JP2003235565A - 乳酸菌用シャトルベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ラクトバチルス・カゼイ YIT0306又はY
IT0356のプラスミドpYIT306由来又はpYIT356由来の複製
必須領域と、大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域
と、大腸菌及び乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝子とを有
することを特徴とする乳酸菌用シャトルベクター。 【効果】 本発明のシャトルベクターを用いれば乳酸菌
及び大腸菌で外来の遺伝子情報を発現させることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、乳酸菌と大腸菌と
において複製可能な乳酸菌用シャトルベクターに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】一般に、インビトロ(in vitro)の遺伝子
操作においては、所望の外来遺伝子を宿主細胞内に移入
させ、その遺伝子情報を発現させることのできる、宿主
細胞に適合したベクターを使用することが必要とされ
る。

【０００３】遺伝的な知見が集積している大腸菌や枯草
菌、酵母などでは、早くからベクターの開発が進めら
れ、今日では一般的な遺伝子クローニングシステムとし
て確立されている。しかし、乳酸菌においては、形質転
換能が低い、DNAの抽出が容易でないなどの理由によ
り、乳酸菌及び他の菌の両方で複製可能なシャトルベク
ターの開発が望まれている。そのようなシャトルベクタ
ーとしては、pBE31（特開平６−２５３８６号）やpH461
1（特開平４−５８８９号）が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来の乳酸菌用シャトルベクターは、サイズが多きすぎ
て発現効率が十分でない、コロニー形成まで時間がかか
る、ベクターが宿主中で不安定である等の問題を有して
いた。従って本発明の目的は、広範囲の乳酸菌で発現可
能であり、かつ発現効率、操作性、安定性、組換え体の
判別が短時間に行なえる等の良好な乳酸菌用シャトルベ
クターを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、数多
くの乳酸菌についてプラスミドの有無、当該プラスミド
の種類、プラスミドの大きさ、コピー数等の点から検討
した結果、ラクトバチルス・カゼイ YIT0306又はYIT03
56の保有するプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌
のプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌及び乳酸菌
で機能する薬剤耐性遺伝子とを連結すれば、サイズが小
さく、発現効率の高い、広い範囲の乳酸菌及び大腸菌で
複製可能なシャトルベクターが得られることを見出し、
本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、ラクトバチルス・カ
ゼイ YIT0306又はYIT0356のプラスミドpYIT306由来又
はpYIT356由来の複製必須領域と、大腸菌のプラスミド
由来の複製必須領域と、大腸菌及び乳酸菌で機能する薬
剤耐性遺伝子とを有することを特徴とする乳酸菌用シャ
トルベクターを提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のシャトルベクターは、ラ
クトバチルス・カゼイ YIT0306又はYIT0356のプラスミ
ドpYIT306由来又はpYIT356由来の複製必須領域と、大腸
菌のプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌及び乳酸
菌で機能する薬剤耐性遺伝子とを有するものである。

【０００８】プラスミドpYIT306は、YIT0306株のプラス
ミドから分子量の最も小さなプラスミドとして採取する
ことができる。また、プラスミドpYIT356は、YIT0356株
のプラスミドからコピー数が多く、かつ分子量の小さい
プラスミドとして採取することができる。

【０００９】これらのプラスミドの採取は、例えばAnde
rson D. G. and McKay, L. L. 1983. Appl. Environ. M
icrobiol. 46:549-552の記載に従って行うことができ
る。

【００１０】これらのプラスミド由来の複製必須領域
は、複製開始部位及び複製蛋白質遺伝子(rep遺伝子)を
含むものであればよい。プラスミドpYIT306の制限酵素
地図は図１の如くであり、pYIT306由来の複製必須領域
は、rep遺伝子を切断せず、複製開始部位を含むように
するためには、SphIで切断して用いるのが好ましい。プ
ラスミドpYIT306の全塩基配列を配列番号１に示す。配
列番号１中の上流側には複製開始部位があり、648-1304
がrep遺伝子である。本発明においては、これらの複製
開始部位とrep遺伝子を含むような領域であればよく、
前記のSphI断片に限定されるものではない。

