NL8203351A

NL8203351A - Dna-transcriptie promotor; portable promotor; dna en dna-fragmenten; plasmiden en werkwijze voor het maken daarvan; getransformeerde bacterien, in het bijzonder e.coli bacterien; werkwijze voor het produceren van eiwitten.

Info

Publication number: NL8203351A
Application number: NL8203351A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1982-08-26
Filing date: 1982-08-26
Publication date: 1984-03-16

Description

* .

*i VO 3523 DNA-transcriptie promotor; portable promotor; DNA en DNA-fragmenten; plasmiden en werkwijze voor het maken daarvan; getransformeerde bacteriën, in het bijzonder E. coli bacteriën; werkwijze voor het produceren van eiwitten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het op zeer efficiënte wijze in bacteriën, in het bijzonder de bacterie Escherichia coli (E. coli) produceren van prokaryotische en eukaryotische eiwitten. De uitvinding verschaft een nieuwe promotor alsmede een berei-5 dingswijze daarvoor. Genen die onder controle gebracht worden van deze promotor worden met zeer grote efficiëntie tot expressie gebracht.

Voor het tot expressie brengen van een soortvreemd gen in E. coli dient zo'n gen te worden voorafgegaan door 2 structurele elementen 10 1. een promotor, 2. een ribosoom bindingsplaats-volgorde (de z.g. Shine-Dalgarno (SD) basenvolgorde).

Genen, die reeds een ribosoom bindingsplaatsvolgorde bezitten kunnen tot expressie worden gebracht door er een promotor voor te plaatsen.

15 Voor genen, die deze structurele elementen geen van beide bezitten kan men beide elementen van een ander gen lenen dat ze wel heeft. Men plaatst in dat geval het soortvreemde gen in een gen dat wel een promotor en SD volgorde bevat. Wanneer het leesraam van beide genen op elkaar aansluit ontstaat een fusie eiwit. In een aantal gevallen is het gelukt hier-20 uit het gewenste eiwit vrij te maken. De expressie van zo'n fusie eiwit is o.a. afhankelijk van de sterkte van de "geleende" promotor.

Als tweede mogelijkheid kan een gen zonder promotor en SD volgorde geplaatst worden achter een z.g. portable promotor. Een portable promotor is een DNA fragment, dat behalve een promotor ook een 25 SD volgorde bevat. Door een gen op de juiste afstand achter de SD basenvolgorde te plaatsen kan-het gen tot expressie worden gebracht.

De hier te beschrijven uitvinding heeft betrekking op een nieuwe zeer efficient werkende promotor en op een portable promotor, die deze efficient werkende promotor bevat.

30 De uitvinding verschaft nu een DNA-transcriptie promo

tor, welke gebaseerd is op de tet-gen promotor en gekenmerkt wordt doordat het promotor fragment in het -10- gebied de nucleotidenvolgorde TAACCTT

8203351 ........

2 t * heeft.

Met "tet-gen promotor" wordt de promotor van het tetracycline resistentie gen van het plasmide pBR 322 (Bolivar et al.,

Gene 2, 95 - 113 (1977)) bedoeld.

5 In een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van de DNA- transcriptie promotor volgens de uitvinding omvat deze de nucleotiden volgorde: TTGACAGCTTATCATCGATAAGCTAACCTT.

Nog meer in het bijzonder omvat de DNA-transcriptie promotor volgens de uitvinding de nucleotiden volgorde: 10 ATGTITGACAGCTTATCATCGATAAGCTAACCTTTCCGG. Deze promotor wordt verder aangeduid met P3016.

De uitvinding wordt tevens belichaamd in DNA, DNA-fragmenten en plasmiden, die de nieuwe, efficiënte promotor volgens de uitvinding omvatten, alsmede in bacteriën, in het bijzonder Escheri-15 chia coli bacteriën, die dergelijke plasmiden bevatten. Voorbeelden van plasmiden, die de promotor volgens de uitvinding bevatten, zijn de nieuwe plasmiden pEP3016, pK3016 en pBM2. Deze kunnen als volgt worden gemaakt.

