JP2009539368A - メタゲノムライブラリの種々の細菌種への伝達に有用なプラスミドrk2系広宿主範囲クローニングベクター - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明はこのニーズを満たすために開発したものである。具体的には、広宿主範囲RK2レプリコンをベースとして、新規で比較的小型で機能がよく分かっているベクターを開発した。このようなベクターは、メタゲノムライブラリの構築に有用である。このレプリコンから構築されたベクターは、多くのグラム陰性細菌種において機能し(トーマス及びヘリンスキ(Thomas & Helinski)、1989年、「グラム陰性細菌内の広宿主域プラスミド」(Promiscuous Plasmids in Gram-negative bacteria)(トーマス,C.M.編 第1章、p.1−25、アカデミックプレス(ロンドン)社(Academic Press Inc (London) Ltd)、ロンドン)、グラム陽性細菌、酵母及び哺乳動物細胞にさえ伝達される(ポヤート及びチエウ−コート(Poyart and Trieu-Cout)、1997年、FEMSマイクロバイオロジー・レターズ(FEMS Microbiol Lett)156:p.193−198; ベイツ(Bates)ら、1998年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)180:p.6538−6543; ウォーターズ(Waters)、2001年、ネイチャー・ジェネティックス(Nature Genetics)29:p.375−376)ことが一般に知られている。しかしながら、今回提案したようなベクター、特に、宿主染色体中に組み込まれないこのようなベクターを広範囲の種において大型挿入断片をクローニングし、安定的に維持し、発現させることができること、従って、メタゲノム用途の伝達可能なベクターの基礎として用いることができることは、これまで理解され、或いは可能と考えられてこなかった。本発明のベクターが多くの宿主内で複製することができることは、ライブラリ全体を大腸菌から多くの宿主に伝達させることができることを意味しており、これは接合によって効率的に達成される。RK2レプリコンではコピー数の増大がみられ(即ち、1より大きい、通常、約5乃至10のコピー数)、クローニングされた挿入断片の遺伝子量は染色体への挿入の場合よりも著しく多くなり、これにより機能分析が成功する確率が高くなる。その上、必須の複製開始遺伝子trfAの高コピー数突然変異体を用いることによって種の壁を越えてコピー数をさらに増加させることが可能である(ホーガン(Haugan)ら、1995年、プラスミド(Plasmid)33:p.27−39)。大型の挿入断片(例えば、30又は40kb以上、或いは50、60、80又は100kb以上もの断片)を広い範囲の細菌種において(即ち、広い宿主範囲にわたって)比較的高コピー数のベクター(プラスミド)中にクローニングし、維持することができることは、本発明の予想外の驚くべき特徴である。本発明によって、大型挿入断片を含むこのようなベクター(プラスミド)を広範囲の細菌に伝達すると共に、そのようなベクター(プラスミド)を広宿主範囲において安定的に維持することが可能になる。
(i)RK2の複製起点oriV、
(ii)RK2の接合伝達起点oriT、
(iii)RK2からのparDE、
(iv)クローニング領域、
(v)わずか1又は2のコピー数でのこのベクターの複製を可能にする別の複製起点
を含む自己複製人工染色体であり、
このベクターはわずか15kbの大きさであり、RK2のtrfAを含有せず、少なくとも12kbの挿入断片をクローニングすることができるものとし、このベクター内のRK2 DNAの含量はRK2のわずか10%であるものとするクローニングベクターを提供する。
より詳細には、このベクターは、少なくとも15、20、30又は40kbの挿入断片をクローニングすることができる。従って、別の言い方をすれば、このベクターは大型の挿入断片をクローニングすることができる。本明細書において「大型の挿入断片」とは、サイズが少なくとも30kb、特に、少なくとも40、50、60又は70kbの挿入断片と定義する。本発明の特に有利な実施態様においては、少なくとも80kb、特に、少なくとも90又は100kbの挿入断片をクローニングすることができる。有利なことに、120、150、170、180、190又は200kbあるいはそれよりも大きな挿入断片をクローニングすることもできる。別の言い方をすれば、100、120、150、170、190、200又は250kbまでの挿入断片、例えば、少なくとも12、15、20又は30、50、70又は80kbで前記数字のいずれかまでの挿入断片をクローニングすることができる。より詳細には、本発明のベクターにより、このような大型挿入断片を安定に維持することが可能となる。こうした大型挿入断片を含有するこのベクターは広い宿主範囲で安定に維持することができる。さらに、このような大型挿入断片を含有するこのベクターは、広い宿主範囲に伝達させることができる。