【００１１】プラスミドpYIT356の制限酵素地図は図２
の如くであり、pYIT356由来の複製必須領域は、rep遺伝
子を切断せず、複製開始部位を含むようにするために
は、BamHIで切断して用いるのが好ましい。プラスミドp
YIT356の全塩基配列を配列番号２に示す。配列番号２の
上流側には複製開始部位があり、852-1661がrep遺伝子
である。本発明においては、これらの複製開始部位とre
p遺伝子を含むような領域であればよく、前記のBamHI断
片に限定されるものではなく、例えば配列番号２中の1
から2321の2321塩基でも良好なシャトルベクターが調製
できる。

【００１２】一方、大腸菌のプラスミド由来の複製必須
領域もまた、複製開始部位とrep遺伝子を含むものであ
ればよいが、複製開始部位とマルチクローニングサイト
を含むものが好ましい。このようなプラスミドとして
は、pUC19、pUC118、pBR322、pACYC177等を用いること
ができるが、pUC19が特に好ましい。

【００１３】これらの大腸菌のプラスミドについては、
制限酵素地図、配列等が良く知られており、複製開始部
位とマルチクローニングサイトを含む領域も公知であ
る。

【００１４】大腸菌及び乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝
子としては、抗生物質耐性遺伝子が好ましく、エリスロ
マイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子
等が挙げられる。これらの薬剤耐性遺伝子は、乳酸菌が
持つ薬剤耐性プラスミドから得るのが好ましい。

【００１５】本発明のシャトルベクターは、原則として
前記の各領域及び薬剤耐性遺伝子を連結することにより
作製できるが、複製必須領域を含む大腸菌プラスミド
と、薬剤耐性遺伝子を含む断片と、プラスミドpYIT306
又はpYIT356から制限酵素を用いて切断した断片とを連
結することにより作製するのが好ましい。

【００１６】かくして得られる本発明のシャトルベクタ
ーの例としては、図３に示す制限酵素地図を有するpUCY
IT306及び図４に示す制限酵素地図を有するpUCYIT356が
挙げられる。pUCYIT306及びpUCYIT356を有する大腸菌
は、FERM P-18707及びFERM P-18708してそれぞれ生命工
学工業技術研究所に寄託されている。

【００１７】本発明シャトルベクターは乳酸菌及び大腸
菌で安定に複製可能であり、所望の外来遺伝子を組み込
んで大腸菌又は乳酸菌に移入させ、その遺伝子情報を発
現させることができる。この場合の外来遺伝子の組み込
み、宿主への移入及び発現は常法に従って行うことがで
きる。

【００１８】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが本発明は何らこれに限定されるものではない。

【００１９】実施例１(プラスミドpYIT306及びpYIT356
の抽出) （１）前培養はMRS培地を、本培養は0.3％Glc-ILS培地
を用いた。プラスミドの抽出はAnderson and McKayの方
法(Appl. Environ. Microbiol. 46: 549-552(1983))に
基づいた。まず、37℃で終夜培養した前培養液30μlを3
mlの0.3％Glc-ILS培地に添加し、37℃で24時間から30時
間培養した。全量集菌し、菌体を50mM Gly-NaOH(pH10.
4)の溶液1mlで洗浄し、再度遠心した。菌体を6.7％スク
ロース-50mMTris-1mM EDTA(pH8)溶液379μlに懸濁し、
更に10mg/ml 25mMリソザイム含有Tris(pH8)溶液を96.5
μl、1mg/ml N-アセチルムラミダーゼSG溶液を10μl加
え、37℃で10分間保温した。この段階で1％SDS溶液10μ
lに菌懸濁液10μl加え、溶菌が起こる事を確認した。更
に、0.25M EDTA-50mM Tris(pH8)溶液を48.2μl、20％SD
S含有50mM Tris-20mM EDTA(pH8)溶液を27.6μl加え、す
ばやく混合し、溶菌させた。37℃で5分間保温後、30秒
間ボルテックスで激しく攪拌した。次に、3N NaOH溶液
を27.6μl加えた後、チューブを10分間ゆっくりと上下
させた。2M Tris(pH7)を49.6μl加え、更に3分間混合
後、5M NaCl溶液を71.7μl加えた。この溶菌液に3％NaC
lで飽和したフェノール溶液700μlを加え、混合後、5分
間遠心分離した。上層を別のチューブに移し、クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（24:1）混液を700μl加
え、混合後、5分間遠心分離した。上層を回収し、当量
のイソプロピルアルコールを加え、氷中、30分間放置し
た。5分間、遠心分離し、核酸画分を沈殿として回収し
た。70％エチルアルコールで沈殿を洗浄し、真空下で乾
固させた。滅菌水100μlに懸濁し、RNase A溶液（10mg/
ml）を1μl加え、37℃、1時間反応した。フェノール処
理後、エタノール沈殿を行い、最終的に50μlの滅菌水
に懸濁し、15μlをアガロースゲル電気泳動に供した。

