KR100245831B1

KR100245831B1 - 테트라사이클린유출펌프저해체의검출방법

Info

Publication number: KR100245831B1
Application number: KR1019920023449A
Authority: KR
Inventors: 데이빗마이클로스스타인; 고오든제랄드거이
Original assignee: 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그; 아메리칸사이아나미드컴파니
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-05
Publication date: 2000-04-01
Also published as: AU670551B2; EP0547403A1; NO304489B1; TW318189B; AU2989692A; JP3329395B2; NO924705L; JPH05317093A; NO924705D0; CA2084404A1; US5789188A

Abstract

tetA가 tetR전자에 의해 암호된 tet 저해체의 조절하에 있는 동안 리포터 유전자(lacZ)의 전사의 존재하에 테트라사이클린 유출 펌프 저해체를 검출하는 방법이 공개된다. 그 방법은 tetA 프로모터가 리포터 유전자 (lacZ)를 전사시키는 리포터 유전자 시스템 및 tetA 유전자에의해 암호된 비교적 아주 적당한 수준의 유출 단백질이 구성적 방식으로 생산되는, 즉 tetR 유전자에 의해 코딩된 저해체의 조절하에 있지 않는, 활성 유출 시스템을 갖는 셀을 사용한다. TetA 유출 단백질의 저해체인 시험 샘플은 셀내 테트라사이클린이 tetA -lacZ전사 융합의 발현을 유발하여 가능한 신호를 제공하는 수준으로 축적되게 한다. DNA 손상제에의한 유발에 저항성이 있으며 (1) 단일 복사수의 유전자 또는 낮은 복사수의 유전자로서 tetA 프로모터에 융합된 지시 유전자 (2)낮은 수준으로 발현되는, 바람직하게는 10ng 이하의 테트라사일클린에 대해 감수성을 가능케하는 수준으로 발현되는 tetR 유전자, 및 (3) 테트라사이클린 유출 펌프를 암호하는 구성 유전자를 포함하는 미생물이 또한 공개된다.

Description

테트라사이클린 유출펌프 저해체의 검출방법.

제1도.

패널 A : 양친 플라스미드( pCB258) 와 네개의 유도체 pCBSal, pGG57, pGG71 및 pGG75의 개략도이다.

패널 B : Tn 10, pCBSal, pGG57 및 pGG71을 비교한다.

제2도 : tet K 출발코돈 부근의 부위조작 돌연변이 유발.

제3a도 : 이, 콜리( E. Coli) 군주 MC1061 에서 플라스미드 pCBSal, pGG57, pGG75 및 pGG71 에 의해 주어지는 테트라사이클린 내성분포.

제3b도 : 둘다 tetK 및 동일한 조절인자를 가지나 플라스미드 복제영역에 다른 pGG57 또는 pGG76 을 가진 이. 콜리 MC1061의 테트라사이클린 내성분포.

제4도 : 기재된 플라스미드는 pGG57 의 유도체이다.

제5도 : 테트라사이클린을 검출하기 위한 평판 검정법의 결과를 나타낸다.

제6도 : 테트라사이클린을 검출하기 위한 액체 검정법을 나타낸다.

제7도 : 액체 배양으로 테트라사이클린 감수성 및 내성균주의 유발을 나타낸다.

제8도 : 활성제가 배양중에 존재할 때 여러가지 검정법의 절차를 나타낸다.

제9도 : 테트라사이클린 유출펌프의 저해체의 관한 액체검정법의 결과를 나타낸다.

제10도 : 테트라사이클린 감수성 및 내성세포의 증식에 미치는 노카르다민의 효과를 나타낸다.

본 발명은 시험시료에서 테트라사이클린류 또는 테트라사이클린 유출펌프 저해체의 검출에 유용한 미생물 및 검정법에 관한 것이다.

단백질 생산을 위해 외래유전자를 발현하는 미생물, 특히, 이, 콜리의 사용은 수년동안 평범한 것이었다. 대부분의 경우에, 미생물을 사용하는 목적은 상업 목적을 위해 대량의 단백질 생산을 가능케하는 것이므로, 단백질을 가능한 최고 수준으로 발현하는 것이 보통 바람직하다. 이런 이유로, 거기에서 사용되는 대부분의 발현시스템 및 DNA 구조물은 고도의 발현을 위해 특정하게 개조된다. 그러나, 저 내지 중간수준의 발현이 실제로 보다 바람직하거나, 필수적이기까지한 상황이 있다. 예컨대, 몇몇 유전자의 과잉발현은 치명적이다. 또한, 미생물이 특별한 유전자 생성물에 대한 약품의 작용을 검출하기 위한 선별용기재로서 사용되는 경우에, 낮은 수준의 단백질 발현은 증진된 감수성을 제공한다. 그러나, 발현 수준을 미세조정하는 것은 일상적인 일이 아니다.

예로서, 테트라사이클린 내성을 극복하는 약품을 선별하기에 적당한 미생물을 개발하기 위하여 테트라사이클린 내성을 암호하는 유전자의 저 내지 중간 수준의 발현을 성취하는 것이 바람직하다.

대부분의 미생물에서 이 내성은 에너지 의존성 유출시스템의 결과이다(1). 이들 유출펌프는 갖가지의 그림-음성 및 그림-양성 세균 둘다에서 분석되었고, 전부 다중막 걸침분역을 갖는 유사한 2차구조를 나타냈다. 그럼에도 불고하고, 이,콜리의 트랜스포슨 Tn10 으로부터의 tetA 유전자에 의해 암호되는 바와 같은 가장 흔한 그림-음성펌프와, 그림-양성 스타필로코쿠스아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 tetK 유전자의 아미노산 서열에 관한 비교는 거의 동일성을 보이지 않는다(2). 그러나, 이들 두 펌프튼 유사한 기능을 수행하므로, 이 시스템에서 유전자 조각 및 생화학적 연구를 수행하는데 용이성을 주는, 이, 콜리 숙주에서 에스. 아우레우스의 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 tetK 유전자에 관한 연구를 수행하는 것이 유용할 것이다. 또한, 동일유전자 균주의 사용은 두개의 유출펌프의 보다 나은 비교를 가능케 한다.

그러나, tetA 또는 tetK 유전자가 표준 강력발현벡터내로 클로닝되면 문제가 있다. 트랜스포슨 Tn10 으로부터의 tetA 유전자의 과잉 발현은, 예컨대, 이 유전자가 다중복사 플라스미드에서 유발되면, 이, 콜리에게 치명적이다(3,4). 그림-음성 세균에서, 펌프의 조절은 tetA 및 tetR 을 위한 보통의 조절영역에 인접하여 위치한 tetR 유전자 생산물인, 억제체의 의해서 조정된다(5,6).

그러므로, tetK 같이, 유출펌프를 암호하는 다른 유전자의 발현이 성취될 수 있다고 가정하면, 최대 발현이 또한 이, 콜리에게 치명적일 것도 가능하다.

tetA 유전자의 조절된 발현을 가능케하기 위해 Tn10 시스템을 개조하는 시도가 이루어졌다. 엑케르트 및 벡크(7)는 최근에 클로닝하고, 조절된 유발성 발현시스템을 사용하여, tetR 부재 하에서 다중복사를 플라스미드 상에서 트랜스포슨 Tn10 으로부터의 tetA 를 발현시켰다. tetA 가 최대로 유발될때 이 시스템에서, 세포는 아마도 양자 원동력의 소산 때문에 다시 사멸한다(7).

세균에서 나오는 테트라사이클린의 능동 유출은 양자의 세포로의 유입에 의해서 에너지를 받지만, 최대 유발은 분명히 세균의 생존에 필수적인 양자 변화도의 손실을 초래한다. 엑케르트와 벡크 시스템에서, tetA 유전자는 다중복사 플라스미드 pCB258 상에서 강력한 tac 프로모터 및 lacI 유전자(유당 억제체를 암호함)를 가진 조절영역 및 lac 작동유전자 부위를 사용하여 전사수준에서 조절된다.

tetA 유전자의 발현은 여러가지 농도의 이소프로필-β-D-리오갈락토피란노시드(IPTG)를 사용하여 조절할 수 있다.

불행하게도, 엑케르트와 벡크 시스템은 테트라사이클린 유출펌프의 저해체를 검출하기 위한 최적의 선별 생물을 만드는 목적에는 부적합하다. 우선, 플라스미드 pCB258 의 제한분석은, tet 조절영역의 2개의 tetR 작동유전자 부위가 tetA 암호영역에 인접하여 플라스미드에 있음에 나타낸다. 따라서, tetA 유전자는, 두개의 억제체가 세포에 존재하면 테트라사이클린 억제체뿐 아니라 lac 억제체 둘다에 의해서 조절된다. 두 억제체의 존재는 선별생물로서 사용하기 위해 고안된 발현시스템에서 해로운 결과를 일으킨다. 따라서, pCB258 은 tetA 유전자의 비교적 약화된 발현을 가능케하면, 테트라사이클린 내성수준은 그럼에도 불구하고 펌프 저해체를 선별하는데 사용하기에는 너무 높다. 더욱이, tet K 같은 대체 유전자의 삽입을 가능케하는 적당한 영역내에 편리한 제한 부위가 없다.

이들 어려움을 극복하기 위해서, 본 발명은 저 내지 중간수지의 테트라시아클린 내성을 결과시키는 DAN 구조물, 벡터 및 이, 콜리 숙주세포를 제공한다. 상기 재료는 테트라사이클린 내성 저해체에 관한 선별 검정법의 생성에서 특히 유용하다.

제1도.

패널 A. 플라스미드 pCBSal 및 pCB258 은 이, 콜리의 트랜스포슨 Tn10 으로부터의 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 tet A 유전자를 가진다. pCBSal 또는 pCB258 에 존재하는 tetA 를 위한 전사 출발점 주위에서 발견되는 제한부위가 나타난낟. 플라스미드 pCBsal은 pCB258 에 위치한 테트라사이클린 억제체 작동유전자 부위의 결실되고, 부가적인 2개의 제한부위( SalI 및 XholI )를 가진다. 플라스미드 pGG57 및 pGG71 은 각각 GG1 및 GG2 라 칭하는 2.0kb SaII/HindIII 단편이 분리된 M13 박테리오파아지에 존재하는, 스타필로코쿠스 아우레우스로부터 유래된 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 tetK 유전자를 가진다.

GG1 및 GG2 는 둘다 M13 박테리오파지 MC71 의 올리고뉴클레오티드-중재부위 조작 돌연변이 유발에 의해서 생성된다. pGG75는 pBR322 로부터 유래된 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 tetC 유전자를 가지며, Sal I 제한부위는 폴리머라제 사슬반응을 사용하여 tetC 의 ATG 의 5' 으로 도입된다.

고도의 테트라사이클린 내성으로 조절된 tetC 의 발현의 tetC 암호영역 바깥에 있는, DHA 서열분석에 의해서 나타난 특성결정안된 조절돌연변이물을 포함한다. lacI 유전자는 IPTG 를 사용하여 tac 프로모터의 조절하에 있는 유전자의 발현을 조절하는 lac 억제체를 암호한다.