本発明のベクターによってDNAのクローニング、有利には上述のようなメタゲノムDNAのクローニングが可能となる。従って、このDNAはゲノムDNAとすることができるが、本発明の最も広い概念として、これを任意のDNAとすることができる。このDNAは任意の供給源からのものであってもよい。従って、ゲノムDNA、cDNA又は任意の種類の合成DNA、例えば、クローニング又は増幅したDNA断片が含まれる。このDNAは、単一の供給源からのものでも複数の供給源の混合物からのものでもよく、例えば、単一の試料からのものでも複数の試料の混合物からのものでもよい。これは、単一のDNAであっても複数のDNAの混合物であってもよく、例えば、単一の生物からのものでも複数種の生物(即ち、少なくとも2種の生物)の混合物からのものでもよい。しかしながら、このDNAは、メタゲノムDNA又は環境試料からのDNAであることが好ましい。従って、このDNAは環境試料から単離又は取得することができる。
このベクターは自己複製することができる。このことは、これが非組込み型ベクターである、即ち、これが宿主染色体中に組み込まれないことを意味している。具体的には、これは、これを導入し、又はこれを伝達させることができる如何なる宿主においても染色体中に組み込まれない。このベクターは、細菌細胞が成長し、分裂する時にこれが(ベクターとして)存在し続けるように、細菌宿主内で自己複製することができる。より詳細には、このベクターはその細菌宿主内で安定的に維持することができる。従って、このベクターは、細菌宿主中に導入することができ、何世代にもわたる(例えば、少なくとも2、3、4、5、6又は10世代にわたる)その宿主の培養中、或いは、より一般的にはその宿主細胞の増殖の間、その宿主内に維持することができる(即ち、ベクターの存在を検出することができる)。
上述したように、本発明のベクターはサイズがわずか15kbである。このベクターの小さなサイズは大型の挿入断片のクローニングを可能にする点で有利である。このベクターのサイズはわずか14、13又は12kbであることが好ましい。
前述したように、oriVからのベクターの複製を生じさせるためには、宿主はtrfA遺伝子を含有するか宿主にこれを供給しなければならない。これは、別のベクターによって宿主に供給することができ、好ましくは、このtrfA遺伝子を宿主の染色体中に挿入する。別のベクターはこれを実現できるようにデザインすることができる。
上記クローニングベクターは、標準的な形質転換技術、例えば、熱ショック形質転換によって宿主細胞中に導入することができる。クローニングベクターを宿主細胞中に導入する方法、特に、細菌の形質転換法については当該分野で周知であり、例えばサムブルック(Sambrook)ら(前掲)を含め、広く文献に記載されている。電気穿孔技術についても周知であり、広く記載されている。
(i) このDNAを上記に定義したようなクローニングベクター中に導入し、
(ii) このクローニングベクターを第1の細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌中に導入し、
(iii) この第1の宿主細胞を培養することによって上記DNAをクローニングし、
(iv) このクローニングしたDNAを1種以上の2次宿主に伝達させる
ことを含む方法を提供する。
(i) このDNAを上記に定義したようなクローニングベクター中に導入し、
(ii) このクローニングベクターを第1の細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌中に導入し、
(iii) この第1の宿主細胞を培養することによって上記DNAのクローンの第1のライブラリを調製し、
(iv) この第1のライブラリを1種以上の2次宿主中に伝達させて1種以上の2次ライブラリを調製する
ことを含む方法を提供する。
−細菌菌株、プラスミド及び成長培地
