JPH05304961A - 大腸菌の中の異種遺伝子の発現のための構成体および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 大腸菌の中の異種遺伝子の発現のための構成
体および方法を提供する。 【構成】 リプレッサー結合部位、リボソーム結合部位
の５’領域および翻訳開始コドンを含有するＴｎ１０
ｔｅｔＡ遺伝子の一部分からなるＤＮＡ配列において、
リプレッサー結合部位が別のヌクレオチド配列により少
なくとも一部分置換されているＤＮＡ配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉの中のタンパク質
の低ないし中程度の発現に適合するＤＮＡ構成体、およ
びタンパク質におけるそれらの使用に関する。

【０００２】タンパク質の生産のための外来遺伝子を発
現するために微生物、とくに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を
使用することは多年にわたって普通に行われてきてい
る。ほとんどの場合において、微生物を使用する目的は
商業的目的で大量のタンパク質を可能とするので、通常
タンパク質を最高の可能なレベルで発現することが望ま
しい。この理由で、ほとんどの発現系およびその中で使
用するＤＮＡ構成体は高いレベルの発現のために特別に
適合される。しかしながら、低ないし中程度のレベルの
発現が実際にいっそう望ましいか、あるいは必須でさえ
ある場合が存在する。例えば、いくつかの遺伝子の過剰
の発現は致死的である。また、微生物が特定の遺伝子産
生物に対する薬物の作用を検出するスクリーンのための
基準として使用される場合において、タンパク質の低い
レベルの発現は増強された感度を提供する。しかしなが
ら、発現の標識の繊細な調整は日常の仕事ではない。

【０００３】１例として、テトラサイクリン耐性をエン
コードする遺伝子の発現の低ないし中程度のレベルを達
成して、テトラサイクリン耐性を克服する薬物をスクリ
ーニングする適当な微生物を発生させることが望まし
い。大部分の微生物におけるこの耐性は、エネルギー依
存性の流出系の結果である（１）。これらの流出ポンプ
は種々のグラム陰性およびグラム陽性の両者のバクテリ
アにおいて分析され、そしてすべては多数の膜スパニン
グドメインをもつ同様な第２構造を示した。それにもか
かわらず、トランスボゾンＴｎ１０からのＥ．ｃｏｌｉ
のｔｅｔＡ遺伝子、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのｔｅｔＫ遺
伝子によりエンコードされる、最も普通のグラム陰性ポ
ンプのアミノ酸配列の比較は同一性をほとんど示さない
（２）。しかしながら、これらの２つのポンプは同様な
機能を実行するので、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主において黄色ブ
ドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のテトラサイクリン流出
ポンプをエンコードするｔｅｔＫ遺伝子についての研究
を実施することは、この系における遺伝学的操作および
生化学的研究を実施することが容易であると、有用であ
ろう。ｔｅｔＡおよびｔｅｔＫの流出ポンプは、テトラ
サイクリンの流出に関連する臨床的問題の大部分の原因
となる。さらに、同質遺伝子の使用は２つの流出ポンプ
のよりよい比較を可能とする。

【０００４】しかしながら、ｔｅｔＡまたはｔｅｔＫ遺
伝子が標準の強い発現ベクターの中にクローニングされ
る場合、１つの問題が存在する。トランスボゾンＴｎ１
０からのｔｅｔＡ遺伝子の過剰の発現は、例えば、この
遺伝子がマルチコピーのプラスミド中で発現される場
合、Ｅ．ｃｏｌｉに対して致死的である（３、４）。グ
ラム陰性バクテリア必要に応じて、このポンプの調節は
ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲのための調節領域に隣接して位
置する、リプレッサーであるｔｅｔＲ遺伝子産生物によ
り仲介される（５、６）。したがって、流出ポンプをエ
ンコードする他の遺伝子、例えば、ｔｅｔＫの発現を達
成できると仮定すると、完全な発現は、また、Ｅ．ｃｏ
ｌｉに対して致死的であることがある。

【０００５】Ｔｎ１０系を修飾してトランスボゾンＴｎ
１０遺伝子からのｔｅｔＡのコントロールされた発現を
可能とする試みがなされてきている。最近、エッカート
（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）（７）は、
マルチコピープラスミド上のトランスボゾンＴｎ１０か
らｔｅｔＡを、ｔｅｔＲの不存在下に、調節された誘発
可能な発現系を使用して、クローニングし、そして発現
した。この系において、ｔｅｔＡが完全に誘発されると
き、多分プロトンの移動力の消散のために（７）、細胞
は再び死亡する；バクテリアの中から外のテトラサイク
リンの活性な流出は細胞の中へのプロトンの侵入により
生かされるが、完全な誘発はバクテリアの生き残りに対
して必須なプロトンの勾配の損失に明らかに導く。エッ
カート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）の系
において、ｔｅｔＡ遺伝子は、マルチコピーのプラスミ
ドｐＣＢ２５８上に強いｔａｃプロモーターおよびｌａ
ｃｉ遺伝子（ラクトンリプレッサー）およびｌａｃオペ
レーター部位を含有する調節領域を使用して、転写のレ
ベルにおいて調節される。ｔｅｔＡ遺伝子の発現は、異
なる濃度のイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を使用して調節することができる。

【０００６】不都合なことには、エッカート（Ｅｃｋｅ
ｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）の系は、テトラサイク
リン流出ポンプの阻害因子の検出のための最適なスクリ
ーニング有機体を構築するという目的に適当である。第
１に、プラスミドｐＣＢ２５８の制限分析は、ｔｅｔ調
節領域の２つのｔｅｔＲオペレーター部位の１つがプラ
スミドの中にｔｅｔＡ解読領域に隣接して残留すること
を示す。こうして、ｔｅｔＡ遺伝子は、ｌａｃリプレッ
サーならびにテトラサイクリンリプレッサーの両者が細
胞の中に存在する場合、両者のリプレッサーにより調節
される。両者のリプレッサーの存在は、スクリーニング
有機体として使用するために設計された発現系において
有害な結果を引き起こす。こうして、ｐＣＢ２５８はｔ
ｅｔＡ遺伝子の比較的弱化された発現を可能とするが、
テトラサイクリン耐性のレベルはそれにもかかわらずポ
ンプ阻害因子についてのスクリーニングにおける使用に
高過ぎる。そのうえ、別の遺伝子、例えば、ｔｅｔＫの
挿入を可能とするために便利な制限部位は適当な領域の
中に存在しない。

【０００７】第２の問題は、とくにＥ．ｃｏｌｉの中の
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔｅｔＫ遺伝子
の発現に関して、生ずる。ｔｅｔＫ遺伝子は、従来、
Ｅ．ｃｏｌｉ系の中にクローニングされ、そして耐性を
付与しなかった（８）。こうして、証拠が示すように、
ｔｅｔＫ遺伝子は自然の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ）発現シグナル、例えば、自然のＴＴＧ開始コドン
を利用して発現することができない。したがって、ｔｅ
ｔＫ遺伝子の多少の操作はＥ．ｃｏｌｉの中の発現を達
成するために必要である。

【０００８】これらの困難を克服するために、本発明
は、その中でエンコードされるタンパク質、とくに異種
タンパク質の低ないし中程度のレベルを生ずる、ＤＮＡ
構成体、ベクターおよびＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を提供す
る。このような材料はテトラサイクリン耐性の阻害につ
いてのスクリーニングアッセイの発生においてとくに有
用である。