패널 B. 상부의 DNA 서열(SEQ ID NO : 1)은 테트라사이클린 억제체를 암호하는 tetR 과, 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 tetK 사이의 트랜스포슨 Tn10(SEQ ID NO : 1)으로부터 온다. Tn10 에서 발견된 2개의 작동유전자 부위는 밑줄쳐있고 BamHI 재한부위의 위치는 제한 분석으로부터 2개의 작동유전자 부위사이에 존재하는 것으로 추론된다.

pCBSal(SEQ ID NO : 2)은 2개의 유일한 제한부위를 갖지만, 이들 변화가 아미노산 수준에서 tetA 암호된 단백질의 변경을 초래하지는 않는다.

2개의 tetK 구조물 간의 유일한 차이는 번역의 출발점이다.

플라스미드 pGG71(SEQ ID NO : 4)은 TTG 출발코돈(밑줄침)을 가지는 한편 플라스미드 pGG57(SEQ ID NO : 3)은 ATC 출발코돈(밑줄침)을 갖는다. 각 구조물에 관한 모든 출발코돈은 화살표로 나타낸다.

제2도. 올리고뉴클레오티드-중재 부위조작 돌연변이유발을 사용하여 변경시킨 박테이오파아지 MC71 에서 tetK 출발코돈 부근의 DNA 영역이 나타나 있다(SEQ ID NO : 5) 올리고뉴클레오티드-중재 부위조작 돌연변이 유발은(1) 돌연변이를 일으키기 원하는 단일가닥 DNA 주형 및 (2) DNA 단편내로 도입하기 원하는 바람직한 변화를 그내에 갖는 짧은(20-40bp) 상보 올리고뉴클레오티드를 필요로한다. 올리고뉴클레오티를 상보 단일가닥 주형에 아닐링되게 한다. 일단 아닐링되면, 올리고뉴클레오티티드의 3' OH 기는, 첨가되어 이중 가닥 생산물의 생산을 결과시키는 DNA 폴리머타제를 위한 프라이머로서 기여한다. 이제 2 가닥중 하나는 올리고뉴클레오티드 프라이먼에 의해 도입된 변경을 갖는다.

이 기술은 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 프라이머(PT1813(SEQ ID NO : 6) 및 PT1814(SEQ ID NO : 7 )에 의해 사용된다. 본래의 tetK 출발부위에 또는 부근의 DNA 서열에서의 변화가 나타나 있다. 이들 올리고 뉴클레오티드-중재 부위조작 돌연변이유발 반응은 둘다 이들 구조물을 PCBSal로 도입하기 위한 편리한 수단을 가능케하는 tetK 의 5' 쪽에 SalI 부위의 생성을 결과시켰다. SalI 부위뿐 아니라, pGG57(SEQ ID NO : 6)은 ATG 출발부위를 가진 tetK 를가지며 pGG71(SEQ ID NO : 7)은 TTG 출발부위를 가진 tetK 를 가진다. 이들 변화에는 tetK 구조물 둘다 DNA 수준에서 동일하다.

제3a도, 세포를 루리아 육즙 액체배지에서 증식시키고, 0.85% 염수로 계단 희석하고, 증가농도의 IPTG 존재하에 증가농도의 테트라사이클린을 함유하는 한천평판위에 도말한다. 평판을 37℃에서 16시간동안 배양했다. 집락 형성단위의 적어도 90% 손실(LD₉₀)을 초래하는 테트라사이클린의 농도가 표시된다.

제3b도. 이들 분포를 얻기 위해 사용되는 방법은 범례 제3a도에서 설명한 원안과 동일하다.

제4도. 플라스미드 pGG76은 lacI 및 tetK 를 가진 pGG57의 pACYC184 유도체이다. 플라스미드 pGG77 및 pGG84는 tetK 암호영역내의 DNA 서열이 결실된다.

제5도. 이 실험에서 표시한 테트라사이클린 양을 함유하는 10ul 점적을 분포에서 설명되는 바와 같이 증식된 세포론에 적용하고, 3시간 배양후 색소생성 기질을 적용한다. 각 점적 내의 테트라사이클린 양이 표시된다. 테르라사이클린 300pg 은 언제나 검출될 수 있다. 보다 많은 양의 테트라사이클린이 적용될때, 유발 환에 의해 둘러싸인 증식억제 지대가 관찰될 수 있다.

제6도. 시료는 본문에서 설명하는 바와 같이 세포의 부분표본에 첨가하고, 유발은 β-갈락토시다제 검정범은 수행함으로써 숫적으로 측정한다.

밀러단위(10)의 β-갈락토시다제 비활성은 세포가 표시된 농도의 테트라사이클린 존재 하에 4세대 동안 증식할때 나타낸다. 테트라사이클린 5-10ng/ml 의 존재가 일상적으로 최대유발에 충분하다.

제7도. 세포를 제7도에서 설명한 바와 같이 표시된 최종농도로 테트라사이클린에 첨가한다. 감수성 균주는 테트라사이클린 선별 생물 KB3ind 이고, 이는 테트라사이클린 5-10ng/ml 존재하에서 증식될 때 최대로 유발한다. 대조적으로, 강력한 테트라사이클린 내성을 주는 Tn10 인자를 가진 균주는 테트라사이클린 농도가 10ug/ml 이상일 때 최대 유발한다. 테트라사이클린 유출펌프의 낮은 구성발현때문에 중간정도의 테트라사이클린 내성 생물인 균주 KB4 는 테트라사이클린 5ng/ml 존재 하에서 낮은 바탕의 유발을 나타내나, 테트라사이클린 30ng/ml 가 존재할 때 최대유발이 존재한다.

제8도. 발효육즘으로부터의 추출물은 용매 추출 및 C18, 역상 컬럼 크로마토그래피에 의해서 조제된다. 발효육즙 10배 농축물을 본문에서 설명되는 바의 테트라사이클린 검정 평판(제8a도), 억제 검정 평판(제8b도) 및 상승작용 평판(제8c도)에 적용한다. 테트라사이클린 유출 펌프에 반대로 작용하는 화합물을 상승작용 검정에서 균주 KB4 의 증식억제( 테트라사이클린 5ug/ml 존재 하에서 증식), 억제 검정에서 균주 KB4 의 β-갈락토시다제의 유발(테트라사이클린 5ng/ml 존재 하에서 증식)을 일으키나, 테트라사이클린 검정에서 균주 KB3ind 의 유발을 일으키지 않을 것으로 예측된다. 2개의 독립 시료를 제조하고, 10배 농축물, 3배 농축물, 및 농축안된 시료를 10 ul 시료를 표시한 각 평판에 적용하고 3시간동안 배양한다. 유발 또는 증식억제는 색소생성 덧바르기 후에 관찰된다. 제제내 활성성분은 억제검정에서만 유발을 일으키고, 상승작용 검정에서는 차별적인 증식 억제를 일으킨다.

활성성분은 분리되어 시데로포 어인 노카르다민인 것으로 결정된다. 또한 다른 별개의 시데로포오가 이 동일한 활성을 보인다.

제9도. 억제활성은 균주 KB4 를 테트라사이클린 결핍 배지에서 증식시켜 액체 배양으로 검정한 다음 유출펌프의 작용 때문에 유발 이하의 테트라사이클린 수준인 테트라사이클린 5ng/ml 를 함유하는 배지로 옮긴다. 또한 노카르다민을 비활성은 밀러단위(10)로 결정한다. 노카르다민이 5ug/ml 이상으로 존재할 때 β-갈락토시다제의 현저한 감소가 관찰된다. 이들 두 반응은 노카르다민이 유출펌프에 의한 테트라사이클린의 유출을 방해함을 나타낸다.

제10도. 세포를 본문에서 설명되는 바와 같은 테트라사이클린 결핍 LB 배지에서 증식시킨 다음 부분표본을 테트라사이클린을 함유하지 않거나, 또는 특별한 균주를 위하여 억제 이하 농도를 함유하는 배지로 첨가한다. 노카르다민( ug/ml )은 표시한 바와 같이 존재하거나 존재하지 않는다. 테트라사이클린 감수성 균주인, 균주 KB3ind 의 경우, 테트라사이클린의 억제 이하농도는 0.5 ug/ml 이다. 균주 KB3ind 의 Tn 10 유도체의 경우, 테트라사이클린 20 ug/ml 가 억제이하 수준이다. 중간정도의 테트라사이클린 내성 생물인 균주 KB4 의 경우, 테트라사이클린 5ug/ml 가 억제이하 농도이다. 노카르다민은 테트라사이클린 내성균주에 대해 테트라사이클린과 함께 심한 증식억제를 일으키는 반면, 테트라사이클린이 없을때 노카르다민은 거의 효과가 없다. 그러나, 테트라사이클린과 함께 노카르다민은 또한 테트라사이클린-감수성 균주의 증식에 영향을 미쳐, 노카르다민이 테트라사이클린의 세포내의 흡수를 증가시킬 수 있다는 가능성을 보인다.

본 발명은 테트라사이클린은 관련 검정법에서 사용하기위해 한층 특정하게 개조된, 테트라사이클린에 의한 유발에 대해 감수성이 미생물에 제공한다. 미생물은 검정에 적절한 온도인 37℃에서 증식을 가능케하고, 테트라사이클린의 존재에 관한 검정에서 거짓 양성을 일으킬 수 있는 DNA 손상제에 의한 유발에 대해 감수성이 아니도록 변경된다. 적절한 구체예어서, 미생물은 테트라사이클린에 대해 매우 낮은 수준의 내성을 갖도록 변경된다. 상기 미생물은 소량의 펌프 저해체에 대해서도 매우 감수성이므로 테트라사이클린 유추펌프 저해체의 검출에 관한 검정에서 사용하기에 특히 적절하도록 개조된다. 바람직하게는, 미생물 이, 콜리 이다.

미생물은 테트라사이클린 유사활성을 갖는 화합물의 검출(테트라사이클린 검정)에 관해서 및 펌프 억제 화합물의 검출에 관한 신규의 검정을 위한 기초를 제공한다. 테트라사이클린 유사화합물의 검출을 위한 검정방법은 다음 특성을 갖는 미생물을 이용한다 :

(a) 단일 도는 낮은 복사수의 유전자로서, tetA 프로모터에 융합된 지시유전자; (b) 낮은 수준으로 발현되는 tetR 프로모터; (c)는 DNA 손상제에 의한 유발에 대해 저항성이 있다.

적절한 구체예에서, 미생물은 또한 (d) 37℃에서 증식할 수 있다. 미생물은 테트라사이클린을 함유하지 않는 배지에서 배양되고 테트라사이크린 유사화합물의 존재에 관해 시험될 시료와 접촉된다. 또한 배양물은 미생물의 지시유전자가 발현될 때 검출가능한 신호를 생기에 할 수 있는 시약과 접촉시킨다. 이 시약은 배양배지에 존재할 수 있거나, 사용되는 특별한 시스템에 따라서, 후에 첨가될 수 있다. 배양물이 검출가능한 신호의 존재 또는 부재에 관해 관찰되어, 시험시료에서 테트라사이클린 유사 활성의 존재 또는 부재를 나타낸다.