Uitgaande van het plasmide pEP301 kan het plasmide 20 pEP3016 worden verkregen, doordat plasmide pEP301 wordt geknipt met het restrictie-enzym HindlII, de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp van DNA polymerase, in het bijzonder T4 DNApolemerase, het produkt geknipt wordt met het restrictie-enzym Hpal en het grootste fragment gesloten wordt met DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase.

25 Het plasmide pEP301, waarvan is uitgegaan is bekend.

Het kan worden gemaakt uit het plasmide pHP3, waarvan de constructie ♦ is beschreven door B.E. Enger et al., Gene 9 (1980) 69 - 85. Dit plasmide pHP3 wordt geknipt met het restrictie-enzym HindlII, waarna het fragment, dat het tryptofaan A (trpA) gen bevat, wordt gesloten met be-30 hulp van T4 DNA ligase. Deze constructie van het plasmide pEP301 is eveneens door B.E. Enger et al, Gene 15 (1981), 297 - 305 beschreven.

Uit het plasmide pEP3016 kan het plasmide pK3016 worden gemaakt, doordat plasmide pEP3016 wordt geknipt met het restrictie-enzym Hpall, de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp 35 van DNA polymerase, in het bijzonder T4 DNA polymerase, het produkt geknipt wordt · met het restrictie-enzym EcoRI en het promotor bevattende fragment door DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase gekoppeld wordt aan het ga- 8 2 0 3 3 5 1 ............ 7 .....

* J

3 lactose K (galK) gen bevattende EcoRI-Smal fragment, dat door knippen van het plasmide pKOl met de restrictie-enzymen EcoRI en Smal wordt verkregen.

Het hierbij gebruikte plasmide pKOl is beschreven door 5 McKenney et al, Gene Amplification and analysis, Vol. II, Elsevier-

North Holland, 1981? J.C. Chirikjian en T.S. Papas, eds.

Uit het plasmide pK3016 kan het plasmide pBM2 worden gemaakt, doordat plasmide pK3016 wordt geknipt met het restrictie-enzym

EcoRI, de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp van DNA

10 polymerase, in het bijzonder T4 DNA polymerase, aan de uiteinden een syn-

ATGGTACCAT

thetisch DNA fragment (linker)metdenucleotidenvolgorde wordt gekoppeld en het molekuul met DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase wordt gesloten.

De uitvinding strekt zich tevens uit tot deze werk-15 wijzen voor het maken van de plasmiden pEP3016, pK3016 en pBM2.

, De uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het produceren van eiwitten in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, die gekenmerkt wordt doordat bacteriën worden gebruikt, die een öf meer plasmiden bevatten, waarin het gen of de genen, waarvan 20 expressie gewenst wordt, onder controle van een DNA transcriptie promotor volgens de uitvinding staat respectievelijk staan.

De uitvinding verschaft verder tevens een portable pro- , motor, die een DNA-transcriptie promotor volgens de uitvinding, alsmede een Shine-Dalgarno volgorde omvat.

25 Het heeft volgens de uitvinding de voorkeur, dat de

Shine-Dalgarno volgorde gevolgd wordt door een restrictie-enzym herkenningsvolgorde.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de portable promotor volgens de uitvinding is de Shine-Dalgarno volgorde AGGA en 30 wordt deze gevolgd door de herkenningsvolgorde van het restrictie- enzym EcoRI, waarbij de nucleotidenvolgorde van de Shine-Dalgarno volg- * orde en de EcoRI herkenningsvolgorde tezamen bij voorkeur AGGAATTC is.

1 De uitvinding wordt verder ook belichaamd in DNA, DNA- fragmenten en plasmiden, die een portable promotor volgens de uitvinding 35 omvatten, alsmede in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, die dergelijke plasmiden bevatten.

8203351.........

t V

4 *

Een voorbeeld van een plasmide, dat een portable promotor volgens de uitvinding omvat, is het nieuwe plasmide pMBL604. Dit kan worden gemaakt uit het plasmide pBM2, doordat plasmide pBM2 geknipt wordt met het restrictie-enzym Hinfl, de enkelstrengige uiteinden 5 worden opgevuld met behulp van DNA polymerase, in het bij zonder T4 DNA polymerase,het produkt geknipt wordt met het restrictie-enzym PstI, en het promotor bevattende fragment met behulp van DNA ligase.^..r_ ^ in het bijzonder

TAGGAATTCCTA

T4 DNA ligase wordt gekoppeld aan de linker" -^jggTTAAGGAÏen aan een trPA

gen bevattend Pstl-Hpal fragment, dat door knippen van het plasmide pOS185 10 met de restrictie-enzymen PstI en Hpal wordt verkregen.