【００２０】その結果、最も分子量が小さいプラスミド
としてYIT0306由来のプラスミドが得られた。また、分
子量が小さく、かつコピー数の多いプラスミドとしてYI
T0356由来のプラスミドが得られた。なお、同様の操作
は類縁の乳酸菌42株に対しても行ったが、分子量の小さ
さ、コピー数の多さで、上記のものに優るプラスミドは
得られなかった。

【００２１】実施例２(シャトルベクターpUCYIT306の作
製) Ａ．材料及び方法

【００２２】（１）複製開始領域検索ベクターのpNDE4
の作製 乳酸菌でのプラスミド複製に必要な領域を検索するベク
ターpNDE4を構築した。まず、大腸菌で複製するプラス
ミドpUC19をNde IとDra Iで切断し、大腸菌内での複製
に必要な1380塩基の断片を得た。エリスロマイシン耐性
遺伝子はEnterococcus faecalis DS5由来のプラスミドp
AMβ1をHha Iで切断し、1113塩基の断片を得た。この二
つの断片を繋ぎ合わせてpNDE4とした。pNDE4は大腸菌内
で複製可能である事、また、大腸菌にエリスロマイシン
耐性を付与する事も確かめた。

【００２３】（２）培地及び抗生物質 大腸菌の培養にはLB培地、乳酸菌の培養にはMRS培地を
用いた。抗生物質アンピシリンは100μg/ml、エリスロ
マイシンは、大腸菌では500μg/ml、乳酸菌では20μg/m
lの濃度で用いた。

【００２４】（３）プラスミドの精製及び配列決定 実施例１で得られたDNA画分をアガロースゲル電気泳動
で分離し、分子量の一番小さなバンドを切り出した。こ
のプラスミドをpYIT306と名付けた。適当な制限酵素で
切断し、ベクターpUC118に連結後、塩基配列を決定し
た。

【００２５】（４）シャトルベクターの作製 塩基配列よりrep遺伝子を切断せず、且つ、pYIT306を1
箇所で切断する酵素を検索した。SphIがその条件に当て
はまったので、pYIT306をSphIで切断し、pNDE4のSphI部
位に挿入した（図５）。

【００２６】（５）乳酸菌へのエレクトロポレーション
法 MRS培地で前培養した菌液（ラクトバチルス カゼイ YI
T9029及びYIT0291）1mlを20mlのMRS培地に接種し、37
℃、5時間培養した。培養時間はクレット値の変化が100
前後になるのを目安とした。全量集菌後、菌体を10％グ
リセロール溶液で3回洗浄し、最終的に200μlの10％グ
リセロール溶液に菌体を懸濁した。40μlの菌液にプラ
スミド溶液を加え、0.2cmキュベットを用いて、0.25kV,
25μF,200Ωの条件で電気パルスを加えた（Gene Pulse
r, Bio-Rad）。MRS培地を0.9ml加え、37℃で1時間保温
し、エリスロマイシン含有のMRS寒天培地に蒔いた。

【００２７】Ｂ．結果 （１）pYIT306の塩基配列決定及び相同性検索 pYIT306の全塩基配列を決定した。1753塩基より成る非
常に小さなプラスミドであり、その制限酵素地図を図１
に示した。200塩基以上から成るopen readingframeを検
索した所、2箇所見つかった。そのうちの一つ、224アミ
ノ酸から成るORFは、BLAST検索からrolling circle型複
製を行うpCI411のRep蛋白質と高い相同性を示した。よ
って、このORFがプラスミドの複製に関与するrep遺伝子
であると考えた。また、pYIT306の複製様式はpCI411と
同様にrolling circle型であると推測された。このプラ
スミドのG＋C含量は40％であった。またpYIT306の塩基
配列を配列番号１に示す。