TN10 의 tetA 유전자는 세포가 테트라사이클린을 만날때만 발현하기 때문에, tetA 프로모터로 부터의 발현은 테트라사이클린의 좋은 지시자이다.

검출의 용이성 및 감수성을 위해, 적절한 구체예에서, β-갈락토시다제를 암호하는 lac Z 구조유전자에 인접하여 tetA 로 부터의 전사신호( 프로모터 및 작동유전자 부위)를 갖는 유전자 융합물이 사용된다. 특히 적절한 구체예에서, 다음 인자는 검정의 감수성 및 특이성에 기여한다 : (1) tetA 조절영역의 lac Z 구조유전자의 융합은 박테리오파아지 λ 내에서 단일 복사이며, (2) tet R 유전자는 플라스미드 상의 bla 유전자에 대해 반대 방향으로 통합되어, 낮은 수준의 억제체를 결과하며, (3) λ clind 대립 유전자는 37℃ 에서 증식을 가능케하나 DNA 손상제에 의한 유발을 막고, (4) 검정의 시간적 조절 및 감수성 색소생성 시약(6-브로모-2-나프틸-β-갈락토피라노시드 및 패스트 블루 RR) 은 검출가능한 신호의 존재에 의해서 표시된다.

테트라사이클린 유출펌프 저해체 검출을 위한 두가지 방법이 또한 제공된다. 상승작용 검정은 테트라사이클린 존재 하에서 유출펌프를 억제할 수 있는 화합물을 검출한다. 이 검정에서, 사용된 미생물은 다음 특성을 가진다 : (a) 단일 또는 저복사수 유전자로서 tet A 프로모터로 융합된 지시유전자, (b) 낮은 수준으로 발현되는 tet R 유전자; (c) DNA 손상제에 의하 유발에 대해 저항성이 있고; (d) 테트라사이클린에 대해 낮은 수준의 내성을 주는 테트라사이클린 유출펌프 유전자. 바람직하게는 미생물이 37℃ 에서 증식할 수 있다. 미생물은 억제이하이나 유발수준의 테트라사이클린을 함유하는 배지에서 증식시키고, 유출 펌프 저해체의 존재에 관해 시험될 시료와 접촉시킨다. 또한 배양물은 지시유전자가 배양배지에서 또는 이후의 첨가에 의해서 발현될 때 검출가능한 신호를 생기게할 수 있는 시약과 접촉시킨다. 검출가능한 신호의 존재 또는 부재를 관찰하여, 펌프 저해체의 존재 또는 부재를 나타낸다. 이 검정에서 신호의 부재는 증식억제를 나타내므로, 시험 시료내에 유용한 저해화합물의 존재를 나타낸다.

교대의 검정인 억제 감정에서, 상승작용 검정에 관해 전술한 바와같은 미생물이 비억제 및 유발이하 수준의 테트라사이클린 및, 지시유전자가 발현될때 검출가능한 신호를 생기게 하는 화합물을 함유하는 배지에서 증식되고, 미생물은 시험시료와 접촉시켜 배지에서 검출가능한 신호의 존재 및 부재가 관찰된다. 이 검정은 유발, 즉 시험 시료와의 접촉 전에, 단지 유발이하 수준의 테트라사이클린을 함유한 배지에서 검출가능한 신호의 존재를 관찰함으로써 테트라사이클린 유출펌프의 저해체를 확인한다.

다음 용어는 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐서 사용된다 :

tetA 는 트랜스포슨 Tn 10 내의 테트라사이클린 내성을 주는 유전자를 언급하는데 사용되고, tetK는 스타필로코쿠스 아우레우스 에서 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 유전자를 말하고, tet C 는 플라스미드 pB322 로부터의 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 유전자를 말한다.

본 선별 검정을 개발하는데 유용한 DNA 구조를 및 발현벡터 및 미생물은 본원의 참고문헌으로 병합된 미합중국 제5,384,259호에서 공개된다. 청구된 DNA 서열은 원래 테트라사이클린 내성을 초해하는 트랜스포슨 Tn10 (tetA 유전자)으로 부터 테트라사이클린 펌프를 암호화하는 플라스미드 pCB258 유전자 내에서 발견되 BamHI - NcoI 단편의 변형에 의해 얻어진다. tetA 조절을 유발할 수 있는 발현 시스템은, 상기된 바와같이, 엑케르트 (Eokert ) 및 벡크 (Beok)(7)에 의해 공개되었다.

그러나, 이 시스템은 잠재적으로 테트라사이클린 펌프 유전자의 발현을 허용할 수 없을 수 있다. 부가적으로, 그것은 tetA와 다른 유전자를 클로닝하는데 편리한 제한 부위가 없고, 테트라사이클린 펌프 저해체를 검출하는데 사용될 미생물에 사용이 부적합한 억제체 결합 부위를 가진다. 그러므로, 플라스미드, 특히 tet A 유전저의 암호영역 및 조절 영역의 부분을 갖는 BamHI - Ncol 단편은, 결과 클로닝된 유전자의 발현 수준을 낮게할 뿐만 아니라, 그 플라스미드내로 다른 유전자의 클로닝을 가능케하는 서열을 제공하기 위해 연구된다.

트랜스포슨 Tn 10 의, 조절 영역 부분을 포함하는 tetA 유전자의 개략도는 제1도에 제공된다. 일반적으로 장내세균에서의 테트라사이클린 내성은, 두개 유전자의 작용을 통하여, 트랜스포슨 Tn 10 에 의해 조정된다. 간단히, 펌프 유전자 tet A 의 발현은 tet R 유전자 생성물인 억제체에 의해 조절되며, 두개의 tet R 억제체 결합 부위는 tetA 암호영역의 약간 상류에 위치한다. 엑케르트 및 벡크의 플라스미드 pCB258 은, tac 프로모터 뒤에 Tn 10 tet A 유전자를 클리닝함으로써 tet A 유전자의 조절 발현을 얻을 수 있도록 조작되었다.

이 시스템에서 발현은 동일 플라스미드 상에 암호된 lac 저해체의 조절하에 있다. 엑케르트 및 벡크는, 제한 분석이 tetA 암호영역 가장 가까이에 하나의 결합 부위가 있음을 나타내지만, 어느정도, 있다하더라도 tet R 억제제 결합부위 중 어느쪽이 재조합 플라스미드 상에 존재하는 지는 억케르트 및 백크에 의해 나타나지 않았다.

에스ㆍ아우레우스 tet K 의 발현을 이루기 위한 시도로, pCB258 플라스미드는 편리한 출발점을 제공한다; 특히, 벡터의 Bam HI 및 NcoI 부위 사이의 영역에 관심이 집중된다. 이 영역의 서열의 세부사항은 제1b도에 밝혀진다. 조사는 tet K 유전자가 클로닝될 수 있는 알맞은 제한 부위가 없음을 나타낸다. 이 문제점을 극복하기 위해, 교잡되어 원하는 변형물을 가진 DNA 단편을 형성 할 수 있는 한쌍의 올리고머가 합성되며, 벡터의 BamHI 및 NcoI 부위로 클로닝하기 위한 BamHI 및 NcoI 점착 말단을 가진다. 한가닥을 제1b도에 도래한다("pCBSal"으로 라벨됨). 벡터내이 단편의 치환은 두개의 유일한 제한 부위, 개시 코돈 상류 및 인접한 Sa1I 부위, 및 tetA 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는, 암호 영역내 XhoI 부위의 도입을 결과시킨다. Sal I 부위를 포함하는 변화는 예상밖의 결과를 갖는다.

이 벡터를 사용하여 이. 콜리에서 tet A 를 발현시킬 때, tet A 유전자의 발현을 유발하기 위해서 양친 벡터에 의해 요구되는 것보다 높은 농도의 IPTG 가 요구된다. 이것은 상기 변화가 tetA 리보즘 결합부위["리보즘 결합부위"는 골드 및 스트오모(22)에 의해 정의된 바와같이 넓은 의미로 해석됨]의 강도를 변경시킴을 시사한다.

그런다음 이 구조물을 사용하여 이, 콜리에서 에스, 아우레우스 의 tet K 유전자 발현을 시도하였다. 변형되지 않은 tetK 유전자는, 이, 콜리에 존재할때, 내성을 부여하지 않으므로 어떤 변경이 요구된다. 이, 콜리 발현을 성취하기 위해, 박테리오파아지 M13 에서, tetK 유전자를 클리닝 목적을 위해 출발 부위에 5' 쪽으로 바로 접한 Sal I 부위를 갖도록 변형된다. 부가적으로, 이 콜리 에서의 발현을 용이하게 하기 위해, 정상 tetK TTG 출발부위를 ATG 로 돌연변이시킨다. 그런다음 결과변형된 tetK 유전자를 pCBSal 벡터내로 관찰한다.

플라스미드 구조물을 사용하여 tetK 발현을 위해 이, 콜리를 형질전환시킨다. 이, 콜리 ATG 출발 부위의 존재에 의해 비교평가된, 발현 시스템에서 명백히 약화된 리보솜 결합 부위의 효과는, 유발 물질의 부재하에 단지 25ug/ml 의 테트라사이클린에 대해 내성을 수여하므로, 예스, 아우레우스 tetK 유전자 생성물을 낮은 수준으로 생산하는 균주를 결과시킨다.

pCBSal 유형의 구조물을 가진 플라스미드를 갖는 균주는 낮은 수준의 유전자를 발현하지만, tet 유전자 앞의 강력한 tac 프로모터를 제거함으로써 더욱 더 발현 수준을 감소시키는것이 가능하다. 양친 pCB258 및 플라스미드 pCBSal 둘다에서, 발현은 이 프로모터에 의해 조절된다. 그러나, 실질적인 발현은 유발물질의 부재하에서도, pCB258 로부터, 및 pCBSal 로 부터 더욱 작은 정도로 일어난다. 관심사가 되는 유전자 및 그것의 전사출발 신호가 아닌 리보솜 결합부위(즉, SD 및 ATG)를 다른 플라스미드에 클로닝함으로써 발현을 더욱 감소시킬 수 있다. 새로운 플라스미드에서의 위치는 바람직하게 활발히 전사되는 유전자 내가 아니다. 상기 유전자 및 그의 리보솜 결합부위를 가진 삽입물은, 예컨대 벡터 및 삽입물이 동일한 효소에 의해 절단되면 알려진 방법에 의해서 플라스미드 내의 특별한 위치에서 어느 방향으로든 클로닝될 수 있다.

선별 미생물을 개발하여 테트라사이클린 펌프 저해체를 검출하는 정황에 있어서, 이 유형의 균주는 이상적이다. 테트라사이클린 유출펌프를 갖는 다른 생물, 예를들면 트랜스포슨 Tn 10 을 갖고 있는 균주는 선별생물로서 많은 단점을 갖는다.

