JPH05317093A - テトラサイクリンのスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 テトラサイクリンのスクリーニング法を提供
する。 【構成】 次の特性 （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、
（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、および
（ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
る、（ｄ）そしてさらに、テトラサイクリン流出ポンプ
の阻害因子の同定の場合には、テトラサイクリン流出ポ
ンプをエンコードする遺伝子を有する微生物を用いる、
テトラサイクリン様化合物を同定するアッセイ、ならび
にテトラサイクリン流出ポンプの阻害因子を同定するア
ッセイ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、試験試料の中のテトラサイクリ
ンまたはテトラサイクリン流出ポンプの阻害因子の検出
において有用な微生物およびアッセイに関する。

【０００２】タンパク質の生産のための外来遺伝子を発
現するために微生物、とくに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を
使用することは多年にわたって普通に行われてきてい
る。ほとんどの場合において、微生物を使用する目的は
商業的目的で大量のタンパク質を可能とするので、通常
タンパク質を最高の可能なレベルで発現することが望ま
しい。この理由で、ほとんどの発現系およびその中で使
用するＤＮＡ構成体は高いレベルの発現のために特別に
適合される。しかしながら、低ないし中程度のレベルの
発現が実際にいっそう望ましいか、あるいは必須でさえ
ある場合が存在する。例えば、いくつかの遺伝子の過剰
の発現は致死的である。また、微生物が特定の遺伝子産
生物に対する薬物の作用を検出するスクリーンのための
基準として使用される場合において、タンパク質の低い
レベルの発現は増強された感度を提供する。しかしなが
ら、発現の標識の繊細な調整は日常の仕事ではない。

【０００３】１例として、テトラサイクリン耐性をエン
コードする遺伝子の発現の低ないし中程度のレベルを達
成して、テトラサイクリン耐性を克服する薬物をスクリ
ーニングする適当な微生物を発生させることが望まし
い。大部分の微生物におけるこの耐性は、エネルギー依
存性の流出系の結果である（１）。これらの流出ポンプ
は種々のグラム陰性およびグラム陽性の両者のバクテリ
アにおいて分析され、そしてすべては多数の膜スパニン
グドメインをもつ同様な第２構造を示した。それにもか
かわらず、トランスボゾンＴｎ１０からのＥ．ｃｏｌｉ
のｔｅｔＡ遺伝子、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのｔｅｔＫ遺
伝子によりエンコードされる、最も普通のグラム陰性ポ
ンプのアミノ酸配列の比較は同一性をほとんど示さない
（２）。しかしながら、これらの２つのポンプは同様な
機能を実行するので、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主において黄色ブ
ドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のテトラサイクリン流出
ポンプをエンコードするｔｅｔＫ遺伝子についての研究
を実施することは、この系における遺伝学的操作および
生化学的研究を実施することが容易であると、有用であ
ろう。ｔｅｔＡおよびｔｅｔＫの流出ポンプは、テトラ
サイクリンの流出に関連する臨床的問題の大部分の原因
となる。さらに、同質遺伝子の使用は２つの流出ポンプ
のよりよい比較を可能とする。

【０００４】しかしながら、ｔｅｔＡまたはｔｅｔＫ遺
伝子が標準の強い発現ベクターの中にクローニングされ
る場合、１つの問題が存在する。トランスボゾンＴｎ１
０からのｔｅｔＡ遺伝子の過剰の発現は、例えば、この
遺伝子がマルチコピーのプラスミド中で発現される場
合、Ｅ．ｃｏｌｉに対して致死的である（３、４）。グ
ラム陰性バクテリア必要に応じて、このポンプの調節は
ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲのための調節領域に隣接して位
置する、リプレッサーであるｔｅｔＲ遺伝子産生物によ
り仲介される（５、６）。したがって、流出ポンプをエ
ンコードする他の遺伝子、例えば、ｔｅｔＫの発現を達
成できると仮定すると、完全な発現は、また、Ｅ．ｃｏ
ｌｉに対して致死的であることがある。

【０００５】Ｔｎ１０系を修飾してトランスボゾンＴｎ
１０遺伝子からのｔｅｔＡのコントロールされた発現を
可能とする試みがなされてきている。最近、エッカート
（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）（７）は、
マルチコピープラスミド上のトランスボゾンＴｎ１０か
らｔｅｔＡを、ｔｅｔＲの不存在下に、調節された誘発
可能な発現系を使用して、クローニングし、そして発現
した。この系において、ｔｅｔＡが完全に誘発されると
き、多分プロトンの移動力の消散のために（７）、細胞
は再び死亡する；バクテリアの中から外のテトラサイク
リンの活性な流出は細胞の中へのプロトンの侵入により
生かされるが、完全な誘発はバクテリアの生き残りに対
して必須なプロトンの勾配の損失に明らかに導く。エッ
カート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）の系
において、ｔｅｔＡ遺伝子は、マルチコピーのプラスミ
ドｐＣＢ２５８上に強いｔａｃプロモーターおよびｌａ
ｃｉ遺伝子（ラクトンリプレッサー）およびｌａｃオペ
レーター部位を含有する調節領域を使用して、転写のレ
ベルにおいて調節される。ｔｅｔＡ遺伝子の発現は、異
なる濃度のイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を使用して調節することができる。

【０００６】不都合なことには、エッカート（Ｅｃｋｅ
ｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）の系は、テトラサイク
リン流出ポンプの阻害因子の検出のための最適なスクリ
ーニング有機体を構築するという目的に適当である。第
１に、プラスミドｐＣＢ２５８の制限分析は、ｔｅｔ調
節領域の２つのｔｅｔＲオペレーター部位の１つがプラ
スミドの中にｔｅｔＡ解読領域に隣接して残留すること
を示す。こうして、ｔｅｔＡ遺伝子は、ｌａｃリプレッ
サーならびにテトラサイクリンリプレッサーの両者が細
胞の中に存在する場合、両者のリプレッサーにより調節
される。両者のリプレッサーの存在は、スクリーニング
有機体として使用するために設計された発現系において
有害な結果を引き起こす。こうして、ｐＣＢ２５８はｔ
ｅｔＡ遺伝子の比較的弱化された発現を可能とするが、
テトラサイクリン耐性のレベルはそれにもかかわらずポ
ンプ阻害因子についてのスクリーニングにおける使用に
高過ぎる。そのうえ、別の遺伝子、例えば、ｔｅｔＫの
挿入を可能とするために便利な制限部位は適当な領域の
中に存在しない。

【０００７】これらの困難を克服するために、本発明
は、低ないし中程度のレベルのテトラサイクリン耐性を
生ずるｄｎｓ構成体、ベクターおよびＥ．ｃｏｌｉの宿
主細胞を提供する。このような材料はテトラサイクリン
耐性の阻害因子についてのスクリーニングアッセイの開
発においてとくに有用である。

【０００８】本発明は、テトラサイクリンに関係するア
ッセイにおける使用にさらに特別に適合する、テトラサ
イクリンによる誘発に対して感受性の微生物を提供す
る。微生物は３７℃、すなわち、アッセイに好ましい温
度、において成長することができるように、かつテトラ
サイクリンの存在についてのアッセイにおいて誤った陽
性を引き起こし得る、ＤＮＡ損傷因子により誘発に対し
て感受性ではないように、修飾される。好ましい実施態
様において、微生物はさらにテトラサイクリンに対して
非常に低いレベルの耐性を与えるように修飾される；こ
のような微生物は、なお少ない量のポンプ阻害因子に対
する極端に感受性であるので、テトラサイクリン流出ポ
ンプの阻害因子の阻害因子の検出についてのアッセイに
おける使用にとくによく適合する。好ましくは、微生物
はＥ．ｃｏｌｉである。

【０００９】微生物は、テトラサイクリン様活性を有す
る化合物の検出（テトラサイクリンのアッセイ）および
ポンプの阻害化合物の検出の両者のために、新規なアッ
セイのための基準を提供する。テトラサイクリン様化合
物の検出のアッセイ法は、次の特性を有する微生物を利
用する：（ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子とし
て、ｔｅｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺
伝子、（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、
（ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
る。好ましい実施態様において。微生物は、また、
（ｄ）３７℃において成長することができる。微生物を
テトラサイクリンを含有しない培地の中で培養し、そし
てテトラサイクリン様化合物の存在について試験すべき
試料と接触させる。培養物を、また、微生物のインジケ
ーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシグナルを
生成することができる試薬と接触させる。この試薬は、
使用する特定の系に依存して、培地の中に存在すること
ができるか、あるいは引き続いて添加することができ
る。培養物を検出可能なシグナルの存在または不存在に
ついて観察し、これにより試験試料の中のテトラサイク
リン様活性の存在または不存在を示す。

【００１０】Ｔｎ１０のｔｅｔＡ遺伝子は、細胞がテト
ラサイクリンに直面するときにのみ、発現されるので、
ｔｅｔＡプロモーターからの発現はテトラサイクリンの
すぐれたインジケーターである。検出が容易でありかつ
感度のために、好ましい実施態様において、β−ガラク
トシダーゼをコードする、ｌａｃＺ構造遺伝子に隣接し
てｔｅｔＡからの転写シグナルを含有する遺伝子を使用
する。とくに好ましい実施態様において、次の因子はア
ッセイの感度および特異性に寄与する：（１）ｌａｃＺ
構造遺伝子へのｔｅｔＡコントロール領域の融合はバク
テリオファージλ内の単一のコピーである、（２）ｔｅ
ｔＲ遺伝子はプラスミド上のｂｌａ遺伝子に関して反対
の向きで組み込まれ、低いレベルのリプレッサーを生ず
る、（３）λｃＩｎｄアレルは３７℃における成長を可
能とするが、ＤＮＡ損傷因子による誘発を防止する、お
よび（４）検出可能なシグナルの存在により示されるア
ッセイのタイミングおよび感受性の発色性試薬（６−ブ
ロモ−２−ナフチル−β−ガラクトピラノシドおよびフ
ァストブルーＲＲ）の使用。

【００１１】テトラサイクリン流出ポンプの阻害因子を
決定する２つの方法が、また、提供される。シナージイ
（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイは、テトラサイクリンの存
在下に流出ポンプを阻害することができる化合物を検出
する。このアッセイにおいて、使用する微生物は次の特
性を有する：（ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子
として、ｔｅｔＡプロモーターに融合したインジケータ
ー遺伝子、（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝
子、（ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性
である、および（ｄ）低いレベルのテトラサイクリン耐
性を与えるテトラサイクリン流出ポンプの遺伝子；好ま
しくは微生物は３７℃において成長することができる。
微生物は阻害以下のレベルであるが、誘発レベルのテト
ラサイクリンを含有する培地の中で成長させ、そして流
出ポンプの阻害因子存在について試験すべき試料と接触
させる；培養物を、また、培地の中であるいは引き続く
添加により、インジケーター遺伝子が発現されるとき、
検出可能なシグナルを産生することができる試薬と接触
させる。検出可能なシグナルの存在または不存在を観測
し、これによりポンプ阻害因子を示す。このアッセイに
おいてシグナルの不存在くち成長阻害因子を示し、した
がって試験試料の中の有用な阻害化合物の存在を示す。

【００１２】別のアッセイ、阻害アッセイ、において、
シナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイについて記載し
た微生物を、非阻害および阻害以下のレベルのテトラサ
イクリンおよび、インジケーター遺伝子が発現されると
き、検出可能なシグナルを生成する化合物を含有する培
地の中で成長させる；この有機体を試験試料と接触さ
せ、そして培地の中の検出可能なシグナルの存在または
不存在を観測する。このアッセイは、試験試料との接触
の前に、阻害以下のレベルのみのテトラサイクリンを含
有するした培地の中で、誘発、すなわち、検出可能なシ
グナルの存在を観測することによって、テトラサイクリ
ン流出ポンプの阻害因子を同定する。

【００１３】次の用語をこの明細書および特許請求の範
囲を通して使用する：ｔｅｔＡはトランスボゾンＴｎ１
０においてテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を意味
するために使用する；ｔｅｔＫは黄色ブドウ球菌（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の中のテトラ
サイクリン流出ポンプをエンコードする遺伝子を意味す
る；そしてｔｅｔＣはプラスミドｐＢＲ３２２からのテ
トラサイクリン流出ポンプをエンコードする遺伝子を意
味する。

【００１４】本発明のアッセイおよび微生物の開発にお
いて有用なＤＮＡ構成体および発現ベクターは、同時継
続出願に記載されており、その開示をここに引用によっ
て加える。