【０００９】本発明は、テトラサイクリンのリプレッサ
ー結合部位、リボソーム結合部位の５’領域および翻訳
開始コドンを含有するＴｎ１０ ｔｅｔＡ遺伝子の一部
分からなるＤＮＡ配列において、テトラサイクリンのリ
プレッサー結合部位が別のヌクレオチド配列により少な
くとも一部分置換されている、ＤＮＡ配列に関する。こ
の明細書および特許請求の範囲を通して、用語「リボソ
ーム結合部位」は、ゴールド（Ｇｏｌｄ）およびストー
モ（Ｓｔｏｒｍｏ）（１５）により解釈されるように、
広い意味において使用する；それはシャイン・ダルガル
ノ（ＳｈｉｎｅＤａｌｇａｒｎｏ）配列ばかりでなく、
かつまた翻訳に影響を与える他の因子を包含することを
意味する。これらは開始コドン、開始コドンからのシャ
イン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ）の
スペーシング、メッセンジャーＤＮＡの二次構造、開始
コドンに対して５’の領域のヌクレオチド配列（ここに
おいて５’領域は開始コドンに関してほぼ位置−２１ま
でを意味する）、および解読領域の配列を包含する。こ
れらの因子のいくつかまたはすべては、本発明に従い別
のヌクレオチド配列と置換することによって変更するこ
とができる。１つの実施態様において、別のヌクレオチ
ド配列は１または２以上の制限部位からなる。

【００１０】他の実施態様において、新規なＤＮＡ配列
は、また、問題のタンパク質のための解読領域からな
る。解読領域はＥ．ｃｏｌｉに対して自然のタンパク
質、例えば、ｔｅｔＡによりエンコードされるテトラサ
イクリン流出ポンプをエンコードすることができる。あ
るいは、解読領域はＥ．ｃｏｌｉに対して異種のタンパ
ク質をエンコードすることができる。

【００１１】解読領域を含有する新規な構造体は、Ｅ．
ｃｏｌｉの中で発現するとき、それによりエンコードさ
れるタンパク質の比較的低いレベルを生ずることができ
る。これらの配列は、例えば、ファージＰ１またはλ継
代培養を使用する形質導入によるか、あるいは適当なプ
ラスミドのベクターで形質転換することによって、Ｅ．
ｃｏｌｉの中に組み込むことができる。そのように産生
された微生物は、タンパク質が宿主細胞に対して毒性で
あることが期待されたこの場合において、あるいは調節
タンパク質の研究において、あるいはわずかに少量のタ
ンパク質の発現が望ましい場合において、タンパク質の
発現の研究のための研究の道具として有用である。

【００１２】好ましい実施態様において、微生物を使用
して、テトラサイクリン流出ポンプをエンコードする遺
伝子を発現する。とくに好ましい実施態様において、ポ
ンプは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）のｔｅｔＫポンプである。このような
微生物はテトラサイクリン流出ポンプを阻害する能力に
ついて化合物をスクリーニングするために有用である。
このようなスクリーンのための方法は同時継続出願、発
明の名称「テトラサイクリンのスクリーン法」、その内
容をここに引用によって加える、に開示されている。

【００１３】次の用語をこの明細書および特許請求の範
囲を通して使用する：ｔｅｔＡはトランスボゾンＴｎ１
０の中のテトラサイクリン流出ポンプをエンコードする
遺伝子を意味する；ｔｅｔＣはプラスミドｐＢＲ３２２
のテトラサイクリン流出ポンプをエンコードする遺伝子
を意味する；そしてｔｅｔＫは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の中のテトラ
サイクリン流出ポンプをエンコードする遺伝子を意味す
る。

【００１４】特許請求の範囲記載のＤＮＡ配列は、テト
ラサイクリン耐性の原因となるトランスボゾンＴｎ１０
（ｔｅｔＡ遺伝子）からのテトラサイクリンポンプをエ
ンコードするプラスミドｐＣＢ２５８内に見いだされ
る、ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片を修飾することによっ
て、本来得られる。ｔｅｔＡ調節のための誘発可能な発
現系は、前述したように、エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）
およびベック（Ｂｅｃｋ）（７）により開示された。し
かしながら、この系は、テトラサイクリンポンプを強く
発現し過ぎるので、テトラサイクリンポンプの遺伝子の
発現に許容されえないことがある。さらに、それはｔｅ
ｔＡ以外の遺伝子のクローニングのための便利な制限部
位を欠如し、そしてテトラサイクリンポンプの阻害因子
の検出に使用すべき微生物におけるその使用と不適合性
である、リプレッサー結合部位を含有する。したがっ
て、プラスミド、とくに解読領域およびｔｅｔＡ遺伝子
の調節領域の一部分を含有するＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断
片を研究して、このプラスミドの中への他の遺伝子のク
ローニングを可能とし、ならびにそのようにクローニン
グされた遺伝子の低いレベルの発現を可能とする配列を
提供することを試みる。

【００１５】Ｔｎ１０の、調節領域の一部分を包含す
る、ｔｅｔＡ遺伝子の略線図を図２に示す。腸のバクテ
リアにおけるテトラサイクリン耐性は、一般に、２つの
遺伝子の作用を通して、トランスボゾンＴｎ１０により
仲介される。簡単に述べると、テトラサイクリン流出ポ
ンプ遺伝子ｔｅｔＡの発現は、ｔｅｔＡ解読領域のわず
かに上流に位置する、ｔｅｔＲ結合部位に結合すること
ができるｔｅｔＲ遺伝子により調節される（５、６）。
エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）
のプラスミドｐＣＢ２５８を、ｔａｃプラスミドの背後
のＴｎ１０ｔｅｔＡ遺伝子をクローニングすることによ
って、操作してｔｅｔＡ遺伝子のコントロールされた発
現を達成した；この系における発現は、同一プラスミド
上にエンコードされたｌａｃリプレッサーのコントロー
ル下にある。ｔｅｔＲリボソーム結合部位のいずれか
が、存在する場合、組み換えプラスミド上にどの程度に
それらが存在するかをエッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）およ
びベック（Ｂｅｃｋ）は示さなかったが、制限分析はｔ
ｅｔＡ解読領域に最も近い１つの結合部位が残留するこ
とを示す。

【００１６】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔ
ｅｔＫの発現を達成する試みにおいて、ｐＣＢ２５８プ
ラスミドは便利な開始点を提供する；とくに、このベク
ターのＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ部位の間の領域に注目
が集中された。この領域の配列の詳細は図２に見いださ
れる。これを見ると示されるように、ｔｅｔＫ遺伝子を
クローニングすることができる便利な制限部位は存在し
ない。この問題を克服するために、ハイブリダイゼーシ
ョンして所望の修飾をもちかつ標準のクローニング法
（９）によりベクターのＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ部位
の中にクローニングするためのＢａｍＨＩおよびＮｃｏ
Ｉ粘着末端を含有するＤＮＡ断片を形成することができ
る、１対のオリゴマーを合成する。１つの鎖を図２に示
す（「ｐＣＢＳａ１」と表示する）。このベクターの中
のこの断片の置換は、２つの独特制限部位、すなわち、
開始コドンより上流のかつそれに隣接するＳａｌＩ部
位、および解読領域内のＸｈｏＩ部位の導入を生じ、こ
れらはｔｅｔＡタンパク質のアミノ酸配列を変更しな
い。ＳａｌＩ部位を包含する変化は予期せざる作用を有
する。このベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉの中でｔｅ
ｔＡを発現するとき、新しい配列はｔｅｔＡの発現を弱
くする。ＩＰＴＧの不存在下に、ｐＣＢ２５８を有す
る、菌株ＭＣ１０６１は４０μｇ／ｍｌのテトラサイク
リンに対する耐性を与えるが、ｐＣＢＳａ１を有するＭ
Ｃ１０６１はちょうど２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンに対する耐性を与える。さらに、ｐＣＢ２５８を含有
する菌株の遺伝子の発現に関連する細胞の死亡は、０．
２ミリモルのＩＰＴＧが存在するとき、起こるが、ｐＣ
ＢＳａ１を含有するＭＣ１０６１は、１ミリモルのＩＰ
ＴＧを添加するまで、殺されない。これが示唆するよう
に、この変化はｔｅｔＡのリボソーム結合部位の強さを
変更し、それを効率的とする、および／またはｍＲＮＡ
の安定性を変更する。

