JPS63263087A - ポリペプチドの遺伝子工学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子操作による細菌中でのポリペプチドの調製におい
て、所望のポリペプチドの構造遺伝子は、読み枠で細菌
に固有のポリペプチドのβ−ガラクトシダーゼをコード
する遺伝子と連結していることが多い。細菌は、したが
って、所望のポリペプチドのアミノ末端がβ−ガラクト
シダーゼのカルボキシル末端に結合した融合タンパク質
を産生ずる。

βガラクトシダーゼ部分の化学的または酵素的除去にお
いて、βガラクトシダーゼ部分は多くの断片に壊される
。その結果、分子量のように分画に′関与する性質が所
望のタンパク質と似たβガラクトシダーゼ断片が生じる
。このため、所望のポリペプチドの分画および分離が著
しく難しくなり、収率が低下する。短縮したβガラクト
シダーゼ部分を有する融合タンパク質を調製する方法に
ついては、Ｂｒｏｅｋｅｒ：　Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　
　Ｔｅｃｈｎ、　　３　（＋９８６）　５３−５７に記
載がある。これら融合タンパク質の長所として、融合タ
ンパク質を臭化シアンで切断すれば、切断産物が少ない
ので精製が容易であるということが述べられている。こ
の既知の方法は、切断産物の数は減少させるが、また、
分画に関与する性質が所望産物と類似する断片も生じさ
せるため、上記の問題点を解決するものではない。

既知の方法の問題点は、βガラクトシダーゼまたはβガ
ラクトシダーゼフラグメントの遺伝子中のメチオニンお
よび／またはアルギニンおよび／またはシスティンのコ
ードンを一部または全体的に他のアミノ酸のコードンに
置換する、本発明の方法によって解決される。

この方法によれば、所望のポリペプチドの取り出しの際
の問題がないようにβガラクトシダーゼ部分のフラグメ
ントをｒ仕立て（ｔａｉｌｏｒ）Ｊることができる。

ゆえに、本発明は、遺伝子的にコード可能なポリペプチ
ドの調製方法に関し、より詳細には、このポリペプチド
の構造遺伝子を、正しい読み枠中において、βガラクト
シダーゼまたはβガラクトシダーゼフラグメントの遺伝
子を介してレギュレーター領域と連結させて、この遺伝
子構造物を細菌内に導入し、そこで不溶性融合タンパク
質を発現させ、細胞破砕後にこれを分離して、所望のポ
リペプチドを化学的または酵素的切断によって得る方法
において、βガラクトシダーゼまたはβガラクトシダー
ゼフラグメントの遺伝子中のメチオニンおよび／または
アルギニンおよび／またはシスティンのコードンを、一
部または全体的に、他のアミノ酸のコードンに置き換え
ることをコードする、ものである。

本発明の他の要旨および好ましい実施態様は、以下に説
明され、特許請求の範囲に定義される通りである。

２５０個より多いか、βガラクトシダーゼの全配列より
は有意に少ないアミノ酸を含有するβガラクトシダーゼ
フラグメントを有する構造物は、分離が容易な不溶性融
合タンパク質を生ずることが見出された。このβガラク
トシダーゼ部分は、約３００〜約８００個、好ましくは
約３２０〜約６５０個、のアミノ酸を有し、かつ、βガ
ラクトシダーゼの７ミノ末端および／またはカルボキシ
ル末端部分を含有するのが有利である。

βガラクトシダーゼまたはβガラクトシダーゼフラグメ
ントの遺伝子は、正しい読み枠中でレギュレーター領域
と結合しており、必要であれば、アダプターを介して所
望のポリペプチドの構造遺伝子と結合している。

このアダプターは、適宜に除外することもできるが、所
望のポリペプチドのアミノ末端の前方に位置するアミノ
酸（またはアミノ酸の一群）をコードし、所望ポリペプ
チドのβガラクトシダーゼ部分からの化学的または酵素
的分離を容易にする。