Tn 10은 테트라사이클린에 대해 높은 수준의 내성을 수여하고, 그 결과, 신호가 최대로 테트라사이클린 내성 균주에서 검출될 수 있기 전에 억제하는 비교적 많은 펌프가 있다. 또한, Tn 10 의 tet A 유전자는 조절되고, 유출 펌프의 억제는 테트라사이클린의 세포내 증가된 수준에 대한 반응으로서, 새로운 유출 펌프의 증가된 합성을 결과시킬 것이므로, 저해체의 효과는 최대 테트라사이클린 내성 균주에 의해 최소화 될 것이다. 또한 트랜스포슨 Tn 10 은 tetA 유전자 뿐만 아니라, 억제체 유전자 tetR 에도 기여하고, 억제체 발현 증가는 감수성 감소를 야기할 수 있다(9).

발현이 어느 정도 조절될 있는 그러한 방식으로 변형되었던, 엑케르트 및 벡크 플라스미드인, pCB258 조차도 여전히 그것의 단점을 갖는다.

낮고 구성적 수준의 tetA 발현은 테트라사이클린 유출펌프의 저해체를 검출하기위한 선별 생물의 위해 최적이고, 엑케르트 및 벡크 시스템은 몇가지 이유로 이상적으로 적합하지 않다.

첫째로, pCB258 을 갖는 균주에서 tetA 발현 수준은, 펌프 저해체에 관한 선별에 최적 사용을 위해 여전히 너무 높다( 40 ug/ml 에 대해 내성을 수여 함; MIC =50 ug/ml, IPTG 부재하에서). 두번째로, 플라스미드 pCB258 에서의 tetA 발현을 유도하는 유당은, 선별될 발효 육즙 내에 존재할 수 있어, 선별을 방해한다. 더욱이, 플라스미드 pCB258 의 제한 분석은, tet 조절 영역의 두개의 작동유전자 결합 부위 중 하나는 플라스미드 pCB258 에 존재함을 나타낸다. tet 조절 인자를 이용하므로 tetR 유전자를 갖는 선별 생물에 있어서, 낮은, 구성적 수준의 tetA 발현을 이룰 수 없었다. 최종적으로, tetK와 같은 교체 유전자의 삽입을 가능케하는 적당한 영역내의 편리한 제한부위가 없다.

특정한 pCBSal 서열내에서의 몇몇 변형은 상기 서열의 유용한 특성에 미치는 전체적인 효과를 변경시키지 않고 수행될 수 있음이 자명할 것이다. 예를 들면, SalI 부위를 다른 유용한 제한 부위로 치환할 수 있음이 숙고된다. 발현될 유전자 및 원하는 발현 수준에 따라, 대체 프로모터, 예를 들면, 이. 콜리 trp. 또는 λPL ara 도 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 하기 실시예에 재시될 바와 같이, 관련되지 않은 플라스미드 상에서 쉽게 발현될 수 있으므로, 본 발명은 특별한 플라스미드의 사용에 제한되지 않고, 다른 플라스미드 내로 원하는 서열을 삽입하기 위해 요구될 수 있는 변형, 즉 제한 부위의 변형은 본 명세서의 설명이 제공하는 당분야의 기술내에 있다.

상기 벡터는 펌프 저해체를 검출하기 위한 검정법의 개발을 위한 기재를 제공한다. 그러나, 부가의 조작이 검정 시스템에서 사용하기 위해 최적으로 개조된 미생물을 생성하는데 필요하다. 몇몇 특성은 테트라사이클린 검정에서 또는 펌프 저해체 검정에서 유용한 검정 미생물을 개발하기 위해 바람직하고, 이전에 입수가능한 어떤 미생물도 모든 필요한 특성을 갖지 않았다. 따라서, 이상적인 기초 미생물은 검정 시스템이 실행될 수 있기 전에 필요하다.

본 검정을 개발하기 위하여, λRSTET 158-43을 가진 전술한 균주는 이상적인 검정 생물을 개발하는데 편리한 기초를 제공한다(9). λRSTET158-43 은 임의의 검정 생물을 고안하는데 유용한 몇몇의 기초적 특성을 가진다. 예컨대, λRSTET 158-43 은 예상되는 생물학적 사건 발생의 존재 또는 부재에 관한 시각적 검출을 가능케하는 편리한 지시시스템을 가지며, 이 경우에 효소 β-갈락토시마제를 암호하는 lacZ 유전자는 tetA 유전자의 부재하에, 트랜스포슨 Tn10 으로 부터의, tetA 프로모터와 융합된다. 전술한 바와같이, tetA 프로모터로 부터의 전사는 테트라사이클린 억제체인, tetR 유전자 생산물에 의해 조절된다. 세포가 테트라사이클린 부재 하에서 증식될 때면, 전사는 tetA ㅍ프로모터로부터 개시되지 않는다.

세포가 테트라사이클린을 만날때, 테트라사이클린은 세포로 들어가고 결합하여 억제체를 불활성화시키고, mRNA 가 제조된다. 다시말해, 테트라사이클린 존재 하에서, tetA ㅍ프로모터가 유발되고 tetA 유전자의 발현이 일어난다. 유사하게, tetA-lacZ 융합의 경우에, β-갈락토시다제의 유발 및 발현이 측정된다. 이 유형의 검출시스템은 β-갈락토시다제 기질이 배지에 포함될 때 검정 평판상에서 색깍변화 표시의 인지 용이성 때문에 특히 유용하다.

그러나, 검정시스템은 lacZ 융합물의 사용에 제한되지 않음을 알 것이고, 발광효소 시스템 또느 클로트암페니콜 아세틸 전이효소 시스템같이, tetA 프로모터의 유발시 검출가능한 신호를 제공하는 임의의 다른 지시시스템이 허용가능하다.

적절한 구체예에서, 융합 구조물은 검정 미생물내에 단일 유전자 복사물로서 존재한다. 융합 유전자가 다중 복사 플라스미드 상에 크로닝하면, 세포가 배지에서 테트라사이클린 없이 증식될 때 생성된 지시제(예, β-갈락토시다제)의 바탕값은 설명한 생물(11)에서와 같이 상당히 높을 것이다. 다음 실시예에서, lacZ-tetA 융합물이 이, 콜리의 염색체로 통합되는 λ 박테리오파아지 상에 위치한 구체예가 설명되지만, 단일 또는 저복사수 플라스미드 상에의 삽입 또한 허용가능하다.

특히 tetR 유전자에 관한 부가의 변형 또한 검정의 감도에 기여한다.

tet 은 보통 적절한 구체예에서 다중복사 플라스미드 상에 존재 하지만, 그것은 낮은 수준으로 존재한다. "낮은 수준"의 억제제는 감도를 테트라사이클린 10ng 이하로 수여하는 양을 의미한다. 이것이 성취되는 한 방법은 그 자신의 프로모터없이 삽입되는 tetR 유전자를 "잘못된" 방향으로 플라스미드 유전자 bla 로 클로닝함으로써이다(9). 이 방법으로 매우 적은 억제체 단백질이 제조되어, 시스템은 극히 낮은 수준의 테트라사이클린에서 유발하도록 자극된다. 이들 특성을 갖는 검정 생물은 테트라사이클린 검출에 있어서 전술한 검정 생물보다 민감하다(11).

그러나 전술한 생물(9)은 37℃에서 증식할 수 없다는 점에서 단점이 있다. 이것은 λ 억제체인, CI 단백질이 온도-감수성이고 37℃에서의 가열에 대한 반응으로 유발되기 때문이다. 다른 세균 균주는 야생형 λ 억제체를 갖기 때문에, 37℃에서 증식할 수 있다. 이 종류의 균주는 37℃ 에서 보다 빠르게 증식하는 세포에 의해 검정이 수행되어, 예컨대 검정이 1일 만에 완전히 수행될 수 있도록 보장한다는 장점을 갖는다. 또한 의도하지 않은 온도 변화가 검정 결과에 영향을 미치지 않을 것이라는 장점을 갖는다. 그러나, 야생형 CI 대립유전자를 가진 이 균주는 테트라사이클린 뿐만 아니라 미토마이신 C 와 같은 DNA 손상제에 영향을 받기쉽다는 단점을 가진다. 이 부류의 화합물(발효육즙과 같은 시험될 재료의 존재하기 매우 쉬운)은 또한 37℃에서의 증식을 가능하도록 변형된 이 생물에서 β-갈락토시다제 생산을 유발할 것이다. 이것은 잠재적으로 허용불가능한, 검정에서의 특이성 결여를 생기게 한다. 이 문제는 Ind-표현형(13)을 야기하는 돌연변이된 CI 유전자의 대립유전자의 치환에 의해 SOS 시스템에 의해 λ가 유발되지 못하게 함으로써 극복한다. ind 돌연변이물의 도입 후, 미생물은 테트라사이클린에 대해 적합하게 특이성이 있다.

전술한 생물은 테트라사이클린의 검출을 위한 다양한 검정에서 유용하다. 예컨대, 평판 검정에서, 상기와 같이 구성된 세포를 연질한천과 혼합하고 평판에 붓는다. 시험될 시료 화합물은 한천에 또는 충전된 디스크에 직접 적용하고 배양한다. 배양 후, 평판을 적당한 기질로 덧 바르기하여 지시유전자의 발현을 검출한다. 예컨대, lacZ 유전자를 사용할 때, 평판은 6-브로모-2-나프틸-β-D-갈락토피탄노시드 및 적당한 염료로 덧바른다. β-갈락토시다제의 존재는 설명한 바(11)와 같이 자색 반점으로 표시된다. β-갈락토시다제 활성이 측정되는 액체 검정 또한 사용될 수 있다(10, 12).

테트라사이클린 유출펌프 저해체 검정에서 사용하기위해, 상기 생물의 부가적인 변형이 수행된다. 전술한 바의 기본 미생물을, 유출펌프 유전자를 가진 플라스미드 첨가 하에 사용한다. 가장 민감한 검정 시스템을 제조하기 위해서, 이용되는 플라스미든 전술한 바와같은 것이고, 이는 테트라사이클린에 대해 매우 낮은 수준의 내성을 주도록 고안되었다. 적절한 구체에에서, 이 낮은 수준의 내성은 그의 전사 출발신호(프로모터)를 제외한, 유출펌프 유전자 및 그의 리보좀 결합부위 신호를 플라스미드의 "불활성" 영역으로 클로닝하여 얻는다. 상기에서 나타낸 바와같이, 특정한 신규 DNA 구조물은 그들의 조절하에서 유전자의 감소된 발현을 제공하고, 이 부가의 단계는 본래의 프로모터의 영향을 제거함으로써, 이미 낮은 수준의 발현을 한 단계 더 취한다. 이들 구조물은 임의의 테트라사이클린 유출펌프 유전자와 함께 사용될 수 있지만, 본 검정의 경우, tetA 및 tetK 가 시험될 적절한 펌프이다.