Het hierbij gebruikte plasmide pOSl85 is verkregen door koppeling met behulp van DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase, van een Pstl-Clal fragment uit pOS225, dat het C-terminale gedeelte van het trpA gen bevat, aan een Pstl-Clal fragment uit pEP3018, dat het N-15 terminale gedeelte van het trpA gen bevat. Het plasmide pOS225 is verkregen door koppeling van eenamp (ampicilline resistentie) gen bevattend EcoRI fragment met een cpgevuld EcoRI uiteinde uit pBR322 aaneen trpA gen bevattend Hpal-Sall fragment uit pHP3. Het plasmide pEP3018 is beschreven door B.E.

Enger (Dissertatie 1^81, Landbouw Hogeschool Wageningen).

20 De uitvinding strekt zich tevens uit tot deze werk wijze voor het maken van het plasmide pMBL604.

De uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het produceren van eiwitten in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, welke gekenmerkt wordt doordat bacteriën worden gebruikt, 25 die een of meer plasmiden bevatten, waarin het gen of de genen, waarvan expressie gewenst wordt, onder controle van een portable promotor volgens de uitvinding staat respectievelijk staan.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de figuren en de voorbeelden. Van de figuren, die overigens niet op 30 schaal zijn, toont: fig. 1, IA en 1B de constructie van het plasmide pEP301 uit het plasmide pHP3, en de constructie van de plasmiden pEP3016 en PEP3018 uit het plasmide pEP301, alsmede de struktuur van de promotoren * van deze plasmiden; 35 fig. 2 de struktuur van de promotoren en P301, P3016 en - -P3018, alsmede ter verdere vergelijking de struktuur van de tet promo-t ........'8 2 0 3 3 5 1 ' 4 J 9 5 tor en de trp promotor; fig. 3 de constructie van het plasmide pK3016 uit de plasmiden pEP3016 en pKOl; fig, 4 de constructie van het plasmide pBM2 uit het 5 plasmide pK3016; fig. 5 de constructie van het plasmide pMBL604 uit de plasmidén pBM2 en pOS185? fig. 6 de constructie van het plasmide pOS225 uit de plasmiden pBR322 en pHP3 en de constructie van het plasmide pOSl85 uit 10 de plasmiden pOS225 en pEP3018; en fig, 7 de herkenningsyolgorden en het knippatroon van een aantal restrictie-enzymen.

Voorbeeld I

Constructie van de plasmiden pEP301 (verg.), pEP3Q16 (uitv.) en pEP3018 15 (verg.)

De promotor P3016 werd verkregen door een verandering aan te brengen in de structuur van de promotor van het tet gen. De promotor P3016 is opgebouwd uit het -35 gebied van de tet promotor, gelegen op het EcoRI-HindlII fragment van plasmide pHP3, en een -10 gebied dat 20 gevormd is door koppeling van het opgevulde HindXII uiteinde aan het Hpal uiteinde van het trpB gen.

Voor de constructie van een plasmide met de promotor P3016 is uitgegaan van plasmide pHP3dathet tet gen inclusief de tet promotor en het gehele trp operon bevat. Door het plasmide pHP3 te knippen met 25 HindlII, werd een breuk aangebracht in het -10 gebied van de tet promotor en eveneens in trpB. Het plasmide pEP301 werd hieruit gevormd door sluiting van het fragment dat het trpA gen bevat met behulp van T4 DNA ligase. Uitgaande van pEP301 werd pEP3016 gevormd. Hiertoe werd pEP301 geknipt met HindlII en werden de enkelstrengige uiteinden opgevuld mèt 30 T4 DNA polymerase. Vervolgens werd het plasmide geknipt met Hpal en werd het grootste fragment weer gesloten met T4 DNA ligase. Na transformatie van E. coli KI2 trpEA2 bacteriën vond selectie plaats op getransformeerde bacteriën door uitplaten op voedingsbodems, die behalve M9 medium, tryptofaan en ampillicine bevatten. Op overeenkomstige wijze 35 werd het plasmide pEP3018 gevormd. pEP301 werd geknipt met HindlII, de enkelstrengige uiteinden werden opgevuld en vervolgens aan elkaar gekoppeld.