【００２８】（２）シャトルベクターの作製 pYIT306をプラスミド複製領域検索ベクターpNDE4（約2.
5kb）に挿入し、シャトルベクターの構築を試みた。ま
ず、pYIT306を切断する制限酵素の検索を行った。rep遺
伝子を切断せず、pYIT306を１箇所で切断する制限酵素
として、SphIを見つけた。そこで、pYIT306をSphIで切
断し、pNDE4のSphI部位に挿入し、シャトルベクターpUC
YIT306を得た。得られたpUCYIT306の制限酵素地図を図
３に示す。このプラスミドをL. casei YIT9029及びYIT0
291にエレクトロポレーション法により形質転換した。3
6時間後には小さなコロニーが確認され、48時間後には
十分の大きさが得られた事より、pYIT306由来の複製開
始領域がYIT9029若しくはYIT0291内で機能する事が判明
した。

【００２９】次に、形質転換されたコロニーから任意に
3個選び、プラスミドを抽出した。図７に示す様に、YIT
9029では、pLY101(YIT9029由来)の他にプラスミドのバ
ンドが、YIT0291では１本のプラスミドのバンドが確認
され、シャトルベクターが染色体に組み込まれる事な
く、プラスミドの状態で保持されている事が明らかとな
った。

【００３０】実施例３（シャトルベクターpUCYIT356の
作製） Ａ．材料と方法

【００３１】（１）大腸菌プラスミド 実施例２と同じpNDE4を用いた。

【００３２】（２）プラスミドの精製及び配列決定 実施例１で得られたDNA画分をアガロースゲル電気泳動
で分離し、分子量の一番小さなバンドを切り出した。こ
のプラスミドをpYIT356と名付けた。適当な制限酵素で
切断し、ベクターpUC118に連結後、塩基配列を決定し
た。

【００３３】（３）シャトルベクターの作製 塩基配列よりrep遺伝子を切断せず、且つ、pYIT356を1
箇所で切断する酵素を検索した。BamHIがその条件に当
てはまったので、pYIT356をBamHIで切断し、pNDE4のBam
HI部位に挿入し、シャトルベクターpUCYIT356を得た
（図６）。

【００３４】（４）シャトルベクターpUCYIT356のL. ca
sei YIT9029内での安定性試験 選択マーカーであるエリスロマイシンを含むMRS培地で
L. casei YIT9029/pUCYIT356を終夜培養した。培養液を
MRS培地で希釈し、1×10⁶希釈液100μlをエリスロマイ
シン不含MRS培地に継代し、43時間培養した。培養後の
菌液をエリスロマイシン不含MRS寒天培地に蒔き、コロ
ニーを形成させ、任意に88個のコロニーを選び、エリス
ロマイシン含有MRS寒天培地とエリスロマイシン不含MRS
寒天培地につき直した。エリスロマイシン耐性コロニー
数を88で徐し、100倍した値をプラスミド保有率(％)と
して計算した。更に、エリスロマイシン耐性コロニーを
任意に11個選び、プラスミド画分を抽出し、これらの株
がプラスミドを保有しているかを調べた。

【００３５】Ｂ．結果 （１）pYIT356の塩基配列決定及び相同性検索 pYIT356の全塩基配列を決定した。4934塩基より成るプ
ラスミドであり、その制限酵素地図を図２に示した。20
0塩基以上から成るopen reading frameを検索した所、6
箇所見つかった。そのうちの一つ、278アミノ酸から成
るORFは、BLAST検索からθ型複製を行うpSK11LのRep蛋
白質と高い相同性を示した。よって、このORFがプラス
ミドの複製に関与するrep遺伝子であると考えた。ま
た、pYIT356の複製様式はpSK11Lと同様にθ型であると
推測された。このプラスミドのG＋C含量は43％であっ
た。またpYIT356の塩基配列を配列番号２に示す。pYIT3
56のrep遺伝子周辺には特徴的な配列が存在していた。r
ep遺伝子の開始コドンより43塩基上流にTATTTT配列が、
また、その17塩基上流にATGTAA配列というプロモーター
配列が見つかった。また、プロモーター配列のすぐ上流
にdirectrepeat配列が存在していた。それは、AAAATAC
(C/T)TTTTTCCACGTTG配列が4回繰り返されており、何ら
かの機能調節を行っている可能性が示唆された。

