420

gtaaagacgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt 480

gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tcccggg 517

<210> 5

<211> 630

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis 2709)

<400> 5

atgggaaagg tatatgtgtt tgatcaccct cttatacagc ataagcttac atacatccgg 60

gacgtaaaga ccggaacgaa agaattcaga gagcttgttg atgaggttgc aacgctgatg 120

gcatttgaga ttacgcgaga cctgccgctg gaggaagtga atgtagagac tcctgtgcaa 180

atggcaaagt caaacgtcat cgccggaaaa aaactcgggg ttgttccgat tctgagagca 240

gggcttggaa tggtagacgg aattttgaag ctgattcctg ctgcaaaagt cggacatgtc 300

gggctttacc gtgatcctga aacattgaag cctgttgagt attatgtcaa gcttccatcc 360

gatgttgaag aacgcgaatt catcgtcgtc gatccgatgc tggcaaccgg aggttcggcg 420

gtagaggcgc tgaacagctt gaaaaaacgc ggcgcaaaaa atatccgctt tatgtgtctg 480

atcgctgccc cggaaggtgt agacgaagtg cagaagcatc atcctgacgt tgacatttac 540

attgccgctc tggatgaaaa actaaatgaa aaaggatata tcgttcccgg attgggcgac 600

gccggagacc gcatgttcgg aacgaaataa 630

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gacaaatggt ccaaactagt gtcacaatgc gccatcaaac 40

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cttttttatg tactgtgcgg ccgcgtttcc tctctcccct ctaatcg 47

<210> 8

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cgctaacgcg gccgcacagt acataaaaaa ggagacatga acgatggata agaaatactc 60

aataggctta gatatc 76

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

aattcatcga tatctagatc ttcagtcacc tcctagctga ctcaaa 46

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gacaaatggt ccaaactagt gaaaaaagag ggtatcgagc tcg 43

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gatggcgcat tgtgacacta gtccgggaac gatatatcct ttttc 45

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

catccgggac gtaaagcgga acgaaagaat tcagagagc 39

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

caataatgct gagctcacta gtccgggaac gatatatcct ttttc 45

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ctaggaggtg actgaagatc tcattatgtt tgaatttccg 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

caattcatcg atatctagat ctcccgggaa aaaaagcacc 40

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ggacgaattc aaaacatatg ccc 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

cattatttcg ttccgaacat gcg 23

<210> 18

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280

attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340

atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400

gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460

gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520

attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580

gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640

aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700

acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760

ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820

actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880

aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940

taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000

tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060

atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120

aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180

cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240

gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300

cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360

gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420

tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480

aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540

tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600

tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660

caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720

cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780

cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840

attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900

ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960

cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020

gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080

gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107

Claims

1.一种CRISPR/Cas9基因敲除系统，其特征在于，所述基因敲除系统是以穿梭质粒pWH1520为载体，将所有调控元件构建于该载体上并经甲基化修饰后所得，所述调控元件包括由pS启动子控制的cas9蛋白、由pLY-2启动子控制的sgRNA转录盒子，以及上、下游同源臂修复序列HA。

2.如权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因敲除系统，其特征在于，所述的甲基化修饰是将构建好的CRISPR/Cas9基因敲除系统转化入大肠杆菌EC135/pM.Bam后获得。

3.如权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因敲除系统，其特征在于，所述pS启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述pLY-2启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

4.如权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因敲除系统，其特征在于，所述sgRNA转录盒子中的sgRNA scaffold如序列表SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因敲除系统的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将pS启动子和cas9基因的融合片段、sgRNA转录盒子以及上、下游同源臂修复序列重组连接至pWH1520载体构建重组载体；

(2)将步骤(1)构建好的重组载体转化入EC135/pM.Bam感受态，并经阿拉伯糖进行诱导培养后提取重组载体质粒DNA，此即为本发明所述的经过了芽孢杆菌限制-修饰系统中质粒pM.Bam甲基化修饰的CRISPR/Cas9基因敲除系统。

6.如权利要求5所述的一种CRISPR/Cas9基因敲除系统的构建方法，其特征在于，阿拉伯糖诱导培养的方法如下：

7.包含权利要求1-4任意一项所述CRISPR/Cas9基因敲除系统的重组菌株，其特征在于，所述重组菌的宿主细胞为地衣芽孢杆菌2709。

8.权利要求7所述重组菌株的应用。