.......8 2 0 3 3 5 1 i * 6

De nucleotidenvolgorde van de promotoren, die aldus zijn ontstaan, is weergegeven in fig. 2. Ter vergelijking is ook de struktuur van de tet promotor en de trp promotor weergegeven. De constructie van de plasmiden is weergegeven in fig. 1, la en lb.

5 Voorbeeld II

Constructie van het plasmide pK3016

Voor de constructie van pK3016 werd allereerst het promotor bevattende EcoHI-HpalI fragment uit pEP3016 geïsoleerd. Hiertoe werd pEP3016 geknipt met Hpall, werden de enkelstrengige uiteinden op-10 gevuld met T4 DNA polymerase en werd het DNA geknipt met EcoRI. Uit plasmide pKOl werd het EcoRI-Smal fragment geïsoleerd door knippen met EcoRI en Smal. Het EcoRI-HpalI fragment uit pEP30l6 werd gekoppeld aan het EcoRI-Smal fragment uit pKOl en het resulterende plasmide werd getransformeerd naar E. coli Kl2 C600 galK bacteriën. Selectie voor pK3016 15 bevattende bacteriën vond plaats inMacConkey galactose medium waaraan ampicilline was toegevoegd.

De constructie wordt getoond in fig. 3.

Voorbeeld III

Vergelijking van de expressie-efflciëntie van de promotor P3016 volgens 20 de uitvinding met bekende promotoren

De sterkte van de promotoren is bepaald in plasmiden, waarbij de promotor is geplaatst voor genen (trpA en galK), die een eigen ribosoom bindingsplaatsvolgorde hebben. De relatieve efficiëntie waarmee de promotoren P301, P3016 en P3018 het trpA gen tot ex- 25 pressie brengen is bepaald door de hoeveelheid trpA gen produkt(tryptofaan synthetase A;TSase A) te meten in bacteriën die plasmiden met deze promotoren bevatten. De resultaten zijn weergegeven in de Tabel, 3e kolom. Ter vergelijking is ook de hoeveelheid TSase A bepaald, gemaakt door een plasmide dat het trpA gen bevat, onder controle van de tet promotor (Ptet), 30 of van de trp promotor (Ptrp). Eveneens is de hoeveelheid TSase A bepaald / in E. coli bacteriën die geen plasmide bevatten,onder condities dat het

chromosomale trpA gen maximaal tot expressie komt. Uit de resultaten blijkt dat het aanbrengen van veranderingen in de struktuur van het -10 gebied van de promotor belangrijke verschillen veroorzaakt in expressie 35 van het trpA gen. Vergeleken met de expressie van trpA, onder controle van de tet promotor (pEP702) of de trp promotor (pEPl21), is de trpA

8203351 s ♦ 7 . expressie onder controle van de promotor P3016 (plasmide pEP3016) 16 respectievelijk 8 maal zo efficiënt. In vergelijking met de door het chromosoom gecodeerde TSase A synthese is die in p£P3016 ongeveer 80 maal zo efficiënt.

5 De promotor P3016 blijkt eveneens tot een zeer hoog niveau van expressie aanleiding te geven, wanneer de promotor geplaatst wordt voor een ander gen, t.w. het galK gen. Zoals blijkt uit de resultaten van de Tabel, kolom 4, vertoont P3016 dezelfde grote efficiëntie v§n synthese van het galK enzym als van het trpA enzym.

10 Uit het voorgaande blijkt dat zeer hoge expressie niveaus verkregen kunnen worden van een gen dat voorzien is van een eigen ribosoom bindingsplaats volgorde, door een DNA fragment waarop P3016 gelegen is voor het gen te plaatsen of het gen achter het fragment te plaatsen.