적절한 구체예에서, 조작된 플라스미드에 의해 주어지는 내성 수준은 테트라사이클린 25 ug/ml 이하, 바람직하게는 10 ug/ml 이하이다. 그런다음 선별을 수행할 수 잇다. 다음 실시예에서, 이 필요조건을 만족시키는 2개의 특정한 의 선별생물이 설명된다. 한 균주인 KB4 는 테트라사이클린 100ug/ml 이상에 대해 내성인 KB3ind 의 TN10 유도체와 반대로, 10 ug/ml 이하에 대해 내성을 주는, 플라스미드 PBT401 로 삽입되는 tetA 유전자를 가진다. 유출펌프 유전자의 삽입 효과는 제7도에 나타낸다. 균주 KB3ind는 테트라사이클린 감수성이고 테트라사이클린 단지 5-10 ng/ml 에 노출될때 최대로 유발한다. 대조적으로, 트랜스포슨 Tn10의 존재는 테트라사이클린 농도가 테트라사이클린 1 ug/ml에 도달할 때까지 최대유발을 막는다. 테트라사이클린에 대해 별로 크지 않은 내성을 결과시키는 균주 KB4 에서 구성적으로 생산된 유출 펌프는 5 ng/ml 존재 하에서 Tn10 균주보다 효과적으로 β-갈락토시다제의 유발을 막는다. 따라서, 균주 KB4 가 매우 낮은 농도의 테트라사이클린에 노출될 때 보다 많은 펌프가 합성될 수 있어, Tn 10 균주와 비교할 때로 테트라사이클린의 내부 테트라사이클린 농도의 감소를 결과시킨다. 그러나, 농도가 단지 약간 증가될 때, KB4는 보다 많은 유출펌프를 제조함으로써 반응할 수 없고 테트라사이클린 농도가 30 ng/ml 로 증가될때 최대 유발이 일어난다. 따라서, 균주 KB4가 테트라사이클린 내성면에서 최적일 수 있다. 균주 KB5는 tetK 유전자가 tetA 유전자 대신 존재하는 것을 제외하고는 KB4와 동질유전자이다. KB5의 MIC는 또한 테트라사이클린 약 10 ug/ml 이다. tetK 유전자는 균주 KB4 와 비교되는 유발곡선에서 유사한 이동을 결과시킨다.

펌프 저해체에 관한 두 유형의 검정은 이 유형의 선별생물을 사용하도록 고안된다. 첫째는 상승작용 검정이고, 이는 테트라사이클린과 함께 생물을 사멸하는 화합물 또는 조성물의 능력을 결정한다. 바람직하게는, 선별인 테트라사이클린 부재하에서가 아닌, 테트라사이크린 5 ug/ml 존재하에서 증식억제를 일으키는 화합물을 확인한다. 간단히 말해서, 상승작용 검정에서, 선별세포는 한천 배지가 선별에서 사용될 균주에 관한 MIC 부근인 테트라사이클린 5 ug/ml을 함유하는 것을 제외하고는, 테트라사이클린 검정에 관해 전술한 바와 같이 처리한다. 증식억제는 자색의 결여에 의해서 검출된다. 대안적으로 세포가 테트라사이클린 5 ug/ml 를 함유하는 배지로 이동되는 것을 제외하고는, 세포는 테트라사이클린 액체 검정에 관해 전술한 바와 같이 처리한다.

두번째 유형의 검정은 억제 검정이다. 이 검정은 β-갈락토시다제의 최대유발이 감수성 균주인 균주 KB3ind(제7도)에서 테트라사이클린 5-10 ng/ml 존재하에 발생한다는 사실을 의지한다. 그러나, 테트라사이클린의 세포내 농도는 유출펌프의 작용 때문에 내성 균주에서 감소되는 경향이 있다. 그러므로, 유발하는 세포내로 충분한 테트라사이클린을 축적하는데 배지내의 보다 많은 테트라사이클린이 필요할 지도 모른다. 이 검정은 내성균주에 관해 유발이하 수준의 테트라사이클린 존재하에 β-갈락토시다제(또는 다른 지시유전자) 유발을 일으키는 화합물을 검출하기 위해 고안된다. 특히 유망한 화합물은 상승작용 검정에서 증식억제 및 억제 검정에서 유발을 일으키는 것일 것이다.

다음의 비제한적 실시예는 본 발명의 실행을 부가적으로 설명한다.

실시예

플라스미드 pCBSal 의 구성

Bam HI 및 Nco I 말단을 가지는, 아래(각각 SEQ ID NO 8 및 SEQ ID NO 9)에서 나타낸 한상의 합성된 상보 올리고머는 표준 결찰조건(8)을 사용하여, pCB258(7)의 Bam HI/Nco I 큰단편내로 결찰시킨다.

플라스미드 pCBSal은 pCB258에서 발견되는 테트라사이클린 작동유전자 결합부위가 부분적으로 결실되고, 2개의 유일한 제한부위를 가진다 : 출발코돈 tetA 바로옆의 5' 쪽에 SalI 부위 및 유전자에 의해 암호되는 아미노산 서열을 변경하지 않는 tetA 의 암호영역내의 XhoI 제한 부위, BamHI 또한 pCBSal 에서 유일하다.

tetK 를 가진 발현벡터의 구성

이, 콜리에서 tetK 유전자를 발현하는 pCBSal 은 2단계로 구성된다. 첫째, M13 박테리오파아지내의 tetK 유전자인 MC71(3)을 쿤넬 일동(15)에 따라서 올리고 뉴클레오티드-중재부위조작 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이 시킨다.

올리고머을 사용하여 본래 존재하는 tetK 출발 코돈을 ATG로 변경시키고, SalI 제한부위를 새로운 출발 코돈의 바로 상류로 도입시킨다. 그런다음 변형된 tetK 유전자를 가진 RFI 파아지 DNA를 Sal I/Hind III로 소화시키고 pCBSal이 Sal I/Hind III로 소화될 때 생성된 큰 단편내로 결찰시켜, 플라스미드 pGG57을 결과시킨다. pGG71 이라 불리는, 원래의 TTG 출발코돈을 가지는 동질 유전자플라스미드도 2 단계로 구성된다. 올리고머 이미지를 사용하여 tetK를 위한 본래의 (TTG) 번역 출발부위에 인접하여 Sal I 제한부위를 도입시킨다. 플라스미드 pGG71은 상기 에서 개설된 방법으로 구성된다. 모든 파아지 구조물의 사열은 표준방법(8)에 따라서 DNA 서열분석을 사용하여 확인한다.

tetK 유전자는 플라스미드 pGG57을 Sca I 및 Hind III 효소로 소화시키고, 표준 기술(8)을 사용하여 플라스미드 pACYC184를 Hinc II 및 Hind III 효소로 소화시켜 생성된 큰 단편과 2.7 Kb 단편을 결찰함으로써 대안적으로 발현벡터 위로 클로닝된다. pGG76 이라 부르는 결과의 재조합체는 lac I 유전자, tac 프로모터, 그뒤에 ATG 개시코돈을 가진 tetK 유전자를 가진다.

플라스미드 pBR322로 부터의 테트라사이클린 유출펌프를 암호하는 tetC 유전자는 표준기술(8)을 사용하여, ATG 출발코돈 바로 앞에 Sal I 부위를 조작하기 위해 폴리머라제 사슬반응을 사용함으로써 이 발현시스템으로 전이된다. 결과의 플라스미드는 Sal I 및 Nhe I 효소로 소화시키고, tetC 암호 영역의 5'말단을 가지는 소단편을 분리한다. tetCdml 3' 말단을 Ava I 효소로 소화시키고, 클레노우 효소로 메우고, Nhe I 효소로 소화시켜 분리한다.

전체 tecC 암호영역은 3방식 결찰에 의해서 발현시스템으로 결찰시키고, 이때 발현벡터는 Hind III로 소화시키고, 메우고, Sal I 효소로 소화시켜 조제한다 (2 방식 결찰은 tetC 유전자 내의 Sal II 부위 존재 때문에 간단하지 않다). 전체의 tetC 유전자를 가진 플라스미드는 균주 MC1061의 형질전환 후 분리하여, 암피실린 내성에 관해 선택한다. 표준기술이 사용된다(9).

균주 MC1061 내의 플라스미드 pGG58의 테트라사이클린 내성은, 높은 수준의 IPTG가 배지에 첨가될 때로 15 ug/ml 이다. 테트라사이클린 내성 수준은 플라스미드 pBR322에 의해 주어지는 테트라사이클린 내성보다 적어도 5 배 더 낮아서, 발현의 최적수준이 얻어지지 않음을 나타낸다. 그러므로 0.1mM IPTG 도 함유한 LB 한천에서 테트라사이클린 100 ug/ml의 존재하에서 생존하여 상당한 유발을 가능케 할 수 있는 돌연변이체가 선택된다. 이후의 연구에서 사용되는 플라스미드 pGG75를 가지는 한 돌연변이 유도체가 분리된다. 형질전환체는 높은 테트라사이클린 내성에 대해 순종을 번식하기 때문에 돌연변이는 플라스미드 상에 위치하는 것으로 결정된다. tet C 암호영역내에서 돌연변이의 가능성은 표준기술(8)을 사용하여, 전체의 tet C 암호영역을 서열화하고, 야생형 서열만을 발견함으로써 제거된다.

테트라사이클린 내성의 결정

플라스미드 pCBSal, pGG57, pGG71, pGG75 또는 pGG76을 가진 이. 콜리 균주 MC1061은 암피실린 50ug/ml를 함유하는 루리아육즙(2)에서 배양물을 하룻밤동안 증식시킴으로써 테트라사이클린 내성에 관해 시험한다. 각각의 하룻밤 배양물의 1 : 50 희석물을 L-A 육즙내로 접종한다. 지수적으로 증식하는 세포를 0.85% 염수에서 계단희석하여 각 평판이 200-500 세포로 접종되도록 한다. 세포는 IPTG 및 테트라사이클린 농도 범위(0.001mM-1.0mM IPTG 및 0-200ug/ml 테트라사이클린)를 함유하는, 암피실린(50ug/ml)함유 L-한천(pH 6.8-7.0)상에 도달한다. 평판을 37℃에서 18-20시간동안 배양하고 최소억제농도(MIC)는 세포의 적어도 90%가 집락을 형성하지 못하게 하는 테트라사이클린 농도(LD 90)로서 결정된다. pCBSal, pGg57, pGg71의 비교는 제3a도에서 나타낸다. 플라스미드 pCBSal은 pCB258과 비교할 때 동일한 수준의 테트라사이클린 내성을 주지만, pCB258은 IPTC부재 하에서보다 높은 내성을 준다(MIC=50). 더욱이, pCBSal 을 가진 세포를 사멸시키는데 1mM IPTG 가 필요한 반면, pCB258을 가진 세포를 사멸하는데는 단지 0.1mM IPTG가 충분하다. 따라서, pCBSal의 리보솜 결합부위에 대한 변경이 표시된다. ATG 출반코돈을 가진 tet K 유전자를 갖는 플라스미드 pGG57은 또한 낮은 수준의 IPTG 에서 증식될 때 내성을 주며, tetA의 발현과 같이, 부가적인 유발은 세포사멸을 일으킨다. TTG 출발코돈을 가진 플라스미드 pGG71은 극히 낮은 수준의 내성을 주어, 이는 높은 IPTG 수준에서만 존재한다. 이 결과는 이. 콜리 내 tet K 유전자의 발현에서 ATG 출발부위의 중요성을 나타낸다.

pGG76 tet K 발현결과는 제3b도에 나타낸다. 플라스미드 pGG57은 pBR322 개시점에 의존하는 반면, 플라스미드 pGG76은 pACYC184의 복제개시점을 갖는다. 도표가 나타내는 바와 같이, IPTG 하의 유발시, pGG76 를 자진 이. 콜리 MC1061 은, 보다 많은 IPTG 가 최대 테트라사이클린 내성을 얻는데 필요한 것을 제외하고는, pGG57을 가진 MC1061과 유사한 테트라사이클린 내성분포를 나타낸다. 이것은 pACYC184 유도체가 pGG57 보다 적은 복사수로 존재한다는 사실과 일치하므로, 충분한 내성을 주기위해 보다 많은 IPTG를 필요로 할 것으로 예측할 수 있다. 전체로, 이들 결과는 tet K의 조절가능한 발현이 관련없는 플라스미드 유형에서 사용될 수 있음을 나타낸다.