【００１７】次いで、この構成体を使用してＥ．ｃｏｌ
ｉの中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔｅｔ
Ｋ遺伝子の発現を試みる。修飾しないｔｅｔＫ遺伝子
は、Ｅ．ｃｏｌｉの中に存在するとき、耐性を与えない
ので、多少の変更が要求される。Ｅ．ｃｏｌｉの中の発
現達成するために、ｔｅｔＫ遺伝子は、バクテリオファ
ージＭ１３の中において、クローニングの目的で開始部
位に対して直ぐの５’にＳａｌＩを含有するするように
修飾される。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を促進
する１つの便利な手段として、通常のｔｅｔＫのＴＴＧ
開始コドンをＡＴＧに突然変異化する。次いで、こうし
て修飾されたｔｅｔＫ遺伝子をｐＣＢＳａ１ベクターの
中に結合する。

【００１８】プラスミドｐＧＧ５７を使用して、Ｅ．ｃ
ｏｌｉを形質転換し、そしてｔｅｔＫの発現について試
験する。明らかに弱化されたリボソーム結合部位の作用
は、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＴＧ開始コドンの存在によりバラ
ンスされ、インデューサーの不存在下に、約２５μｇ／
ｍｌの適度のレベルのテトラサイクリン耐性を与え、し
たがって低いレベルの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ｔｅｔＫ遺伝子産生物
を産生する菌株を生ずる。

【００１９】ｐＣＢＳａ１から誘導されたプラスミドを
もつＥ．ｃｏｌｉは低いレベルのタンパク質を適当に発
現するが、ｔｅｔ遺伝子より先行する強いｔａｃプロモ
ーターをさらに除去することによってさえ、発現のレベ
ルを減少することができる。親のｐＣＢ２５８およびプ
ラスミドｐＣＢＳａ１の両者において、発現はこのプロ
モーターにより調節される。しかしながら、実質的な発
現は、インデューサーの不存在下においてさえ、ｐＣＢ
２５８から起こり、そしてより少ない程度に、ｐＣＢＳ
ａ１から起こる。発現は、転写開始シグナルではなく、
問題の遺伝子およびそのリボソーム結合部位を他のプラ
スミドの中にクローニングすることによって、さらに減
少することができる。新規なプラスミドにおける位置は
活性的に翻訳開始コドンされる遺伝子内に存在しないこ
とが好ましい。この型のプラスミドはテトラサイクリン
流出ポンプの遺伝子の発現においてとくに有用である
が、当業者は容易に認識するように、それらは、また、
Ｅ．ｃｏｌｉの中の異種遺伝子の発現において使用する
ことができる。このような低いレベルの発現系が有用で
ある他の遺伝子は、例えば、スクリーンにおける調節タ
ンパク質または大量で細胞に対して毒性であるタンパク
質を包含する。

【００２０】テトラサイクリンポンプ阻害因子を検出す
るスクリーニング微生物を発生させることに関して、こ
の型の菌株は理想である。他のテトラサイクリンポンプ
を含有する有機体、例えば、トランスボゾンＴｎ１０を
有する菌株は、この型の系においてある数の欠点を有す
る。例えば、Ｔｎ１０は高いレベルのテトラサイクリン
耐性を与え、こうして、完全にテトラサイクリン耐性の
菌株においてシグナルを検出することができる前に、阻
害すべき多数のポンプが存在する。また、Ｔｎ１０のｔ
ｅｔＡ遺伝子は調節される；流出ポンプの阻害は、テト
ラサイクリンの細胞内のレベルの増加に対する応答とし
て、新規な流出ポンプの合成の増加を生ずるので、阻害
因子の作用は完全にテトラサイクリン耐性菌株により最
小となるであろう。トランスボゾンＴｎ１０は、また、
リプレッサー遺伝子ｔｅｔＲ、ならびにｔｅｔＡ遺伝子
に寄与する；リプレッサーの発現の増加は感受性の減少
を引き起こすことがある（１０）。エッカート（Ｅｃｋ
ｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）のプラスミドである
ｐＣＢ２５８は、発現をある程度までコントロールする
ことができるように、修飾されていてさえ、なおその欠
点を有する。低い、構成的なレベルのｔｅｔＡの発現
は、エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃ
ｋ）の系が、いくつかの理由で、理想的には適合しない
仕事である、テトラサイクリン流出ポンプの阻害因子を
検出するための、スクリーニング有機体に最適である。
第１に、ｐＣＢ２５８を含有する菌株の中のｔｅｔＡの
発現ベクターのレベルは、ポンプの阻害因子についての
スクリーニングにおける最適な使用になお高過ぎる（Ｍ
ＩＣ＝５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧの不存在下）。第２
に、プラスミドｐＣＢ２５８上のｔｅｔＡの発現を誘発
するであろうラクトースは、スクリーニングすべき発酵
ブロス内に存在することがあり、スクリーンを妨害す
る。さらに、ｐＣＢ２５８の制限分析は、ｔｅｔ調節領
域の２つのオペレーター結合部位の１つがプラスミドｐ
ＣＢ２５８の中に存在することを示す。ｔｅｔ調節要素
を利用し、したがってｔｅｔＲ遺伝子を含有するスクリ
ーニング有機体において、低い構成的なレベルの発現を
達成することができない。最後に、別の遺伝子、例え
ば、ｔｅｔＫの挿入を可能とする便利な制限部位は適当
な領域に存在しない。

【００２１】他の研究のための低い発現系の使用に関し
て、同質遺伝子の宿主の中のｔｅｔＡ、ｔｅｔＣおよび
ｔｅｔＫの調節された発現は遺伝子産生物の注意深い比
較を可能とする。例えば、１つのテトラサイクリン耐性
の決定基を含有するバクテリアの１つの菌株は、第２の
テトラサイクリン耐性決定基を含有する異なる有機体よ
り、特定のテトラサイクリンに対して耐性であることを
観察することができる。差が決定基または菌株に起因す
るかどうを決定することは困難である。本発明は、同一
の遺伝学的バックグラウンドにおける３つの異なるテト
ラサイクリン流出ポンプの注意した比較を可能として、
異なるポンプが明確な基質の特異的を有するという仮説
を試験することができる（１１）。これによりランスボ
ゾンＴｎ１０からのｔｅｔＡポンプは関係するｔｅｔＣ
ポンプと顕著には異ならないことが示されるが、黄色ブ
ドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのｔｅｔＫポンプは
事実異なる基質特異的を示すと思われる。また、カリウ
ムイオンの細胞の中への侵入を促進する能力をｔｅｔＣ
ポンプは有する（１２）が、ｔｅｔＡポンプをそれをも
たず、この能力を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）
のｔｅｔＫポンプが有するかどうかの研究が可能とな
る。これらの実験はカリウムの吸収が特異的に欠乏する
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株においてのみ実施することができ（１
２）、これは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）にお
いて利用可能ではない。ｔｅｔＫポンプはカリウムイオ
ンの侵入を促進することができたと決定される。また、
ハイブリッドポンプのタンパク質が、本発明の調節され
た、低い発現系を利用することによって機能的すること
ができるかどうかの研究が可能である。また、従来の研
究（１３）と対照的に、少なくともいくつかのハイブリ
ッドｔｅｔＣ−ｔｅｔＡのポンプは機能することができ
ることが発見された。したがって、低い発現系は、スク
リーニング有機体の構成ならびに過剰に発現される場
合、致死的作用を有する、これらのタンパク質の機能の
研究の両者において、価値ある利点である。