【００１５】特許請求の範囲記載のＤＮＡ配列は、テト
ラサイクリン耐性の原因となるトランスボゾンＴｎ１０
（ｔｅｔＡ遺伝子）からのテトラサイクリンポンプをエ
ンコードするプラスミドｐＣＢ２５８内に見いだされ
る、ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片を修飾することによっ
て、本来得られる。ｔｅｔＡ調節のための誘発可能な発
現系は、前述したように、エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）
およびベック（Ｂｅｃｋ）（７）により開示された。し
かしながら、この系は、テトラサイクリンポンプを強く
発現し過ぎるので、テトラサイクリンポンプの遺伝子の
発現に許容されえないことがある。さらに、それはｔｅ
ｔＡ以外の遺伝子のクローニングのための便利な制限部
位を欠如し、そしてテトラサイクリンポンプの阻害因子
の検出に使用すべき微生物におけるその使用と不適合性
である、リプレッサー結合部位を含有する。したがっ
て、プラスミド、とくに解読領域およびｔｅｔＡ遺伝子
の調節領域の一部分を含有するＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断
片を研究して、このプラスミドの中への他の遺伝子のク
ローニングを可能とし、ならびにそのようにクローニン
グされた遺伝子の低いレベルの発現を可能とする配列を
提供することを試みる。

【００１６】Ｔｎ１０の、調節領域の一部分を包含す
る、ｔｅｔＡ遺伝子の略線図を図１〜２に示す。腸のバ
クテリアにおけるテトラサイクリン耐性は、一般に、２
つの遺伝子の作用を通して、トランスボゾンＴｎ１０に
より仲介される。簡単に述べると、テトラサイクリン流
出ポンプ遺伝子ｔｅｔＡの発現は、ｔｅｔＡ解読領域の
わずかに上流に位置する、ｔｅｔＲ結合部位に結合する
ことができるｔｅｔＲ遺伝子により調節される。エッカ
ート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）のプラ
スミドｐＣＢ２５８を、ｔａｃプラスミドの背後のＴｎ
１０ｔｅｔＡ遺伝子をクローニングすることによって、
操作してｔｅｔＡ遺伝子のコントロールされた発現を達
成した；この系における発現は、同一プラスミド上にエ
ンコードされたｌａｃリプレッサーのコントロール下に
ある。ｔｅｔＲリボソーム結合部位のいずれかが、存在
する場合、組み換えプラスミド上にどの程度にそれらが
存在するかをエッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック
（Ｂｅｃｋ）は示さなかったが、制限分析はｔｅｔＡ解
読領域に最も近い１つの結合部位が残留することを示
す。

【００１７】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔ
ｅｔＫの発現を達成する試みにおいて、ｐＣＢ２５８プ
ラスミドは便利な開始点を提供する；とくに、このベク
ターのＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ部位の間の領域に注目
が集中された。この領域の配列の詳細は図２に見いださ
れる。これを見ると示されるように、ｔｅｔＫ遺伝子を
クローニングすることができる便利な制限部位は存在し
ない。この問題を克服するために、ハイブリダイゼーシ
ョンして所望の修飾をもちかつベクターのＢａｍＨＩお
よびＮｃｏＩ部位の中にクローニングするためのＢａｍ
ＨＩおよびＮｃｏＩ粘着末端を含有するＤＮＡ断片を形
成することができる、１対のオリゴマーを合成する。１
つの鎖を図２に示す（「ｐＣＢＳａ１」と表示する）。
このベクターの中のこの断片の置換は、２つの独特制限
部位、すなわち、開始コドンより上流のかつそれに隣接
するＳａｌＩ部位、および解読領域内のＸｈｏＩ部位の
導入を生じ、これらはｔｅｔＡタンパク質のアミノ酸配
列を変更しない。ＳａｌＩ部位を包含する変化は予期せ
ざる作用を有する。このベクターを使用してＥ．ｃｏｌ
ｉの中でｔｅｔＡ遺伝子を発現するとき、ｔｅｔＡ遺伝
子の発現を誘発するために、親のベクターにより要求さ
れるより高い濃度のＩＰＴＧが要求される。これが示唆
するように、この変化はｔｅｔＡのリボソーム結合部位
［「リボソーム結合部位」はゴールド（Ｇｏｌｄ）およ
びストルモ（Ｓｔｏｒｍｏ）（２２）により定義される
ように広い意味に解釈される］の強さを変更し、それを
効率に劣るようにさせる。

【００１８】次いで、この構成体を使用してＥ．ｃｏｌ
ｉの中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔｅｔ
Ｋ遺伝子の発現を試みる。修飾しないｔｅｔＫ遺伝子
は、Ｅ．ｃｏｌｉの中に存在するとき、耐性を与えない
ので、多少の変更が要求される。Ｅ．ｃｏｌｉの中の発
現達成するために、ｔｅｔＫ遺伝子は、バクテリオファ
ージＭ１３の中において、クローニングの目的で開始部
位に対して直ぐの５’にＳａｌＩを含有するするように
修飾される。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を促進
するために、通常のｔｅｔＫのＴＴＧ開始コドンをＡＴ
Ｇに突然変異化する。次いで、こうして修飾されたｔｅ
ｔＫ遺伝子をｐＣＢＳａ１ベクターの中に結合する。

【００１９】このプラスミド構成体を使用して、Ｅ．ｃ
ｏｌｉを形質転換し、そしてｔｅｔＫの発現について試
験する。明らかに弱化されたリボソーム結合部位の作用
は、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＴＧ開始コドンの存在によりバラ
ンスされ、インデューサーの不存在下に、約２５μｇ／
ｍｌの適度のレベルのテトラサイクリン耐性を与え、し
たがって低いレベルの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ｔｅｔＫ遺伝子産生物
を産生する菌株を生ずる。

【００２０】ｐＣＢＳａ１型の構成体を含有するプラス
ミドをもつ菌株は低いレベルの遺伝子を発現するが、ｔ
ｅｔ遺伝子より先行する強いｔａｃプロモーターをさら
に除去することによってさえ、発現のレベルを減少する
ことができる。親のｐＣＢ２５８およびプラスミドｐＣ
ＢＳａ１の両者において、発現はこのプロモーターによ
り調節される。しかしながら、実質的な発現は、インデ
ューサーの不存在下においてさえ、ｐＣＢ２５８から起
こり、そしてより少ない程度に、ｐＣＢＳａ１から起こ
る。発現は、転写開始シグナルではなく、問題の遺伝子
およびそのリボソーム結合部位（すなわち、ＳＤおよび
ＡＴＧ）を他のプラスミドの中にクローニングすること
によって、さらに減少することができる。新規なプラス
ミドにおける位置は活性的に翻訳開始コドンされる遺伝
子内に存在しないことが好ましい。この遺伝子およびそ
のリボソーム結合部位を含有するインサートを、例え
ば、ベクターおよびインサートを同一酵素により切断す
る場合、既知の方法によりプラスミドの中の特定の位置
に両方の向きにクローニングすることができる。

【００２１】テトラサイクリンポンプ阻害因子を検出す
るスクリーニング微生物を発生させることに関して、こ
の型の菌株は理想である。他のテトラサイクリンポンプ
を含有する有機体、例えば、トランスボゾンＴｎ１０を
有する菌株は、この型の系においてある数の欠点を有す
る。Ｔｎ１０は高いレベルのテトラサイクリン耐性を与
え、こうして、完全にテトラサイクリン耐性の菌株にお
いてシグナルを検出することができる前に、阻害すべき
多数のポンプが存在する。また、Ｔｎ１０のｔｅｔＡ遺
伝子は調節される；流出ポンプの阻害は、テトラサイク
リンの細胞内のレベルの増加に対する応答として、新規
な流出ポンプの合成の増加を生ずるので、阻害因子の作
用は完全にテトラサイクリン耐性菌株により最小となる
であろう。トランスボゾンＴｎ１０は、また、リプレッ
サー遺伝子ｔｅｔＲ、ならびにｔｅｔＡ遺伝子に寄与す
る；リプレッサーの発現の増加は感受性の減少を引き起
こすことがある（９）。エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）お
よびベック（Ｂｅｃｋ）のプラスミドであるｐＣＢ２５
８は、発現をある程度までコントロールすることができ
るように、修飾されていてさえ、なおその欠点を有す
る。低い、構成的なレベルのｔｅｔＡの発現は、エッカ
ート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびベック（Ｂｅｃｋ）の系
が、いくつかの理由で、理想的には適合しない仕事であ
る、テトラサイクリン流出ポンプの阻害因子を検出する
ための、スクリーニング有機体に最適である。第１に、
ｐＣＢ２５８を含有する菌株の中のｔｅｔＡの発現ベク
ターのレベルは、ポンプの阻害因子についてのスクリー
ニングにおける最適な使用になお高過ぎる（ＭＩＣ＝５
０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧの不存在下）。第２に、プラス
ミドｐＣＢ２５８上のｔｅｔＡの発現を誘発するであろ
うラクトースは、スクリーニングすべき発酵ブロス内に
存在することがあり、スクリーンを妨害する。さらに、
ｐＣＢ２５８の制限分析は、ｔｅｔ調節領域の２つのオ
ペレーター結合部位の１つがプラスミドｐＣＢ２５８の
中に存在することを示す。ｔｅｔ調節要素を利用し、し
たがってｔｅｔＲ遺伝子を含有するスクリーニング有機
体において、低い構成的なレベルの発現を達成すること
ができない。最後に、別の遺伝子、例えば、ｔｅｔＫの
挿入を可能とする便利な制限部位は適当な領域に存在し
ない。

【００２２】明らかなように、特定のｐＣＢＳａ１配列
内のある種の修飾は、その配列の有用な特性への全体の
作用を変更しないで、可能である。例えば、ＳａｌＩ部
位は任意の制限部位で置換できることが考えられる。ま
た、理解されるように、発現すべき遺伝子および発現の
所望のレベルに依存して、別のプロモーター、例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐまたはλＰＬを同様によく使用す
ることができる。また、次の実施例において示すよう
に、発現が無関係のプラスミドについて容易に達成する
ことができ、そして他のプラスミドの中に所望の配列挿
入するために要求される修飾、すなわち、制限部位の修
飾は、この明細書の開示が与えられると、当業者の技量
の範囲内であるので、本発明は特定のプラスミドの使用
に限定されない。

【００２３】前のベクターはベクターはポンプ阻害因子
を検出するアッセイの開発のための基準を提供する。し
かしながらアッセイ系における使用に最適に適合する微
生物をつくるために追加の操作を必要とする。テトラサ
イクリンのアッセイまたはポンプ阻害因子のアッセイに
おいて有用な微生物を発生する目的にある種の特性は望
ましく、そして従来入手可能な微生物はすべての要求さ
れる特性を含有する。こうして、アッセイ系を実行する
ためには、理想的な基本の微生物を必要とする。

【００２４】本発明のアッセイを開発する目的で、従来
記載されたλＲＳＴＥＴ１５８−４３を含有する菌株は
理想的なアッセイの有機体を発生させる便利な基礎を提
供する（９）。λＲＳＴＥＴ１５８−４３は、アッセイ
の有機体を表示するとき有用である、ある種の基本的な
特性を有する。例えば、λＲＳＴＥＴ１５８−４３は便
利なインジケーター系を有し、この系は予測した生物学
的事象の発生の存在または不存在の視的検出を可能と
し、この場合において、酵素β−ガラクトシダーゼをエ
ンコードするｌａｃＺ遺伝子は、トランスボゾンＴｎ１
０からのｔｅｔＡプロモーターあとｔｅｔＡ遺伝子の不
存在下に融合する。前述したように、ｔｅｔＡプロモー
ターからの転写はｔｅｔＲ遺伝子産生物、テトラサイク
リンリプレッサーにより調節される。細胞をテトラサイ
クリンの不存在下に成長させるとき、転写はｔｅｔＡプ
ロモーターから開始されない。細胞がテトラサイクリン
と直面するとき、テトラサイクリンは細胞の中に入り、
リプレッサーと結合しそしてそれを活性化し、そしてｍ
ＲＮＡが作られる；換言すると、テトラサイクリンの存
在下に、ｔｅｔＡプロモーターは誘発され、そしてｔｅ
ｔＡ遺伝子の発現が起こる。同様に、ｔｅｔＡ−ｌａｃ
Ｚの融合の場合において、誘発およびβ−ガラクトシダ
ーゼの発現を測定する。このタイプの検出系は、β−ガ
ラクトシダーゼ基質が培地の中で誘発されるとき、アッ
セイのプレート上の色の変化の指示の認識が容易である
ために、とくに有用である。しかしながら、認識される
ように、アッセイ系はｌａｃＺの融合の使用に限定され
たない；ｔｅｔＡプロモーターの誘発のとき検出可能な
シグナルを提供する任意のインジケーター、例えば、ル
シフェラーゼ系またはクロランフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ系は許容されうる。

