JP2002078491A - 青枯病菌由来の挿入配列因子 - Google Patents

青枯病菌由来の挿入配列因子

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JP2002078491A
JP2002078491A JP2000310193A JP2000310193A JP2002078491A JP 2002078491 A JP2002078491 A JP 2002078491A JP 2000310193 A JP2000310193 A JP 2000310193A JP 2000310193 A JP2000310193 A JP 2000310193A JP 2002078491 A JP2002078491 A JP 2002078491A
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Akira Hasebe
亮 長谷部
Kenichi Tsuchiya
健一 土屋
Mitsuo Hotta
光生 堀田
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 農業上重要な関連細菌の挿入配列因子を提供
すること。 【解決手段】 トランスポゾントラップベクターを用い
て単離された青枯病菌（Ralstonia solanacearum）ゲノ
ム由来の３つの挿入因子およびそれらにコードされるト
ランスポザーゼを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、青枯病菌（Ralsto
nia solanacearum）のゲノムより単離された転移因子お
よびこの転移因子によってコードされるトランスポザー
ゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】転移因子は、ゲノム上を動き回ることに
よって、転移した前後の遺伝子を不活性化または活性化
するのみならず、多様なゲノム再編成（欠失、反転、重
複など）を引き起こすことが知られている。また、これ
らの転移因子が微生物の進化および環境適応にとって重
要なゲノム可塑性（genome plasticity）を生み出して
いることが知られている（Arberら，FEMS Microb. Eco
l.，15:5-14(1994)）。
【０００３】転移因子は、トランスポゾンと挿入配列因
子とに大きく分類することができる。トランスポゾン
は、転移に関与する遺伝子の他に、抗生物質耐性などの
表現形質遺伝子を有する遺伝子と定義され、他方、挿入
配列因子（Insertion sequenceelement、以下、ＩＳ因
子という）は、大きさが一般的に２ｋｂ以下で、遺伝子
の転移に関わる以外の表現形質遺伝子を持たない遺伝子
として定義されている（Gayら, J.Bacteriol.，164:918
-921(1985)）。
【０００４】このＩＳ因子は、大腸菌の突然変異を引き
起こす因子として、1960年代後半に最初に発見された。
その後、大腸菌群を中心に、ＩＳ因子の単離と性状解析
が進められた。1980年代後半になると、大腸菌群以外の
細菌からもＩＳ因子の単離の報告がなされるようにな
り、現在では、医学細菌、環境細菌などから、500前後
のＩＳ因子が単離されたことが報告されている（Mahill
onら，Microbiol. Mol.Bio. Rev., 62:725-774(199
8)）。
【０００５】単離されたＩＳ因子は、その塩基配列およ
び推定されるアミノ酸配列をもとに相互の比較が進めら
れ、現在までに得られたＩＳ因子は、１７のファミリー
に類別されている。このうちＩＳ３ファミリーおよびＩ
Ｓ５ファミリーは大ファミリーであり、グラム陰性細菌
からグラム陽性細菌までの幅広い範囲の細菌から、この
ファミリーに属するＩＳ因子が単離されている（Mahill
onら，前出）。
【０００６】ＩＳ３およびＩＳ５ファミリーにおけるＩ
Ｓ因子の構造の特徴は、末端に逆向きの反復配列が存在
し、さらにトランスポザーゼをコードする２つのオープ
ンリーディングフレームを有することである。末端逆向
き反復配列は、この部分で組換えが起きることから、転
移に重要な役割を果たしていると考えられる。例えば、
挿入の際、挿入を受けた部位の２〜１３塩基対がＩＳ因
子の両側に同方向反復配列として重複される（Galasお
よびChandler, Mobile DNA, 109-162, ASM Press (Wash
ington,D.C.) 1989）。
【０００７】トランスポザーゼは、遺伝子の挿入反応を
触媒する酵素である。ＩＳ３ファミリーおよびＩＳ５フ
ァミリーのＩＳ因子において、トランスポザーゼは２つ
のオープンリーディングフレームによりコードされてお
り、翻訳の際に１つのタンパク質として発現される。例
えば、ＩＳ３ファミリーの場合、２つのオープンリーデ
ィングフレームは重複しており、重複部分でフレームシ
フトが起こり、２つのオープンリーディングフレームが
連続して翻訳されることにより、トランスポザーゼが発
現される（OhtsuboおよびSekine, Current topics in M
icrobiology and Immunology,204:1-26 (1996)）。
【０００８】ところで、種々の微生物から得られるＩＳ
因子は、それぞれホモロジーはあるものの、各微生物に
特有の配列を有している。そこで、この特有の配列を利
用して、微生物が関与する農業、食品、医療などの産業
分野において、例えば、植物病原菌の同定、感染症の診
断、伝染経路の解明、あるいは有用遺伝子の単離に利用
されている。最も実用的に使われているＩＳ因子は、結
核菌（Mycobacteriumtuberculosis）から得られたＩＳ6
110であり、結核菌の診断、伝染経路の解明など、疫学
調査にも貢献している（Otalら, J.Clin.Microbiol.，2
9:1252-1254(1991)）。類似の試みは、多くの細菌で進
められている。
【０００９】ＩＳ因子の特徴として、転移を起こすこと
で、挿入した前後の遺伝子を活性化するか不活性化する
ことができる。この機能を積極的に利用して、有用遺伝
子を単離するための道具として、ＩＳ因子を利用する試
みも進められている（Haasら，Molecular Biology of P
seudomonas，238-249，ASM Press (Washington D.C.)(1
996)）。
【００１０】ところで、ＩＳ因子の単離は、戦略的に進
められてきたというよりは、突然変異株の解析によって
偶然に得られてきたものがほとんどである。これは、そ
の定義からもわかるように、ＩＳ因子には遺伝子転移に