例えば、所望のポリペプチドがメチオニンを含まない場
合、または、遺伝子操作によってメチオニンを含まない
ように修飾されている場合には、所望のポリペプチドの
アミノ末端の前方のアミノ酸としてメチオニンを選択す
れば、それより後の所望のポリペプチドを塩化シアンま
たは臭化シアンによる切断によってβガラクトシダーゼ
部分から分離することができるので有利である。所望の
ポリペプチドがトリプシンによって不活化されない場合
には、所望のポリペプチドのアミノ末端の前方のアミノ
酸としてアルギニンを利用して、それより後の所望のポ
リペプチドをトリプシン切断によって得ることができる
。もちろん、この場合には、遺伝子操作によって所望ポ
リペプチド中に存在するトリプシン切断部位を除去する
ことも可能である。

宿主細胞の外来性タンパク質の産生能には限度があるた
めに、一般には、βガラクトシダーゼ構造物は短縮され
たものが好ましく、それによって、融合タンパク質のよ
り多くの部分が所望タンパク質のために利用できる。こ
のように、これ自体で収率の決定的な改善をもたらす。

他の利点は、細胞破砕の後の不溶性融合タンパク質の分
離が容易になるだけではなく、宿主固有のプロテアーゼ
による著しい分解が起きないということにもある。

そのために誘発時間をより長くすることが可能になり、
これによって細菌内での外来性タンパク質の蓄積量がよ
り大きくなる。さらに、工程が容易になることから、所
望タンパク質の分離の際の損失が少なくなり、その結果
、全体として、既知の方法に較べて有意に高い収率が得
られる。

諸図面は、短縮したβガラクトシダーゼ構造物を用いた
本発明の好ましい実施態様の説明図であるが、　「所望
しない」コードンの「所望の」コードンへの置換に係る
表示は含まれていない。

第１図は、リンカ−を含まない（Ａ　１．　〜５．）、
およびリンカ−を含む（Ｂ１．〜５．）、短縮βガラク
トシダーゼ配列の構造を示す、説明図である。

第２図は、プラスミドｐＷＺＲＩ（プラスミドｐＵＣ９
およびｐＵＲ２７０からのβガラクトシダーゼフラグメ
ントを含むプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体）の構築を
示す、説明図である。

第３Ａ〜３Ｄ図は、モンキープロインシュリンＤＮＡを
有するプラスミドｐＷＩ６の構築を示す、説明図である
。

第４図は、Ｉ）ＷＩ６（第３Ｄ図）および第１図のβガ
ラクトシダーゼフラグメン）Ａ２からのプラスミドｐＷ
ＺＩＰ　　ｄＭｄＣの構築を示す、説明図である。

第５図は、ｐＷＩ６（第３Ｄ図）およびｐｗｚ　ＩＰ　
　ｄＭｄＣ（第４図）からのプラスミドｐＷＺＰＷＢｉ
　　ｄＭｄＣの構築を示す、説明図である。ｐＷＺＰＷ
Ｂｌ　　ｄＭｄＣは、所望のポリペプチドの発現のため
の遺伝子の挿入を可能にするポリリンカー（ＭＣ９）を
含有ずろ。

レギュレーター領域は、天然のもの、とくに細菌特有の
もの、化学合成されたもの、または、例えば融合プロモ
ーターｔａｃの複合領域などが用いられる。レギュレー
ター領域は、加えて、ｌａｃオペレーターなどのオペレ
ーター、およびβガラクトシダーゼフラグメントのメチ
オニンコードンの６〜１４個塩基の上流のリポソーム結
合部位を含有する。

便宜なβガラクトシダーゼフラグメントは、アミノ末端
およびカルボキシル末端の部分配列の融合からなる。こ
れによって、融合タンパク質中のβガラクトシダーゼ部
分がかなり削減される。加えて、この構造によって種々
のレギュレーターシステムの置換を簡単に行うことがで
きる。しかし、βガラクトシダーゼのアミノ末端配列の
み、または、カルボキシル末端を優先した配列を用いる
ことも可能である。これら短縮βガラクトシダーゼ構造
物の天然の制限酵素切断部位を用いることも可能である
。しかしながら、正しい読み枠を保証（停止コードンを
含まない）し、適宜に、ＡＴＣ開始コードンを含む、化
学合成リンカ−またはアダプターを有する構造物を利用
することも可能である。第１Ａ図は、天然の制限酵素切
断部位を用いたβガラクトシダーゼフラグメン）・、第
１Ｂ図は、リンカ−を利用したβガラクトシダーゼフラ
グメントを示す。