【００２５】好ましい実施態様において、融合構成体は
単一の遺伝子コピーとしてアッセイの微生物の中に存在
する。融合遺伝子をマルチコピーのプラスミド上でクロ
ーニングする場合、細胞が培地の中でテトラサイクリン
の不存在下に成長するとき、産生されるインジケーター
（例えば、β−ガラクトシダーゼ）のバックグラウンド
は、記載された有機体（１１）におけるように、かなり
高い。次の実施例において、ｌａｃＺ−ｔｅｔＡ融合が
Ｅ．ｃｏｌｉの染色体の中に組み込まれたλバクテリオ
ファージ上に位置する実施態様を記載する；しかしなが
ら、単一のまたは低いコピー数のプラスミド上の挿入
は、また、許容されうる。

【００２６】それ以上の修飾は、特別にｔｅｔＲ遺伝子
に関すると、また、アッセイの感度に寄与する。ｔｅｔ
Ｒは通常マルチコピーのプラスミド上に存在するが、好
ましい実施態様において、それは低いレベルで存在す
る。「低いレベル」のリプレッサーとは、１０ｎｇまた
はそれより少ないテトラサイクリンに対する感受性を与
える量を意味する。これを達成する１つの方法は、「誤
った」向きでプラスミド遺伝子、ｂｌａの中に挿入され
た、それ自身のプロモーターをもたないｔｅｔＲ遺伝子
をクローニングすることによって達成される（９）。こ
の方法において、非常にわずかのリプレッサータンパク
質をつくり、こうしてこの系をトリガーして極めて低い
レベルのテトラサイクリンにおいて誘発する。これらの
特性を有するアッセイ有機体は、テトラサイクリンの検
出において、従来記載されたアッセイ有機体（１１）よ
りも感受性である。

【００２７】しかしながら、前述の有機体（９）は、３
７℃において成長することができないという欠点が存在
する。これは、ＣＩタンパク質、λリプレッサーは温度
感受性であり、そして３７℃の加熱に応答して誘発され
るためである。バクテリアの変異型の菌株は、野生型λ
リプレッサーを含有するので、３７℃において成長する
ことができる（１９）。この種類の菌株は利点を有し、
アッセイは３７℃においていっそう急速に成長する細胞
を使用して実施することができ、例えば、アッセイはそ
の全体において単一の日に実施することができることが
保証される。また、それは偶発的な温度の変動がアッセ
イの結果に影響を与えないという利点を有する。しかし
ながら、この菌株は、野生型ＣＩアレルをもち、テトラ
サイクリンに加えて、ＤＮＡ損傷因子、例えば、ミトマ
イシンＣに対して感受性であるという欠点を有する。こ
のクラスの化合物（これらは試験すべき材料の中に存在
する可能性が非常に高い）は、また、３７℃で成長でき
るように修飾したこの有機体においてβ−ガラクトシダ
ーゼの産生を誘発するであろう。これは許容されえない
アッセイにおける特異性の欠如を潜在的につくる。この
問題は、Ｉｎｄ−表現型（１３）を引き起こし、λがＳ
ＯＳ系により誘発されなくさせる、ＣＩ遺伝子の突然変
異したアレルを置換することによって克服される。

【００２８】前述の有機体はテトラサイクリンを検出す
る種々のアッセイにおいて有用である。例えば、プレー
トのアッセイにおいて、そのように構成した細胞を柔寒
天と混合し、そしてプレートの中に注ぐ。試験すべき試
料の化合物を寒天にまたは含浸したディスクの中に直接
適用し、そしてインキュベーションする。インキュベー
ション後、プレートを適当な基質でオーバーレイして、
インジケーター遺伝子の発現を検出する。例えば、ｌａ
ｃＺ遺伝子を使用するとき、プレートを６−ブロモ−２
−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび適当な
色素でオーバーレイする；β−ガラクトシダーゼの存在
は記載されたように（１１）紫色のスポットにより指示
される。β−ガラクトシダーゼ活性を測定する液体アッ
セイを、また、使用することができる（１０、１２）。

【００２９】テトラサイクリン流出ポンプの阻害因子の
アッセイにおいて使用するために、このような有機体の
それ以上の修飾を実施する。前述した基本的微生物は、
流出ポンプ遺伝子を有するプラスミドを添加して、使用
される。最も感受性のアッセイ系を生成するために、利
用するプラスミドは、非常に低いレベルのテトラサイク
リン耐性を与えるように設計した、前述したようなもの
である。好ましい実施態様において、この低いレベルの
耐性は、その転写開始シグナル（プロモーター）ではな
く、流出ポンプ遺伝子およびそのリボソーム結合部位の
シグナルをあるプラスミドの「不活性の」領域の中にク
ローニングすることによって達成される。上に示したよ
うに、特定の新規なＤＮＡ構成体はそれらのコントロー
ル下に遺伝子の減少した発現を提供する；この追加の段
階は、自然プロモーターの影響を除去することによっ
て、既に低いレベルの発現の１段階をさらに取る。これ
らの構成体は、本発明のアッセイのために、任意のテト
ラサイクリン流出ポンプの遺伝子とともに使用すること
ができるが、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＫは好ましい試験す
べきポンプである。

【００３０】好ましい実施態様において、操作したプラ
スミドにより与えられる耐性のレベルは２５μｇ／ｍｌ
以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下である。次いでス
クリーンを実施することができる。以下の実施例におい
て、これらの要件を満足するスクリーニング有機体の２
つの特定のタイプを記載する。１つの菌株ＫＢ４はプラ
スミドｐＢＴ４０１の中に挿入されたｔｅｔＡ遺伝子を
含有し、ｐＢＴ４０１は、１００ｎｇ／ｍｌより多いテ
トラサイクリンに対して耐性であるＫＢ３ｉｎｄのＴｎ
１０誘導体と反対に、１０μｇ／ｍｌより少ないテトラ
サイクリンに対する耐性を与える。流出ポンプの遺伝子
の挿入の効果は図１０に示されている。菌株ＫＢ３ｉｎ
ｄはテトラサイクリン感受性であり、そしてちょうど５
〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンに暴露するとき、
最大に誘発する。対照的に、トランスボゾンＴｎ１０の
存在は、テトラサイクリン濃度が１μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンに到達するまで、完全な誘発を防止する。テ
トラサイクリンに対する中程度の耐性を生ずる、菌株Ｋ
Ｂ４において産生された流出ポンプは、Ｔｎ１０菌株よ
り効率的に５ｎｇ／ｍｌの存在下にβ−ガラクトシダー
ゼの誘発を防止する。こうして、より多くのポンプは、
菌株ＫＢ４を非常に低い濃度のテトラサイクリンに暴露
するとき、合成することができ、Ｔｎ１０菌株と比較し
たときでさえ、テトラサイクリンの内部のテトラサイク
リン濃度の減少を生ずる。しかしながら、濃度がわずか
にのみ増加するとき、ＫＢ４はより多くの流出ポンプを
作ることによって応答することができず、そしてテトラ
サイクリン濃度が３０ｎｇ／ｍｌに増加するとき、完全
な誘発が起こる。こうして、ＫＢ４はテトラサイクリン
耐性により最適であることができる。菌株ＫＢ５はＫＢ
４に対して同質遺伝子であるが、ただしｔｅｔＫ遺伝子
はｔｅｔＡ遺伝子の代わりに存在する。ＫＢ５のＭＩＣ
は、また、約１０μｇ／μｌのテトラサイクリンであ
る。ｔｅｔＫ遺伝子は菌株ＫＢ４と比較して誘発曲線の
同様なシフトを生ずる。

【００３１】ポンプ阻害因子についてのアッセイの２つ
のタイプはこのタイプのスクリーニング有機体を使用し
て設計する。第１はシナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッ
セイであり、これはテトラサイクリンと組み合わせて有
機体を殺す化合物または組成物の能力を決定する。好ま
しくは、スクリーンは５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン
の存在下に成長の阻害を引き起こすが、その不存在では
引き起こさない。簡単に述べると、シナージイ（Ｓｙｎ
ｅｒｇｙ）アッセイにおいて、スクリーニング細胞はテ
トラサイクリンのアッセイについて前述したように処理
するが、ただし寒天培地はスクリーンにおいて使用すべ
き菌株についてほぼＭＩＣである、５μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含有する。成長の阻害は紫色の欠如によ
り検出される。あるいは、細胞をテトラサイクリンの液
体アッセイについて前述したように処理するが、ただし
細胞は５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する培地
にシフトされる。

【００３２】第２の型のアッセイは阻害アッセイであ
る。このアッセイは、β−ガラクトシダーゼの完全な誘
発が菌株ＫＢ３ｉｎｄ（図１０）、すなわち、感受性菌
株において５〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存
在下に起こるという事実に頼る。しかしながら、テトラ
サイクリンの細胞内の濃度は流出ポンプの作用のために
残基菌株において減少する傾向がある。したがって、培
地の中のより多くのテトラサイクリンは、誘発に十分な
テトラサイクリンを細胞内に蓄積するために要求される
であろう。このアッセイは、耐性菌株について阻害以下
のレベルのテトラサイクリンの存在下にβ−ガラクトシ
ダーゼ（またはインジケーター遺伝子）の誘発を引き起
こす化合物を検出するように設計する。とくに有望な化
合物は、シナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイにおい
て成長の阻害および阻害アッセイにおいて誘発を引き起
こすものであろう。

【００３３】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。これらの実施例は本発明を限定しない。

【００３４】

【実施例】実施例 プラスミドｐＣＢＳａ１の構成 ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ末端を含有する、下に示す、
１対の合成した相補的オリゴマーを、標準結合条件
（８）を使用して、ｐＣＢ２５８（７）の大きいＢａｍ
ＨＩ／ＮｃｏＩ断片に結合する。

【００３５】

【化１】

【００３６】プラスミドｐＣＢＳａ１はｐＣＢ２５８の
中に存在するテトラサイクリンのオペレーター結合部位
について欠失されており、そして２つの独特制限部位を
含有する；開始コドンｔｅｔＡに対して直ぐに５′のＳ
ａｌＩ部位および遺伝子によりエンコードされるアミノ
酸配列を変更しないｔｅｔＡの解読領域の中のＸｈｏＩ
制限部位。ＢａｍＨＩ部位は、また、ｐＣＢＳａ１にお
いて独特である。

【００３７】ｔｅｔＫを含有する発現ベクターの構成 Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｔｅｔＫ遺伝子を発現するｐＣＢ
Ｓａ１誘導体を２工程において構成する。第１に、Ｍ１
３バクテリオファージ、ＭＣ７１（３）の中のｔｅｔＫ
遺伝子を、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら（１５）に従
い、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発を
使用して突然変異化する。オリゴマー５′−ＣＣＴＣＡ
ＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＡＧＴ
ＴＴＡＧ−３′を使用して、ＡＴＧに対する天然に存在
するｔｅｔＫ開始コドンを変更し、そして新しい開始コ
ドンのちょうど上流にＳａｌＩ制限部位を導入する。次
いで、修飾されたｔｅｔＫ遺伝子を含有するＲＦＩファ
ージＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そし
て、ｐＣＢＳａ１をＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たとき、発生した大きい断片の中に結合して、プラスミ
ドｐＧＧ５７を生成する。ｔｅｔＫ遺伝子のもとのＴＴ
Ｇ開始コドンを含有する同質遺伝子のプラスミド、ｐＧ
Ｇ７１と呼ぶ、を、また、２工程で構成する。オリゴマ
ー５′ＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＡ
ＡＧ３′を使用して、ｔｅｔＫのための自然（ＴＴＧ）
翻訳開始コドンに隣接してＳａｌＩ制限部位を導入す
る。プラスミドｐＣＢＳａ１を上に概説した方法で構成
する。すべてのファージ構成体の配列を標準の手順
（８）に従いＤＮＡ配列分析により評価する。

【００３８】ｔｅｔＫ遺伝子は、プラスミドｐＧＧ５７
をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化し、そし
て、標準の技術（８）に従い、プラスミドｐＡＣＹＣ１
８４をＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化す
ることによって発生した大きい断片に２．７Ｋｂの断片
を結合することによって、別の発現ベクター上にクロー
ニングする。生ずる組み換え体は、ｐＧＧ７６と表示
し、ｌａｃＩ遺伝子、ｔａｃプロモーター、引き続いて
ＡＴＧ開始コドンを含有するｔｅｔＫ遺伝子を含有す
る。