15 TABEL·

Plasmide promotor trpA enzym galK enzym PEP301 P301 0,03 pK301 P301 - 0,02 ΡΕΡ3018 P3018 1,0 20 pK3018 P3018 - 1,0 ΡΕΡ3016 P3016 8 - ΡΚ3016 P3016 - 6 ΡΕΡ702 Ptet 0,5 pEP121 Ptrp 1,0 - 25 chromosoom Ptrp 0,1

Tabel. Promotor sterkte bepaald door het meten van de trpA enzymen galK enzym activiteit. De aangegeven waarden zijn relatieve waarden, waarbij de sterkte van P3018 op 1 is gesteld. Alle waarden zijn gecorrigeerd voor het copie-aantal van het plasmide, bepaald door het 30 meten van de δ-lactamase activiteit.

Bepaling van de trpA enzymactiviteit vond plaats volgens O. Smith en C. Yanofsky (in Methods in Enzymology, Vol. 5 (Academie Press, 1962; S.P. Colowick en N.O. Kaplan, ed.\) en die van de galK enzymactiviteit 35 volgens K. McKenney et al. (in Gene amplification and analysis, Vol. II (Elsevier-North Holland, 1981; J.C. Chirikjian en T.S. Papas, eds.)) 820 3 3BI ——— δ

Voorbeeld IV

Constructie van de plasmiden pBM2 en pMBL604

De constructie van de plasmiden pBM2 en pMBL604 wordt getoond in respectievelijk figuur 4 en figuur 5.

5 Het plasmide pMBL604 bevat een portable promotor vol gens de uitvinding, doordat een SD volgorde aangebracht is op korte afstand na de promotor P3016. De SD volgorde wordt onmiddellijk gevolgd door een EcoRI knipplaats. Dit maakt het mogelijk om het transla-tie-start codon van het gekloneerde gen op de juiste afstand (8 - 12 10 base paren (bp)) van de SD volgorde te plaatsen.

Voor de constructie van pMBL604 is gebruik gemaakt van een synthetisch DNA molecuul (SD linker) van de volgende samenstelling

TAGGAATTCCTA

ATCCTTAAGGAT.- ^ Dit oligonucleotide dat is verkregen door organo-chemi- sche synthese volgens de triëstermethode, bevat een SD volgorde (AGGA) en een herkenningsplaats voor het restrictie-enzym EcoRI (GAATTC).

De constructie van het plasmide met de portable promotor (pMBL604) verloopt verder als volgt: Allereerst werd de EcoRI herken-20 ningsplaats in pK3016 direct naast de promotor P3016 vervangen door een Kpnl herkenningsplaats (fig. 4). Dit om te voorkomen dat het gewenste plasmide twee EcoRI herkenningsplaatsen zal bevatten,nl.één'voordepromotor ênéén inde. SD linker.Het plasmide jK30_16werd gekniptmetEcoRI en de en- kelstrengige uiteinden werden opgevuld m.b.v. T4 DNA polymerase.

ATGGTACCAT

1 25 Vervolgens werd een Kpnl linker - gekoppeld

lALunluuTA

tussen de uiteinden. Na sluiting van de moleculen met T4 DNA ligase werden deze gebruikt voor transformatie van E. coli Kl2 C600 galK bacteriën. De verkregen transformanten bevatten een plasmide pBM2, dat in plaats van eeh EcoRI knipplaats een Kpnl knipplaats bevat (fig. 4).

30 Uit het plasmide pBM2 werd vervolgens het Pstl-Hinfl fragment geïsoleerd dat de promotor P3016 bevat. Hiertoe werd pBM2 geknipt met Hinfl en werden de enkelstrengige uiteinden opgevuld met behulp van T4 DNA polymerase. Na incubatie met PstI, werd het PstI-Hinfl fragment met de promotor geïsoleerd door middel van electroforese op een 35 agarose gel.

Het Pstl-Hinfl fragment werd vervolgens met behulp van 8 2 0 3 3 5 1 ' J* ♦ 9 T4 DNA ligase gekoppeld aan de SD linker en aan een Pst3>HpaI fragment dat trpA bevat (fig. 5). Het Pstl-Hpal fragment werd verkregen door knippen van pOSl'85 met PstI en Epal en isolatie van het grootste fragment door middel van electroforese op een agarose gel. Na transformatie van 5 E. coli trpA bacteriën werden transformanten geïsoleerd die een plasmide bevatten van de verwachte grootte (4,4 kilobase (kb)). De eventueel aanwezige overmaat aan Kpnl of SD linkers werd verwijderd door knippen van het plasmide met Kpnl en EcoRI en sluiten van het molecuul met T4 DNA ligase. Het gevormde plasmide wordt aangeduid als pMBL604. De 10 structuur werd bevestigd door analyse met behulp van de restrictie-enzymen PstI, Kpnl, EcoRI, Hinfl en Hpall.