βガラクトシダーゼフラグメントの修飾を単独または組
合せでさらに行うことは、特殊な場合に有利であろう。

塩化シアンまたは臭化シアンで切断してβガラクトシダ
ーゼフラグメントから分離するポリペプチドの場合には
、ポリペプチドの精製は、インビトロの点（ｔａｒｇｅ
ｔｅｄ）突然変異によって障害となっているメチオニン
残基のコードンのいくつか、好ましくは全て、を他のア
ミノ酸、好ましくはロイシンまたはイソロイシン、のコ
ードンに置換すれば、容易になる。

このように修飾された融合タンパク質においては、切断
の結果、所望のポリペプチドの他に、大きさおよび／ま
たは電荷を基にして所望のポリペプチドから容易に分離
できるように選択されたβガラクトシダーゼ切断断片が
少数生成する。

アスパラギン酸とプロリンとの間のポリペプチド結合を
酸切断によってβガラクトシダーゼフラグメントから分
離するポリペプチドの場合には、βガラクトシダーゼフ
ラグメント中の適当なコードンを、インビトロの点突然
変異によって、好ましくはアスパラギン酸のコードンを
グルタミン酸のコードンへ転換することによって、１１
飾し、酸切断がこれらのポイントで起きないようにする
ことが有利であろう。

トリプシン切断によってβガラクトシダーゼフラグメン
トから分離するポリペプチドの場合には、インビトロの
点突然変異によって、アルギニンおよび／またはリジン
のコードンを１１飾し、トリプシン切断後に生じたβガ
ラクトシダーゼフラグメントを、大きさおよび／または
電荷を基にして所望のポリペプチドから容易に分離でき
るようにすることが可能である。

システィンを全く含まないポリペプチドの場合には、β
ガラクトシダーゼフラグメントをコードするＤＮＡと所
望のポリペプチドをコードするＤＮＡとの間に、アミノ
酸システィンのコードンを挿入することが可能である。

次いで、続く特異的Ｓ−シアニレ−ジョンによって所望
のポリペプチドをβガラクトシダーゼ部分から切り離゛
すことが可能となる。

ジスルフィド結合の形成が活性に重要であるようなポリ
ペプチドの場合には、βガラクトシダーゼフラグメント
に存在するシスティンのコードンを、インビ）ｒコの点
突然変異によって、他のアミノ酸、好ましくはセリン、
のコードンに変換することが有益であることが一般に認
められている。

このようにして、βガラクトシダーゼフラグメンＩ・と
ポリペプチドとの間の不都合なジスルフィド結合のいか
なる形成をも阻害できる。

βガラクトシダーゼフラグメントと所望のポリペプチド
の構造遺伝子の間のアダプターは、好ましい場合には省
略可能であるが、所望のポリペプチドのアミン末端の直
前に位置して、所望のポリペプチドのβガラクトシダー
ゼ部分からの分離を容易にするようなアミノ酸またはア
ミノ酸配列をコードする。既に述べたように、このアミ
ノ酸はメチオニンでもよく、その場合には、所望のポリ
ペプチドがメチオニンを含まないかまたは対応するコー
ドンを遺伝子操作で修飾しておく限りは、臭化シアンに
よる直接的切断が可能になる。このタイプのアダプター
の一例は、次のような塩基配列を有する。

５　’　　　　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　　ＴＴＣＧＣ
Ａ　ＡＴＧ（ＥｃｏＲＩ）　　　　ＴＡ　ＣＴＴ　ＡＡ
Ｇ　ＣＧＴ　ＴＡＣ読み枠内でトリプシン切断部位をコ
ードするアダプターの一例は、次のような配列を有する
。

５　’　　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＣＡ　Ａ
ＧＡ（ＥｃｏＲｌ）　　　ＴＡ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＧ
Ｔ　ＴＣＴ化学的または酵素的な種々の方法による切り
離しをさらに促進するには、βガラクトシダーゼ部分か
らの所望のポリペプチドの分子空間的分離が行われる。