【００３９】プラスミドｐＢＲ３２２からのテトラサイ
クリン流出ポンプをエンコードするｔｅｔＣ遺伝子を、
標準の技術（８）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応に
よりこの発現系の中に転移して、ＡＴＧ開始コドンの直
前でＳａｌＩを操作する。生ずるプラスミドをＳａｌＩ
およびＮｈｅＩ酵素で消化し、そしてｔｅｔＣ解読領域
の５′末端を含有する小さい断片を分離する。ｔｅｔＣ
の３′末端は、ｐＢＲ３２２をＡｖａＩ酵素で消化し、
クレノー酵素でフィルインし、そしてＮｈｅＩ酵素で消
化することによって分離する。全体のｔｅｔＣ解読領域
を３方結合により発現系の中に結合し、ここで発現ベク
ターはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フィルインし、そして
ＳａｌＩ酵素で消化することによって調製する。（２方
結合はｔｅｔＣ遺伝子内のＳａｌＩ部位の存在のために
直接的では内。）全体のｔｅｔＣ遺伝子を含有するプラ
スミドを菌株ＭＣ１０６１の形質転換後分離し、アンピ
シリン耐性について選択する。標準の技術を使用する
（９）。

【００４０】菌株ＭＣ１０６１内のプラスミドｐＣＢ２
５８のテトラサイクリン耐性は、高いレベルのＩＰＴＧ
を培地に添加したときでさえ、１５μｇ／ｍｌである。
テトラサイクリン耐性のレベルはｐＢＲ３２２により与
えられるテトラサイクリン耐性より少なくとも５倍低
く、発現の最適なｌｖが達成されないことが示される。
したがって、多少の誘発を可能とする、０．１ミリモル
のＩＰＴＧを、また、含有したＬＢ寒天の中で、１００
μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下に生き残ること
ができる突然変異体が選択される。プラスミドｐＧＧ７
５を含有する、１つの突然変異誘導体を分離し、そして
引き続く構造において使用する。形質転換体は高いテト
ラサイクリン耐性について事実生ずるので、突然変異は
プラスミド上に位置すると決定される。ｔｅｔＣ解読領
域内の突然変異の可能性は、標準の技術（８）により、
全体のｔｅｔＣ解読領域を配列決定し、そして野生型配
列のみを見いだすことによって排除される。

【００４１】テトラサイクリン耐性の決定 プラスミドｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１、ｐ
ＧＧ７５またはｐＧＧ７６を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株
ＭＣ１０６１を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
するルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）（２）
の中の一夜の培養により、テトラサイクリン耐性につい
て試験する。各一夜の培養物の１：５０の希釈物を新鮮
なＬ−Ａブロスの中に接種する。指数的に成長する細胞
を０．８５％の生理的塩類溶液の中に系統的希釈し、こ
うして各プレートを２００〜５００細胞で接種する。ア
ンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有し、ある範囲の濃
度のＩＰＴＧおよびテトラサイクリン（０．００１ミリ
モル〜１．０ミリモルのＩＰＴＧおよび０〜２００μｇ
／ｍｌのテトラサイクリン）を含有するＬ寒天（ｐＨ
６．８−７．０）上に細胞を広げる。プレートを３７℃
において１８〜２０時間インキュベーションし、そして
最小阻害濃度（ＭＩＣ）を細胞の少なくとも９０％がコ
ロニーを形成するのを防止する濃度（ＬＤ９０）として
決定する。ｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１、ｐ
ＧＧ７５またはｐＧＧ７６の比較を図４に示す。プラス
ミドｐＣＢＳａ１は、ｐＣＢ２５８と比較したとき、同
一レベルのテトラサイクリン耐性を与える；しかしなが
ら、ｐＣＢ２５８はＩＰＴＧの不存在下により高い耐性
を与える（ＭＩＣ＝５０）。さらに、ちょうど０．１ミ
リモルのＩＰＴＧはｐＣＢ２５８を含有する細胞を殺す
ために十分であるが、１ミリモルのＩＰＴＧはｐＣＢＳ
ａ１を含有する細胞を殺すために必要である。こうし
て、リボソーム結合部位の変更は示される。プラスミド
ｐＧＧ５７は、ＡＴＧ開始部位をもつｔｅｔＫ遺伝子を
含有し、また、低いレベルのＩＰＴＧにおいて成長させ
るとき、耐性を与え、それ以上の誘発は細胞の死亡を引
き起こす。ＴＴＧ開始コドンを含有するプラスミドｐＧ
Ｇ７１は、高いＩＰＴＧレベルにおいてのみ起こる、極
端に低いレベルの耐性を与える。この結果は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉの中のｔｅｔＫ遺伝子の発現においてＡＴＧ開始部
位の重要性を示す。

【００４２】ｐＧＧ７６のｔｅｔＫの発現の結果は図５
に示す。プラスミドｐＧＧ７６はｐＡＣＹＣ１８４の複
製の由来を含有するが、プラスミドｐＧＧ５７はｐＢＲ
３２２に頼る。この図面が示すように、ＩＰＴＧで誘発
すると、ｐＧＧ７６を有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０
６１はｐＧＧ５７を有するＭＣ１０６１に対する同様な
テトラサイクリン耐性のプロフィルを示すが、ただしよ
り多くのＩＰＴＧは最大のテトラサイクリン耐性を達成
するために要求される。これは、ｐＡＣＹＣ１８４誘導
体がｐＧＧ５７より低いコピー数で存在し、したがって
完全な耐性を与えるためにより多くのＩＰＴＧを必要と
することがあるという事実と一致する。全体的に、これ
らの結果が示すように、ｔｅｔＫの調節可能な発現は無
関係のプラスミドの型において使用することができる。

【００４３】無関係のｔｅｔＫ発現プラスミドの構成 プラスミドｐＧＧ５６、ｐＧＧ７１、ｐＧＧ７６および
ｐＣＢＳａ１はｔｅｔ遺伝子のより低い発現において有
用であり、ｔｅｔＲ遺伝子産生物による調節の特徴は除
去され、そしてリボソーム結合部位は翻訳が弱化される
ように変更される。しかしながら、プラスミドのすべて
は、誘発可能なプロモーターを調節する調節要素、すな
わち、ｌａｃＩ遺伝子を含有する。スクリーニング有機
体の目的のために、この最終レベルの調節を排除して、
ｔｅｔＫ遺伝子が低い構成的レベルで発現されるように
する。この目的で、トランスボゾンＴｎ１０のｔｅｔＡ
遺伝子を含有するプラスミドｐＢＴ４０１（９）は、プ
ラスミドｐＣＢＳａ１をＳｍａＩ制限酵素で消化し、そ
してプラスミドｐＢＴ４０１の中に小さい断片を結合す
ることによって構成し、これをＢａｍＨＩ酵素で消化
し、そしてクレノー酵素で記載するようにクレノー酵素
でフィルインする。テトラサイクリン耐性を与える構成
体において、制限分析により決定して、遺伝子はカナマ
イシン耐性（ａｐｎ）遺伝子と同一の向きである。この
遺伝子が反対方向にあるとき、テトラサイクリン耐性は
検出されない。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の
ｔｅｔＫ遺伝子を含有する同質遺伝子のプラスミドは、
ｔｅｔＫ源としてプラスミドｐＧＧ５７を使用して同様
に構成する。

【００４４】これらのプラスミドを使用して、テトラサ
イクリン流出ポンプの阻害因子についてのスクリーニン
グアッセイにおける使用に適当なＥ．ｃｏｌｉ菌株を形
質転換する。

【００４５】テトラサイクリン流出ポンプの基質の特異
性 従来の研究が示唆するように、テトラサイクリン流出ポ
ンプは異なるテトラサイクリンを認識し、そして送り出
す能力を変化する（１１）。この解釈は別の説明により
制限される。例えば、差は宿主菌株の感受性に起因する
ことがありうる。さらに、流出ポンプがより強いテトラ
サイクリン耐性を与える場合、誘導体、例えば、ミノカ
イクリンに対する低いレベルの耐性が、すべてのテトラ
サイクリン基質を送る能力の増大と反対に、ポンプがミ
ノカイクリンを認識する能力に起因するかどうかを区別
することは困難である。「よりすぐれた」ポンプが、よ
り効率よいポンプであるよりむしろ、単に致死的がより
低く、より大きい数における許容されることさえ可能で
ある。他の可能性を除外しかつ唯一の変数として異なる
基質を見るために、ｔｅｔＡ、ｔｅｔＣおよびｔｅｔＫ
がエンコードするポンプが種々のテトラサイクリンに対
する耐性を単一の宿主菌株ＭＣ１０６１を与える能力
を、本発明の低いレベルの調節された系を使用して研究
する（表１）。この発現系を使用して、密接に関係する
流出系、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＣは異なるテトラサイク
リン類似体に対する基質の特異性の顕著な差を示ないこ
とが明らかにされた。さらに、ＩＰＴＧ濃度をｔｅｔＡ
を有するＭＣ１０６１について減少して、テトラサイク
リン耐性がｔｅｔＣ菌株と同一であるようにするとき、
他のテトラサイクリンに対する耐性の小さい差は消失す
る。対照的に、ｔｅｔＫ流出系はテトラサイクリン誘導
体のミノサイクリン、ドキシテトラサイクリンおよび６
−デメチル−６−デオキシテトラサイクリンを送り出す
能力の差を事実示す（表１）。こうして、低いレベルの
調節された発現系は、別の説明を除外し、そしてテトラ
サイクリン流出ポンプの間の基質の特異性の真の差を決
定することができる。

【００４６】

【表１】

【００４７】ｐＧＧ５７、ｐＣＢＳａ１またはｐＧＧ７
５を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１を使用し
て、テトラサイクリンならびに６つのテトラサイクリン
類似体についてＭＩＣ（ＬＤ９０）を決定する。各プラ
スミドは最大の誘発のために異なるレベルのＩＰＴＧを
必要とする。ＭＩＣの研究はｐＧＧ５７を含有するＥ．
ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１について０．０１ミリモルの
ＩＰＴＧの存在下に実施する。０．５ミリモルのＩＰＴ
Ｇのレベルは、ｐＧＧ７５を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株
ＭＣ１０６１の最適な誘発のために要求される。ｐＣＢ
Ｓａ１を含有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１は、最
大の誘発のために０．１ミリモルのＩＰＴＧのＩＰＴＧ
レベルを必要とする。これらのＭＩＣの研究のすべては
二重反復実験において実施する。

【００４８】テトラサイクリンのアッセイ ｔｅｔ感受性スクリーニング有機体の構成 λｓｔｅｔ１５８−４３（９）は、（ａ）Ｔｎ１０から
のｔｅｔＡプロモーターへのｌａｃＺの転写的融合；
（ｂ）ｂｓｔβ−ガラクトシダーゼからＣＩＩＩ遺伝子
への欠失、ｇａｍ遺伝子の損失、ＲｅｃＡ（組み換え欠
如）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌株におけるプラーク形成能力の
損失を生ずる；および（ｃ）ｃＩ８５７アレル、これ
は、リソゲンを３７℃において成長させるとき、誘発お
よび細胞の溶解を引き起こす。後者の特性はスクリーニ
ング微生物における使用に望ましくないと考えられる。
したがって、λ交雑を実施して、望ましい融合遺伝子を
保持するが、３７℃において成長しそしてＲｅｃＡ宿主
において複製することができ、ならびにＤＮＡ損傷因子
のために誘発を防止するＣＩｉｎｄ突然変異を有するハ
イブリッドのファージ得るようにする。適当なハイブリ
ッドを達成するために、融合を含有しないが、ＣＩｉｎ
ｄアレルおよびｇａｍ⁺遺伝子を有するλＷ３（１６）
とλｓｔｅｔ１５８−４３を交雑させて、ＲｅｃＡ宿主
菌株の中で複製させる。２つのファージの等しい多重性
を使用して、標準遺伝学的技術（１７）に従い、中性
（Ｒｅｃ⁺）宿主菌株ＮＫ５０３１を同時感染させる。
生ずるファージ調製物を使用して、ｇａｍ⁺ファージの
みに対するプラークの形成を可能とする、ＭＣ４１００
のＲｅｃＡ５６誘導体を３７℃において感染させる。Ｃ
Ｉｉｎｄアレルの存在は３７℃において濁ったプラーク
についてスクリーニングすることによってアッセイす
る。なぜなら、ＣＩ５８７アレルは温度感受性のリプレ
ッサーをエンコードするし、リソゲンが形成することが
できないので、３７℃において透明なプラークを生ずる
からである。ｌａｃＺ融合の存在は、β−ガラクトシダ
ーゼのインジケーターのＸ−ｇａｌを培地の中に含める
とき、ブルーのプラークについてスクリーニングするこ
とによって指示される。

【００４９】プラークの精製後、ファージ調製物を作
る。ブルーのｇａｍ⁺ファージを含有するリソゲンは、
ファージをＮＫ５０３１細胞の菌叢上にスポッティング
し、そして３７℃において成長することができるブルー
のコロニーについて数回ストリーキングすることによっ
て得られる。

【００５０】プラスミドｐＢＴ４０１は、ｔｅｔＲ遺伝
子を含有し、標準手順（８）に従い、カナマイシン耐性
について選択することによって、ハイブリッドλファー
ジを含有する菌株の中に形質転換することができる。形
質転換体の菌株ＫＢ３ｉｎｄは、β−ガラクトシダーゼ
の誘発によりテトラサイクリンに対して応答する。