関わる以外の表現形質がないため、積極的な単離が困難
であったためである。転移因子のポジティブセレクショ
ン（ある構造遺伝子の一部に転移因子が転移することに
よって、検出マーカーが活性化することを利用する手
法）が1985年に報告されて以来（Gayら，前出）、類似
のトランスポゾントラップベクターが開発され、現在ま
でにAgrobacterium tumefaciens、Pseudomonas cepaci
a、Rhizobium meliloti、Rhizobium leguminosarumなど
の細菌からこの手法でＩＳ因子が単離されるようになっ
た。
【００１１】しかし、この手法によるＩＳ因子の単離数
は20数個にすぎず、全体の単離総数から比べればわずか
である。今後、ポジティブセレクション手法の開発を受
けて、多様な菌からの新たなＩＳ因子の単離が加速化す
るものと予測される。
【００１２】農業上重要な植物関連細菌については、長
谷部らがトランスポゾントラップベクターpSHI1063（Ha
sebeら, Plasmid, 39:196-204(1998)）を用いて、わが
国のイネの重要病原細菌であるイネもみ枯細菌病菌（Ps
eudomonas glumae）から３種類のＩＳ因子を単離してい
る（特開平１０−２４８５７３）。しかし、その他のＩ
Ｓ因子の単離研究がほとんど進められていないのが実状
である。種々の植物病原細菌（微生物）のＩＳ因子が単
離されれば、その病原菌対策が可能になるので、農業分
野においては、ＩＳ因子の単離およびその利用が望まれ
ている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明では、
野菜の重要病原細菌の１つである青枯病菌（Ralstonias
olanacearum）に由来する新たなＩＳ因子を提供するこ
とを目的とする。青枯病菌は、トマト、タバコ、バレイ
ショなどのナス科植物をはじめ３０数科１００余種の植
物に対して萎ちょう性導管病を引き起こす、世界的に重
要な土壌伝染性植物病原細菌である。さらに、これらの
ＩＳ因子によってコードされるトランスポザーゼを提供
することも目的とする。これらのＩＳ因子およびトラン
スポザーゼの提供により、例えばトランスポザーゼを失
活するように組換えるなど、青枯病菌に対する感染防止
が可能となり、農業分野に極めて有益である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、青枯病菌（Ralstonia solanacearu
m）から新たなＩＳ因子を単離することに成功し、本発
明を完成した。
【００１５】本発明は、末端逆向き反復配列として、
５’末端に配列番号２の塩基配列および３’末端に配列
番号３の塩基配列を有し、そしてこれらの末端逆向き配
列の間にオープンリーディングフレームとして、配列番
号４および配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含む、挿入配列因子またはその機能的等価物を提
供する。ここで、オープンリーディングフレームは、重
複して、または独立して存在することができる。
【００１６】本発明は、さらに、配列番号１の塩基配列
からなる挿入配列因子を提供する。
【００１７】さらに、本発明は、末端逆向き反復配列と
して、５’末端に配列番号７の塩基配列および３’末端
に配列番号８の塩基配列を有し、そしてこれらの末端逆
向き配列の間にオープンリーディングフレームとして、
配列番号９および配列番号１０のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を含む、挿入配列因子またはその機能的等
価物を提供する。ここで、オープンリーディングフレー
ムは、重複して、または独立して存在することができ
る。
【００１８】本発明は、さらに、配列番号６の塩基配列
からなる挿入配列因子を提供する。
【００１９】さらに、本発明は、末端逆向き反復配列と
して、５’末端に配列番号１２の塩基配列および３’末
端に配列番号１３の塩基配列を有し、そしてこれらの末
端逆向き配列の間にオープンリーディングフレームとし
て、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含む、挿入配列因子またはその機能的等価物を提供す
る。
【００２０】本発明は、さらに、配列番号１１の塩基配
列からなる挿入配列因子を提供する。
【００２１】本発明は、また、配列番号１の５６位〜８
５５位の塩基配列から発現されるトランスポザーゼまた
はその機能的等価物を提供する。
【００２２】本発明は、また、配列番号６の６５位〜８
２２位の塩基配列から発現されるトランスポザーゼまた
はその機能的等価物を提供する。
【００２３】本発明は、また、配列番号１１の４４位〜
８６５位の塩基配列から発現されるトランスポザーゼま
たはその機能的等価物を提供する。
【００２４】
【発明の実施の形態】（１）定義 本発明において、「ＩＳ因子」とは、大きさが２ｋｂ以
下で、遺伝子の転移に関わる遺伝子以外に発現形質遺伝
子を有さず、トランスポザーゼをコードする１つまたは
２つのオープンリーディングフレームおよび末端逆向き
反復配列を含む遺伝単位をいう。
【００２５】ISJsp104.2は、配列番号１の塩基配列から
なるＩＳ因子である。
【００２６】ISmsp4.2は、配列番号６の塩基配列からな
るＩＳ因子である。
【００２７】ISmsp101.3は、配列番号１１の塩基配列か
らなるＩＳ因子である。
【００２８】本発明において、「トランスポザーゼ」と
は、遺伝子の挿入反応を触媒する酵素をいう。
【００２９】本明細書中で使用する「機能的等価物」と
は、元のＩＳ因子またはトランスポザーゼの機能または
活性を実質的に有し、そして元のＩＳ因子またはトラン
スポザーゼと最適に並べ合わせた場合に、それぞれ塩基
配列またはアミノ酸配列において９０％以上、好ましく
は９５％以上のホモロジーを有するＩＳ因子またはトラ
ンスポザーゼをいう。
【００３０】このようなＩＳ因子の機能的等価物は、機
能部位である末端逆向き反復配列またはオープンリーデ
ィングフレームにおいて、元の配列に加えて、1つ以上
のヌクレオチドの置換，付加、欠失、または挿入を含
み、かつ、元のＩＳ因子あるいはトランスポザーゼと少
なくともほぼ同等の機能あるいは活性を有するものをい
う。このような機能的等価物の例として、コードするト
ランスポザーゼのアミノ酸の保存的置換を引き起こすヌ
クレオチド置換を有するＩＳ因子、オープンリーディン
グフレーム内に介在ヌクレオチドを有するＩＳ因子など
が挙げられる。
【００３１】また、このようなトランスポザーゼの機能
的等価物は、元の配列に加えて、1つ以上のアミノ酸の
置換（好ましくは保存的置換）、またはさらなるアミノ