【００３６】（２）シャトルベクターの作製 pYIT356をプラスミド複製領域検索ベクターpNDE4（約2.
5kb）に挿入し、シャトルベクターの構築を試みた。pYI
T356をBamHIで切断し、pNDE4のBamHI部位に挿入し、シ
ャトルベクターpUCYIT356を得た。得られたpUCYIT356の
制限酵素地図を図４に示す。このプラスミドをL. casei
YIT9029及びYIT0291にエレクトロポレーション法によ
り形質転換した。36時間後には十分の大きさのコロニー
が得られた事より、pYIT356由来の複製開始領域がYIT90
29若しくはYIT0291内で機能する事が判明した。次に、
形質転換されたコロニーから任意に3個選び、プラスミ
ドを抽出した。図８に示す様に、YIT9029では、pLY101
の他にプラスミドのバンドが、YIT0291では１本のプラ
スミドのバンドが確認され、シャトルベクターが染色体
に組み込まれる事なく、プラスミドの状態で保持されて
いる事が明らかとなった。

【００３７】（３）シャトルベクターpUCYIT356のL. ca
sei YIT9029内での安定性試験 選択マーカーであるエリスロマイシンを含むMRS培地で
L. casei YIT9029/pUCYIT356を培養し、1×10⁶希釈液10
0μl（6.9×10²cfuに相当）をエリスロマイシン不含MRS
培地に継代し、43時間培養した。培養後の菌数は5.4×1
0¹⁰cfuであり、約10⁸倍（26世代分裂）に増殖した計算
となる。培養後の菌液をエリスロマイシン不含MRS寒天
培地に蒔き、コロニーを形成させ、任意に88個のコロニ
ーを選び、エリスロマイシン含有MRS寒天培地とエリス
ロマイシン不含MRS寒天培地につき直した。その結果、8
8個中、エリスロマイシン耐性コロニーは82個であり、9
3.18％が選択圧をかけなくても、プラスミドを保有して
いた計算となる。エリスロマイシン耐性コロニーを任意
に11個選び、プラスミドを抽出した所、すべての株で目
的の大きさのプラスミドが確認された。この結果は、エ
リスロマイシン耐性遺伝子は染色体上に組み込まれたわ
けではなく、プラスミド上に保持されている事を示し、
pYIT356由来のシャトルベクターは極めて安定にL. case
i YIT9029に保持されていた事が判明した。

【００３８】（４）pYIT356の複製開始領域の検索 最後にpYIT356のどの部分がL. casei内での複製に必須
かを調べた。シャトルベクターpUCYIT356をHindIIIで切
断後、電気泳動で上のバンドのみを分画し、再度連結反
応を行うと、pYIT356のrep遺伝子を含むBamHI-HindIII
断片（配列番号２における塩基番号1から2321まで）が
残った形のシャトルベクターが構築される。これをpUCY
IT356-1と名付けた。このプラスミドをL. casei YIT902
9に形質転換した所、問題なくコロニーが出現した事よ
り、pYIT356の複製に必要な領域を2321塩基にまで狭め
る事に成功した。