本研究に用いた細菌株及びプラスミドを表1に記載した。大腸菌株は37℃でルリア−バータニ(Luria-Bertani)(LB)培地中又はL寒天上で増殖させた。シュードモナス−フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)及びザントモナス−カンペストリス(Xanthomonas campestris)株は、LB中又はディフコ(Difco)PIA寒天上(P.フルオレッセンス)及びYMブロス中又はYM寒天上(X.カンペストリス)30℃で増殖させた。(関係する場合)抗生物質を以下の濃度で用いた:クロラムフェニコール12.5μg/ml(大腸菌)、30μg/ml(X.カンペストリス);カナマイシン50μg/ml(大腸菌及びX.カンペストリス);テトラサイクリン10μg/ml(大腸菌)、15μg/ml(X.カンペストリス)又は25μg/ml(P.フルオレッセンス)。大腸菌における挿入断片を含むクローンの青/白選択に5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal)及びイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)を用いた。EPI300中のクローンは、エピセンター社のコピー・コントロール・フォスミド・ライブラリ・プロダクション・キット(Copy Control Fosmid Library Production Kit)からの溶液を用い、L−アラビノース誘導により単一コピー数から高コピー数に転換させた。PmG5からのtrfAの発現は0.5mMのm−トルイル酸塩の添加により誘導した。
サムブルック(Sambrook)及びラッセル(Russel)、2001年、「分子クローニング:実験用マニュアル(Molecular cloning; a laboratory manual)」、第3版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークの方法に従って、又は市販のキットを用いることによってアガロースゲル電気泳動及び通常のDNA操作を行った。DNAの配列決定は、ビッグ−ダイ・ターミネータv1.1サイクル・キット(Big-Dye Terminator v1.1 Cycle kit)(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems))を用いて又はMWG−バイオテク(Biotech)AGによって実施した。
pCC1FOSにparDEoriT領域及びカナマイシン耐性遺伝子を導入することにより、フォスミド及びBACクローニング用の広宿主範囲ベクター(pRS44)を構築した。このベクターのヌクレオチド配列全体が既知である。大腸菌S17.1(λpir)(デ・ロレンゾ(De Lorenzo)ら、1993年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)175:p.6902−6907)を宿主として用い、pKD20(バッケビグ(Bakkevig)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)187:p.8375−8384)中にtrfA及びテトラサイクリン耐性遺伝子をクローニングすることにより、自殺トランスポゾンベクターpRS48を構築した。更なる詳細については表1を参照されたい。
トロンヘイムス(Trondheims)フィヨルド(ノルウェー)に沿った6箇所の異なる場所の表面ミクロレイヤーからの水を、基本的にギャレット(Garrett)(ギャレット、1965年、リムノロジー・アンド・オーシャノグラフィー(Limnol and Oceanogr)10:p.602−605)により報告されているようにして、2004年7月から10月までの期間に収集した。先ず、各20乃至25リットルの試料を250μmグリッドに通して前濾過して最大粒子を除去した後、孔径60μmのナイロンフィルター(ミリポア社(Millipore))に通して濾過した。この濾過液は、先ずペリコン(Pellicon)XL50限外ろ過装置を用いてタンジェント流濾過を行い、次いでアミコン(Amicon)攪拌セル(ミリポア社)でさらに濃縮することによって、2段階濃縮した。次に、試料を2×STE緩衝液(1M NaCl、0.1M Na2EDTA、10mMトリス−HCl、pH8.0)で希釈して150乃至250μg/mlの最終DNA濃度を得た。この細胞懸濁液を等容量の2%InCertアガロース(キャンブレックス社(Cambrex))のPBS緩衝液(0.8% NaCl、0.02% KCl、0.144% Na2HPO4、0.024% KH2PO4、pH7.4)溶液と混合し、アガロースプラグを使い捨てプラグモールド(バイオラド社)で成形した。