酸（例えば、リーダー配列、分泌配列、精製の際にあれ
ば有利な配列など）を含んでもよい。これらの機能的等
価物の作製は、十分に当業者の通常知り得る技術範囲内
にあると考えられる。
【００３２】（２）転移因子の探索方法 転移因子の探索においては、分子生物学的実験手法（Ｄ
ＮＡの電気泳動、電気泳動したＤＮＡをゲルから回収す
る方法、制限酵素消化、ＰＣＲ、ＤＮＡの放射標識、ハ
イブリダイゼーション、塩基配列決定など）が用いられ
るが、これらの手法としては、例えば、Sambrookら, A
Laboratory Manual，第2版, Cold Spring Harbor Pres
s, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されて
いるような、当業者が通常用いる手法が採用される。
【００３３】（ａ）使用細菌 本発明においては、青枯病菌（Ralstonia solanacearu
m）が用いられる。好ましい菌株としては、Ralstonia s
olanacearum MAFF301556株が挙げられる。この菌株は、
1983年に長崎県でバレイショから分離された青枯病菌で
ある。この菌株は、農林水産省ジーンバンク（茨城県つ
くば市観音台２丁目１番２号）に配布可能株として登録
されており、微生物遺伝資源としての利用を図るため、
試験研究用として、誰でも入手可能である。
【００３４】（ｂ）原理 転移因子を単離するための手段として、トランスポゾン
トラップベクターを用いる。本発明では、トランスポゾ
ントラップベクターとして、pSHI1063を使用する（飯田
ら, 第14回日本分子生物学会講演要旨, p216(1991)）。
トラップベクターpSHI1063は、全長11.5kb、Pseudomona
s aeruginosaの広宿主域プラスミドpVS1と大腸菌のプラ
スミドpBR322との融合プラスミドである。このトラップ
ベクターpSHI1063は、大腸菌、Pseudomonas属細菌、Agr
obacterium属、Rhizobium属などの広範囲のグラム陰性
細菌での増殖が可能である。このトラップベクターpSHI
1063は、さらに、選択マーカー遺伝子としてアンピシリ
ン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を有
している。そして、転移因子をトラップするため、λフ
ァージのｃＩリプレッサー遺伝子およびその制御下にあ
るＰＲプロモーターに連結されたカナマイシン耐性遺伝
子（neo）を有している（これをトラップカセット遺伝
子と呼ぶ）。このトラップベクターpSHI1063を細菌に導
入した後、その細菌の有するIＳ因子などの転移因子が
このトラップベクターpSHI1063中のｃＩリプレッサー遺
伝子内に転移すると、トラップベクター中のｃＩリプレ
ッサーが不活性化されて、ＰＲプロモーターが活性化さ
れ、カナマイシン耐性遺伝子が作動する。従って、トラ
ップベクターpSHI1063のｃＩリプレッサー遺伝子内に転
移因子が存在する場合、細菌はカナマイシン耐性となる
ため、効率的な転移因子の選抜が可能となる。
【００３５】（ｃ）転移因子の取得 上記原理に基づいて、トラップベクターpSHI1063をRals
tonia solanacearum MAFF301556株に導入し、選択した
カナマイシン耐性株を培養し、例えば、１００℃、５分
間煮沸し、菌体を破砕し、ＤＮＡを抽出した後、トラッ
プカセット遺伝子の配列をプライマーとしてＰＣＲを行
い、転移因子を有するＤＮＡ断片を増幅する（Sambrook
ら、前出）。
【００３６】（ｄ）転移因子の塩基配列の決定 次に、増幅、回収された挿入配列の塩基配列を決定す
る。まず、（ｃ）で得られる転移因子を含むＰＣＲ増幅
産物から目的のＤＮＡ断片の調製を行い、適切なベクタ
ー、例えば、pT7Blueベクターにサブクローニングす
る。得られるポジティブクローンからプラスミドＤＮＡ
を調製し、塩基配列決定の鋳型とし、このプラスミドＤ
ＮＡについて、例えば、Primer Walking法を用いて両ス
トランドの塩基配列が決定される。塩基配列の決定に
は、例えば、オートシークエンサー（ＡＢＩ社製モデル
1377）が用いられる。
【００３７】（ｅ）単離された転移因子のホモロジー検
索 塩基配列の決定された転移因子について、データベース
（DNA Information and Stock Center, URL＝http://ww
w.dna.affrc.go.jp）を用いて、塩基配列ホモロジーお
よびアミノ酸配列ホモロジーの検索を行い、新規遺伝子
の特徴づけを行う。以上のようにして、転移因子が選択
される。
【００３８】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明する。 （実施例１）Ralstonia solanacearum MAFF301556株
（以下、単に「MAFF301556株」という）の有する転移因
子の探索を行った。転移因子の探索には、トランスポゾ
ントラップベクターが必要であり、本発明ではpSHI1063
を用いた。
【００３９】まず、MAFF301556株を、PTYG寒天培地（蒸
留水1000ml中、バクトペプトン0.25g、バクトトリプト
ン0.25g、バクト酵母エキス0.5g、ブドウ糖0.5g、MgSO
４・7H ２O 30mg、CaCl２・2H２O 3.5mg、寒天粉末15g）上
で、28℃にて生育させた。生育したコロニーを５mlのPT
YG液体培地に植菌し、28℃で２日間振とう培養した。
【００４０】この培養液からコンピテントセルを作成し
た。培養液４mlを200mlのPTYG培地に加え、28℃でＯＤ
５００が約0.2になるまで振とう培養した。培養後、培
養液を氷中に20分間おいた後、遠心分離して（3000rpm/
10分/４℃）集菌した。菌体を10mlの氷冷した１mM HEPE
S・NaOH緩衝液（pH7.0）に懸濁し、再度遠心分離して集
菌し、菌体を10mlの氷冷した１mM HEPES・NaOH緩衝液（p
H7.0）に懸濁した。遠心分離によって（8000rpm/10分/
４℃）集菌して、菌体を２mlの氷冷した10％グリセロー
ル溶液に懸濁し、コンピテントセルを調製した。
【００４１】得られたコンピテントセルを40μlとり、
ＴＥ緩衝液（10mM Tris・HCl（pH8.0）−１mM EDTAに溶
解した約0.36μgのトランスポゾントラップベクターpSH
I1063（液量１μl）を混合し、予め４℃で冷却したキュ
ベットに移した。バイオラッド社製高電圧パルス発生装
置「ジーンパルサー」を用いて、このキュベットに電気
パルスを加えた。電気パルスの条件は、電気抵抗200
Ω、電気容量25μFD、電場6.25KV/cmであった。