【００２２】明らかなように、特定のｐＣＢＳａ１配列
内のある種の修飾は、その配列の有用な特性への全体の
作用を変更しないで、可能である。例えば、ＳａｌＩ部
位は任意の制限部位で置換できることが考えられる。ま
た、理解されるように、発現すべき遺伝子および発現の
所望のレベルに依存して、別のプロモーター、例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐまたはλＰＬを同様によく使用す
ることができる。また、次の実施例において示すよう
に、発現が無関係のプラスミドについて容易に達成する
ことができ、そして他のプラスミドの中に所望の配列挿
入するために要求される修飾、すなわち、制限部位の修
飾は、この明細書の開示が与えられると、当業者の技量
の範囲内であるので、本発明は特定のプラスミドの使用
に限定されない。また、構成体はテトラサイクリン流出
ポンプの遺伝子の発現に関連して発生されたが、明らか
なように、Ｅ．ｃｏｌｉの中の低い発現が望ましい任意
の遺伝子をｔｅｔＡまたはｔｅｔＫ遺伝子の代わりに使
用することができる。

【００２３】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。これらの実施例は本発明を限定しない。

【００２４】

【実施例】プラスミドｐＣＢＳａ１の構成 ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ末端を含有する、下に示す、
１対の合成した相補的オリゴマーを、標準結合条件
（９）を使用して、ｐＣＢ２５８（７）の大きいＢａｍ
ＨＩ／ＮｃｏＩ断片に結合する。

【００２５】

【化１】

【００２６】プラスミドｐＣＢＳａ１はｐＣＢ２５８の
中に存在するテトラサイクリンのオペレーター結合部位
について欠失されており、そして２つの独特制限部位を
含有する；開始コドンｔｅｔＡに対して直ぐに５’のＳ
ａｌＩ部位および遺伝子によりエンコードされるアミノ
酸配列を変更しないｔｅｔＡの解読領域の中のＸｈｏＩ
制限部位。ＢａｍＨＩ部位は、また、ｐＣＢＳａ１にお
いて独特である。

【００２７】ｔｅｔＫを含有する発現ベクターの構成 Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｔｅｔＫ遺伝子を発現するｐＣＢ
Ｓａ１誘導体を２工程において構成する。第１に、Ｍ１
３バクテリオファージ、ＭＣ７１（８）の中のｔｅｔＫ
遺伝子を、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら（１４）に従
い、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発を
使用して突然変異化する。オリゴマー５’−ＣＣＴＣＡ
ＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＡＧＴ
ＴＴＡＧ−３’を使用して、ＡＴＧに対する天然に存在
するｔｅｔＫ開始コドンを変更し、そして新しい開始コ
ドンのちょうど上流にＳａｌＩ制限部位を導入する。次
いで、修飾されたｔｅｔＫ遺伝子を含有するＲＦＩファ
ージＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そし
て、ｐＣＢＳａ１をＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たとき、発生した大きい断片の中に結合して、プラスミ
ドｐＧＧ５７を生成する。ｔｅｔＫ遺伝子のもとのＴＴ
Ｇ開始コドンを含有する同質遺伝子のプラスミド、ｐＧ
Ｇ７１と呼ぶ、を、また、２工程で構成する。オリゴマ
ー５’ＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＡ
ＡＧ３’を使用して、ｔｅｔＫのための自然（ＴＴＧ）
翻訳開始コドンに隣接してＳａｌＩ制限部位を導入す
る。プラスミドｐＣＢＳａ１を上に概説した方法で構成
する。すべてのファージ構成体の配列を標準の手順
（９）に従いＤＮＡ配列分析により評価する。

【００２８】ｔｅｔＫ遺伝子は、プラスミドｐＧＧ５７
をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化し、そして
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４をＨｉｎｃＩＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩ酵素で消化することによって発生した大きい
断片に２．７Ｋｂの断片を結合することによって、別の
発現ベクター上にクローニングする。生ずる組み換え体
は、ｐＧＧ７６と表示し、ｌａｃＩ遺伝子、ｔａｃプロ
モーター、引き続いてＡＴＧ開始コドンを含有するｔｅ
ｔＫ遺伝子を含有する。

【００２９】プラスミドｐＢＲ３２２からのテトラサイ
クリン流出ポンプをエンコードするｔｅｔＣ遺伝子を、
標準の技術（９）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応に
よりこの発現系の中に転移して、ＡＴＧ開始コドンの直
前でＳａｌＩを操作する。生ずるプラスミドをＳａｌＩ
およびＮｈｅＩ酵素で消化し、そしてｔｅｔＣ解読領域
の５’末端を含有する小さい断片を分離する。ｔｅｔＣ
の３’末端は、ｐＢＲ３２２をＡｖａＩ酵素で消化し、
クレノー酵素でフィルインし、そしてＮｈｅＩ酵素で消
化することによって分離する。全体のｔｅｔＣ解読領域
を３方結合により発現系の中に結合し、ここで発現ベク
ターはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フィルインし、そして
ＳａｌＩ酵素で消化することによって調製する。（２方
結合はｔｅｔＣ遺伝子内のＳａｌＩ部位の存在のために
直接的では内。）全体のｔｅｔＣ遺伝子を含有するプラ
スミドを菌株ＭＣ１０６１の形質転換後分離し、アンピ
シリン耐性について選択する。標準の技術を使用する
（９）。

【００３０】菌株ＭＣ１０６１内のプラスミドｐＣＢ２
５８のテトラサイクリン耐性は、高いレベルのＩＰＴＧ
を培地に添加したときでさえ、１５μｇ／ｍｌである。
テトラサイクリン耐性のレベルはｐＢＲ３２２により与
えられるテトラサイクリン耐性より少なくとも５倍低
く、発現の最適なｌｖが達成されないことが示される。
したがって、多少の誘発を可能とする、０．１ミリモル
のＩＰＴＧを、また、含有したＬＢ寒天の中で、１００
μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下に生き残ること
ができる突然変異体が選択される。プラスミドｐＧＧ７
５を含有する、１つの突然変異誘導体を分離し、そして
引き続く構造において使用する。形質転換体は高いテト
ラサイクリン耐性について事実生ずるので、突然変異は
プラスミド上に位置すると決定される。ｔｅｔＣ解読領
域内の突然変異の可能性は、標準の技術（９）により、
全体のｔｅｔＣ解読領域を配列決定し、そして野生型配
列のみを見いだすことによって排除される。