小型挿入断片ライブラリは、Sau3AIで部分消化した環境DNAを多コピープラスミドベクターpLitmus28のBamHI部位にランダムにクローニングすることにより作製した。これらの挿入断片は部分的に配列を決定し、BLASTアルゴリズムを用いて位置合わせした。フォスミドライブラリは、基本的に、エピセンター社のコピー・コントロール・フォスミド・ライブラリ・プロダクション・キットプロトコルに記載されている手順に従って構築した。
−広宿主範囲メタゲノムベクター系の構築
市販のpCC1FOSベクターを開始点として用いて広宿主範囲フォスミド及びBACベクター(pRS44、図1)を構築した。pCC1FOSは、2つの複製起点、F因子起点(ori2)及びRK2からのoriVを有する。ori2は大腸菌内で機能し、この宿主内でのライブラリの構築時に作動するが、多くの他の宿主では作動しない。oriVは、対象宿主で複製開始蛋白質TrfAを発現させることにより活性化させることができる。我々がここで用いた戦略は、pCC1FOSに接合伝達の起点(oriT)を導入して非大腸菌宿主への接合を可能にすることである。また、我々はRK2からの安定化要素parDEを挿入して、大型挿入断片を含む組換えプラスミドが新たな宿主から失われる確率を低下させた。最後に、カナマイシン耐性遺伝子を挿入して、一部の宿主で有用となる可能性のある別の選択マーカを設けた。BamHI部位は粘着末端BACクローニングに有用であるのに対して、Eco72I部位は平滑末端フォスミドクローニングに用いる。青/白スクリーニング用のlac系はpCC1FOSから保持した。
プラスミドの安定性は、ここに記載したメタゲノムクローニングベクターが機能する上で決定的なものとなる可能性があり、これを定量化するために、我々は、これが大腸菌EPI300で抗生物質選択の非存在下に失われる割合を測定した(図2)。この実験の対照として、我々は天然RK2プラスミド及びpCC1FOSを用いた。伝達の繰り返しを行って、実験室スケールのバッチ培養で生じる世代数をはるかに超える数字である約230の世代にわたって増殖をモニターした。この実験から、pCC1FOSではプラスミドの損失を容易に検出することができるが、pRS44及び36kbの対照DNA挿入断片を含有するその誘導体(pRS49)は共に、全RK2と同様、顕著に安定であることが分かった。従って、この実験から、parDEをこのベクターに導入することの適切性が明瞭に確認された。
最初の実験から、上記市販ベクターの対照として用いた36kbの標準挿入断片はpRS44ではpCC1FOSと同様な頻度で大腸菌内にパッケージされ、定着することが分かった。しかしながら、我々は環境からのDNAを含むベクターを調べたいと思った。何故なら、そのような試料からのDNAをクローニングするのは困難又は非効率な場合があることはよく知られているからであり、また、我々が、新たな宿主における環境DNA挿入断片の挙動を調べたいと思ったからである。我々の研究室では、海洋表層からの微生物の研究を含むプロジェクトが進行中であるが、この表層はその下の水よりもはるかに高濃度の有機物及び細菌を含有していることがこれまでに分かっている。従って、我々は、そのようなDNA試料を用いてこのベクター系を試験することにした。
大腸菌株EPI300は、新たな宿主へのoriT媒介性接合を可動化するのに必要なtra遺伝子群を含有しておらず、このため、上記ライブラリからの選択プラスミドは先ず、RK2のtra遺伝子群が染色体に組み込まれているS17.1株中に形質転換する。このライブラリを原料DNAとして用いて多数の形質転換体を得ることは容易であるので、この付加的な工程はプラスミドの大型ライブラリから新たな宿主への後の伝達に対して制約とはならないことが分かった。