조절안된 tetK 발현 플라스미드의 구성

플라스미드 pGG56, pGG71, pGG76, 및 pCBSal 모두는 tet R 유전자 생산물에 의한 조절특징이 제거되고 리보솜 결합부위가 번역을 약화시키도록 변경된다는 점에서 보다 낮은 수준의 tet 유전자 발현에서 유용하다. 그러나, 플라스미는 모두 조절인자인 lac I 유전자를 가지며, 이는 유발성 tac 프로모터를 조절한다. 미생물을 선별하기 위하여. 이 최종 수준의 조절을 제거하여 tet K 유전자가 낮은 구성수준으로 발현되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 이 때문에, 트랜스포슨 Tn 10의 tet A 유전자를 가진 플라스미드 pBT401(9)유도체는 플라스미드 pCBSal 을 Sma I 제한효소로 소화시키고, Bam RI 효소로 소화되고 설명한 바와같이 클레노우 효소로 메워지는 플라스미드 pBT401 내로 소단편을 결찰시켜 구성한다. 테트라사이클린 내성을 주는 구조물에서, 유전자는 제한 분석에 의해 결정되는, aph 유전자(가나마이신내성)와 동일한 방향이다. 유전자가 반대방향일 때. 테트라사이클린 내성은 검출되지 않는다. 에스, 아우레우스의 tet K 유전자를 가진 동질유전자 플라스미드는 tet K 의 공급원으로서 플라스미드 pGG57 을 사용하여 유사하게 구성된다.

이들 플라스미를 사용하여 테트라사이클린 유출 펌프 저해체에 관한 선별분석에서 사용하기에 적당한 이.콜리 균주를 형질전환한다.

테트라사이클린 유출펌프의 기질특이성

이전의 연구들은 테트라사이클린 유출펌프가 여러 가지 테트라사이클린을 인식하고 유출시키는 그들의 능력이 달라짐을 시사한다(11). 이 해석은 대안적인 설명에 의해서 제한된다. 예컨대, 차이는 숙주균주의 감수성 탓으로 돌릴 수 있음이 가능하다. 더욱이, 한 유출펌프가 테트라사이클린에 대해 보다 강한 내성을 주면, 미노사이클린과 같은 유도체에 대해 낮은 수준의 내성은, 모든 테트라사이클린 기질을 유출시키는 그의 증진된 능력에 대립하는 것으로서, 미노사이클린을 인식하는 펌프의 능력으로 기인되는 것인지 아닌지를 분별하는 것은 어렵다. "보다 좋은" 펌프는 보다 효율적인 펌프라기 보다는 단순히 덜 치명적이고, 보다 큰 수로 허용되는 것도 가능하다. 다른 가능성을 제거하고 유일한 변수로서 서로다른 기질을 고찰하기 위해서, 단일 숙주균주 MC1016 에 여러 가지 테트라사이클린에 대한 내성을 주기위한 tet A-, tet C- 및 tet K-암포펌프의 능력은 본 발명의 낮은 수준의 조절시스템을 사용하여 연구한다(표 1). 이 발현시스템을 사용하여, 밀접하게 관련된 유출시스템, tet A 및 tet C 는 서로다른 테트라사이클린 유사체에 대한 기질특이성에 있어서 현저한 차이를 보이지 않음을 나타낸다. 더욱이, 테트라사이클린 내성은 tet C 균주와 동일하도록 IPTG 농도가 tet B 를 가진 MC1061에 대해 감소될 때, 다른 테트라사이클린에 대한 내성에서의 작은 차이는 사라졌다. 반대로 tet K 유출시스템은 테트라사이클린 유도체 미노사이클린, 독시테트라사이클린, 및 6-데메틸-6-데옥시테트라사이클린을 유출시키는 능력에서 차이를 나타낸다(표 1). 따라서 낮은 수준의 조절 발현시스템은 대안적인 설명을 판정하도록 하고, 테트라사이클린 유출펌프 중에서 기질특이성의 진정한 차이를 결정한다.

[표 1]

pGG57, pCBSal 또는 pGG75 를 가진 이. 콜리 MC1061을 사용하여 테트라사이클린 및 6개 테트라사이클린 유사체에 관한 MIC(LD 90)을 결정했다. 각각의 플라스미드는 최대 유발을 위해 서로다른 수준의 IPTG 를 필요로 했다. MIC 연구는 pGG57 을 가진 이.콜리 MC1061 의 경우 0.01mM IPTG 존재하에서 수행했다. IPTG 수준 0.5mM 은 pGG75를 가진 이. 콜리 MC1061의 최대 유발에 필요했다. pCBSal을 가진 이.콜리 MC1061은 최대 유발을 위해 0.1mM IPTG의 IPTG 수준을 필요로 했다. 이들 MIC 연구는 모두 중복하여 수행했다.

테트라사이클린 검정

tet-감수성 선별생물의 구성

λSet 158-43(9)은 (a)Tn 10으로부터의 tetA 프로모터로 lacZ 의 전사융합물; (b) RecA (재조합 결여)이. 콜리 숙주 균주에서 용균반형성능력의 손실을 결과시키는 gam 유전자의 손실인, bet 유전자로부터 CIII 유전자까지의 결실물; 및 (c) 용원군이 37℃에서 증식할 때 유발 및 세포용해를 일으키는 c1857 대립유전자를 가진다. 후자의 특성은 선별 미생물에서 사용하기에 바람직하지 않은 겻으로 생각된다. 그러므로, λ 교잡 DNA 손상제로 인한 유발을 막는 CIind 돌연변이를 가질 뿐 아니라, 37℃에서 증식하고 RecA 숙주에서 복제할 수 있는, 바람직한 융합유전자를 보유하는 잡종 파아지를 얻도록 수행된다. 적당한 잡종을 얻기위하여, λ Stet 158-43을, 어떠한 융합도 가지지 않으나 CIind 대립유전자 및 gam⁺유전자를 갖는 λW3(16)과 교잡하여, RecA 숙주 균주에서 복제를 가능케한다. 동일한 수의 두 파아지는, 표준 피아지 유전기술(17)을 사용하여, 중성(Rec⁺)숙주균주 NK5031을 동시 감염시키는데 사용된다. 결과의 파아지 조제물을 사용하여, 37℃에서 MC4100의 RecA 56 유도체를 감염시키고, 이는 gam⁺파아지에 대해서만 용원반 형성을 가능케 한다. CIling 대립유전자가 온도 감수성 억제체를 암호하여, 용원군이 형성될 수 없기 때문에 37℃에서 투명한 용원반을 결과시키기 때문에, 37℃에서 탁한 용원반에 관해 선별함으로써 CIind 대립유전자의 존재를 평가한다.

lacZ 융합의 존재는 β-갈락토시다제의 지시제인 X-gal 이 배지에 포함될 때 청색용원반에 관해 선별함으로써 표시된다.

용원반 정제 후, 파아지 조제물이 제조된다. 청색 gam⁺파아지를 가진 용원군은 파아지를 NK50 31 세포의 론 위로 점적하고, 37℃에서 증식할 수 있는 청색 집락을 수해 수회 도말한다.

tetR 유전자를 가진 플라스미드 pBT401은 표준방법(8)을 사용하여 가나마이신 내성에 관해 선택함으로써 잡종 λ파아지를 가진 균주내로 형질전환한다. 형질전환체 균주 KB3ind 는 β-갈락토시다제의 유발에 의해 테트라사이클린에 반응한다.

테트라사이클린에 관한 시험에서 KB3ind 의 사용

테트라사이클린을 검출하기 위하여, 전술한것(11)과 유사한 평판검정법을 개발한다. 세포는 가나마이신 25ug/ml 를 함유한 루티아육즙(NaOH 로 pH7.5로 조정함)에서 세포밀도 0.5 흡광단위(600nm)로 증식시킨다. 배양물 25ml 시료는 원심분리에 의해 수확하고 육즙 1ml 에 재현탁시킨다. 세포를 연질한천(1%, 중량/부피) 25㎖ 와 혼합하고 22㎠ NUNC 평판(Corning)내에서, LB(pH 7.5) +가나마이신 100㎖ 위에 붓는다. 시료는 2내지 15ｕl 를 점적함으로써, 또는 화합물이 주입된 디스클 적용시킴으로써 적용하고, 평판을 37℃에서 3-4시간 동안 배양한다. 평판은 디메틸술폭시드 2㎖에 용해된 6-브로모-2-나프틸-β-D-갈락토피란노시드 13.5mg 및 패스트 블루 RR(Sigma)86.5mg을 함유하는 용액으로 덧바르고, 여기에 연질한천 25㎖ 를 첨가한다. β-갈락토시다제는 자색 반점의 존재에 의해 검출된다.

cIind 대립 유전자가 예측되는 바와같이 작용하도록 확실하게 하기위하여, 균주 KB 3ind는 전술한 평판검정법을 사용하여 시험한다. 블데오마이신 22.5 ng 까지, 키토마이신 C 150 ng 또는 자이레이스 저해체 시노딘(18) 150 ng을 함유하는 3 ㎕ 시료를 전술한 바와같이 평판위에 점적한다. β-갈락토시다제는 검출되지 않으나, 균주에 대한 증식 저해체 구역만이 CIind 대립 유전자를 가진 λ응원군을 갖는 것으로 생각된다. cI 양생형 대립유전자를 가자 대조표준 균주인 NK 5031(λ Stet 158-50) (19)은 β-갈락토시다제를 유발시킴으로써 세가지 시약에 반응한다.

그런다음 KB 3ind를 사용하는 검정법의 감도를 결정한다. 평판검정법을 사용하면, 30 ㎍/㎖ 내지 30 ng/㎖ 범위의 테트라사이클린 농도를 함유하는 시료 10 ㎕는 일상적으로 검출된다.(제5도). 따라서 300 pg 만큼 적은 테트라사이클린은 일상적으로 검출되고, 때때로 10 pg 만큼 적은 테트라사이클린이 검출된다.