【００３１】テトラサイクリン耐性の決定 プラスミドｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１、ｐ
ＧＧ７５またはｐＧＧ７６を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株
ＭＣ１０６１を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
するルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）（２）
の中の一夜の培養により、テトラサイクリン耐性につい
て試験する。各一夜の培養物の１：５０の希釈物を新鮮
なＬ−Ａブロスの中に接種する。指数的に成長する細胞
を０．８５％の生理的塩類溶液の中に系統的希釈し、こ
うして各プレートを２００〜５００細胞で接種する。ア
ンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有し、ある範囲の濃
度のＩＰＴＧおよびテトラサイクリン（０．００１ミリ
モル〜１．０ミリモルのＩＰＴＧおよび０〜２００μｇ
／ｍｌのテトラサイクリン）を含有するＬ寒天（ｐＨ
６．８−７．０）上に細胞を広げる。プレートを３７℃
において１８〜２０時間インキュベーションし、そして
最小阻害濃度（ＭＩＣ）を細胞の少なくとも９０％がコ
ロニーを形成するのを防止する濃度（ＬＤ９０）として
決定する。ｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１、ｐ
ＧＧ７５またはｐＧＧ７６の比較を図４に示す。プラス
ミドｐＣＢＳａ１は、ｐＣＢ２５８と比較したとき、同
一レベルのテトラサイクリン耐性を与える；しかしなが
ら、ｐＣＢ２５８はＩＰＴＧの不存在下により高い耐性
を与える（ＭＩＣ＝５０）。さらに、ちょうど０．１ミ
リモルのＩＰＴＧはｐＣＢ２５８を含有する細胞を殺す
ために十分であるが、１ミリモルのＩＰＴＧはｐＣＢＳ
ａ１を含有する細胞を殺すために必要である。こうし
て、リボソーム結合部位の変更は示される。プラスミド
ｐＧＧ５７は、ＡＴＧ開始部位をもつｔｅｔＫ遺伝子を
含有し、また、低いレベルのＩＰＴＧにおいて成長させ
るとき、耐性を与え、それ以上の誘発は細胞の死亡を引
き起こす。ＴＴＧ開始コドンを含有するプラスミドｐＧ
Ｇ７１は、高いＩＰＴＧレベルにおいてのみ起こる、極
端に低いレベルの耐性を与える。この結果は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉの中のｔｅｔＫ遺伝子の発現においてＡＴＧ開始部
位の重要性を示す。

【００３２】ｐＧＧ７６のｔｅｔＫの発現の結果は図５
に示す。プラスミドｐＧＧ７６はｐＡＣＹＣ１８４の複
製の由来を含有するが、プラスミドｐＧＧ５７はｐＢＲ
３２２に頼る。この図面が示すように、ＩＰＴＧで誘発
すると、ｐＧＧ７６を有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０
６１はｐＧＧ５７を有するＭＣ１０６１に対する同様な
テトラサイクリン耐性のプロフィルを示すが、ただしよ
り多くのＩＰＴＧは最大のテトラサイクリン耐性を達成
するために要求される。これは、ｐＡＣＹＣ１８４誘導
体がｐＧＧ５７より低いコピー数で存在し、したがって
完全な耐性を与えるためにより多くのＩＰＴＧを必要と
することがあるという事実と一致する。全体的に、これ
らの結果が示すように、ｔｅｔＫの調節可能な発現は無
関係のプラスミドの型において使用することができる。

【００３３】無関係のｔｅｔＫ発現プラスミドの構成 プラスミドｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１、ｐＧＧ７５、ｐＧ
Ｇ７６およびｐＣＢＳａ１はｔｅｔ遺伝子のより低い発
現において有用であり、ｔｅｔＲ遺伝子産生物による調
節の特徴は除去され、そしてリボソーム結合部位は翻訳
が弱化されるように変更される。しかしながら、プラス
ミドのすべては、誘発可能なプロモーターを調節する調
節要素、すなわち、ｌａｃＩ遺伝子を含有する。スクリ
ーニング有機体の目的のために、この最終レベルの調節
を排除して、ｔｅｔＫ遺伝子が低い構成的レベルで発現
されるようにする。この目的で、トランスボゾンＴｎ１
０のｔｅｔＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＴ４０１
（１０）は、プラスミドｐＣＢＳａ１をＳｍａＩ制限酵
素で消化し、そしてプラスミドｐＢＴ４０１の中に小さ
い断片を結合することによって構成し、これをＢａｍＨ
Ｉ酵素で消化し、そしてクレノー酵素で記載するように
（９）クレノー酵素でフィルインする。テトラサイクリ
ン耐性を与える構成体において、制限分析により決定し
て、遺伝子はカナマイシン耐性（ａｐｎ）遺伝子と同一
の向きである。この遺伝子が反対方向にあるとき、テト
ラサイクリン耐性は検出されない。黄色ブドウ球菌
（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔｅｔＫ遺伝子を含有する同質
遺伝子のプラスミドは、ｔｅｔＫ源としてプラスミドｐ
ＧＧ５７を使用して同様に構成する。

【００３４】これらのプラスミドを使用して、テトラサ
イクリン流出ポンプの阻害因子についてのスクリーニン
グアッセイにおける使用に適当なＥ．ｃｏｌｉ菌株を形
質転換する。

【００３５】テトラサイクリン流出ポンプの基質の特異
性 従来の研究が示唆するように、テトラサイクリン流出ポ
ンプは異なるテトラサイクリンを認識し、そして送り出
す能力を変化する（１１）。この解釈は別の説明により
制限される。例えば、差は宿主菌株の感受性に起因する
ことがありうる。さらに、流出ポンプがより強いテトラ
サイクリン耐性を与える場合、誘導体、例えば、ミノカ
イクリンに対する低いレベルの耐性が、すべてのテトラ
サイクリン基質を送る能力の増大と反対に、ポンプがミ
ノカイクリンを認識する能力に起因するかどうかを区別
することは困難である。「よりすぐれた」ポンプが、よ
り効率よいポンプであるよりむしろ、単に致死的がより
低く、より大きい数における許容されることさえ可能で
ある。他の可能性を除外しかつ唯一の変数として異なる
基質を見るために、ｔｅｔＡ、ｔｅｔＣおよびｔｅｔＫ
がエンコードするポンプが種々のテトラサイクリンに対
する耐性を単一の宿主菌株ＭＣ１０６１を与える能力
を、本発明の低いレベルの調節された系を使用して研究
する（表１）。この発現系を使用して、密接に関係する
流出系、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＣは異なるテトラサイク
リン類似体に対する基質の特異性の顕著な差を示ないこ
とが明らかにされた。さらに、ＩＰＴＧ濃度をｔｅｔＡ
を有するＭＣ１０６１について減少して、テトラサイク
リン耐性がｔｅｔＣ菌株と同一であるようにするとき、
他のテトラサイクリンに対する耐性の小さい差は消失す
る（データは示されていない）。対照的に、ｔｅｔＫ流
出系はテトラサイクリン誘導体のミノサイクリン、ドキ
シテトラサイクリンおよび６−デメチル−６−デオキシ
テトラサイクリンを送り出す能力の差を事実示す（表
１）。こうして、低いレベルの調節された発現系は、別
の説明を除外し、そしてテトラサイクリン流出ポンプの
間の基質の特異性の真の差を決定することができる。