この目的のために、ポリ（アミノ酸）のコードンを、特
殊の化学合成アダプターを介してβガラクトシダーゼ部
分とポリペプチドとの間に挿入する。一般に、このポリ
（アミノ酸）「アーム」の異なる構築の観点から、アミ
ノ酸としては、遺伝子、的にコード可能な全てのアミノ
酸の使用が可能である。例えば、グリシン、アラニン、
セリンまたはプロリンなどの非荷電の小アミノ酸、また
はアスパラギン酸およびグルタミン酸のような荷電した
アミノ酸が一方では用いられ、他方ではリジンおよびア
ルギニンが用いられる。ポリ（アミノ酸）鎖は、５〜３
０個、好ましくは１０〜２４個、とくに好ましくは１５
〜２０個、のアミノ酸を含有するのが適当である。ポリ
（アミノ＃）の選択によフては、所望の遺伝子産物をβ
ガラクトシダーゼ部分とともに直接に折り返すこと（ｆ
ｏｌｄｉｎｇ−ｂａｃｋ）も可能である。

所望のポリペプチドの構造遺伝子は、天然の供給源から
または化学合成によって既知の方法で得られる。天然物
からの遺伝子の例として、ＥＰ−Ｂ第０　、０３２　、
６７５号明ｍ書を引用できる。宿主細胞内での特異的な
コードン利用に適する化学合成遺伝子は、例えば、独国
特許公開第３　、３２７　、００７号（成長ホルモン放
出因子の誘導体）、第３，３２８，７９３号（セクレチ
ン誘導体）、第３　、４０９　、９６６号（ヒトγ−イ
ンターフェロン）、第３，４１４，８３１号（ヒトγイ
ンターフエロン誘導体）、第３，４１９，９９５号（イ
ンターロイキン２および誘導体ンおよび、第３，４２９
，４３０号（ヒルディン誘導体）の明細書に記載された
もの、または、　（公開前の）独国特許公開第３，６３
２，０３７号明細書（カルシトニン）に提示されものを
用いるのが有利である。

レギュレーター領域、βガラクトシダーゼ遺伝子フラグ
メント、必要であれば、アダプターおよび構造遺伝子か
らなる遺伝子構造の適当なベクターへの組み込み、この
ようにして得た複合ベクターの適当な宿主細胞への導入
、宿主細胞の培養、細胞破砕、融合タンパク質の分離と
切断、および所望のポリペプチドの分離は、一般に知ら
れている。この目的のためには、広範に用いられる参考
書およびハンドブックを参照すればよい。

好ましいベクターは、プラスミド、とくに、１）　Ｂ　
Ｒ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ８およびｐ　Ｕ　Ｃ９
のような大腸菌と和合するプラスミドであるが、他の市
販のものまたは一般に人手可能なプラスミドも用いられ
る。好ましい細菌宿主は大腸菌である。

本発明の詳細は、以下の語例に説明される通りである。

例」ぶ− ２０）ｔ　ｇの市販のプラスミドｐ　ＵＣ９（Ｖｉｅｉ
ｒａら：　Ｇｅｎｅ　１９　（１９Ｂ２）　２５９−２
６８；　Ｔｈｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　
Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−ＬＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　１９８４、付録４０頁）を
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩでの二重消化に供
して、１２３塩基対（Ｂ　、ｐ　）の長さのＤＮＡフラ
グメントをゲル電気泳動によって分離して取り出す。こ
のフラグメントは、βガラクトシダーゼのアミノ末端の
コード配列の一部を含む。

βガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシル末端部分から
天然ＥｃｏＲＩ切断部位までを分離するために、２０７
ｔｇのプラスミドｐＵＲ２７０（Ｒｕｅｔｈｅｒおよび
Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ：　ＥＭＢＯＪ、　２（＋９
８３）　１７９１〜１７９４）を先ずＥｃｏＲｌで消化
し、次いで、酵素Ｐ　Ｖ　ＩＩ　Ｉによる部分消化に供
する。