ここに報告した実験結果から、上記広宿主範囲ベクターは、これに大型の挿入断片を含有させても極めて安定的に維持され、恐らくほとんど全てのグラム陰性宿主にこれを伝達させることができることが分かる。また、我々は、λパッキングによって限定されるものより大きなサイズの挿入断片をpRS44が含有する能力について調べる予備的な試みを行った。こうした実験からこれまでに、大腸菌内にサイズが少なくとも80kbのpRS44誘導体を安定的に維持することができたこと(データ示さず)、このことは、確立されている狭宿主範囲BACベクターに特有な挿入断片サイズを有するメタゲノムライブラリの構築に上記RK2レプリコン系を用いることができることを示していることが分かった。ここに提示した結果から、上記のプラスミドは新たな宿主を継代中に変化することが極めて多いようであることが分かる。興味深いことに、プラスミド構造が修飾されることについては、これまでにもS17.1株を用いた接合実験で認められている(プリーファ(Priefer)ら、1985年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)163:p.324−330)。こうした修飾は任意の特定クローンの全ての伝達で生じるわけではないので、この問題は、他の方法で必要とされると考えられるよりも多数の接合完了体を単純にスクリーニングすることにより解決することができる。
ブラトニー(Blatny)JM、ブロータセット(Brautaset)T、ウィンター−ラーセン(Winther-Larsen)HC、ホーガン(Haugan)K及びバラ(Valla)S(1997年a)「RK2レプリコンを利用した汎用性のある1組の広宿主範囲クローニング及び発現ベクターの構築並びに使用(Construction and use of a versatile set of broad-host-range cloning and expression vectors based on the RK2 replicon.)」アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー(Appl Environ Microbiol)63:p.370−379
ブラトニー(Blatny)JM、ブロータセット(Brautaset)T、ウィンター−ラーセン(Winther-Larsen)HC、カルナカラン(Karunakaran)P及びバラ(Valla)S(1997年b)「グラム陰性細菌において遺伝子発現レベルを上下に調節するのに有用な改良広宿主範囲RK2ベクター(Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in Gram-negative bacteria.)」プラスミド(Plasmid)38:p.35−51
デ・ロレンゾ(De Lorenzo)V、カーズ(Cases)I、ヘレロ(Herrero)M及びティミス(Timmis)KN(1993年)「経路誘導剤に対するTOLプロモータの初期及び後期反応:lacZ−tetバイシストロニックレポータを含有するシュードモナス・プチダにおけるポストエクスポネンシャルプロモータの同定(Early and late responses of TOL promoters to pathway inducers: identification of postexponential promoters in Pseudomonas putida with lacZ-tet bicistronic reporters.)」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)175:p.6902−6907
ギメスタッド(Gimmestad)M、シュレッタ(Sletta)H、カルナカラン(Karunakaran)P、バッケビグ(Bakkevig)K、エーテスバグ(Ertesvag)H、エリングセン(Ellingsen)TE、スクジャック(Skjak)−ブレーク(Braek)G及びバラ(Valla)S(2004年)特許WO2004/011628A1「シュードモナス・フルオレッセンス及びその変異株の新規突然変異株、その産生方法並びにアルギン酸塩製造におけるその使用(New mutant strains of Pseudomonas fuorescens and variant thereof, methods for their production, and uses thereof in alginate production.)」
ヘッテ(Hoette)B、ラート−アーノルド(Rath-Arnold)I、ピューラー(Puehler)A及びシモン(Simon)R(1990年)「ザントモナス−カンペストリスpv.カンペトリスにおけるエキソポリサッカライド産生に関与する35.3−キロベースDNA領域のクローニング及び解析(Cloning and analysis of a 35.3-kilobase DNA region involved in exopolysaccharide production in Xanthomonas campestris pv. campetris.)」ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J Bacteriol)172:p.2804−2807