【００４２】パルスをかけた後、細胞／ＤＮＡ混合液を
すばやく２mlのPTYG培地に移し、28℃で１時間振とう培
養し、遠心分離（8000rpm/10分/４℃）して、菌体を１m
lの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液を滅菌蒸留水により
順次10倍希釈し、10−４までの菌体希釈液を得た。その
100μlをとり、スペクチノマイシン100μg/mlを含むPTY
G寒天プレートに播いた。また、形質転換効率を確認す
るためにコントロールとして抗生物質を含まないPTYG寒
天プレートにも同数の菌を播いた。これを28℃で２日間
培養した。出現したスペクチノマイシン耐性の形質転換
コロニーを白金耳を用いて、再度スペクチノマイシンを
含むPTYGプレートに塗布し、28℃で２日間培養し、シン
グルコロニーを形成させた。Ralstonia solanacearum M
AFF301556株へのpSHI1063の形質転換効率は、５×10
−４であった。
【００４３】次に、シングルコロニーを形成したスペク
チノマイシン耐性のコロニーを白金耳で１個ずつ拾い、
100μg/mlのスペクチノマイシンを含む５mlのPTYG培地
に植え、28℃で２日間振とう培養した。培養後、懸濁液
を滅菌蒸留水で順次10倍希釈し、懸濁液原液から10−６
希釈液までの菌体希釈液100μlを、50μg/mlのカナマイ
シンおよび100μg/mlのスペクチノマイシンを含むPTYG
寒天プレートに塗布した。変異株の出現効率を確認する
ために、コントロールとして100μg/mlのスペクチノマ
イシンを含むPTYG寒天プレートに同数の菌を播いた。こ
れを28℃で２日間培養した。得られたカナマイシン耐性
の形質転換コロニーを、白金耳を用いて、再度50μg/ml
のカナマイシンおよび100μg/mlのスペクチノマイシン
を含むPTYGプレートに塗布し、シングルコロニーを形成
させた。
【００４４】得られた形質転換体からの変異体出現率
は、約100％から６×10−７と幅があり、形質転換クロ
ーンによって大きく異なった。この形質転換体から得ら
れた９７個の変異体を以下の検討に用いた。
【００４５】常法により、pSHI1063のトラップカセット
遺伝子配列をもとに作成された多種類のプライマーを用
いて、９７個の変異体について、ＰＣＲ法により挿入配
列のＤＮＡ断片の増幅を行った。増幅にはＤＮＡ増幅装
置（ASTEC社製PC800）を用い、94℃−１分（ＤＮＡ変
性）、55℃−２分（アニーリング）、72℃−３分（ＤＮ
Ａ伸長）のサイクルを25回行った。ＰＣＲ反応後、反応
液より１μlをとり、アガロース電気泳動（1.5％アガロ
ース）によりＤＮＡ増幅の確認を行った。
【００４６】その結果、７１個のカナマイシン耐性変異
体のプラスミドにはＤＮＡの挿入は見出されなかった
が、２６株の変異体から得られたプラスミドには、トラ
ップベクターpSHI1063にＤＮＡ断片が挿入されているこ
とが確認された。このプラスミドを上流から下流に６領
域（ｃＩ遺伝子の最上流域より、neo遺伝子の上流まで
をＩ〜VI領域に分割）に分け、どの領域にＤＮＡが挿入
されたかを調べたところ、２６の変異体のうち、Ｉ領域
に３個、II領域に1４個、III領域に２個、IV領域に６
個、およびＶ領域に１個の挿入が見られたが、VI領域に
は、ＤＮＡは挿入されていなかった（図１）。
【００４７】つぎに、２６個の変異体から得られたプラ
スミドの塩基配列を決定した。得られたＰＣＲ反応産物
から挿入されたＤＮＡ断片を切り出し、pT7Blueベクタ
ーにサブクローニングを行った。得られたポジティブク
ローンからプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列決定の
鋳型とした。このプラスミドＤＮＡについてPrimer Wal
king法を用いる両ストランドの塩基配列決定をオートシ
ークエンサー（ABI社製モデル1377）を用いて行った（S
ambrookら, 前出）。
【００４８】塩基配列が決定されたＤＮＡ断片につい
て、市販のデータベース（DNA Information and Stock
Center, URL＝http://www.dna.affrc.go.jp）を用い
て、塩基配列ホモロジーおよびアミノ酸配列ホモロジー
の検索を行い、遺伝子の特徴づけを行った。結果を表１
に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】その結果、転移因子として、３つの新規Ｉ
Ｓ因子（ISJsp104.2、ISmsp4.2、およびISmsp101.3）が
単離された。その性状は、以下のとおりである。 （ａ）ISJsp104.2 ISJsp104.2は、配列番号１の塩基配列からなる全長864b
pの塩基配列であり、末端に不完全逆向き反復配列（19b
p）があった（図２の下線矢印部分、配列番号２および
３）。ISJsp104.2の両端には、3bpの標的重複配列がつ
ながっており、その配列はTTAであった（図２のボック
スで囲んだ部分）。塩基配列のホモロジー比較からISJs
p104.2は、ＩＳ５ファミリーのIS427サブグループに属
するＩＳ因子（Mahillonら, 前出）であるIS1418（Burk
holderia glumae）と74.8％、ISB111（Ralstonia solan
acearum）と70.9％、およびIS402（Burkholderia cepac
ia）と59.5％の高い相同性を有する。したがって、ISJs
p104.2は、ＩＳ５ファミリーのIS427サブグループに属
する、Ralstonia solanacearumより得られた新規なＩＳ
因子であると考えられる。
【００５１】（ISJsp104.2がコードするトランスポザー
ゼ）ISJsp104.2の塩基配列解析およびアミノ酸配列ホモ
ロジー解析を行い、このＩＳ因子が他のＩＳ因子と同様
に、トランスポザーゼをコードすることを確認した。ISJ
sp104.2は、ＩＳ３およびＩＳ５ファミリーで一般的に
見られるように（Mahillonら, 前出）、トランスポザー
ゼ（転移酵素）をコードすると考えられる２つのオープ
ンリーディングフレーム（ORFA、ORFB）を有する。これ
らは一部重複し、かつフレームシフトしている（図
２）。さらに、重複部分の塩基配列には、フレームシフ
トに関与すると推定される特徴的なモチーフ（Ｃ
５Ｇ６）がある（図２の下線部分）（Iversenら，Plasm
id 32:46-54(1994)）。ORFAは、134アミノ酸より構成さ
れ（配列番号４）、またORFBは、211アミノ酸より構成
されていた。配列番号５）。また、ISJsp104.2のORFAお
よびORFBは、それぞれIS1418のORFAおよびORFBと70％以