대안적으로, 액체검정법도 사용된다. 세포를 LB(ph 7.5)에서 증식시키고, 테트라사이클린 함유 시료를 배양물의 밀도가 0.1 OD 단위일때 부분표본에 첨가한다. 세포 3-4 세대후, 각각의 부분표본을 설명한 바와같이(10, 12) β-갈락토시다제 활성에 관해 측정하고 밀러단위(12)를 결정한다. 액체검정법에서, 0.1 ng/㎖ 만큼 적은 테트라사이클린이 검출될 수 있었고, 버트란드 일도(9)에 의해 보고된 이전의 결과를 유지함에 있어서, 5-10 ng/㎖은 최대유발을 결과시켰다(제6도). 평판 및 액체 검정법 둘다의 경우, 이 균주는 이전에 보고된 선별생물(11)보다 감수성이 있다.

평판검정법 또는 액체검정법은 항균활성을 갖는 것으로 앞서 알려진 모든 테트라사이클린을 검출할 수 있다. 이들 화합물은, 테트라사이클린, 클로로테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 6-디메틸 클로로테트라사이클린, 및 6-데옥시-6-디메틸테트라사이클린을 포함한다. 또한 테트라사이클린의 안하이드로 유도체가 이전의 결과(11)와 일치하여 검출될 수 있다.

여러가지 다른 항생물질은 다른 항생물질이 양성신호를 결과시키는지를 시험하기 위해서 평판 검정법으로 활성을 시험한다. 표 2는 검정 평판상에 놓인 디스크에서일 때 몇몇 화합물을 제한된 범위로 자색의 생성을 결과시킴을 나타낸다. 그러나 양성신호를 결과시키는 비특이성 약품의 양은 유발에 필요한 테트라사이클린의 양보다 3차수 많은 크기이다. 현저한 증식억제 지대를 둘러싸는 자색환은 고농도의 비특이성 약품이 적용될 때만 검출할 수 있다. 큰 증식억제지대를 둘러싸는 얇은 자색환은 예컨대, 세포를 비색계 시약에 침투시키는 인위구조물일 수 있음이 가능하다. 때때로 β-락탐 부류 항생물질의 일원이 이 반응르 일으킨다는 것은 흥미롭다. 여하튼, 검정생물은 테트라사이클린을 매우 잘 식별하나, 광범위하게 다양한 테트라사이클린 구조물에 대해 민감함이 명백하다. 이 결과를 보충하기 위해서, 두번째 셋트의 실험은 주어진 약품 약 250 ng을 함유하는 다수의 2-3 ㎕ 시료를 검정 평판위에 적용시켜 수행한다(표 3). 시험한 여러가지 약품중 어떤 것도 양성반응을 결과시키지 않는다.

[표2]

[표 3]

나타낸 약품 약 250ng 을 각각의 검정 평판위에 점적했다. 시험한 이들 약품중 어떤 것도 테트라사이클린, 억제, 또는 상승작용 검정에 대해 양성이 아니었다.

레델레 콜렉션으로부터의, 테트라사이클린을 생산하는 것으로 알려진 여러가지 균주는 정지상으로 증식한다. 낮은 수준의 클로로테트라사이클린을 생산하는 원래의 두가(Duggar) 분리물, 균주 A377을 포함하는 모든 일상적인 시험은 평판 검정법에서 양성이다. 미지의 배양물을 검정하여 테트라사이클린 생산체를 검출할 때, 원래의 두가 균주는 동일한 증식 양생법을 사용하여 증식시키고 양성 대조표준으로서 시험한다. 또한, 토양으로 부터 분리된 미지의 배양물의 발효육즙은 테트라사이클린 유도체 생산체로서 확인된다.

tet-내성 선별 미생물의 구성

트랜스포슨 Tn0의 tetA 유전자를 가진 유도체를 플라스미드 pBT401(9)은 플라스미드 pCBSal을 SmaI 제한요소로 소화시키고, BamHI 효소로 소화되고 설명한 바(8)와 같이 클레노우 효소로 메운 플라스미드 pBT401로 작은 단편을 결찰시켜 구성한다. 테트라사이클린 내성을주는 구조물에서, 유전자는 제한 분석에 의해서 결정되는 가나마이신 내성 유전자와 동일한 방향이다. 유전자가 반대 방향일 때, 테트라사이클린 내성은 검출되지 않는다. 가나마이신 내성 유전자를 통과하는 통독전사가 tetA 유전자의 낮은 발현수준을 설명하는 것이 가능하다. 에스. 아우레우스의 tetK 유전자를 가진 동질유전자 플라스미드는 tetK의 공급원으로서, 전술한 플라스미드 pGG57을 사용하여 유사하게 구성한다. 이들 플라스미드 둘다는 설명한 잡종 λ 파아지를 가진 균주 NK5031의 유도체로 형질전환된다. 균주 KB4는 tetA를 가진다. 균주 KB5는 tetK를 가진다.

제7도는 KB3ind, KB4, 및 KB5로 관찰되는 유발의 비교를 나타낸다. KB3ind는 테트라사이클린 감수성이고, 단지 5-10ng/㎖의 테트라사이클린에서 최대로 유발한다. tetA 유전자를 가진 KB4는 테트라사이클린 100 ㎍/㎖ 이상에 대해 내성이 있는 KB3ind의 Tn10 유도체와 비교하여, 10 ㎍/㎖ 이하에 대해 내성을 준다. KB4는 아마도 그의 구성적 발현 때문에 Tn10 균주보다 효과적으로 5 ng/㎖의 존재 하에서 유발을 막는다. 따라서, 균주 KB4가 매우 낮은 농도의 테트라사이클린에 노출될 때 보다 많은 펌프가 합성될 수 있다. 이것은 테트라사이클린의 내부농도 감소 및 Tn10 균주와 비교되는 적은 유발을 결과시킨다. 그러나, 테트라사이클린 농도가 약간만 증가될 때, 균주 KB4는 보다 많은 유출펌프를 제조함으로써 반응할 수 없고, 테트라사이클린의 농도가 30 ng/㎖으로 증가할 때 최대 유발이 일어난다. Tn10 균주는 최대 유발을 위해 테트라사이클린 1㎍/ml을 필요로 한다. 따라서, 균주 KB4는 매우 적은 펌프의 억제가 반응을 결과시킬 수 있다는 점에서, 테트라사이클린 유출펌프의 저해체를 검출하는 면에서 최적에 가까운 것으로 나타낸다.

tetK 유전자가 낮은 수준의 테트라사이클린 내성을 주는 것을 제외하고는, 균주 KB5는 균주 KB4와 동질유전자이다. 또한 균주 KB5의 MIC는 테트라사이클린 약 10 ㎍/㎖이다. tetK 유전자는 균주 KB4와 비교되는 유발곡선에서 유사한 이동을 결과시킨다. 두 균주는 테트라사이클린 부재 하에서 보다 느림에도 불구하고, 테트라사이클린 5 ㎍/㎖ 존재 하에서 증식한다.

유출펌프 저해체에 관한 검정

두 검정법은 tetA 유전자 생산물(균주 KB4를 사용) 또는 tetK 유전자 생산물(균주 KB5를 사용)의 저해체를 검출하기 위해 개발된다. 억제 검정법에서, 균주 KB4 또는 KB5의 세포는 한천배지가 테트라사이클린 5 ng/㎖을 함유하는 것을 제외하고는, 상기의 테트라사이클린 선별에서 설명한 바와같이 처리한다. 대안적으로 액체 검정법도 개발된다. 세포를 먼저 LB(pH 7.5)에서 증식시킨다. 그런다음 세포를 테트라사이클린 5 ng/㎖을 함유하는 배지로 이동시키고 테트라사이클린 함유시료를 분표본에 첨가한다. 그런다음 세로를 배양하고 테트라사이클린 검정법에 관해 설명한 바와 같이 검정한다. 억제 검정법은 균주 KB3ind 에서 tetA 의 최대 유발이 테트라사이클린 5-10mg/㎖ 존재 하에 일어난다는 사실을 의지한다(제7도). 그러나, 세포내 농도는 유출펌의 작용 때문에 테트라사이클린 내성 균주에서 감소되므로, 유발하는 세포 내로 충분한 테트라사이클린을 축적시키기 위해서는 배지내에 보다 많은 테트라사이클린이 필요할 것이다. 억제 검정법은 내성 균주에 관해 유발 이하 수준의 테트라사이클린 존재 하에서 β-r갈락토시다제 유발을 일으키는 화합물을 검출하도록 고안된다.

상승작용 검정법에서, 한천 배지가 균주 KB4 또는 KB5에 관한 MIC 부근의, 테트라사이클린 5 ㎍/㎖을 함유하는 것을 제외하고는, 평판 검정법에 관한 상기와 같이 처리한다. 증식억제는 비색계 시약을 함유하는 덧바르기후에 자색의 생성 결여에 의해서 검출된다. 대안적으로, 세포는 세포가 테트라사이클린 5 ㎍/㎖을 함유하는 배지로 이동되는 것을 제외하고는, 액체검정법에 관한 상기와 같이 처리한다. 이 선별은 테트라사이클린과 함께 검정 생물을 죽이는 화합물, 항생물질, 발효육즙 등을 검출하기 위해, 즉 테트라사이클린 5 ㎍/㎖ 존재 하에서 증식억제를 일으키나, 테트라사이클린 부재 하에서는 일으키지 않는 물질을 검출 하기 위해 고안된다.

이상적인 화합물은 상승작용 검정법에서 증식억제를, 및 억제 검정법에서 유발을 일으키는 것이다.

유출펌프 저해체인 것으로 알려진 입수가능한 양성 대조표준은 없다. 테트라사이클린 존재 또는 부재 하에서 유출펌프를 발현하는 세포를 사멸하기위해 고안된, 푸사르산같은 친유성 킬레이트화제는 균주 KB4를 사용하는 억제 또는 상승작용 검정법에서 양성으로 검사되지 않는다. 이들 제제는 세포가 낮은 세포밀도에서 및 특별한 배지에서 펌프를 강력하게 발현할 때만 활성이 있다. 그러나, 몇몇 발효육즙은 억제 및 상승작용 평판 검정법 둘다에서 양성으로 검사되는 물질을 함유한다(제8도). 한 세균배양물에 의해서 생산된 우수한 활성성분은 균주 KB4 및 KB4 둘다의 경우 Fe⁺⁺⁺에 결합하는 시데로포어인, 노카르다민인 것으로 밝혀진다. 노카르다민 1 ㎍은 상승작용 검정법 또는 억제 검정법에서 활성을 검출하는데 충분하다. 노카르다민이 유일하게 펌프에 반대로 작용하는지, 또는 다른 철결합 화합물도 동일한 작용을 갖는지를 시험하기 위하여, 시데로포어 페리크롬 및 페리크롬 A도 테트라사이클린 유출펌프에 반대로 작용하는 그들의 능력에 관해 시험한다. 두 화합물은 노카르다민과 동일한 물농도에서 양성으로 검사된다.