パンセグロウ(Pansegrau)W、ランカ(Lanka)E、バルト(Barth)PT、フィグルスキー(Figurski)DH、ギネイ(Guiney)DG、ハース(Haas)D、ヘリンスキー(Helinski)DR、シュワブ(Shwab)H、スタニッシ(Stanisich)VA及びトーマス(Thomas)CM(1994年)「バーミンガムIncPαプラスミドの完全ヌクレオチド配列−編集及び比較分析(Complete nucleotide sequence of Birmingham IncPα plasmids - compilation and comparative analysis.)」ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)239:p.623−633)
シモン(Simon)R、プリーファ(Priefer)U及びピューラー(Puehler)A(1983年)「インビボ遺伝子操作用広宿主範囲可動化系:グラム陰性細菌におけるトランスポゾン突然変異誘発(A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria.)」バイオ/テクノロジー(Bio/Technology)1:p.784−791
材料及び方法
−細菌株、プラスミド及び成長培地
表3に本研究に用いた細菌株及びプラスミドを記載した。
サムブルック(Sambrook)及びラッセル(Russel)(2001年、「分子クローニング:実験用マニュアル(Molecular cloning; a laboratory manual)」、第3版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク)の方法に従って、又は市販のキットを用いることによってアガロースゲル電気泳動及び通常のDNA操作を行った。
部位特異的突然変異誘発は、プラスミドpHH100G5に対してストラテジーン社(Stratagene)製クイックチェンジ・サイト−ダイレクテッド・ムタジェネシス・キット(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit)を用いて実施した。pHH100G5は、もともとpRS44を得るためにpRS43ベクターに組み込まれていたカナマイシン耐性遺伝子を有している。次に、上記の突然変異を誘発させたカナマイシン耐性遺伝子をそのプラスミドから切り出し、pRS43中に連結してpTA44を得た。
最大約200kbの挿入断片を含むBACクローンがバイオS&T社(Bio S&T Inc.)(カナダ)によって構築された。植物アサガオ(Ipomoea nil)の核からの高分子量DNAをクローニング材料として用い、pTA44ベクターを下記のBACクローニングベクターとして用いた。
アサガオの植物核からの高分子量(HMW)DNA調製の方法については、ジャン(Zhang)HB、X.P.ジャオ(Zhao)、A.H.パターソン(Patterson)及びR.A.ウィング(Wing)、1995年、ザ・プラント・ジャーナル(The Plant Journal)7:p.175−184に記載されている。
CHEF DRIII(バイオ−ラド社(Bio−Rad)、カナダ)を用い、1%(w/v)パルスフィールドアガロースゲルを含む0.5×TBE上で部分消化したHMW DNAをサイズ選択した。サイズ選択は、90sの一定パルス時間及び6V/cmで11℃、12時間のPFGEにより行った。50乃至350kbを含むゲル切片を30sの一定パルス時間及び6V/cmで5時間、PFGEにより電気溶出させた。溶出したDNA断片は、連結前に少なくとも2時間、1×TE(10mMトリス−HCl、1mM EDTA、pH8.0)緩衝液に対して透析した。
pTA44を使用した。DH10B中に形質転換後、マクシプレプ(Maxiprep)キット(キアゲン社(Qiagen)、カナダ)を用いてベクターDNAの精製を行った。精製ベクターDNAに対してHindIII消化及び脱リン酸化を行った後、フェノール/クロロホルムにより精製した(標準的プロトコル)。精製した消化DNAは25ng/μlの溶液とした。
80乃至100ngの部分消化し、サイズ選択したDNA断片を、1×リガーゼ緩衝液及び3単位のリガーゼで50μlの容量とした20ngのベクターDNA(pTa44−HindIII及びpIndigoBAC−HindIII)と14℃で一晩インキュべーションして連結させた。