上のアミノ酸配列のホモロジーを有していた。
【００５２】（ｂ）ISmsp4.2 ISmsp4.2は、配列番号６からなる全長842bpの塩基配列
であり、末端に不完全逆向き反復配列（18bp）があった
（図３の下線矢印部分、配列番号７および８）。ISmsp
4.2の両端には、3bpの標的重複配列がつながっており、
その配列はTAAであった（図３のボックスで囲んだ部
分）。塩基配列のホモロジー比較から、ISmsp4.2は、Ｉ
Ｓ５ファミリーのIS427サブグループに属するＩＳ因子
（Mahillonら,前出）であるIS427（Agrobacterium tume
faciens）と56.7％、およびIS298（Caulobacter cresce
ntus）と54.9％の相同性を有する。したがって、ISmsp
4.2は、ＩＳ５ファミリー、IS427サブグループに属する
Ralstonina solanacearumより得られた新規なＩＳ因子
であると考えられる。
【００５３】なお、ISmsp4.2およびISmsp104.2は、ＩＳ
５ファミリー、IS427サブグループに両者とも属する
が、両者の相同性は低く、50％以下であった。
【００５４】（ISmsp4.2がコードするトランスポザー
ゼ）ISmsp4.2にも、トランスポザーゼをコードすると考
えられる２つのオープンリーディングフレーム、ORFA(1
16アミノ酸)（配列番号９）およびORFB（159アミノ酸）
（配列番号１０）があり、ＩＳ５ファミリー、IS427サ
ブグループに属する他のＩＳ因子と同様に、ORFAおよび
ORFBは一部重複し、そしてフレームシフトしていた（図
３）。また、重複部分の塩基配列には、フレームシフト
に関与すると推定される特徴的なモチーフ（Ａ６Ｇ）が
あった（図３の下線部分）（OhtsuboおよびSekine, 前
出）。ORFAおよびORFBとも、他のＩＳ因子とのアミノ酸
配列ホモロジーが高いものがなく、いずれも40％以下で
あった。
【００５５】（ｃ）ISmsp101.3 ISmsp101.3は、配列番号１１からなる全長884bpの塩基
配列であり、末端に不完全逆向き反復配列（18bp）があ
った（図４の下線矢印部分、配列番号１２および１
３）。ISmsp101.3の両端には、3bpの標的重複配列がつ
ながっており、その配列はTAAであった（図４のボック
スで囲んだ部分）。塩基配列のホモロジー比較から、IS
msp101.3は、ＩＳ５ファミリー、IS1031サブグループに
属するＩＳ因子（Mahillonら, 前出）であるIS12528（G
luconobacter suboxydans）と67.6％、ISRlF7-2（Rhizo
bium leguminosarum）と56.6％、ISRm220-12-1（Sinorh
izobium meliloti）と56.5％、およびIS1031（Acetobac
ter xylinum）と54.6％の相同性を有する。したがっ
て、ISmsp101.3は、ＩＳ５ファミリー、IS1031サブグル
ープに属するRalstonina solanacearumより得られた新
規なＩＳ因子であると考えられる。
【００５６】（ISmsp101.3がコードするトランスポザー
ゼ）ISmsp101.3にも、トランスポザーゼをコードすると
考えられる１つのオープンリーディングフレーム、ORFA
(274アミノ酸)（配列番号１４）があり、ＩＳ５ファミ
リー、IS1031サブグループに属するIS12528のORFA274と
71.1％もの高いアミノ酸配列ホモロジーがあった。
【００５７】
【発明の効果】トランスポゾンなどの「動く遺伝子」
（転移因子）は、生物ゲノム自身の自己改変のセルフメ
カニズムとして生物の進化および環境適応に大きく関与
している可能性が指摘されている。本発明の遺伝子は、
微生物のゲノム上を動き回り、飛び込んだゲノムの下流
の遺伝子を活性化または不活性化する性質を有する。こ
の性質を利用して、産業上有用な遺伝子などの単離を効
率的に行うことが可能となる。また、これらの遺伝子を
用いることにより、Ralstonina solanacearumについて
の伝染経路の解明、菌の同定などが可能となり得る。ま
た、本発明のトランスポザーゼを用いて転移因子の転移
機能を促進させることにより、産業上有用な遺伝子など
の単離の効率化が図られるほか、Ralstonina solanacea
rumの変異誘発による病原性の低下促進などの防除剤的
効果が見込まれる。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Institute of Agrobiological Resources Ministr y of Agriculture Forestry and Fisheries <120> Insertion sequence element from Ralstonina solanacearum <130> P100N07196 <160> 14 <210> 1 <211> 864 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <220> <221> CDS <222> (56)...(855) <400> 1 gggccgctaa caaaaccaag tcatcgaacg caggtggttg agcgttgttg ttggcatggc 60 acgaaagaag atcagcaatg aactgtggaa ggcgttgcaa ccgctgctgc cggttgtgga 120 gccttcgacc aaaggcggtc gtccgcgcgt ggatgatcgg gcggcgctga acggcatcct 180 gtttgttctg cataccggta tcccgtggga agacctgcct aaagaactgg gctttggcag 240 cggcatgacg tgctggcgtc gcctgcggga gtggcaggcc aacggcgttt gggagcggct 300 gcatttggct ctgctcaagc gcctgcgcga acacgaccag atcgactgga gccgagccag 360 tgtcgacggt gcaacggtgg ccagcccccg gggggcgagc agacggggcc gaatccaacg 420 gatcgtggca agctcggtag caagcgccat ctcgtcgtag atcggcgcgg cgtgccgttg 480 gcgctgatgg tcaccggtgc caatcgtcac gactcggtgg tgttcgaggt gctcgttgac 540 gccatcccga gcgtgcccgg