【００３９】

【発明の効果】本発明のシャトルベクターを用いれば乳
酸菌及び大腸菌で外来の遺伝子情報を発現させることが
できる。

【００４０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> Shuttle Vector for Lactococcus <130> P00721402 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1753 <212> DNA <213> pYIT306 <400> 1 gacagactca ctagaccaag acacttttgc gcatgcaaag aaaagcacac ctgctttttt 60 tgcctgcctc acggcgagtg cggggtgagt ttgagcggga gctcccgctc atttatgggg 120 tcaagctgac acagcttgcg ggtttgggca gcgcccatgg ttttattcgt gtgggataga 180 aatttgaaaa tcaggggggg cgagggagcg aattttgcga ccgtactacg accccccctt 240 taagtgccga gtgccaaaac tgaattttag gtggcttcag gtctactctc ccaagggatt 300 aggccacttt attattgagc gacattttgg cgacattttg gtgatttttt tgaatttaat 360 acgtattttg ttgcattaaa tacgtaatta tgctactttt tctttagtga atatttgaag 420 gaggttagaa attttggaaa gtaaaaagag attgacgatt acgttatcga gtcaagttct 480 tgaatatttg tcggagactg cgaaaaacaa aggtttatct aaatctgcat tgattacagt 540 tgcactagaa aaatacaagg aagggcagaa atgagcacaa aaaaagagcg tacccgctga 600 aaagttcgct cgattgttgc ttattctgat aaggcgattt taacattatg gctaaagaca 660 aggcaaggta cttcactttt ttgctatatc cggaaagtat tccaaatgat tggaatcaac 720 gcttggaact gatgggcgtt cctattgcga ttagtcctct gcatgatagg gataagagca 780 atgttgaagg acagacgtac aagaaagctc attatcatgt tgtttatgtg gcaaaaaatc 840 ctgttacgac ggatagcgtt aggaaaagaa ttcaaagggc tttggggcct agaagcgttt 900 ctaaagtgca aattgttgtt cagagcatga aaaatatgta tttgtatctg acacatgaat 960 ctaaagacgc tattgctaaa aataagcaca agtacagcaa gcacgacatt actttgctga 1020 acaattttga tattgatcgc tatattacgc ttgatgttga agacaaagac gacatgctga 1080 atgatgtttg tgatttgatt gatgaccata atttggcaaa tatgcgtgaa ctgagacgct 1140 ttttaaaagc tcatggttca gaatatggca tacccggtat taaagtcgtc aattcggttt 1200 tacgtgctca tactggactg ataaggctgt atttcgatgc tgtttatcag gaacgcaagt 1260 acggcagagg cgatataaac aaagagaccg gtgagataca agactaatta gcaaatgaaa 1320 attgggtgct caattgagcg ccttttttgt tgtcggctag ccgacttctg atacaggttt 1380 aagtgtttta gcacaactcc aatttatttg gagtgtaagt gcgcattgct ttaaaaatag 1440 caatgaaaaa atccgaagaa aatgtcaaag gcgcacttac acgtcatcaa agatgacgct 1500 gtgctaaacc cattaaaacc tgtatcagat ttcgctttgc tcaaacaaaa ctgacttgcg 1560 tcagttggaa tctttaaagc caataaagtc cagtcgccaa ctccttcgga ctttattggc 1620 tttaaagatt ggctttaaat gcccctaatt tgctctctaa gccattttag ctgttaaccg 1680 tataatttac tgtccgtcaa cggtaaatcg acgtagaacg gcttttagcc gttctaggag 1740 gctttaagga gtt 1753 <210> 2 <211> 4934 <212> DNA <213> pYIT356 <400> 2 ggatccgaag ctcgccaagt accacgtcaa ggtcactaag tcgactattt tggtggacct 60 gttagccgag cagtaaaacc ggcaatcgat cagttgtcgg ttgaagcgtt tctgtgctaa 120 aaatatggat acaaacaggg agcaacccca aaaaagagtg ctctcttagc agagccgtta 180 aaggcagaac agccgcactc ccagtatctc gggaatgcgg ccgttttgtc tttaatgcta 240 ttgctggtaa acgcttcagc taacaaaaca ccttaggacg caaatatgga cttctgagag 300 cctttcagct gtctgatgta tctctgcagt atccgtattt gctcgtgaat ggccgtgtaa 360 gccctccgag cccgtaggcg aggtttgttc tgaaccacgc aagcgaagcg cgctagggaa 420 agccagaggc gcgcaggcgg agccggagtt aaacgtggcg aagccacacc tttttaggga 480 gcgaagcgac caagtgttgg tatggggttt ggggagaggt tctccccaag gtcttatgtt 540 gtatttttac gtggaaaaag ttggctcaag cgtttttttt ttttgcctcg cgcgtatgta 600 attacattgt cctatacatt ttaattacat ttaaatacat taggggggca cgaacgcttt 660 aatggcggcg ttatcgtggc actaaaatac ctttttccac gttgaaaata cttttttcca 720 cgttgaaaat acctttttcc acgttgaaaa tacttttttc cacgttgaaa ataccttata 780 tgtaatataa acttaaagtg agtattttag gaattggggg tatctagttg gcacttacat 840 caaacaaaaa agtgaatgtt gctctggcgg ggttattgga tcgtcaggac tacctagtaa 900 cgcaagccaa tgacctggca agatctctcg gtaatttgag tacgttccag cataaggtgt 960 tggattattg ctttagttac gtcacggcta acgacaatgc aaacacggtg tatcacctga 1020 caacactaga gatcattcat catttaggtc ttaacacttc cggcgacagc tataaacgtg 1080 tggttaaggc ttttaaggct ttaaatgaaa atactgctat atacatgcgt accacagagc 1140 ccgacggtaa acacggtatc ttaatgacct cattattcgc gtatataaaa gtgatagatg 1200 atggtcgtgt tgaattcaaa ttcagtgcaa cagttgctcc gttcgtattt cagctgaaac 1260 gacaattcta ctcgttccat ctttcggagc tgactagagt tcgttccaaa tataccctct 1320 caatgatgaa gctgtggaac gcaaatgcta tcggaaaatg gcgtgaccaa aacgatccta 1380 gctctctacc acctgccgct actattaagg gaagccttac agattgggag tcctggtttc 1440 ttggatctga cgatgatgga aaacctatta