De constructie van het in de constructie van plasmide PMBL604 toegepaste plasmide pOSl85 wordt in fig. 6 getoond. Uit plasmide pBR322 werd door knippen met het restrictie-enzym EcoRI, opvullen van 15 de enkelstrengige uiteinden met behulp van T4 DNA polymerase, en knip-* pen met het restrictie-enzym Aval o.a. een fragment verkregen, dat het amp gen van pBR322 bevat. Dit fragment werd met behulp van T4 DNA ligase gekoppeld aan een uit het plasmide pHP3 (zie fig. 1) door knippen met de restrictie-enzymen Hpal en Sail verkregen fragment, dat het trpA gen 20 van plasmide pHP3 bevatte. Deze koppeling leidde tot het plasmide pOS225 (4,1 kb),-waaruit vervolgens door knippen met de restrictie-enzymen PstI en Clal o.a. een fragment (het grootste fragment) werd verkregen, dat het C-terminale gedeelte van het trpA gen bevatte. Dit fragment werd ten slotte met behulp van T4 DNA ligase gekoppeld aan een uit het 25 plasmide pEP3018 (zie fig. 1B) door knippen met de restrictie-enzymen PstI en Clal verkregen fragment, dat het N-terminale gedeelte van het trpA gen bevatte. Deze koppeling gaf het plasmide pOSl85.

Het plasmide pMBL604 bevat een aantal kloneringsplaat-sen achter de EcoRI knipplaats, gezien vanuit de promotor P3016. De aan-30 wezigheid van deze kloneringsplaatsen maakt het eenvoudig om het trans·? latie-start codon van een te kloneren gen op de juiste afstand van de SD volgorde te brengen.

Als het gen bijvoorbeeld tussen de Ball en de PvuII knipplaats is gekloneerd, kan het molecuul daarna worden geopend door het 35 aanbrengen van een breuk in de Ball knipplaats. Met gebruikmaking van het enzym Bal31 dat nucleotiden afsplitst van het uiteinde van een DNA molecuul kan men het gewenste aantal nucleotiden voor het translatie- 8 2 0 3 3 5 1 ~ ~ : 10 start codon verwijderen.

Tenslotte kan het molecuul weer gesloten worden nadat een breuk is aangebracht in de EcoRI knippplaats en het enkelstrengige EcoRI uiteinde opgevuld is. Op deze wijze kan men ervoor zorgen dat 5 de afstand tussen de SD volgorde en het translatie-start codon de gewenste 8 - 12 bp bedraagt.

Indien de vorming van een fusie-eiwit wordt gewenst kan dit verkregen worden door het gen te kloneren in bijvoorbeeld de Narl knipplaats in het galK gen in een plasmide, dat van pK3016 of pBM2 is 10 afgeleid door een transcriptie terminator achter het galK gen aan te brengen. Ook is het mogelijk om een DNA fragment te isoleren uit pEP3016 met daarop de P3016 promotor en het begin van trpA en dit te kloneren voor het gewenste gen.

..... 8TÖT3T! '

Claims

1. DNA-transcriptie promotor, welke gebaseerd is op de tet-gen promotor, met het kenmerk, dat het promotorfragment in het -10 gebied de nucleotiden volgorde TAACCTT heeft.

2. DNA-transcriptie promotor volgens conclusie 1, met het 5 kenmerk, dat deze de nucleotidenvolgorde: TTGACAGCTTATCATCGATAAGCTAACCTT omvat.

3. DNA-transcriptie promotor volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat deze de nucleotiden volgorde ATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTAACCTTTCCGG omvat.

4. DNA of DNA-fragment, omvattende een DNA-transcriptie pro motor volgens conclusie 1, 2 of 3.

5. · Plasmide, omvattende een DNA-transcriptie promotor volgens conclusie 1, 2 of 3.

6. Plasmide pEP3016.

7. Plasmide pK3016.

8. Plasmide pBM2.

9. Bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, welke een of meer plasmiden volgens een of meer van de conclusies 5-8 bevatten.