【００５１】テトラサイクリンについての試験における
ＫＢ３ｉｎｄの使用 テトラサイクリンを検出するために、従来記載されたア
ッセイ（１１）に類似するプレートのアッセイを開発す
る。細胞を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するルリ
アブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）（ＮａＯＨでｐＨ
７．５に調節した）の中で０．５吸収単位（６００ｎ
ｍ）の細胞密度に成長させる。培養物の２５ｍｌの試料
を遠心により収穫し、そして１ｍｌのブロスの中に再表
面させる。細胞を２５ｍｌの柔寒天（１％、ｗ／ｖ）と
混合し、そして２２ｃｍ²のＮＵＮＣプレート（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ）内の１００ｍｌのＬＢ（ｐＨ７．５）＋カナ
マイシン上に注ぐ。試料を２〜１５μｌをスポッティン
グするか、あるいは化合物で含浸したディスクを適用す
ることによって適用し、そしてプレートを３７℃におい
て３〜４時間インキュベーションする。プレートを２ｍ
ｌのジメチルスルホキシド中に溶解した１３．５ｍｇの
６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドおよび８６．５ｍｇのファーストブルー（Ｓｉｇｍ
ａ）を含有する溶液でオーバーレイし、これに柔寒天を
添加する。β−ガラクトシダーゼは紫色のスポットの存
在により検出される。

【００５２】ＣＩｉｎｄアレルは期待するように機能的
であることを確かめるために、菌株ＫＢ３ｉｎｄを前述
のプレートアッセイにより試験する。２２．５ｎｇまで
のブレオマイシン、１５０ｎｇのミトマイシンＣまたは
１５０ｎｇのグリアーゼ阻害因子シノジン（１８）を含
有する３μｌの試料を、前述したように、プレート上に
スポッティングする。ＣＩｉｎｄアレルをもつλリソゲ
ンを含有すると信じられる菌株について、成長阻害因子
のゾーンを除外して、β−ガラクトシダーゼは検出され
ない。対照菌株、すなわち、ｃＩ野生型アレルを含有す
るＮＫ５０３１（λＳｔｅｔ１５８−５０）（１９）
は、β−ガラクトシダーゼを誘発することによって３つ
の試薬に応答する。

【００５３】次いで、ＫＢ３ｉｎｄを使用するアッセイ
の感度を決定する。プレートのアッセイを使用して、３
０μｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌまでの範囲のテトラサ
イクリン濃度を含有する、１０ｍｌの試料を日常的に検
出する（図８）。こうして、３００ｐｇ程度に少ないテ
トラサイクリンは日常的に検出され、そして時には１０
０ｐｇ程度少ないテトラサイクリンが検出される。

【００５４】あるいは、液体アッセイをまた使用する。
細胞をＬＢ（ｐＨ７．５）の中で成長させ、そしてテト
ラサイクリンを含有する試料を、培養物の密度が０．１
ＯＤ単位であるとき、アリコートに添加する。細胞の３
〜４世代後、各アリコートをβ−ガラクトシダーゼ活性
について記載されているように（１０、１２）測定し、
そしてミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位（１２）を決定す
る。液体アッセイにおいて、０．１ｎｇ／ｍｌの程度に
少ないテトラサイクリンを検出することができ、そし
て、バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）ら（９）により
報告されている従来の結果と一致して、５〜１０ｎｇ／
ｍｌは完全な誘発を生じた（図９）。プレートアッセイ
および液体アッセイの両者について、この菌株は従来報
告されたスクリーニング有機体（１１）よりいっそう感
受性である。

【００５５】プレートアッセイまたは液体アッセイのい
ずれも、抗バクテリア活性を有することが従来知られて
いるすべてのテトラサイクリンを検出することができ
る。これらの化合物は、次のものを包含する：テトラサ
イクリン、クロロテトラサイクリン、ミノサイクリン、
ドキシサイクリン、６−ジメチルクロロテトラサイクリ
ン、および６−デオキシ−６−ジメチルテトラサイクリ
ン。テトラサイクリンのアンヒドロ誘導体を、また、検
出することができ、従来の結果（１１）と一致する。

【００５６】種々の他の抗生物質をプレートアッセイを
使用して活性について試験して、他の抗生物質が陽性の
シグナルを生ずるかどうかを試験する。表２は、アッセ
イのプレート上に配置したディスクにおいて、いくつか
の化合物が制限された程度に紫色を生成することを示
す。しかしながら、陽性のシグナルを生ずる非特異的薬
物の量は誘発に必要なテトラサイクリンの量より３桁大
きい。成長の阻害の主要な量を取り囲む紫色のリング
は、非特異的薬物を適用したときにのみ、検出可能であ
る。大きい成長阻害のゾーンを取り囲む薄い紫色のリン
グは、例えば、色測定試薬に対して細胞を透過性とする
人工物であることがあり得る；β−ラクタムのクラスの
抗生物質のメンバーが時にはこの応答を引き起こすこと
は興味あることである。いずれの場合においても、明ら
かなように、アッセイの有機体はテトラサイクリン類を
非常によく識別し、しかも広範な種類のテトラサイクリ
ン構造に対して感受性である。この結果を再び強調する
ために、ほぼ２５０ｎｇの所定の薬物を含有する２〜３
μｌの試料ををアッセイプレート上に適用することによ
って、第２の組の実験を実施する（表３）。試験した種
々の薬物のいずれも陽性の応答を生じない。

【００５７】

【表２】

【００５８】

【表３】

【００５９】

【表４】 表 ３ テトラサイクリン、阻害およびシナージイ のアッセイにおいて試験した化合物 抗生物質のクラス 抗生物質の名称 未知 抗生物質Ａ１５３１ 未知 抗生物質Ａ４８２５ 未知 抗生物質Ａ７３６３ 未知 抗生物質Ａ９５３７ 未知 抗生物質ＡＭ３７４＃２２ ノナゾマイシン アクチノマイシン アクチノマイシン粗製物 アミノグリコシド 抗生物質ＡＭ３１ベータおよびガンマ アミノグリコシド 抗生物質ＢＭ１２３、Ａｌｂａ、ＳＯ４ アミノグリコシド 抗生物質ＢＭ７８２ アミノグリコシド 硫酸パロモマイシン アンサマイシン ゲルダマイシン アンチフンガル アンチプロトゾイン アウロドックス型 抗生物質Ｃ０８０７８アルファ 塩基性マクロリド ロイコマイシン 塩基性マクロリド レロマイシン、ＬＬ−ＡＭ６８４ベータ ベータラクタム ペニシリンＮ粗製物 クロランフェニカル クロランフェニカル 環状デプシペプチド 環状抗生物質Ａ０３４１ベータ、塩酸塩 環状デプシペプチド エタマイシン、Ｎａ塩 環状デプシペプチド バリノマイシン／マイチサイド 環状ペプチド バシトラシン 環状ペプチド ノナクチン（ＡＥ４０９ガンマ） 環状ペプチド ポリミキシン−Ｂ−ＳＯ４ フンガルメタボライト 抗生物質Ｖ２１４Ｘ フンガルメタボライト 抗生物質Ｖ２４１Ｗ フンガルメタボライト 抗生物質Ｚ−１２２０Ａ＃３ フンガルメタボライト クラバシン／パツリン フンガルメタボライト フサリン酸 フンガルメタボライト クリオトキシン グリコペプチド 硫酸アボパルシン グリコスペルミジン 抗生物質ＢＭ１２３ガンマ、ＨＣｌ ヒグロマイシン ヒグロマイシンＡ リノマイシン リンコマイシンＨＣｌ リポプチド アスパルトシン、Ｎａ塩 マクロライド ニュートラムシン 種々雑多なもの アクチトズ酸／マイコバシジン 種々雑多なもの アラゾペプチン 種々雑多なもの シトリニン 種々雑多なもの ウスン酸 ナフトキノン フレノリシン（ＡＣ８６０アルファ） ネトロプシン ネトロプシン、ＨＣｌ ヌクレオシド アングスタマイシン ヌクレオシド ブラストシジン「ｓ」 ヌクレオシド ヌクレオシジン ヌクレオシド プロマイシンアミノヌクレオシド ヌクレオシド プロマイシンＨＣｌ オルトソミシン類 アビラマイシン フェナジン フェナジン アルファ−ＣＯＯＨ 植物ホルモン ジベレリン酸 ポリエン ニスタチン ポリエーテル 抗生物質ＢＬ５８０アルファ キノサイクリン イソキノサイクリンＨＣｌ（ＡＡ５７５ガン マ） キノマイシン型 レボマイシン ストレプトトリシン型 抗生物質ＡＣ５４１、硫酸塩 アラシル−ペプチド 抗生物質ＢＯ２９６４ ビオマイシン ビオマイシン、硫酸塩 ビルギニアマイシン型 ストレプトマイシン／ベルチマイシン ほぼ２５０ｎｇの示した薬物を各アッセイプレート上に
スポッティングした。これらの薬物のいずれも、テトラ
サイクリンのアッセイ、阻害アッセイまたはシナージイ
（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイについて試験して陽性では
なかった。

【００６０】レダーレ（Ｌｅｄｅｒｌｅ）コレクション
からの、テトラサイクリンを産生することが知られてい
る種々の菌株を定常期に成長させる。すべては、低いレ
ベルのクロロテトラサイクリンを産生する、もとのヅッ
ガー（Ｄｕｇｇａｒ）分離物、菌株Ａ３７７、を包含す
る、プレートアッセイにおいて試験して日常的に陽性で
ある。未知の培養物をアッセイしてテトラサイクリン産
生体を検出するとき、もとのヅッガー（Ｄｕｇｇａｒ）
菌株を同一の成長法により成長させ、そして陽性の対照
として試験する。さらに、土から分離された未知の培養
物の発酵ブロスはテトラサイクリン誘導体の産生物とし
て同一される。

【００６１】ｔｅｔ耐性のスクリーニング有機体の構成 トランスボゾンＴｎ１０のｔｅｔＡ遺伝子を含有する誘
導体のプラスミドｐＢＴ４０１（９）は、プラスミドｐ
ＣＢＳａ１をＳｍａＩ制限酵素で消化し、そして記載さ
れているように（８）ＢａｍＨＩ酵素で消化しそしてク
レノー酵素でフィルインしたプラスミドｐＢＴ４０１の
中に、小さい断片を結合することによって構成する。テ
トラサイクリン耐性を与える構成体において、遺伝子
は、分析分析により決定して、カナマイシン耐性遺伝子
と同一の向きである。遺伝子が反対向きにあるとき、テ
トラサイクリン耐性は検出されない。カナマイシン耐性
遺伝子を過ぎる読み過ごし転写は低いレベルのｔｅｔＡ
遺伝子をを説明することができる。黄色ブドウ球菌
（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｔｅｔＫ遺伝子を含有する同質
遺伝子のプラスミドは、ｔｅｔＫの源として、前述のプ
ラスミドｐＧＧ５７を使用して同様に構成する。これら
のプラスミドの両者を、記載したハイブリッドのλファ
ージを含有する菌株ＮＫ５０３１の誘導体の中に形質転
換する。菌株ＫＢ４はｔｅｔＡを含有する。菌株ＫＢ５
はｔｅｔＫを含有する。

【００６２】図１０は、ＫＢ３ｉｎｄ、ＫＢ４およびＫ
Ｂ５を使用して観測された誘発の比較を示す。ＫＢ３ｉ
ｎｄはテトラサイクリン感受性であり、そしてちょうど
５〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンにおいて最大に
誘発する。ＫＢ４は、ｔｅｔＡ遺伝子を含有し、１０μ
ｇ／ｍｌより少ないテトラサイクリンに対する耐性を与
え、これに対して、ＫＢ３ｉｎｄのＴｎ１０誘導体は１
００μｇ／ｍｌより多いテトラサイクリンに対して耐性
である。ＫＢ４は、多分その構成的発現のために、Ｔｎ
１０菌株より効率よく５ｎｇ／ｍｌの存在下に誘発を防
止する。これはテトラサイクリンの内部の濃度を減少
し、そしてＴｎ１０菌株と比較して誘発をほとんど生じ
ない。しかしながら、テトラサイクリン濃度がほんのわ
ずかに増加するとき、菌株ＫＢ４はより多くの流出ポン
プを作ることによって応答することができず、そしてテ
トラサイクリン濃度が３０ｎｇ／ｍｌに増加するとき、
完全な誘発が起こる。Ｔｎ１０菌株は完全な誘発のため
に１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを必要とする。こう
して、菌株ＫＢ４は、非常にわずかのポンプの阻害が応
答を生ずることができるという意味において、テトラサ
イクリン流出ポンプの阻害因子の検出により、最適に近
いと思われる。