agtggccggc aggtaggttt aaacaaaaag 1500 ccatagatgt tgccatcaag gaacttggtt cactatatcc tcaaaccatg attaatgtgt 1560 tgaggcttac acacggccga cgaatcgaag gctttcaaat tgaatttcgt cccatccgaa 1620 cagttcttga tttgaatcct caagttattg acggtaaacc ctaggctctg aactagtgga 1680 agtgcgaaag cacacaaaat cccgccaaat tctatatatc tattgcgcga tgctgtgcac 1740 cttcaagaac gggtgtgatt gggatggttt tccaaattca ttatagaaag attgcagtcc 1800 gtaatgaagt tccaataaca attagttgta agcgtcaaca tagtagtatt tataaaattt 1860 actgagttga ttgcgaaaga tactgaacgg gtcttagatg aactagacgg caacacaacc 1920 gctatcctgt atgcgcctga aagcctacca gaggcacacc catttagcta tcattcacca 1980 acttaataca gacaactttc cgttatggaa tccgcccagt taacgtaatg gtgcttagca 2040 gcagtgctcg ccccacctgg ttcacaacct accactttgt gaatattgaa cgagttaccc 2100 catagtagcg tgccctagtg ggttttctaa cttgaatgcc tagtgaaata gccacgatag 2160 ctaccgtggc tatttgttac tttccagtgc caaacaatct ctgccaaaaa gacggcggct 2220 gttctggact actttcagcc tttccaggcg cttctggctc tcgttcattc gtttgttcag 2280 aatcactctc aggttcgtct tggggaaatt ctagcttctt aagcttgttc tcagccatta 2340 gttggagttg ctgggattga tcaagcagct tgtgtaattc ctttatttgc tcgtctttag 2400 cactcaactg gctagtgctt gcctttaatt gtcccttaag aacactaatc atggcgcttg 2460 gatcaattat ctcagaacga ctttcggact tagtagcgtc ttcttgcctc tgcttgacgc 2520 tacttgcgtt accttgttct ttacttcgat taacaggatt gccgtaaaac aatgatttta 2580 tagcattttc agagattgcg ttgatttcgt agcgtccgct tgccttttgt ggcctcttgc 2640 tagcgggaag ttgccttata atctgctgaa ccctttgtcg gcttacgttt aactcgtctg 2700 ctatctgttt cgctgacttg ctcatgattg cctccttcgt tctaatgccg attatagcaa 2760 cggctacgaa tagttgccca taaaaatgcc cgaaacgatc ttagaaatcg tttcgggtca 2820 cttatttgaa tcgaatttta ggctttgttt cgagacgttt ccgggcaatc cgttagggta 2880 gactttaatg taaggacttg gtgtctctct ttttttccca tttttcaaac tctgcagtta 2940 agtcccgatc ggtaactaag ccttcgacca aatctttcgg aataaggtta taagtttctg 3000 atagaaattt gtatgcactc ataactttct caaattggcg gctattatag tcataactga 3060 cggtcaatct tggtcggatt ttagcgttaa cgaccaattg gactttaaac acgaaactat 3120 tattttcctg acccagacta attttataca aagaatcttt cggatggtat ataccttctg 3180 ttgagattgt tacatagatg ttggggataa atactctgga catataactt acgctttctg 3240 cgcagggttg agagtcacgt cttgcgcctt tggttagtct aactatctct cgtaaatagt 3300 atatatcagt tgagtgacac tcgcaaggac ttttttcccc ccgattggaa aaagcaaaaa 3360 tcgtagatca atttgtttta aaaccaatca aagaagaatt aactcctttg ttcggtggac 3420 taacaatccg caagaaatac gatgagggac gcggcaagct agtcatcgct tatgtattcg 3480 cttgggaagc aagcgtaaag acgctgagga cgtgcacgtc agcaagcaac ggcgagttga 3540 ccgacaaaga aaagtggcgc gcactcgaca aagttcgcgg cgtcaaacta ggcacaaccg 3600 agcaagaata cctcgccaaa aaataaaaag agcacgacga agaaatcgca aaaaaagcga 3660 agcaagaagt gctcggacag ctcaaaaata attggcatta gctcagcgtt tttctccagg 3720 aaaagatcaa aacaaaatga gttgcaatcc gatcgtccta aaaaatagcc cgatcgaaac 3780 gatcactttt tgagggtggt ttgacaggtc ctaaaatcaa gaaagagcat aaggcaaaac 3840 tgaccccaaa attggcgtaa accgcagtgc ggtttggttt gtcgtgatag cacgctgggg 3900 gcaaaaggtg tagtaaaacg cgatatgctc cacgtgaaaa aatctcgagc gtgtagtaaa 3960 ccgcgtttta ctacacgtgg tttaggctaa tcgtgacaag ggttagcgcc attcactaca 4020 cgtaaacgac gttttactac acctgagcaa gtttattcgc attttggtca taaacgagcg 4080 cgttttggcg ttacatcgtc cgcacctaga cggtgcattg gacgcaacac taaatacacg 4140 atatgagatg cacaagttga agcgttagtg ttgatcatcg cacagtttag atgttacagt 4200 tgactcaatg atttttatgc tcattaagca tcaccaacgc ttcgaattaa tcatctctaa 4260 tagtgagttt tatgttgcgt ccaatgcacc gtctaggtgc acactatgta acacaaaaaa 4320 tgagtgctca ctcaccgaca acctccattc ttgctaaatg ttgaatattg caaagaaatc 4380 caacactgat ctctgtaagc caaatggccc ttagggccat agtctatcgt caaatgttga 4440 attttcttct aaaatccaac attgcctatt ttgctaatgt tggatttcgc gtaaatattc 4500 aacatttcga ccccagcgtg ctatcacgac aaaccaaacc gcactgcggt ttacgccaat 4560 tttggggtca gttttgcctt atgctctttc ttgattttag gacctgtcaa accaccctca 4620 aaaagtgatc gtttcgatcg ggccgttttt gaggtcgatc agatcgcaac tcattttgtt 4680 ttgatctctt acctggagaa aaacgctcac gttttgacct gggtaggcgc aactgtttgc 4740 aaaaaaatcg tccggcaacg tgacgcaatt ttgacgtcgt gttggtttgc cagacgacag 4800 atcaccatca caactcagga ggtttttgaa atgacgaagc aagaagaaac tcgccggatt 4860 atgttcactt tgcccgacca ggcaatcgat aaattagatc agctagtagc aaaaaagcag 4920 gaggaggtcg atca 4934