【００３６】

【表１】 表１ 最大に誘発されたｔｅｔＡ、ｔｅｔＫおよびｔｅｔＣのＭＩＣ（ＬＤ９０） ｐＣＢＳａ１ ｐＧＧ５７ ｐＧＧ７５ テトラサイクリン １５０ １７５ １００ ミノサイクリン １４ ４ ８ アンヒドロＴｃ ３ ２ ２ オキシＴｃ ＞３００ ２５０ ３００ ドキシＴｃ ４０ ７ ２０ クロロＴｃ ５０ ４０ ４０ ６−メチル ２０ ７ ２０ ６−デオキシＴｃ ｐＧＧ５７、ｐＣＢＳａ１またはｐＧＧ７５を含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１を使用して、テトラサイ
クリンならびに６つのテトラサイクリン類似体について
ＭＩＣ（ＬＤ９０）を決定する。各プラスミドは最大の
誘発のために異なるレベルのＩＰＴＧを必要とする。Ｍ
ＩＣの研究はｐＧＧ５７を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｍ
Ｃ１０６１について０．０１ミリモルのＩＰＴＧの存在
下に実施する。０．５ミリモルのＩＰＴＧのレベルは、
ｐＧＧ７５を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１の
最適な誘発のために要求される。ｐＣＢＳａ１を含有す
るＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１は、最大の誘発のため
に０．１ミリモルのＩＰＴＧのＩＰＴＧレベルを必要と
する。これらのＭＩＣの研究のすべては二重反復実験に
おいて実施する。

【００３７】テトラサイクリン流出ポンプの発現の追加
の測度としてのカリウムの吸収 宿主細胞の中から外にテトラサイクリンを送り出すこと
に加えて、ｔｅｔＡポンプではなく、ｔｅｔＣポンプは
Ｅ．ｃｏｌｉの中にカリウムを送入する能力を有する。
この表現型を見るために、２つの突然変異のためにカリ
ウムの吸収が損なわれた宿主Ｅ．ｃｏｌｉ菌株、例え
ば、ＴＫ２２０５を使用しなくてはならない（１２）。
われわれの発現系、およびＥ．ｃｏｌｉにおいてｔｅｔ
Ｋの発現を生ずる適応は、ｔｅｔＫポンプがまたカリウ
ムの侵入を促進する能力を有するという決定を可能とす
る。ｔｅｔＫが低い濃度のカリウムを含有する最小培地
の中でＩＰＴＧで誘発されるとき、すぐれた成長は、プ
ラスミドｐＧＧ５７またはｐＧＧ７６を使用するとき、
観察される。ｔｅｔＣ遺伝子について、カリウムの吸収
およびテトラサイクリンの流出は独立の機能である；事
実、流出活性もつことができない欠失誘導体はカリウム
を送入する能力をなお維持する（１２）。同様によくｔ
ｅｔＫポンプについて、カリウムの吸収は、テトラサイ
クリン流出活性の不存在下に、ちょうど遺伝子の断片が
発現されるとき、起こる（図６〜７）。図６に概略的に
示す構成を発生するために、プラスミドｐＧＧ７６をＫ
ｐｎＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で消化し、そして平滑末
端をつくり、これらを結合してプラスミドｐＧＧ７７を
生成する。同様に、ｐＧＧ７６を、このプラスミド内で
２回切断するＥｃｏＮＩ酵素で消化し、そして、標準ク
ローニング技術（９）に従い、再結合してプラスミドｐ
ＧＧ８４を形成する。両者の誘導体のプラスミドは、低
いレベルのカリウムの存在下に成長する能力を菌株ＴＫ
２２０４に付与する。こうして、これらのポンプの両者
について、カリウムを輸送する能力は遺伝子の最初の１
／３に局在化される。現在の技術水準において、これら
の研究は、カリウム吸収突然変異体が入手可能ではない
ので、自然宿主種の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ）を使用して実施することができない。

【００３８】ハイブリッドのテトラサイクリン流出ポン
プの構成 調節された発現系はハイブリッドのポンプの構成を可能
として、活性、例えば、カリウムの吸収、基質特異性ま
たは強い残基がポンプのあるドメインに局存化されうる
かどうかを研究を可能とする。この目的で、ｔｅｔＣ遺
伝子の最初の４７アミノ酸をエンコードしそしてこの遺
伝子の残部がｔｅｔＡ遺伝子をエンコードするハイブリ
ッド遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応およびオリゴヌク
レオチド仲介部位特異的突然変異誘発、ならびに記載さ
れているように（９）制限消化および結合を使用して構
成する。このハイブリッド遺伝子は、ｐＧＧ７５に結合
すると、テトラサイクリン耐性を宿主菌株ＭＣ１０６１
に付与するタンパク質をエンコードする。こうして、ハ
イブリッドタンパク質は、発表された報告（１３）と反
対に、適切なレベルの発現が達成されるかぎり、テトラ
サイクリンの流出について機能することができる。特別
の機能をもつタンパク質のドメインを同定できるかどう
かを決定するために、他のハイブリッド遺伝子を、ま
た、構成する。以下の生物学的材料は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ）に１９９１年１
２月３日に受託され、そして表示する受け入れ番号を与
えられた。これらはアメリカン・サイアナミド・カンパ
ニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）、レダーレ・ラボラトリーズ（Ｌｅｄｅｒｌｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ニューヨーク州パールリ
バー、の菌株保存機関において入手可能である。

【００３９】 プラスミド 受け入れ番号 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ｐＣＢＳａ１ ＡＴＣＣ ６８８５５ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ｐＧＧ５７ ＡＴＣＣ ６８８５６ 配列ＩＤ Ｎｏ．１ 配列の型：核酸 配列の長さ：６６塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：トランスボゾンＴｎ１０ GTTGACACTC TATCATTGAT AGAGTTATTT TACCACTCCC 40 TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAA 63 ATG 66 1 配列ＩＤ Ｎｏ．２ 配列の型：核酸 配列の長さ：７２塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：プラスミドｐＣＢＳａ１ GGATCCATAG AGAAAGTCGA C 21 ATG AAC TCG AGT ACA AAG ATC GCA TTG GTA ATT ACG 57 1 5 10 TTA CTC GAT GCC ATG 72 15 17 配列ＩＤ Ｎｏ．３ 配列の型：核酸 配列の長さ：３０塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：プラスミドｐＧＧ５７ GGATCCATAG AGAAAGTCGA C 21 ATG TTT AGT 30 1 3 配列ＩＤ Ｎｏ．４ 配列の型：核酸 配列の長さ：３０塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：プラスミドｐＧＧ７１ GGATCCATAG AGAAAGTCGA C 21 TTG TTT AGT 30 1 3 配列ＩＤ Ｎｏ．５ 配列の型：核酸 配列の長さ：２６塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：バクテリオファージＭＣ７１ GTAAAGAGGT AAAATTGTTT AGTTTA 26 配列ＩＤ Ｎｏ．６ 配列の型：核酸 配列の長さ：１７塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：ｐＧＧ５７ GTCGACATGT TTAGTTT 17 配列ＩＤ Ｎｏ．７ 配列の型：核酸 配列の長さ：１７塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：ｐＧＧ７１ GTCGACTTGT TTAGTTT 17引用文献 １、マクマレイ（ＭｃＭｕｒｒａｙ）、Ｌ．Ｍ．、Ｒ．
Ｅ．ペトルッチ（Ｐｅｔｒｕｃｃｉ）、Ｊｒ．および
Ｓ．Ｂ．レビイ（Ｌｅｖｙ）、１９８０、大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における４つの遺伝学
的に異なるテトラサイクリン耐性要素によりエンコード
されるテトラサイクリンの活性な流出、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、７
７：３９７４−３９７７。