インビトロジェン社(Invitrogen)製エレクトロマックス(ElectroMax)DH10Bを形質転換用宿主株として用いた。2マイクロリットルの連結反応混液を用いて20μlの大腸菌細胞を形質転換した。細胞は、600μlのSOC培地(インビトロジェン社、米国)中37℃1時間100rpmで振盪することにより回収した。次いで、この形質転換した細胞60μlを、クロラムフェニコール(12.5mg/L)、X−GAL及びIPTGを補充したLB培地上で37℃一晩インキュベーションすることにより選択をかけた。白色クローン数を記録し、ミニプレップのために約20クローンを手選し、培養した。ミニプレップは以下の工程により行った。
・一晩おいた(overnight)培養液5mlを(500gで5分間)遠沈する。
・上清を除去する。
・キアゲン社製P1溶液を200μl添加する。
・キアゲン社製P2溶液を200μl添加する。
・室温で5分間インキュベートする。
・キアゲン社製氷冷P3溶液を200μl添加する。
・氷上で10分間インキュベートする。
・15分間(13,000gで)遠沈する。
・上清を新しいチューブに移し、1容のイソプロパノール(約420μl;移された容積の約70%(600μl))を添加する。
・−20℃で1時間置く。
・20分間(13,000gで)遠沈する。
・上清を除去する。
・70%エタノール(420μl)を添加する。
・5分間(13,000gで)遠沈する。
・風乾させる。
・TE又は水(約50μl添加)に再懸濁する。
ミニプレップしたDNAをNotIで消化した後、PFGEゲルにかけ、特性化した。
クローンの推定サイズは、(kb単位で)図4に示したとおりである。
1. 195 9. 130 17. 80
2. 48 10. 190 18. 150
3. 135 11. 110 19. 100
4. 120 12. 70 20. 195
5. 58 13. 73 21. 83
6. 75 14. 135 22. 131
7. 70 15. 120
8. 48 16. 95
比較として、pIndigoBACの20クローンの平均サイズは約100kbと計算されたが、これはpTA44のそれと同様である。
標記の効率は、形質転換後に1/10容(即ち、60μl)当たり選択培地上に得られた白色クローンの数によって測定した(表4)。
−BACクローンのシュードモナス・フルオレッセンスへの伝達
選択したBACクローン群を大腸菌株S17.1からシュードモナス−フルオレッセンス::TnRS48へ接合させた。抗生物質選択のないL寒天上で一晩30℃で接合交配を行わせた。次いで、この混合物をカナマイシン及びm−トルイル酸塩を含むPIA上で平板培養した後、30℃で48時間インキュベートした。
結果
−pTA44の構築
クローニングベクターpRS44中に制限酵素HindIIIの認識部位が2箇所(クローニング部位の1箇所及びカナマイシン耐性遺伝子中の1箇所)存在することによってHindIIIで消化したDNAを用いたBACクローニングがこのベクターにとって不可能となる。従って、部位特異的突然変異誘発を行ってカナマイシン耐性遺伝子中のHindIII部位を除去し、それによりベクターpTA44を作製した。
植物核からの高分子量DNA及びクローニングベクターpTA44を用いることによって、最大約200kbの挿入断片を含むBACクローンを得た。パルスフィールド電気泳動を用いてこの挿入断片のサイズを測定し、得られたBACクローンのうちの22クローンについてその結果を図5に示した。連結及び形質転換効率は、市販のBACクローニングベクターpIndigoBAC5(エピセンター社)を用いた平行実験で認められたのと同様であった。
100kb乃至195kbの挿入断片を含む、選択したBACクローン6種(表5)を1つの別の試験種、シュードモナス・フルオレッセンスへ接合によって伝達させた。選択した全てのBACクローンによってP.フルオレッセンス::TnRS48内に接合完了体が得られた。
伝達させたプラスミドのうちの3種の安定性について、P.フルオレッセンス接合完了体からの制限消化した全DNAをサザン解析する(B10)か、プラスミドをP.フルオレッセンス接合完了体から大腸菌へ再伝達させた後、制限解析する(B9及びB19)ことによって検討した。
Claims (25)
- 広宿主範囲の細菌においてDNAをクローニングするためのクローニングベクターであって、
(i)RK2の複製起点oriV、
(ii)RK2の接合伝達起点oriT、
(iii)RK2からのparDE、