노카르다민의 효과는 제9도에서 나타낸 바와 같이, 액체 검정법으로 검출할 수 있다. 5 ng/㎖ 존재 하의 액체 배양물에서 증식하는 세포는 β-갈락토시다제를 낮은 수준으로 유발하지만, 노카르다민이 또한 5 ㎍/㎖ 이상의 농도로 존재할 때면, 균주 KB4 또는 KB5의 경우, β-갈락토시다제의 상승이 일어난다. 세포가 5 ㎍/㎖ 존재 하에서 증식되고 있을 때면, β-갈락토시다제 생산의 억제에 의해 가장 명백하게 검출되는 증식억제는 두 균주의 경우 명백하다.

제10도는 테트라사이클린이 없을 때 노카르다민은 거의 또는 전혀 효과를 갖지 않는 반면에, 균주 KB3ind(매우 내성이 있는 균주)의 Tn10 유도체가 테트라사이클린 25 ㎍/㎖ 존재 하에서 증식될 때면, 노카르다민은 Tn10균주의 증식을 억제한다. 따라서, 노카르다민 및 다른 시데로포어는 세포 내로 낮은 수준의 테트라사이클린을 유지하는 펌프의 능력을 방해하는 효과를 갖는다.

표 2는 여러가지 항생물질이 평판 검정법에서 시험될 때, 억제 검정법에서 양성반응을 일으키는 것은 거의 없고, 상승작용 검정법에서는 없음을 나타낸다. 억제 검정법의 경우 하나의 주목할만한 예외는 테트라사이클린 유도체이고, 이는 균주 KB4 또는 KB5 둘다에 관한 평판 검정법에서 1 ng 만큼 적게 검정될 때 유발을 일으킨다. 테트라사이클린이 검정 평판 상에 점적될때, 유출펌프는 충분한 테트라사이클린을 유출할 수 없이 유발을 막는다. 그러므로 억제검정법은 테트라사이클린 검정법과 함께 실행되어야 하며, 이는 테트라사이클린에 대해 보다 강력한 양성 반응을 나타낼 것이다. 테트라사이클린 검정법에서 큰 증식억제 지대를 둘러싸는 자색환을 일으키는 동일한 β-락탐 항생물질(표 1)은 억제 검정법에서도 유사한 반응을 나타낸다. 반대로 노카르다민은 억제 및 상승작용 검정법 둘다에서 검출되지만, 제10도에서 나타낸 테트라사이클린 검정에서 반응을 보이지 않는다.

발효육즙 선별

양성반응을 일으키는 발효육즙에서 가장 유력한 성분은 시데로포어이다. 다행히도, CAS 평판(21)은 시데로포어에 관한 믿을만한 시험을 제공하여, 이들 활성물질이 빨리 확인될 수 있도록 한다.

요약하면, 연결하여 실행할 수 있는 세가지 선별법이 제공된다. 테트라사이클린 검정법은 테트라사이클린의 pg 수준을 검출하기위해 고안된다. 억제 검정법은 테트라사이클린 1 ng을 검출할 수 있다. 억제 및 상승작용 검정법은 노카르다민 같은 화합물을 검출하기위해 고안되며, 이는 세포내 낮은 수준의 테트라사이클린 유지로부터 테트라사이클린 유출펌프의 능력을 방해한다. 또한 노카르다민은 테트라사이클린 25 ㎍/㎖ 와 협력하여 최대 테트라사이클린 내성 균주의 증식을 억제한다. 다른 강력한 철 킬레이트 화제가 유사한 효과를 가지므로, 그의 활성의 원인인 것은 분명히 노카르다민의 킬레이트화 능력이다. 어떤 이론에 얽매이기를 원하지 않는 한편, 노카르다민은 철과 결합함으로써, 산화-환원 반응에 의존하는 작용을 방해하는 철손실 상태를 일으키는 것이 가능하다. 테트라사이클린의 능동유출은 전자 수송에 의존하는 단백질 구배 및 철에 의해 에너지를 받아, 충분한 양자 이동력을 유지하여, 철없는 시데로포어 간에 연결 및 유출펌프 방해의 그럴듯한 설명을 제공하는 것은 주목할 만하다. 그러나, 테트라사이클린 감수성 균주 KB3ind는 테트라사이클린과 토카르다민의 조합에 의해서 영향을 받으므로, 노카르다민에 의한 처리는 세포에 테트라사이클린의 흡수를 증진시키는 것도 가능하다. 테트라사이클린 유출펌프를 가진 세포로 테트라사이클린의 흡수 증진은 이들 펌프에 반대로 작용하는 대안적인 방법임이 가능하다.

다음의 생물학적 물질은 1991년 12월 3일에, 아메리칸 타입 컬쳐콜렉숀(멜릴렌드 주, 록빌시, 파크론 드라이브 12301)에 기탁되었고 기탁번호를 부여받았다. 이들은 또한 아메리칸 시아나밋드 캄파티(뉴욕주, 퍼어리버시, 레델테라보라토리즈)의 컬쳐 콜렉숀에서 입수가능하다.

서열 목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 : 데이빗 엠, 로즈수타인

고든 지이. 거이

(ii) 발명의 명칭 : 테트라사이클린

(iii) 서열수 : 11

(iv) 통신 주소 :

(A) 수신인 : 아메리칸 사아니밋드 캄파니

(B) 거리 : 원 캠퍼스 드라이브

(C) 시 : 파시파니

(D) 주 : 뉴우저어지주

(E) 국가 : 미합중국

(F) 우편번호 : 07504

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 미세형태 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성

(C) 운영체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : Patentin Release #1.0, Version #1.30

(vi) 현출원 자료

(A) 출원 번호 : US 08/644,931

(B) 출원인 : 13-MAY-1996

(C) 분류

(viii) 대리인 정보

(A) 성명 : 엘리자베쓰 엠. 버나드

(B) 등록번호 : 31,088

(C) 참고/서류 번호 : 31,771-02

(ix) 우편통신 정보

(A) 전화번호 : 201-683-2158

(B) 팩스번호 : 201-6833-4117

(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 66 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA( 게놈)

(ix) 서열 서술 : SEQ ID NO : 1 :

GTTGACACTC TATCATTGAT AGAGTTATTT TACCACTCCC

TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAATG

(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 73 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii)분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열서술 : SEQ ID NO : 2 :

GGATCCATAG AGAAAGTCGA CATGAACTCG AGTACAAAGA

TCGCATTGGT AATTACGTTA CTCGATGCCA TGG

(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA(게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 3 :

GGATCCATAG AGAAAGTCGA CATGTTTAGT TT

(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA(게놈)

(xi) 서열서술 : SEQ ID NO : 4 :

GGATCCATAG AGAAAGTCGA CTTGTTTAGT TT

(2) SEQ ID NO : 5 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO :5 :

GTAAAGAGGT AAAATTGTTT AGTTTA

(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보 :

(i) 서열 특성:

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열서술 : SEQ ID NO : 6 :

GTCGACATGT TTAGTTT

(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 7 :

GTCGACTTGT TTAGTTT

(2) SEQ ID NO : 8에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 68 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 8 :

GATCCATAGA GAAAGTCGA CATGAACTCG AGTACAAAGA

TCGCATTGGT AATTACGTTA CTCGATGC

(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보

(i) 서열 특성;

(A) 길이 : 67 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 9 :

GTATCTCTT CAGCTGTACT TGAGCTCATG TTTCTAGCGT

AACCATTAAT GCAATGAGCT ACGGTAC

(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA (게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 10 :

CCTCAAGTAA AGAGGTCGAC ATGTTAGTTT AG

(2) SEQ ID NO : 11에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 :24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 가닥 : 선형

(ii) 분자형태 : DNA(게놈)

(xi) 서열 서술 : SEQ ID NO : 11 :

AAGAGGTCGA CTTGTTTAGT TAAG

Claims

하기로 구성된 미생물 : (1) 단일 복사수 또는 낮은 복사수로 존재하는, tetA 프로모터에 융합된 지시유전자; (2) (1)의 지시 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 수준으로 발현되는 tetR 유전자; 및 (3) 자생 프로모터에 의해 영향받지않는 테트라사이클린 유출 펌프를 암호하는 구성적으로발현된 유전자.
제1항에 있어서, tatA 프로모터에 융합된 지시 유전자가 단일 복사수로 존재하는 미생물.
제1항에 있어서, tetR 유전자가 10ng 이하의 테트라사이클린에 대해 감수성을 가능케하는 수준으로 발현되는 미생물.
제1항에 있어서, tetR 유전자가 그의 전사 출발 신호없이 존재하는 미생물.
제1항에 있어서, 테트라사이클린 유출 펌프를 암호하는 구성적으로 발현된 유전자가 tatA 또는 tetK 인 미생물
(a) 제1항에 따른 미생물을 억제 이하이나 유발수준의 테트라사이클린 존재하에서, 시험될 시료 및, 지시유전자가 발현될 때 검출가능한 신호를 생기게하는 시약과 접촉시키는 단계; 및 (b) (a)의 미생물내 검출가능한 신호의 존재 또는 부재를 관찰하는 단계로서, 이때 검출가능한 신호의 부재는 시료내의 테트라사이클린 펌프 저해체의 존재를 표시하는 단계로 구성되는, 시험 시료내의 테트라사이클린 유출펌프 저해체의 검출방법.
(a) 제1항에 따른 미생물을 비억제 및 유발이하 수준 이하의 테트라사이클린 존재하에서, 시험될 시료 및, 지시유전자가 발현될 때 검출가능한 신호를 생기게하는 시약과 접촉시키는 단계; 및 (b) (a)의 미생물내 검출가능한 신호의 존재 또는 부재를 관찰하는 단계로서, 이때 검출가능한 신호의 부재는 시료내의 테트라사이클린 펌프 저해체의 존재를 표시하는 단계로 구성되는, 시험 시료내의 테트라사이클린 유출펌프 저해체의 검출 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 미생물이 37℃에서 증식할 수 있는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 지시 유전자가 lacZ인 방법
제6항 도는 제7항에 있어서, tetR 유전자가 10ng 이하의 테트라사이클린에 대해 감수성을 가능케하는 수준으로 발현되는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 미생물이 돌연변이된 CI 유전자의 대립 유전자를 더 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 검출가능한 신호를 생기게하는 시약이 6-브로모-2- 나프틸-β-D-갈락토피라노시드 및 패스트 블루 RR인 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 테트라사이클린 유출 펌프를 암호하는 구성적으로 발현된 유전자가 tetA 또는 tetK 인 방법.
제13항에 있어서, 테트라사이클린 유출 펌프를 암호하는 구성적으로 발현된 유전자는 tetA 이고, 미생물은 KB4 인 방법.
제13항에 있어서, 테트라사이클린 유출 펌프를 암호하는 구성적으로 발현된 유전자는 tetK 이고, 미생물은 KB5인 방법.