【００４０】２、モジュムダー（Ｍｏｊｕｍｄａｒ）、
Ｍ．およびＳ．Ａ．カール（Ｋｈａｒ）、１９８８、黄
色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）のプラスミドｐＴ１８１のテトラサイクリン耐
性遺伝子の特性決定、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１７０：５５
２２−５５２８。

【００４１】３、コウルマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）、Ｄ．
Ｃ．およびＴ．Ｊ．フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）、１９
８１、マルチコピーにおけるトランスボゾンＴｎ１０に
より決定したテトラサイクリン耐性の発現における減少
の分析、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）１８２、１
７１−１７７。

【００４２】４、モイド（Ｍｏｙｅｄ）、Ｊ．Ｓ．、
Ｔ．Ｔ．グエン（Ｎｇｕｙｅｎ）およびＫ．Ｐ．バート
ランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）、１９８３、ｔｅｔ遺伝子
の発現の誘発に対する感受性を付与するマルチコピーの
Ｔｎ１０のｔｅｔプラスミド、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５
５、５４９−５５６。

【００４３】５、バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）、
Ｋ．Ｐ．、Ｋ．ポストル（Ｐｏｓｔｌｅ）、Ｌ．Ｖ．ウ
レイ（Ｗｒａｙ）、Ｊｒ．およびＷ．Ｓ．レズニコフ
（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）、１９８３、オーバーラッピン
グする発散プロモーターはＴｎ１０テトラサイクリン耐
性の発現をコントロール、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２３：
１４９−１５６。

【００４４】６、ヒレン（Ｈｉｌｌｅｎ）、Ｗ．、Ｋ．
ショルメイアー（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒ）およびＣ．
ガッツ（Ｇａｔｚ）、１９８４、Ｔｎ１０エンコーデッ
ドテトラサイクリン耐性オペロンＩＩの発現のコントロ
ール、ＲＮＡポリメラーゼおよびＴＥＴリプレッサーと
ｔｅｔオペロン調節領域との相互作用、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）、１７２：１８５−２０１。

【００４５】７、エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）、Ｂ．お
よびＣ．Ｆ．ベック（Ｂｅｃｋ）、１９８９、トランス
ボゾンＴｎ１０エンコーデッドテトラサイクリンタンパ
ク質の過剰の産生は膜タンパク質の死および損失を生ず
る、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７１：３５５７−３５５９。
８、リチャード・ノウビック（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｎｏｖ
ｉｃｋ）、個人的通信。

【００４６】９、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、
Ｊ．、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）および
Ｔ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９、分子
クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・
スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ）、ニューヨーク。

【００４７】１０、バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎ
ｄ）、Ｋ．Ｐ．ポスル（Ｐｏｓｔｌｅ）、Ｌ．Ｖ．、レ
イ（Ｗｒａｙ）、Ｊｒ．およびＷ．Ｓ．レスニコフ（Ｒ
ｅｓｎｉｋｏｆｆ）、１９８４、単一のｃｏｐプロモー
ターのベクターの構成およびトランスボゾンＴｎ１０テ
トラサイクリン耐性決定基の調節の分析におけるその使
用、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５８：９１０−９１９。

【００４８】１１、チョプラ（Ｃｈｏｐｒａ）、Ｉ．、
Ｋ．ハッカー（Ｈａｃｋｅｒ）、Ｚ．ミスロビン（Ｍｉ
ｓｕｌｏｖｉｎ）およびＤ．Ｍ．ロスステイン（Ｒｏｔ
ｈｓｔｅｉｎ）、１９９０、ｔｅｔＡ−ｌａｃＺ融合系
を使用するテトラサイクリンの感受性の生物学的検出
法、抗微生物剤および化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）３４：１１
１−１１６。

【００４９】１２、ドッシュ（Ｄｏｓｃｈ）、Ｄ．
Ｃ．、Ｆ．Ｆ．サルバシオン（Ｓａｌｖａｃｉｎ）およ
びＷ．エプステイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）、１９８４、ｐ
ＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性要素はカリウムの輸
送を仲介する、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１６０：１１８８−
１１９０。

【００５０】１３、ルビン（Ｒｕｂｉｎ）、Ｒ．Ａ．お
よびＳ．レビイ（Ｌｅｖｙ）、１９９０、インタードメ
インのハイブリッドｔｅｔタンパク質は、ｔｅｔ遺伝子
族の密接に関係するメンバーから誘導されるときにの
み、テトラサイクリン耐性を付与する、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）１７２：２３０３−２３１２。

【００５１】１４、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｔ．
Ａ．、Ｊ．Ｄ．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびＲ．
Ａ．ザコウル（Ｚａｋｏｕｒ）、１９８７、表現型の選
択を使用しない急速なかつ効率よい部位特異的突然変
異、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５４：３６７。

【００５２】１５、ゴールド（Ｇｏｌｄ）、Ｌ．および
Ｇ．ストルモ（Ｓｔｏｒｍｏ）、１９８７、大腸菌およ
びネズミチフス菌：細胞および分子生物学（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｃ．
ニードハード（ｎｉｅｄｈａｒｄ）（編）、アメリカン
・ソサイアティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ、Ｖｏｌ．２：１３０２−
１３０７。

【００５３】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【００５４】１、リプレッサー結合部位、リボソーム結
合部位の５’領域および翻訳開始コドンを含有するＴｎ
１０ ｔｅｔＡ遺伝子の一部分からなるＤＮＡ配列にお
いて、リプレッサー結合部位が別のヌクレオチド配列に
より少なくとも一部分置換されている、ことを特徴とす
る、ＤＮＡ配列。

【００５５】２、別のヌクレオチド配列は少なくとも１
つの制限部位からなる、上記第１項記載の配列。

【００５６】３、さらにタンパク質の解読領域からな
る、上記第１項記載の配列。

【００５７】４、タンパク質はトランスボゾンＴｎ１０
のｔｅｔＡ遺伝子または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ）のｔｅｔＡ遺伝子によりエンコードされるテトラ
サイクリンの流出ポンプである、上記第３項記載の配
列。

【００５８】５、ＳａｌＩ制限部位、ＡＴＧ開始コド
ン、およびｔｅｔＡ解読領域またはｔｅｔＫ解読領域か
らなる、上記第４項記載の配列。

【００５９】６、図１Ｂに描写するように、ｐＣＢＳａ
１の中に存在するか、あるいは図１Ｂに描写するよう
に、ｐＧＧ５７の中に存在する、上記第１項記載の配
列。

【００６０】７、上記第１〜７項のいずれかに記載の配
列からなるベクター。

【００６１】８、プラスミドである、上記第８項記載の
ベクター。

【００６２】９、上記第１〜７項のいずれかに記載の配
列からなるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。１０、配列はプラス
ミド上に含有される、上記第１０項記載の宿主細胞。

【００６３】１１、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）ｔｅｔＫ遺伝子を発現することができる、Ｅ．
ｃｏｌｉ宿主細胞。