actcgatggc cgcccgcgat gccgccccga caagcttcac 600 gcggataagg gatacgactt cgcgcgatgc cgccggcatc tgcgcaagcg gggcatgact 660 ccccggatcg ctcgccgtgg catcgagaag aacgaccggc tcggcaagca tcgctgggtt 720 gtcgagcgca cccatgcctg gcttgctggc ttcggcaagt tgcgcattcg tttcgagcgt 780 tctcttcaga ctcatctcgc tttgctcacc ctggcttgcg ccgtcatctg cgggcgattt 840 gttgatcggt tttgttagcg actc 864 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400> 2 gggccgctaa caaaaccaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400> 3 tcggttttgt tagcgactc 19 <210> 4 <211> 134 <212> PRT <213> Ralstonia solanacearum <400> 4 Met Ala Arg Lys Lys Ile Ser Asn Glu Leu Trp Lys Ala Leu Gln Pro 1 5 10 15 Leu Leu Pro Val Val Glu Pro Ser Thr Lys Gly Gly Arg Pro Arg Val 20 25 30 Asp Asp Arg Ala Ala Leu Asn Gly Ile Leu Phe Val Leu His Thr Gly 35 40 45 Ile Pro Trp Glu Asp Leu Pro Lys Glu Leu Gly Phe Gly Ser Gly Met 50 55 60 Thr Cys Trp Arg Arg Leu Arg Glu Trp Gln Ala Asn Gly Val Trp Glu 65 70 75 80 Arg Leu His Leu Ala Leu Leu Lys Arg Leu Arg Glu His Asp Gln Ile 85 90 95 Asp Trp Ser Arg Ala Ser Val Asp Gly Ala Thr Val Ala Ser Pro Arg 100 105 110 Gly Ala Ser Arg Arg Gly Arg Ile Gln Arg Ile Val Ala Ser Ser Val 115 120 125 Ala Ser Ala Ile Ser Ser 130 <210> 5 <211> 211 <212> PRT <213> Ralstonia solanacearum <400> 5 Arg Thr Gly Leu Trp Gln Arg His Asp Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Gly Gln Arg Arg Leu Gly Ala Ala Ala Phe Gly Ser Ala Gln 20 25 30 Ala Pro Ala Arg Thr Arg Pro Asp Arg Leu Glu Pro Ser Gln Cys Arg 35 40 45 Arg Cys Asn Gly Gly Gln Pro Pro Gly Gly Glu Gln Thr Gly Pro Asn 50 55 60 Pro Thr Asp Arg Gly Lys Leu Gly Ser Lys Arg His Leu Val Val Asp 65 70 75 80 Arg Arg Gly Val Pro Leu Ala Leu Met Val Thr Gly Ala Asn Arg His 85 90 95 Asp Ser Val Val Phe Glu Val Leu Val Asp Ala Ile Pro Ser Val Pro 100 105 110 Gly Leu Asp Gly Arg Pro Arg Cys Arg Pro Asp Lys Leu His Ala Asp 115 120 125 Lys Gly Tyr Asp Phe Ala Arg Cys Arg Arg His Leu Arg Lys Arg Gly 130 135 140 Met Thr Pro Arg Ile Ala Arg Arg Gly Ile Glu Lys Asn Asp Arg Leu 145 150 155 160 Gly Lys His Arg Trp Val Val Glu Arg Thr His Ala Trp Leu Ala Gly 165 170 175 Phe Gly Lys Leu Arg Ile Arg Phe Glu Arg Ser Leu Gln Thr His Leu 180 185 190 Ala Leu Leu Thr Leu Ala Cys Ala Val Ile Cys Gly Arg Phe Val Asp 195 200 205 Arg Phe Cys 210 <210> 6 <211> 842 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <220> <221> CDS <222> (65)...(822) <400> 6 gggtcaggac ccattgattt gaattgacgg ctatgattca gacgggcgga taggagcctg 60 actgatgagt aatttgttct ggctgactaa cgagcaaatg gctcgtcttc agccctattt 120 ccccaagagc catggccgcc agcgtgtcga tgatcggcgt gtgctgagcg gcatcatttt 180 cgtcaatcgc aacgggctcc ggtggtgcga tgcgccgaag gaatatggcc cggcgaaaac 240 gctgtataac cgctggaaac gctggagcga caagggcatc tttatccaga tgatggacgg 300 cctggctgtg cctgaagctg cagaacacca gaccgtcatg attgatgcaa cctatctcaa 360 ggcccaccgc acggcttcga gcctgcgggt aaaaaagggg gcgcgggtcg cctgattgga 420 cgcacgaaag gcgggatgaa caccaagctt catgccgtga cggatgcgag tggtcgcccg 480 atcagtttct tcataacggc cggtcaaatc