【００６３】菌株ＫＢ５は、ｔｅｔＡ遺伝子が低いレベ
ルのテトラサイクリン耐性を与える以外、菌株ＫＢ４に
対して同質遺伝子的である。菌株ＫＢ５のＭＩＣは、ま
た、約１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンである。ｔｅ
ｔＡ遺伝子は菌株ＫＢ４と比較して誘発曲線の同様なシ
フトを生ずる。両者の菌株を、テトラサイクリンの不存
在下におけるよりゆっくりであるにもかかわらず、５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下に成長する。

【００６４】流出ポンプの阻害因子についてのアッセイ ｔｅｔＡ遺伝子産生物（菌株ＫＢ５を使用する）または
ｔｅｔＫ遺伝子産生物（菌株ＫＢ４を使用する）の阻害
因子を検出するために、２つのアッセイを開発する。阻
害アッセイにおいて、寒天培地が５ｎｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを含有する以外、絵うのテトラサイクリンの
スクリーンにおいて記載したように、菌株ＫＢ４または
菌株ＫＢ５の細胞を処理する。あるいは、液体アッセイ
をまた開発する。細胞をまずＬＢ（ｐＨ７．５）の中で
成長させる。次いで細胞を５ｎｇ／ｍｌのテトラサイク
リンを含有する培地に移し、そしてテトラサイクリンを
含有する試料をアリコートに添加する。次いで細胞をイ
ンキュベーションし、そしてテトラサイクリンのアッセ
イについて記載したようにアッセイする。阻害アッセイ
は、ｔｅｔＡの完全な誘発が菌株ＫＢ３ｉｎｄにおいて
５〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下に起こ
るという事実に頼る（図１０）。しかしながら、細胞内
濃度はテトラサイクリン耐性菌株において流出ポンプの
作用のために減少するので、誘発するために十分なテト
ラサイクリンを細胞の内側に蓄積ためにはより多いテト
ラサイクリンを培地の中に必要とするであろう。阻害ア
ッセイは、耐性菌株について誘発以下のレベルのテトラ
サイクリンの存在下にβ−ガラクトシダーゼの誘発を引
き起こす化合物を検出するように設計する。

【００６５】シナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイに
おいて、寒天培地が、菌株ＫＢ４またはＫＢ５のＭＩＣ
付近である、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有す
る以外、プレートアッセイについて前述したように、細
胞を処理する。成長の阻害は、色測定試薬を含有するオ
ーバーレイ後の紫色の生成の欠如により、検出される。
あるいは、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する
培地に細胞を移す以外、液体アッセイについて前述した
ように、細胞を処理する。このスクリーンは、テトラサ
イクリンと比較してアッセイの有機体を殺す化合物、抗
生物質、発酵ブロスなどを検出する、すなわち、テトラ
サイクリンの不存在下ではなく、５μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンの存在下に成長の阻害を引き起こす物質を検
出するように、設計する。

【００６６】理想的な化合物は、シナージイ（Ｓｙｎｅ
ｒｇｙ）アッセイにおいて成長の阻害を引き起こし、そ
して阻害アッセイにおいて誘発を引き起こす化合物であ
る。流出ポンプの阻害因子であることが知られている、
入手可能な陽性の対照は存在しない。テトラサイクリン
存在または不存在において流出ポンプを発現する細胞を
殺すように設計された、親油性キレート剤、例えば、フ
サル酸（２０）は、菌株ＫＢ４を使用する阻害アッセイ
またはシナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイにおいて
試験して陽性ではない。これらの因子は、低い細胞密度
でかつ特別の培地において、細胞がポンプを強く発現す
るときにのみ活性である。しかしながら、発酵ブロス
は、阻害およびシナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）のプレー
トアッセイの両者において試験して陽性である物質を含
有する（図１１）。１つのバクテリアの培養により産生
された主要な活性成分は、菌株ＫＢ４およびＫＢ５の両
者について、ノウカーダミン（ｎｏｃａｒｄａｍｉｎ
ｅ）、Ｆｅ＋＋＋ｎｉ結合するシデロフォア（ｓｉｄｅ
ｒｏｐｈｏｒｅ）であることが分かった。１μｇのノウ
カーダミンはシナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイま
たは阻害アッセイにおいて活性を検出するために十分で
ある。ノウカーダミンがポンプと独特に対抗するかどう
か、あるいは他の鉄結合化合物がまた同一の作用を有す
るかどうかを試験するために、シデロフォアのフェリク
ロームおよびフェリクロームＡを、また、テトラサイク
リン流出ポンプと対抗する能力について試験する。両者
の化合物はノウカーダミンと同一モル濃度において試験
して陽性である。その鉄のキレート剤のキレート化しな
い形態のみは、この阻害活性を示す。

【００６７】ノウカーダミンの作用は、図１２に示すよ
うに、液体アッセイにおいて検出することができる。５
ｎｇ／ｍｌのの存在下に液体培養において成長した細胞
は低いレベルにおいてのみβ−ガラクトシダーゼを誘発
する；しかしながら、ノウカーダミンは、また、５μｇ
／ｍｌより大きい濃度で存在し、菌株ＫＢ４またはＫＢ
５について、β−ガラクトシダーゼの上昇が起こる。細
胞が５ｎｇ／ｍｌの存在下に成長しているとき、成長の
阻害は、β−ガラクトシダーゼの産生の阻害により最も
明瞭に検出され、両者の菌株について明らかである。

【００６８】図１３が示すように、菌株ＫＢ３ｉｎｄ
（高度に耐性の菌株）のＴｎ１０誘導体は２５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンの存在下に成長させるとき、ノウ
カーダミンはＴｎ１０菌株の成長を阻害するが、テトラ
サイクリンが存在しないとき、作用をほとんどあるいは
まったくもたない。こうして、ノウカーダミンおよび他
のシデロフォア類は細胞の内側においてテトラサイクリ
ンの低いレベルを維持するポンプの能力を妨害する作用
を有する。

【００６９】表２が示すように、種々の抗生物質をプレ
ートアッセイで試験するとき、わずかのものは阻害アッ
セイにおいて陽性の応答を引き起こし、そしてシナージ
イ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイにおいていずれも応答を
引き起こさない。阻害アッセイについての１つの顕著な
例外は、菌株ＫＢ４およびＫＢ５の両者についてのプレ
ートアッセイにおいて１ｎｇ程度に少なくをスポッティ
ングしたとき、誘発を引き起こすテトラサイクリンの誘
導体である。テトラサイクリンをアッセイプレート上に
スポッティングするとき、流出ポンプは誘発を防止する
ために十分なテトラサイクリンを送り出すすることがで
きない。したがって、阻害アッセイはテトラサイクリン
のアッセイに関して実施すべきであり、これはテトラサ
イクリンに対してより強い陽性の応答を示す。テトラサ
イクリンのアッセイにおいて成長の阻害の大きいゾーン
を取り囲む紫色のリングを引き起こす同一のβ−ラクト
ム抗生物質（表１）は、阻害アッセイにおいて同じよう
によく同様な応答を示す。ノウカーダミンは、対照的
に、図１３に示すテトラサイクリンのアッセイにおいて
応答を示さないが、それは阻害アッセイおよびシナージ
イ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイの両者において検出され
る。

【００７０】スクリーニング発酵ブロス 陽性の応答を引き起こす発酵ブロスにおける最も優勢な
成分はシデロフォア類である。幸いにも、ＣＡＳプレー
ト（２１）はシデロフォア類の信頼性ある試験を提供す
るので、これらの活性物質は急速に同定することができ
る。

【００７１】要約すると、組み合わせて実施することが
できる３つのスクリーンが提供される。ｐｇレベルのテ
トラサイクリンを検出するテトラサイクリンのアッセイ
を設計する。テトラサイクリンのアッセイは１ｎｇのテ
トラサイクリンを検出することができる。阻害アッセイ
およびシナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイは、低い
細胞内レベルのテトラサイクリンを維持するテトラサイ
クリン流出ポンプの能力を妨害する化合物、例えば、ノ
ウカーダミンを検出するように設計する。ノウカーダミ
ンは、また、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと組み
合わせて、完全にテトラサイクリン耐性の菌株の成長を
阻害する。その活性の原因となるのは、明らかに、ノウ
カーダミンのキレート化能力である。なぜなら、他の強
い鉄キレート剤は同様な作用を有するからである。いか
なる理論にも拘束されたくないが、ノウカーダミンは、
鉄と結合することによって、酸化−還元反応に依存する
機能を妨害する鉄誘導体の状態を引き起こすことがあ
る。テトラサイクリンの活性な流出を、電子の輸送およ
び鉄に依存する、タンパク質の勾配により生かして、完
全なプロトンの移動力を維持して、鉄不含シデロフォア
と流出ポンプの妨害との間の関係のもっともらしい説明
を得ることができることは注目に値する。しかしなが
ら、また、ノウカーダミンにより処理は細胞によるテト
ラサイクリンの吸収を増強することができる。なぜな
ら、テトラサイクリン感受性ＫＢ３ｉｎｄはテトラサイ
クリンおよびノウカーダミンとの組み合わせにより影響
を受けるからである。テトラサイクリン流出ポンプを含
有する細胞の中へのテトラサイクリンの吸収は、これら
のポンプと対抗するポンプの別の手段であることができ
る。

【００７２】以下の生物学的材料は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）米国マリイランド州ロックビレ）に１９９１年１２
月３日に受託され、そして表示する受け入れ番号を与え
られた。これらはアメリカン・サイアナミド・カンパニ
ー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ）、レダーレ・ラボラトリーズ（Ｌｅｄｅｒｌｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ニューヨーク州パールリバ
ー、の菌株保存機関において入手可能である。

【００７３】

【表５】 プラスミド 受け入れ番号 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ｐＣＢＳａ１ ＡＴＣＣ ６８８５５ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／ｐＧＧ５７ ＡＴＣＣ ６８８５６ Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＢ３ｉｎｄ ＡＴＣＣ ６８８５７ Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＢ４ ＡＴＣＣ ６８８５８ Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＢ５ ＡＴＣＣ ６８８５９ 配列ＩＤ Ｎｏ．１ 配列の型：核酸 配列の長さ：６６塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：トランスボゾンＴｎ１０

【００７４】

【化２】

【００７５】配列ＩＤ Ｎｏ．２ 配列の型：核酸 配列の長さ：７２塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：プラスミドｐＣＢＳａ１

【００７６】

【化３】

【００７７】配列ＩＤ Ｎｏ．３ 配列の型：核酸 配列の長さ：３０塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：プラスミドｐＧＧ５７

【００７８】

【化４】

【００７９】配列ＩＤ Ｎｏ．４ 配列の型：核酸 配列の長さ：３０塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：プラスミドｐＧＧ７１

【００８０】

【化５】

【００８１】配列ＩＤ Ｎｏ．５ 配列の型：核酸 配列の長さ：２６塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：バクテリオファージＭＣ７１

【００８２】

【化６】

【００８３】配列ＩＤ Ｎｏ．６ 配列の型：核酸 配列の長さ：１７塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：ｐＧＧ５７

【００８４】

【化７】

【００８５】配列ＩＤ Ｎｏ．７ 配列の型：核酸 配列の長さ：１７塩基対 鎖の性質：一本鎖 トポロジー：直線 もとの有機体源：ｐＧＧ７１

【００８６】

【化８】

【００８７】引用文献 １、マクマレイ（ＭｃＭｕｒｒａｙ）、Ｌ．Ｍ．、Ｒ．
Ｅ．ペトルッチ（Ｐｅｔｒｕｃｃｉ）、Ｊｒ．および
Ｓ．Ｂ．レビイ（Ｌｅｖｙ）、１９８０、大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における４つの遺伝学
的に異なるテトラサイクリン耐性要素によりエンコード
されるテトラサイクリンの活性な流出、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、７
７：３９７４−３９７７。

【００８８】２、モジュムダー（Ｍｏｊｕｍｄａｒ）、
Ｍ．およびＳ．Ａ．カール（Ｋｈａｒ）、１９８８、黄
色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）のプラスミドｐＴ１８１のテトラサイクリン耐
性遺伝子の特性決定、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１７０：５５
２２−５５２８。

【００８９】３、コウルマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）、Ｄ．
Ｃ．およびＴ．Ｊ．フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）、１９
８１、マルチコピーにおけるトランスボゾンＴｎ１０に
より決定したテトラサイクリン耐性の発現における減少
の分析、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）１８２、１
７１−１７７。

【００９０】４、モイド（Ｍｏｙｅｄ）、Ｊ．Ｓ．、
Ｔ．Ｔ．グエン（Ｎｇｕｙｅｎ）およびＫ．Ｐ．バート
ランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）、１９８３、ｔｅｔ遺伝子
の発現の誘発に対する感受性を付与するマルチコピーの
Ｔｎ１０のｔｅｔプラスミド、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５
５、５４９−５５６。