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpYIT306の制限酵素地図を示す。

【図２】プラスミドpYIT356の制限酵素地図を示す。

【図３】シャトルベクターpUCYIT306の制限酵素地図を
示す。

【図４】シャトルベクターpUCYIT356の制限酵素地図を
示す。

【図５】シャトルベクターpUCYIT306の構築を示す図で
ある。

【図６】シャトルベクターpUCYIT356の構築を示す図で
ある。

【図７】シャトルベクターpUCYIT306のYIT0291及びYIT9
029での複製を示す図である。

【図８】シャトルベクターpUCYIT356のYIT0291及びYIT9
029での複製を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 木脇 真祐美 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 DA05 DA06 EA04 FA02 FA15 GA11

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトバチルス・カゼイ YIT0306又はY
   IT0356のプラスミドpYIT306由来又はpYIT356由来の複製
   必須領域と、大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域
   と、大腸菌及び乳酸菌で機能する薬剤耐性遺伝子とを有
   することを特徴とする乳酸菌用シャトルベクター。
2. 【請求項２】 複製必須領域が、複製開始部位及び複製
   蛋白質遺伝子を含むものである請求項１記載の乳酸菌用
   シャトルベクター。
3. 【請求項３】 大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域
   が、複製開始部位及びマルチクローニングサイトを含む
   ものである請求項１又は２記載の乳酸菌用シャトルベク
   ター。
4. 【請求項４】 ラクトバチルス・カゼイ YIT0306又はY
   IT0356のプラスミドpYIT306由来又はpYIT356由来の複製
   必須領域が、複製開始部位及び複製蛋白質遺伝子を含む
   ものである請求項１〜３のいずれか１項記載の乳酸菌用
   シャトルベクター。
5. 【請求項５】 次の（１）又は（２）の制限酵素地図を
   有するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の乳
   酸菌用シャトルベクター。 【化１】