agcgattaca ccggtgctgc cgccttgctt 540 gatgaacttc ccaaggccaa atggctactg gccgaccgtg gctatgatgc cgactggtat 600 cgtgacgcgt tacaggcgaa ggggatcact ccctgcattc ccggtcggaa atcccggacc 660 acgaccatca aatacgacaa acgccgctat aaacggcgca accgaataga gatcatgttc 720 gggcgtctca aggattggcg acgtgtcgct acgcgctatg acaggtgccc aatggctttt 780 ctttccgcca tctctctcgc tgcaaccgtt atcttctggc tctgatcaac gagtcctgac 840 cc 842 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400> 7 gggtcaggac ccattga 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400> 8 tcaacgagtc ctgaccc 17 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> Ralstonia solanacearum <400> 9 Met Ser Asn Leu Phe Trp Leu Thr Asn Glu Gln Met Ala Arg Leu Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Phe Pro Lys Ser His Gly Arg Gln Arg Val Asp Asp Arg Arg 20 25 30 Val Leu Ser Gly Ile Ile Phe Val Asn Arg Asn Gly Leu Arg Trp Cys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Tyr Gly Pro Ala Lys Thr Leu Tyr Asn Arg Trp 50 55 60 Lys Arg Trp Ser Asp Lys Gly Ile Phe Ile Gln Met Met Asp Gly Leu 65 70 75 80 Ala Val Pro Glu Ala Ala Glu His Gln Thr Val Met Ile Asp Ala Thr 85 90 95 Tyr Leu Lys Ala His Arg Thr Ala Ser Ser Leu Arg Val Lys Lys Gly 100 105 110 Ala Arg Val Ala 115 <210> 10 <211> 159 <212> PRT <213> Ralstonia solanacearum <400> 10 Cys Asn Leu Ser Gln Gly Pro Pro His Gly Phe Glu Pro Ala Gly Lys 1 5 10 15 Lys Gly Gly Ala Gly Arg Leu Ile Gly Arg Thr Lys Gly Gly Met Asn 20 25 30 Thr Lys Leu His Ala Val Thr Asp Ala Ser Gly Arg Pro Ile Ser Phe 35 40 45 Phe Ile Thr Ala Gly Gln Ile Ser Asp Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Glu Leu Pro Lys Ala Lys Trp Leu Leu Ala Asp Arg Gly Tyr 65 70 75 80 Asp Ala Asp Trp Tyr Arg Asp Ala Leu Gln Ala Lys Gly Ile Thr Pro 85 90 95 Cys Ile Pro Gly Arg Lys Ser Arg Thr Thr Thr Ile Lys Tyr Asp Lys 100 105 110 Arg Arg Tyr Lys Arg Arg Asn Arg Ile Glu Ile Met Phe Gly Arg Leu 115 120 125 Lys Asp Trp Arg Arg Val Ala Thr Arg Tyr Asp Arg Cys Pro Met Ala 130 135 140 Phe Leu Ser Ala Ile Ser Leu Ala Ala Thr Val Ile Phe Trp Leu 145 150 155 <210> 11 <211> 884 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <220> <221> CDS <222> (44)...(865) <400> 11 gagcccgttt gaaaattccc cgccgttgtg gtgtaaaggc gggatgtgga aaaaagaaga 60 tcgagagcgt gaggcgaagc tggctcggaa gaccaagcgt tacccgagcg acctgacgga 120 tatcgaatgg gccgctgtgc agccgctgct gccacgcgcg gccgtgcgag gccggcgtcg 180 ggagtgcgac ttgagggagg tggtcaacgc cttgcgctat ctggtgcgag cgggctgcgg 240 ttggcgcatg ctgccgcacg acttcccgcc ttggcaaacc gtgtattggt ggtttcgtcg 300 gctcatgcgt cgcttcctgt tccgcacgct gcacgacgtg gtgctgatgt tggaccggga 360 gttggctggg cgccagccgt gcccgagtgc gggcgtcatc gacagccaga cagtcaaagc 420 gccctcggcc gacaagcgtg gctacgacgc ggccaagaaa atcgtcgggc gcaagcggca 480 tatcgcggtg gacacggatg gacggctgct gatggtgaac ctgacaccgg cggacattgc 540 cgatagcacg ggtgcgctgg cggtgctgga ggcggtgaag aagcgctggc caggcataaa 600 acacctgttc gctgacggtg cgtatgaccg cacaacgctg atggacaagg catcgaccct 660 cgacttcgtg gttgaggtgg tgcgccggca cgagcagcaa