【００９１】５、バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）、
Ｋ．Ｐ．、Ｋ．ポストル（Ｐｏｓｔｌｅ）、Ｌ．Ｖ．ウ
レイ（Ｗｒａｙ）、Ｊｒ．およびＷ．Ｓ．レズニコフ
（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）、１９８３、オーバーラッピン
グする発散プロモーターはＴｎ１０テトラサイクリン耐
性の発現をコントロール、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２３：
１４９−１５６。

【００９２】６、ヒレン（Ｈｉｌｌｅｎ）、Ｗ．、Ｋ．
ショルメイアー（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒ）およびＣ．
ガッツ（Ｇａｔｚ）、１９８４、Ｔｎ１０エンコーデッ
ドテトラサイクリン耐性オペロンＩＩの発現のコントロ
ール、ＲＮＡポリメラーゼおよびＴＥＴリプレッサーと
ｔｅｔオペロン調節領域との相互作用、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）、１７２：１８５−２０１。

【００９３】７、エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）、Ｂ．お
よびＣ．Ｆ．ベック（Ｂｅｃｋ）、１９８９、トランス
ボゾンＴｎ１０エンコーデッドテトラサイクリンタンパ
ク質の過剰の産生は膜タンパク質の死および損失を生ず
る、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７１：３５５７−３５５９。 ８、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、Ｅ．
Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアチ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク。

【００９４】９、バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）、
Ｋ．Ｐ．ポスル（Ｐｏｓｔｌｅ）、Ｌ．Ｖ．、レイ（Ｗ
ｒａｙ）、Ｊｒ．およびＷ．Ｓ．レスニコフ（Ｒｅｓｎ
ｉｋｏｆｆ）、１９８４、単一のｃｏｐプロモーターの
ベクターの構成およびトランスボゾンＴｎ１０テトラサ
イクリン耐性決定基の調節の分析におけるその使用、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）１５８：９１０−９１９。

【００９５】１０、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｊ．Ｈ．
１９７２、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク
州。

【００９６】１１、チョプラ（Ｃｈｏｐｒａ）、Ｉ．、
Ｋ．ハッカー（Ｈａｃｋｅｒ）、Ｚ．ミスロビン（Ｍｉ
ｓｕｌｏｖｉｎ）およびＤ．Ｍ．ロスステイン（Ｒｏｔ
ｈｓｔｅｉｎ）、１９９０、ｔｅｔＡ−ｌａｃＺ融合系
を使用するテトラサイクリンの感受性の生物学的検出
法、抗微生物剤および化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）３４：１１
１−１１６。

【００９７】１２、ロスステイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉ
ｎ）、Ｄ．Ｍ．、Ｇ．ペイヘル（Ｐａｈｅｌ）、Ｂ．タ
イラー（Ｔｙｌｅｒ）およびＢ．マガサニク（Ｍｇａｓ
ａｎｉｋ）、１９８０、グルタミンシンセターゼの不存
在下の大腸菌のｇｌｎＡプロモーターからの発現の調節
（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｌｎＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｔｈｅ
ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈ
ｅｔａｓｅ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）７７：７３７２−７３７６。

【００９８】１３、ハーシェイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）、
Ａ．Ｄ．（編）１９７１。「バクテリオファージラムダ
（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｌａｍｄｄａ）」、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州。

【００９９】１４、リチャード・ノウビック（Ｒｉｃｈ
ａｒｄ Ｎｏｖｉｃｋ）、個人的通信。

【０１００】１５、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｔ．
Ａ．、Ｊ．Ｄ．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびＲ．
Ａ．ザコウル（Ｚａｋｏｕｒ）、１９８７、表現型の選
択を使用しない急速なかつ効率よい部位特異的突然変
異、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５４：３６７。

【０１０１】１６、Ｓ．アディヤ（Ａｄｙａ）、個人的
通信。

【０１０２】１７、デイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｒ．Ｗ．
ボトステイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）およびＪ．Ｒ．ロウ
（Ｒｏｇｈ）、１９８０、アドバンスド・バクテリアル
・ジェネティックス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク州。

【０１０３】１８、オスバーン（Ｏｓｂｕｒｎｅ）、
Ｍ．Ｏ．、Ｗ．Ｍ．マイエセ（Ｍａｉｅｓｅ）および
Ｍ．グリーンステイン（Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ）、１９
９０、シノジン、グリコシンナモイルスペルジジン抗生
物質によるバクテリアのＤＮＡギラーゼの生体内の阻
害。抗微生物剤および化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ
ｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ
ｐｙ）、３４：１４５０−１４５２。

【０１０４】１９、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｌ．Ｄ．お
よびＫ．Ｐ．バートランド（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）、１９
８８、テトラサイクリン結合ドメインの誘発、位置を妨
害するＴｎ１０リプレッサーにおける突然変異。ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）、２０３：９４９−９５９。

【０１０５】２０、ボチナー（Ｂｏｃｈｎｅｒ）、Ｂ．
Ｒ．、Ｈ．−Ｃ．フカング（Ｈｕｃａｎｇ）、Ｇ．Ｌ．
スチーベン（Ｓｃｈｉｅｖｅｎ）およびＢ．Ｎ．アメス
（Ａｍｅｓ）、１９８０、テトラサイクリン耐性の損失
についての陽性の選択。ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１４３：９
２６−９３３。

【０１０６】２１、シウィン（Ｓｃｈｗｙｎ）、Ｂ．お
よびＪ．Ｂ．ネトランズ（Ｎｔｌａｎｄｓ）、１９８
７、シデロフォアの欠失および決定についての汎用化学
的アッセイ。アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１６０：４７−５
６。

【０１０７】２２、ゴールド（Ｇｏｌｄ）、Ｌ．および
Ｇ．ストルモ（Ｓｔｏｒｍｏ）、１９８７、大腸菌およ
びネズミチフス菌：細胞および分子生物学（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｃ．
ニードハード（ｎｉｅｄｈａｒｄ）（編）、アメリカン
・ソサイアティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ、Ｖｏｌ．２：１３０２−
１３０７。

【０１０８】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【０１０９】１、テトラサイクリンの不存在下に、次の
特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、
（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、および
（ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
る、を有する微生物を、試験すべき試料および、インジ
ケーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシグナル
生成する試薬と接触させ、そして検出可能なシグナルの
存在または不存在を観測し、これにより試料の中のテト
ラサイクリン様活性の存在または不存在を示す、ことか
らなる、試験試料の中のテトラサイクリン様化合物を検
出する方法。

【０１１０】２、微生物は３７℃において成長すること
ができる、上記第１項記載の方法。 ３、ｔｅｔＲ遺伝子は１０ｎｇまたはそれより少ないテ
トラサイクリン様化合物に対して感受性とするレベルで
発現される、上記第１項記載の方法。

【０１１１】４、微生物はＥ．ｃｏｌｉである、上記第
１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、
（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、（ｃ）
ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性である、お
よび（ｄ）３７℃において成長することができる、を有
する微生物。

【０１１２】６、１０ｎｇまたはそれより少ないテトラ
サイクリンに対して感受性である、上記第５項記載の微
生物。

【０１１３】７、Ｅ．ｃｏｌｉである、上記第５または
６項記載の微生物。

【０１１４】８、次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、
（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、（ｃ）
ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性である、お
よび（ｄ）テトラサイクリン流出ポンプをエンコードす
る遺伝子、を有する微生物。

【０１１５】９、流出ポンプの遺伝子はｔｅｔＡまたは
ｔｅｔＫである、上記第８項記載の微生物。

【０１１６】１０、１０ｎｇまたはそれより少ないテト
ラサイクリンに対して感受性である、上記第８または９
項記載の微生物。

【０１１７】１１、阻害以下であるが誘発レベルのテト
ラサイクリンの存在下に、次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、
（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、（ｃ）
ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性である、お
よび（ｄ）テトラサイクリン流出ポンプをエンコードす
る遺伝子、を有する微生物を、試験すべき試料および、
インジケーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシ
グナル生成する試薬と接触させ、そして検出可能なシグ
ナルの存在または不存在を観測し、これにより試料の中
のテトラサイクリン流出ポンプの阻害因子の存在または
不存在を示す、ことからなる、試験試料の中のテトラサ
イクリン流出ポンプの阻害因子を検出する方法。

【０１１８】１２、非阻害および誘発以下のレベルのテ
トラサイクリンの存在下に、次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、
（ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、（ｃ）
ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性である、お
よび（ｄ）テトラサイクリン流出ポンプをエンコードす
る遺伝子、を有する微生物を、試験すべき試料および、
インジケーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシ
グナル生成する試薬と接触させ、そして検出可能なシグ
ナルの存在または不存在を観測し、これにより試料の中
のテトラサイクリン流出ポンプの阻害因子の存在または
不存在を示す、ことからなる、試験試料の中のテトラサ
イクリン流出ポンプの阻害因子を検出する方法。

【０１１９】１３、微生物は（ｅ）３７℃においてにお
いて成長することができる、上記第１１または１２項記
載の方法。

【０１２０】１４、ｔｅｔＲ遺伝子は１０ｎｇまたはそ
れより少ないテトラサイクリンに対して感受性とするレ
ベルにおいて発現される、上記第１１〜１３項のいずれ
かに記載の方法。

【０１２１】１５、流出ポンプはｔｅｔＡまたはｔｅｔ
Ｋである、上記第１１〜１４項のいずれかに記載の方
法。

【０１２２】１６、微生物は１０ｎｇまたはそれより少
ないテトラサイクリンに対して耐性である、上記第１１
〜１５項のいずれかに記載の方法。

【０１２３】１７、有効量のテトラサイクリンまたはテ
トラサイクリン様化合物とテトラサイクリン流出ポンプ
の作用を阻害することができる化合物との組み合わせか
らなる製剤学的組成物。

【０１２４】１８、化合物はキレート化されていない鉄
のキレート剤である、上記第１７項記載の組成物。

【図面の簡単な説明】

【図１】親のプラスミド（ｐＣＢ２５８）および４つの
誘導体ｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７１およびｐ
ＧＧ７５の概略的表示。プラスミドｐＣＢＳａ１および
ｐＣＢ２５８は、Ｅ．ｃｏｌｉのトランスボゾンＴｎ１
０からのテトラサイクリン流出ポンプをエンコードす
る、ｔｅｔＡ遺伝子を含有する。ｐＣＢＳａ１またはｐ
ＣＢ２５８の中に存在するｔｅｔＡのための転写の開始
の回りに見いだされる制限部位が描写されている。プラ
スミドｐＣＢＳａ１はｐＣＢ２５８の中に位置するテト
ラサイクリンのリプレッサーのオペレーター部位の一部
分について欠失され、そして２つの追加の制限部位（Ｓ
ａｌＩおよびＸｈｏＩ）。プラスミドｐＧＧ５７および
ｐＧＧ７１は、それぞれ、ＧＧ１およびＧＧ２と表示さ
れる分離されたＭ１３バクテリオファージの２．０ｋｂ
のＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の中に存在する、黄色
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）から誘導されたテトラサイクリン流出ポンプをエ
ンコードする、ｔｅｔＫ遺伝子を含有する。ＧＧ１およ
びＧＧ２の両者は、Ｍ１３バクテリオファージＭＣ７１
のオリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異により発
生される。ｐＧＧ７５はｔｅｔＣ遺伝子を含有し、この
遺伝子はｐＢＲ３２２からの誘導されたテトラサイクリ
ン流出ポンプをエンコードし、ポリメラーゼ連鎖反応を
使用してｔｅｔＣのＡＴＧに対して５’に導入されるＳ
ａｌＩ制限部位をもつ。テトラサイクリン耐性の高いレ
ベルへのｔｅｔＣの調節された発現は、ｔｅｔＣ解読領
域の外側の残基に対するＤＮＡ配列の分析により示され
た、特性決定されない調節突然変異を包含する。ｌａｃ
Ｉ遺伝子は、ＩＰＴＧを使用してｔａｃポリヌクレオチ
ドのコントロール下に遺伝子の発現を調節するｌａｃリ
プレッサーをエンコードする。

【図２】上部のＤＮＡ配列は、テトラサイクリンのリプ
レッサーをエンコードするｔｅｔＲと、テトラサイクリ
ン流出ポンプをエンコードするｔｅｔＡとの間のトラン
スボゾンＴｎ１０からである。Ｔｎ１０の中に見いださ
れる２つのオペレーター部位は下線が引かれており、そ
してＢａｍＨＩ制限部位の位置は、制限分析からの２つ
のオペレーター部位の間に存在すると推定される。ｐＣ
ＢＳａ１は２つの独特制限部位を含有するが、これらの
変化はアミノ酸レベルにおいてｔｅｔＡエンコーデッド
タンパク質の変更を生じない。２つのｔｅｔＫ構成体の
間の唯一の差は翻訳の開始にある。プラスミドｐＧＧ５
７はＡＴＧ開始コドン（下線が引かれている）を含有す
るが、ｐＧＧ７１はＴＴＧ開始コドン（下線が引かれて
いる）を含有する。各構成体のためのすべての開始コド
ンは矢印で描写されている。