10. Werkwijze voor het produceren van eiwitten in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, met het kenmerk, dat bacteriën worden gebruikt, die een of meer plasmiden bevatten, waarin het gen of de genen, waarvan expressie gewenst wordt, onder controle van een DNA-transcriptie promotor volgens conclusie 1, 2 of 3 staat respec-25 tievelijk staan.

11. Portable promotor, omvattende een DNA-transcriptie promotor volgens conclusie 1, 2 of 3, alsmede een Shine-Dalgarno volgorde.

12. ' Portable promotor volgens conclusie 11, met het ken- · 30 merk, dat de Shine-Dalgarno volgorde gevolgd wordt door een restrictie- enzym herkenningsvolgorde.

13. Portable promotor volgens conclusie 11 of 12, met het kenmerk, dat de Shine-Dalgarno volgorde AGGA is.

- 14. Portable promotor volgens conclusie 13, met het ken- 8 5! 0 3 T51" ~~ ' t* , merk, dat de Shine-Dalgarno volgorde gevolgd wordt door de herkennings-volgorde van het restrictie-enzym EcoRI.

15. Portable promotor volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de nucleotiden volgorde van de Shine-Dalgarno volgorde en de EcoRI 5 herkenningsvolgorde tezamen is: AGGAATTC.

16. DNA of DNA-fragment, omvattende een portable promotor volgens een of meer van de conclusies 11-15.

17. Plasmide, omvattende een portable promotor volgens een of meer van de conclusies 11 - 15.

18. Plasmide pMBL604.

19. Bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, welke een of meer plasmiden volgens conclusie 17 of 18 bevatten.

20. Werkwijze voor het produceren van eiwitten in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, met het kenmerk, dat bac- 15 teriën worden gebruikt, die een of meer plasmiden bevatten, waarin het gen of de genen, waarvan expressie gewenst wordt, onder controle van een portable promotor volgens een of meer van de conclusies 11-15 staat respectievelijk staan.

21. Werkwijze voor het maken van plasmide pEP3016, met het 20 kenmerk, dat plasmide pEP301 wordt geknipt met het restrictie-enzym HindlII, de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp van DNA-polymerase, in het bijzonder ,T4 DNA polymerase, het produkt geknipt wordt met het restrictie-enzym Hpal en het grootste fragment gesloten wordt met DNA-ligase , in het bijzonder T4 DNA ligase.

22. Werkwijze voor het maken van plasmide pK3016, met het kenmerk, dat plasmide pEP3016 wordt geknipt met het restrictie-enzym Hpall, de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp van DNA-polymerase', in het bijzonder T4 DNA polymerase, het produkt geknipt wordt met het restrictie-enzym EcorI en het promotor bevattende fragment door DNAligase,' in he-t 30 bijzonder T4 DNA ligase gekoppeld wordt aan het galK gen bevattende EcoRI-Smal fragment, dat door knippen van het plasmide pKOl met de re-strictie-enzymen EcoRI en Smal wordt verkregen.

23. Werkwijze voor het maken van plasmide pBM2, met het kenmerk, dat plasmide pK3016 wordt, geknipt met het restrictie-enzym EcoRI, 35 de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp van DNA-polymerase, in het bijzonder T4 DNA polymerase, tussen de uiteinden een syn- 1 2 0 3’TBTT : thetisch DNA fragment (linker) met de nucleotidenvolgorde ATGGTACCAT wor^t TACCATGGTA gekoppeld en het molekuul met DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase wordt gesloten.

24. Werkwijze voor het maken van plasmide pMBL604, met het 5 kenmerk, dat plasmide pBM2 geknipt wordt met het restrictie-enzym Hihfl de enkelstrengige uiteinden worden opgevuld met behulp van DNA-polymerase, in het bijzonder T4'DNA polymerase, het produkt geknipt wordt met het restrictie-enzym PstI, eb het promotor bevattende fragment met behulp van DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase wordt gekoppeld aan de lin- 10 ker en aan een trpA gen bevattend Pstl-Hpal fragment, dat “ATCCTTAAGGAT* door Knippen van het plasmide pOSl85 met de restrictie-enzymen PstI en Hpal wordt verkregen. 82 0 3 3~51 '