acgggctttg ccgttctgcc 720 gcgccgctgg gtggtcgagc gcacctttgg gtggatggtt cgctggcgcc gactcgtacg 780 cgactacgag cagcgcgcgg acgtctcgga agccatgatt catatcgcga tgagcggctt 840 gctactgcgc agaatcgctc atccttgaat ttccaaacgg gctc 884 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400> 12 gagcccgttt gaaaattc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400> 13 gaatttccaa acgggctc 18 <210> 14 <211> 274 <212> PRT <213> Ralstonia solanacearum <400> 14 Met Trp Lys Lys Glu Asp Arg Glu Arg Glu Ala Lys Leu Ala Arg Lys 1 5 10 15 Thr Lys Arg Tyr Pro Ser Asp Leu Thr Asp Ile Glu Trp Ala Ala Val 20 25 30 Gln Pro Leu Leu Pro Arg Ala Ala Val Arg Gly Arg Arg Arg Glu Cys 35 40 45 Asp Leu Arg Glu Val Val Asn Ala Leu Arg Tyr Leu Val Arg Ala Gly 50 55 60 Cys Gly Trp Arg Met Leu Pro His Asp Phe Pro Pro Trp Gln Thr Val 65 70 75 80 Tyr Trp Trp Phe Arg Arg Leu Met Arg Arg Phe Leu Phe Arg Thr Leu 85 90 95 His Asp Val Val Leu Met Leu Asp Arg Glu Leu Ala Gly Arg Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Ser Ala Gly Val Ile Asp Ser Gln Thr Val Lys Ala Pro Ser 115 120 125 Ala Asp Lys Arg Gly Tyr Asp Ala Ala Lys Lys Ile Val Gly Arg Lys 130 135 140 Arg His Ile Ala Val Asp Thr Asp Gly Arg Leu Leu Met Val Asn Leu 145 150 155 160 Thr Pro Ala Asp Ile Ala Asp Ser Thr Gly Ala Leu Ala Val Leu Glu 165 170 175 Ala Val Lys Lys Arg Trp Pro Gly Ile Lys His Leu Phe Ala Asp Gly 180 185 190 Ala Tyr Asp Arg Thr Thr Leu Met Asp Lys Ala Ser Thr Leu Asp Phe 195 200 205 Val Val Glu Val Val Arg Arg His Glu Gln Gln Thr Gly Phe Ala Val 210 215 220 Leu Pro Arg Arg Trp Val Val Glu Arg Thr Phe Gly Trp Met Val Arg 225 230 235 240 Trp Arg Arg Leu Val Arg Asp Tyr Glu Gln Arg Ala Asp Val Ser Glu 245 250 255 Ala Met Ile His Ile Ala Met Ser Gly Leu Leu Leu Arg Arg Ile Ala 260 265 270 His Pro
【図面の簡単な説明】
【図１】２６クローンの挿入配列の挿入位置を示す図で
ある。
【図２】ISJsp104.2と、不完全逆向き配列、標的重複配
列、ORFA、およびORFBとの位置関係を示す図である。
【図３】ISmsp4.2と、不完全逆向き配列、標的重複配
列、ORFA、およびORFBとの位置関係を示す図である。
【図４】ISmsp101.3と、不完全逆向き配列、標的重複配
列、およびORFAとの位置関係を示す図である。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 末端逆向き反復配列として、５’末端に
    配列番号２の塩基配列および３’末端に配列番号３の塩
    基配列を有し、 該末端逆向き配列の間にオープンリーディングフレーム
    として、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列を
    コードする塩基配列を含む、挿入配列因子またはその機
    能的等価物。
  2. 【請求項２】 配列番号１の塩基配列からなる挿入配列
    因子。
  3. 【請求項３】 末端逆向き反復配列として、５’末端に
    配列番号７の塩基配列および３’末端に配列番号８の塩
    基配列を有し、 該末端逆向き配列の間にオープンリーディングフレーム
    として、配列番号９および配列番号１０のアミノ酸配列
    をコードする塩基配列を含む、挿入配列因子またはその
    機能的等価物。
  4. 【請求項４】 配列番号６の塩基配列からなる挿入配列
    因子。
  5. 【請求項５】 末端逆向き反復配列として、５’末端に
    配列番号１２の塩基配列および３’末端に配列番号１３
    の塩基配列を有し、 該末端逆向き配列の間にオープンリーディングフレーム
    として、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする塩基
    配列を含む、挿入配列因子またはその機能的等価物。
  6. 【請求項６】 配列番号１１の塩基配列からなる挿入配
    列因子。
  7. 【請求項７】 配列番号１の５６位〜８５５位の塩基配
    列から発現されるトランスポザーゼまたはその機能的等
    価物。
  8. 【請求項８】 配列番号６の６５位〜８２２位の塩基配
    列から発現されるトランスポザーゼまたはその機能的等
    価物。
  9. 【請求項９】 配列番号１１の４４位〜８６５位の塩基
    配列から発現されるトランスポザーゼまたはその機能的
    等価物。
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