【図３】ｔｅｔＫの開始コドン付近の部位特異的突然変
異。オリゴヌクレオチド仲介の部位特異的突然変異を使
用して変更されたバクテリオファージＭＣ７１の中のｔ
ｅｔＫの開始コドン付近のＤＮＡ領域が示されている。
オリゴヌクレオチド仲介の部位特異的突然変異は次を必
要とする：（１）突然変異化しようとする、単一の一本
鎖ＤＮＡ鋳型および（２）ＤＮＡ断片の中に導入しよう
とする、所望の変化をその中に含有する短い（２０〜４
０ｂｐ）相補的オリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレ
オチドは、相補的一本鎖鋳型へのアニーリングを可能と
する。いったんアニーリングすると、オリゴヌクレオチ
ドの３’ＯＨ基は付加されたＤＮＡポリメラーゼのため
のプライマーとして働き、そして二本鎖産生物を産生す
る。２つの鎖の１つは、ここで、オリゴヌクレオチドの
プライマーにより導入された変更を含有する。この技術
を２つの異なるオリゴヌクレオチドのプライマー（ＰＴ
１８１３およびＰＴ１８１４）とともに使用する。自然
のｔｅｔＫ開始部位またはその付近のＤＮＡ配列の中の
変化が描写されている。これらのオリゴヌクレオチド仲
介の部位特異的突然変異の両者はｔｅｔＫに対して５’
のＳａｌＩ部位を生成して、これらの構成体をｐＣＢＳ
ａ１の中に導入する便利な手段を可能とした。ＳａｌＩ
部位に加えて、ｐＧＧ５７はＡＴＧ開始部位をもつｔｅ
ｔＫを含有し、そしてｐＧＧ７１はＴＴＧ開始部位を含
有する。これらの変化以外で、ｔｅｔＫ構成体の両者は
ＤＮＡレベルにおいて同一である。

【図４】Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１の中のプラスミ
ドｐＣＢＳａ１、ｐＧＧ５７、ｐＧＧ７５およびｐＧＧ
７１によりを付与されたテトラサイクリン耐性のプロフ
ィル。細胞をルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔ
ｈ）液体培地の中で成長させ、０．８５％の生理的塩類
溶液で希釈し、そして増加する濃度のＩＰＴＧの存在下
に増加する濃度のテトラサイクリンを含有する寒天プレ
ート上に広げた。プレートを３７℃において１６時間イ
ンキュベーションした。コロニー形成単位の少なくとも
９０％の損失を殺すために要求されるテトラサイクリン
の最小阻害濃度（ＬＤ_９０）を示す。

【図５】ｐＧＧ５７またはｐＧＧ７６を含有するＥ．ｃ
ｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１のテトラサイクリン耐性プロフ
ィル。ｐＧＧ５７およびｐＧＧ７６の両者はｔｅｔＫお
よび同一の調節要素を含有するが、それらのプラスミド
の複製領域において異なる。これらのプロフィルを得る
ために使用した手順は、図面の凡例３Ａに記載するプロ
トコルと同一である。

【図６】列挙するプラスミドはｐＧＧ５７の誘導体であ
る。プラスミドｐＧＧ７６はｌａｃＩおよびｔｅｔＫを
含有するｐＧＧ５７のｐＡＣＹＣ１８４誘導体である。
プラスミドｐＧＧ７７およびｐＧＧ８４はｔｅｔＫ解読
領域内のＤＮＡ配列について欠失されている。

【図７】１２．５ミリモルのカリウムを含有する最小培
地の中で成長したＥ．ｃｏｌｉＴＫ２２０５についての
成長曲線を９時間の期間にわたって実施した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉＴＫ２２０５、及びｐＧＧ７６、ｐＧＧ７７または
ｐＧＧ８４を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＫ２２０５。各
培養物はカリウムの吸収の欠乏の最適な救助に要求され
るレベルのＩＰＴＧを含有する。

【図８】テトラサイクリンのプレートアッセイの結果を
例示する。この実験において、示した量のテトラサイク
リンを含有する１０μｌのスポットをこのテキストに記
載するように成長させた細胞の菌叢に適用し、そして３
時間インキュベーション後、発色性基質を適用する。各
スポットにおけるテトラサイクリンの量を示す。３００
ｐｇのテトラサイクリンを常に検出することができる。
より高い量のテトラサイクリンを適用するとき、誘発の
リングにより取り囲まれた、成長阻害ゾーンを観察する
ことができる。

【図９】テトラサイクリンを検出する液体アッセイを例
示する。試料を、このテキストに記載するように、細胞
のアリコートに添加し、そしてβ−ガラクトシダーゼア
ッセイを実施することによって誘発を膜的に測定する。
細胞が示した濃度のテトラサイクリンの存在下に４世代
成長するときの、β−ガラクトシダーゼの比活性、ミラ
ー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位（１０）、を示す。５〜１０ｎ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在は完全な誘発のため
に日常的に十分である。

【図１０】液体培養におけるテトラサイクリンの感受性
および耐性の誘発を例示する。細胞を図１０に記載する
ように示した最終濃度にテトラサイクリンに添加する。
感受性菌株はテトラサイクリンのスクリーニング有機体
ＫＢ３ｉｎｄであり、これは５〜１０ｎｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンの存在下に成長させたとき完全な誘発す
る。対照的に、Ｔｎ１０要素を含有し、強いテトラサイ
クリン耐性を与える菌株は、テトラサイクリン濃度が１
μｇ／ｍｌ以上であるとき、完全な誘発する。菌株ＫＢ
４は、テトラサイクリン流出ポンプの低い構成的発現の
ために、適度にテトラサイクリン耐性の有機体であり、
５ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下に誘発の低い
バックグラウンドを示すが、３０ｎｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンが存在するとき、完全な誘発を示す。

【図１１】活性因子が培養において存在するときの種々
のアッセイの結果を示す。発酵ブロスからの抽出物は、
溶媒抽出およびＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーに
より調製する。発酵ブロスの１０倍濃縮物を、に記載す
るように、テトラサイクリンアッセイプレートおよびシ
ナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）プレートに適用する。テト
ラサイクリン流出ポンプを拮抗する化合物は、シナージ
イ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）アッセイにおける菌株ＫＢ４の成
長の阻害（５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下の
成長）、阻害アッセイにおける菌株ＫＢ４におけるβ−
ガラクトシダーゼの誘発（５ｎｇ／ｍｌのテトラサイク
リンの存在下の成長）を引き起こすことが期待される
が、テトラサイクリンのアッセイにおいて菌株ＫＢ３ｉ
ｎｄにおいて誘発を引き起こさない。２つの独立の試料
を調製し、そして１０倍の濃縮物、３倍の濃縮物および
濃縮しない試料の１０μｌの試料を示すように各プレー
トに適用し、そして３時間インキュベーションする。成
長の阻害の誘発は発色性オーバーレイ後に観察される。
調製物における活性成分は阻害アッセイにおいてのみ誘
発を引き起こし、そしてシナージイ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）
アッセイにおいて示差的成長の阻害を引き起こす。活性
成分を分離し、そしてノウカーダミン（ｎｏｃａｏｄａ
ｍｉｎｅ）、シデロフォアであると決定される。他の明
確なシデロフォアは、また、この同一の活性を示す。

【図１２】テトラサイクリン流出ポンプの阻害因子につ
いての液体アッセイの結果を示す。阻害活性は、液体培
養において、テトラサイクリンを欠如する培地の中で菌
株ＫＢ４を成長させ、次いで５ｎｇ／ｍｌのテトラサイ
クリン、流出ポンプの作用のために誘発以下のレベルの
テトラサイクリンを含有する培地に移す。ノウカーダミ
ンをまた示すように添加する。４世代の成長後、β−ガ
ラクトシダーゼの比活性をミラー単位（１０）で決定す
る。ノウカーダミンが５μｇ／ｍｌ以上で存在すると
き、β−ガラクトシダーゼの阻害を検出することができ
る。あるいは、ＫＢ４のアリコートを５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンおよび示したノウカーダミン濃度を含有
する培地に移す。β−ガラクトシダーゼの顕著な減少
は、成長速度の減少と平行に、観察される（図示せ
ず）。これらの応答の両者は、ノウカーダミンが流出ポ
ンプによるテトラサイクリンの流出を妨害することを示
す。

【図１３】テトラサイクリン感受性および耐性の細胞の
成長へのノウカーダミンの作用を示す。細胞を、このテ
キストに記載するように、テトラサイクリンを欠如する
培地の中で成長させ、次いでアリコートをテトラサイク
リンを含有しないか、あるいは特定の菌株について阻害
以下の濃度を含有する培地に添加する。ノウカーダミン
（μｇ／ｍｌ）は、示すように、存在するか、あるいは
存在しない。菌株ＫＢ３ｉｎｄ、テトラサイクリン感受
性菌株について、阻害以下の濃度のテトラサイクリンは
０．５μｇ／ｍｌである。ＫＢ３ｉｎｄのＴｎ１０誘導
体について、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンは阻害
以下のレベルである。菌株ＫＢ４、中程度にテトラサイ
クリン耐性の有機体について、５μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンは阻害以下の濃度である。ノウカーダミンは、
テトラサイクリンが存在しないとき、作用をほとんども
たないが、ノウカーダミンはテトラサイクリン耐性菌株
についてテトラサイクリンと組み合わせて重大な成長の
阻害を示す。しかしながら、ノウカーダミンは、テトラ
サイクリンとともに、テトラサイクリン感受性菌株の成
長に影響を与え、ノウカーダミンが細胞の中へのテトラ
サイクリンの吸収を増加することができるであろう可能
性を残す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゴードン・ジエラルド・グアイ アメリカ合衆国マサチユセツツ州01720ア クトン・アパートメントエイ・メインスト リート167

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 テトラサイクリンの不存在下に、次の特
   性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
   ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、 （ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、および （ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
   る、を有する微生物を、試験すべき試料および、インジ
   ケーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシグナル
   生成する試薬と接触させ、そして検出可能なシグナルの
   存在または不存在を観測し、これにより試料の中のテト
   ラサイクリン様活性の存在または不存在を示す、ことか
   らなる、試験試料の中のテトラサイクリン様化合物を検
   出する方法。
2. 【請求項２】 次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
   ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、 （ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、 （ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
   る、および （ｄ）３７℃において成長することができる、を有する
   微生物。
3. 【請求項３】 次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
   ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、 （ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、 （ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
   る、および （ｄ）テトラサイクリン流出ポンプをエンコードする遺
   伝子、を有する微生物。
4. 【請求項４】 阻害以下であるが誘発レベルのテトラサ
   イクリンの存在下に、次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
   ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、 （ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、 （ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
   る、および （ｄ）テトラサイクリン流出ポンプをエンコードする遺
   伝子、を有する微生物を、試験すべき試料および、イン
   ジケーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシグナ
   ル生成する試薬と接触させ、そして検出可能なシグナル
   の存在または不存在を観測し、これにより試料の中のテ
   トラサイクリン流出ポンプの阻害因子の存在または不存
   在を示す、ことからなる、試験試料の中のテトラサイク
   リン流出ポンプの阻害因子を検出する方法。
5. 【請求項５】 非阻害および誘発以下のレベルのテトラ
   サイクリンの存在下に、次の特性： （ａ）単一のまたは低いコピー数の遺伝子として、ｔｅ
   ｔＡプロモーターに融合したインジケーター遺伝子、 （ｂ）低いレベルで発現されるｔｅｔＲ遺伝子、 （ｃ）ＤＮＡ損傷因子により誘発に対して無反応性であ
   る、および （ｄ）テトラサイクリン流出ポンプをエンコードする遺
   伝子、を有する微生物を、試験すべき試料および、イン
   ジケーター遺伝子が発現されるとき、検出可能なシグナ
   ル生成する試薬と接触させ、そして検出可能なシグナル
   の存在または不存在を観測し、これにより試料の中のテ
   トラサイクリン流出ポンプの阻害因子の存在または不存
   在を示す、ことからなる、試験試料の中のテトラサイク
   リン流出ポンプの阻害因子を検出する方法。
6. 【請求項６】 有効量のテトラサイクリンまたはテトラ
   サイクリン様化合物とテトラサイクリン流出ポンプの作
   用を阻害することができる化合物との組み合わせからな
   る製剤学的組成物。