(iv)クローニング領域、
(v)わずか1又は2のコピー数での該ベクターの複製を可能にする別の複製起点
を含む自己複製人工染色体であり、
該ベクターはわずか15kbの大きさであり、RK2のtrfAを含有せず、少なくとも12kbの挿入断片をクローニングすることができるものとし、該ベクター内のRK2 DNAの含量はRK2のわずか10%であるものとするクローニングベクター。 - 少なくとも30kbの挿入断片をクローニングすることができる請求項1に記載のクローニングベクター。
- 少なくとも80kbの挿入断片をクローニングすることができる請求項1又は2に記載のクローニングベクター。
- 前記DNAがメタゲノムDNA又は環境試料からのDNAである請求項1乃至3のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 人工染色体である請求項1乃至4のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 前記人工染色体が細菌人工染色体(BAC)又はP1由来人工染色体(PAC)である請求項5に記載のクローニングベクター。
- 前記別の複製起点がori2又はP1複製起点である請求項1乃至6のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- ori2、repE及びparABを含む請求項1乃至7のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- parC及び/又はredFを含む請求項8に記載のクローニングベクター。
- P1プラスミドレプリコン、任意選択的にP1パッケージング部位(pac)及び任意選択的に2箇所のP1 loxP組換え部位を含む請求項1乃至9のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- さらにcos部位を含む請求項1乃至10のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- フォスミドとBACとの複合ベクターである請求項11に記載のクローニングベクター。
- 1種以上の選択マーカを含む請求項1乃至12のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- DNAのクローニング用ベクター系であって、請求項1乃至13のいずれか1項に記載のクローニングベクター及びRK2のtrfA遺伝子を含む第2のベクターを含むベクター系。
- 前記第2のベクターがトランスポゾンを含む請求項14に記載のベクター系。
- 前記trfA遺伝子が誘導プロモータの制御下にある請求項14又は15に記載のベクター系。
- 前記誘導プロモータがPm又はその突然変異体である請求項16に記載のベクター系。
- 請求項1乃至13のいずれか1項に記載のクローニングベクターを含有する宿主細胞。
- メタゲノムクローニングのための請求項1乃至13のいずれか1項に記載のベクターの使用。
- DNAをクローニングする方法であって、
(i) 該DNAを請求項1乃至13のいずれか1項のクローニングベクター中に導入し、
(ii) 該クローニングベクターを第1の細菌宿主細胞に導入し、
(iii) 該第1の宿主細胞を培養することによって該DNAをクローニングし、
(iv) 該クローニングしたDNAを1種以上の2次宿主に伝達させる
ことを含む方法。 - 前記第1の宿主細胞内の複製が前記別の複製起点(v)から生じ、前記1種以上の2次宿主内の複製がoriVから生じる請求項20に記載の方法。
- 前記第1の宿主細胞が大腸菌である請求項20又は21に記載の方法。
- DNAのクローンのライブラリを調製する方法であって、
(i) 該DNAをクローニングベクター又は請求項1乃至13のいずれか1項中に導入し、
(ii) 該クローニングベクターを第1の細菌宿主細胞に導入し、
(iii) 該第1の宿主細胞を培養することによって該DNAのクローンの第1のライブラリを調製し、
(iv) 該第1のライブラリを1種以上の2次宿主中に伝達させて1種以上の2次ライブラリを調製する
ことを含む方法。 - メタゲノムクローニング用広宿主範囲ベクターの構築のためのRK2レプリコンの使用。
- メタゲノムクローニング用RK2系クローニングベクターであって、大型挿入断片を広い宿主範囲において高コピー数でクローニングすることができるベクター。
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