【図面の簡単な説明】

【図１】親のプラスミド（ｐＣＢ２５８）および４つの
誘導体ｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１およびｐ
ＧＧ７５の概略的表示。プラスミドｐＣＢＳａ１および
ｐＣＢ２５８は、Ｅ．ｃｏｌｉのトランスボゾンＴｎ１
０からのテトラサイクリン流出ポンプをエンコードす
る、ｔｅｔＡ遺伝子を含有する。ｐＣＢＳａ１またはｐ
ＣＢ２５８の中に存在するｔｅｔＡのための転写の開始
の回りに見いだされる制限部位が描写されている。プラ
スミドｐＣＢＳａ１はｐＣＢ２５８の中に位置するテト
ラサイクリンのリプレッサーのオペレーター部位の一部
分について欠失され、そして２つの追加の制限部位（Ｓ
ａｌＩおよびＸｈｏＩ）。プラスミドｐＧＧ５７および
ｐＧＧ７１は、それぞれ、ＧＧ１およびＧＧ２と表示さ
れる分離されたＭ１３バクテリオファージの２．０ｋｂ
のＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の中に存在する、黄色
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）から誘導されたテトラサイクリン流出ポンプをエ
ンコードする、ｔｅｔＫ遺伝子を含有する。ＧＧ１およ
びＧＧ２の両者は、Ｍ１３バクテリオファージＭＣ７１
のオリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異により発
生される。ｐＧＧ７５はｔｅｔＣ遺伝子を含有し、この
遺伝子はｐＢＲ３２２からの誘導されたテトラサイクリ
ン流出ポンプをエンコードし、ポリメラーゼ連鎖反応を
使用してｔｅｔＣのＡＴＧに対して５’に導入されるＳ
ａｌＩ制限部位をもつ。テトラサイクリン耐性の高いレ
ベルへのｔｅｔＣの調節された発現は、ｔｅｔＣ解読領
域の外側の残基に対するＤＮＡ配列の分析により示され
た、特性決定されない調節突然変異を包含する。ｌａｃ
Ｉ遺伝子は、ＩＰＴＧを使用してｔａｃポリヌクレオチ
ドのコントロール下に遺伝子の発現を調節するｌａｃリ
プレッサーをエンコードする。

【図２】上部のＤＮＡ配列は、テトラサイクリンのリプ
レッサーをエンコードするｔｅｔＲと、テトラサイクリ
ン流出ポンプをエンコードするｔｅｔＡとの間のトラン
スボゾンＴｎ１０からである。Ｔｎ１０の中に見いださ
れる２つのオペレーター部位は下線が引かれており、そ
してＢａｍＨＩ制限部位の位置は、制限分析からの２つ
のオペレーター部位の間に存在すると推定される。ｐＣ
ＢＳａ１は２つの独特制限部位を含有するが、これらの
変化はアミノ酸レベルにおいてｔｅｔＡエンコーデッド
タンパク質の変更を生じない。２つのｔｅｔＫ構成体の
間の唯一の差は翻訳の開始にある。プラスミドｐＧＧ５
７はＡＴＧ開始コドン（下線が引かれている）を含有す
るが、ｐＧＧ７１はＴＴＧ開始コドン（下線が引かれて
いる）を含有する。各構成体のためのすべての開始コド
ンは矢印で描写されている。

【図３】ｔｅｔＫの開始コドン付近の部位特異的突然変
異。オリゴヌクレオチド仲介の部位特異的突然変異を使
用して変更されたバクテリオファージＭＣ７１の中のｔ
ｅｔＫの開始コドン付近のＤＮＡ領域が示されている。
オリゴヌクレオチド仲介の部位特異的突然変異は次を必
要とする：（１）突然変異化しようとする、単一の一本
鎖ＤＮＡ鋳型および（２）ＤＮＡ断片の中に導入しよう
とする、所望の変化をその中に含有する短い（２０〜４
０ｂｐ）相補的オリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレ
オチドは、相補的一本鎖鋳型へのアニーリングを可能と
する。いったんアニーリングすると、オリゴヌクレオチ
ドの３’ＯＨ基は付加されたＤＮＡポリメラーゼのため
のプライマーとして働き、そして二本鎖産生物を産生す
る。２つの鎖の１つは、ここで、オリゴヌクレオチドの
プライマーにより導入された変更を含有する。この技術
を２つの異なるオリゴヌクレオチドのプライマー（ＰＴ
１８１３およびＰＴ１８１４）とともに使用する。自然
のｔｅｔＫ開始部位またはその付近のＤＮＡ配列の中の
変化が描写されている。これらのオリゴヌクレオチド仲
介の部位特異的突然変異の両者はｔｅｔＫに対して５’
のＳａｌＩ部位を生成して、これらの構成体をｐＣＢＳ
ａ１の中に導入する便利な手段を可能とした。ＳａｌＩ
部位に加えて、ｐＧＧ５７はＡＴＧ開始部位をもつｔｅ
ｔＫを含有し、そしてｐＧＧ７１はＴＴＧ開始部位を含
有する。これらの変化以外で、ｔｅｔＫ構成体の両者は
ＤＮＡレベルにおいて同一である。

【図４】Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１の中のプラスミ
ドｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７５およびｐＧＧ
７１によりを付与されたテトラサイクリン耐性のプロフ
ィル。細胞をルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔ
ｈ）液体培地（８）の中で成長させ、０．８５％の生理
的塩類溶液で希釈し、そして増加する濃度のＩＰＴＧの
存在下に増加する濃度のテトラサイクリンを含有する寒
天プレート上に広げた。プレートを３７℃において１６
時間インキュベーションした。コロニー形成単位の少な
くとも９０％の損失を殺すために要求されるテトラサイ
クリンの最小阻害濃度（ＬＤ₉₀）を示す。

【図５】ｐＧＧ５７またはｐＧＧ７６を含有するＥ．ｃ
ｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１のテトラサイクリン耐性プロフ
ィル。ｐＧＧ５７およびｐＧＧ７６の両者はｔｅｔＫお
よび同一の調節要素を含有するが、それらのプラスミド
の複製領域において異なる。これらのプロフィルを得る
ために使用した手順は、図面の凡例３Ａに記載するプロ
トコルと同一である。

【図６】列挙するプラスミドはｐＧＧ５７の誘導体であ
る。プラスミドｐＧＧ７６はｌａｃＩおよびｔｅｔＫを
含有するｐＧＧ５７のｐＡＣＹＣ１８４誘導体である。
プラスミドｐＧＧ７７およびｐＧＧ８４はｔｅｔＫ解読
領域内のＤＮＡ配列について欠失されている。

【図７】１２．５ミリモルのカリウムを含有する最小培
地の中で成長したＥ．ｃｏｌｉＴＫ２２０５についての
成長曲線を９時間の期間にわたって実施した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＴＫ２２０５、およびｐＧＧ７６、ｐＧＧ７７ま
たはｐＧＧ８４を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＫ２２０
５。各培養物はカリウムの吸収の欠乏の最適な救助に要
求されるレベルのＩＰＴＧを含有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゴードン・ジエラルド・グアイ アメリカ合衆国マサチユセツツ州01720ア クトン・アパートメントエイ・メインスト リート167

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リプレッサー結合部位、リボソーム結合
   部位の５’領域および翻訳開始コドンを含有するＴｎ１
   ０ ｔｅｔＡ遺伝子の一部分からなるＤＮＡ配列におい
   て、リプレッサー結合部位が別のヌクレオチド配列によ
   り少なくとも一部分置換されていることを特徴とするＤ
   ＮＡ配列。
2. 【請求項２】 請求項１の配列からなるベクター。
3. 【請求項３】 請求項１のいずれかに記載の配列からな
   るＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
4. 【請求項４】 連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
   ｓ）ｔｅｔＫ遺伝子を発現することができる、Ｅ．ｃｏ
   ｌｉ宿主細胞。