２８９５ＢｐのＤＮＡフラグメントを５％ポリアクリル
アミドゲル上の電気泳動で分画し、これを分離する。

βガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ末端およびカルボキ
シル末端のＤＮＡフラグメントを、１６℃で６時間処理
して連結させ、連結反応産物をエタノールで沈澱させる
。沈澱させ、再懸濁したＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して
、次いで、５％ポリアクリルアミドゲル」二で再分画す
る。３０１８Ｈｐの長さのＤＮＡフラグメントを電気溶
出によってゲルから分離し、これをプラスミドｐＢＲ３
２２のＥｃｏＲＩ切断部位に連結させる。このようにし
て得た複合プラスミドをｐＷＺＲｌと称する。

上記の反応工程を第２図に示す。それぞれの操作は、既
知の方法にて行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇ
ｌｌａｒｂｏｒ　１９８２）。

プラスミドｐｗｚＲｒで大腸菌を形質転換させ、そこで
プラスミドを複製増殖させて、それを再分離する。Ｅｃ
ｏＲＩによる消化によって、アミノ末端およびカルボキ
シル末端が短縮されたβガラクトシダーゼ遺伝子フラグ
メントを切り出し、予備的に分離することができる。既
知の制限酵素切断部位を用いて、この構造をさらに短縮
でき、適当な発現プラスミドに挿入することができる。

第１Ａ図は、このタイプの短縮構造物を示す。

第１Ｂ図は、化学合成リンカ−を有する構造物を示す。

第１Ａ図の構造物および第１Ｂ図の構造物は、ともに、
短縮されたβガラクトシダーゼの読み枠が所望のカルボ
キシル末端ポリペプチドの読み枠と直接に連結するよう
に選択されている。第１Ｂ図の化学合成リンカ−は、所
望のいかなるものでもよいが、適宜にＡＴＧ開始コード
ンを含み、また、停止コードンを含まない読み枠を含有
することが不可欠条件であり、−所望の制限酵素切断部
位を有するものである。

例２： モンキープロインシュリンおよび短縮・修飾したβガラ
クトシダーゼからなる融合タンパク質を、次のようにし
て得ることができる。

１０８ｇのプラスミドｐＷＺＲＩ（第２図）を、制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｌで切断して、７．５％ポリ
アクリルアミドゲル上で分画する。

１２３Ｂｐおよび１２２２Ｂｐの長さのＤＮＡフラグメ
ントを分離する。次いで、等モルのこの二つのＤＮＡフ
ラグメントを１０℃で６時間処理して連結させて、これ
をＥｃｏＲＩで消化する。このようにして得た連結反応
混合物を７．５％ポリアクリルアミドゲル上で分画して
、１３４５Ｂｐの長さのＤＮＡバンドを予備的に分離す
る。このＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩで開環して
から脱燐酸しておいたベクターｐＢＲ３２２に連結する
。

このようにして得たプラスミドを ｐＷＺＰＲＩと称する。

ｐＷＺＰＲＩに含まれる８個のメチオニンのコードン（
Ｍｌ〜ＭＢ）およびこのプラスミドに存在する６個のシ
スティンのコードン（Ｃ１〜Ｃ６）を除去するために、
ｐＷＺＰＰ　ＴからのＤＮＡバンドをＥｃｏＲＩで切断
する。１３４５８ｐの大きさのフラグメントを、Ｅｃｏ
ＲＩで開環してから脱燐酸しておいたファージベクター
Ｍ　１３　ｍ　ｐｌ　９　ａ　ｍ　（Ｐａｔｓｃｈｉｎ
ｓｋｙら：　ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５９（１９８８）　
３４１〜３５３）に連結する。大腸菌ＪＭ１０ｉにトラ
ンスフェクションした後に得られろファージをＭＷＺＰ
ａｍと称する。メチオニンのコードンを除去する最初の
工程としては、ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法（Ｋｒａｍ
ｅｒら：＝Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１２
（１９８４）　９４４１〜９４５６）によるインビトロ
の点突然変異を行わせる。このとき、この方法は効率が
よい（平均７０％）ので、４個のオリゴヌクレオチドｄ
Ｍ５〜ｄＭ８（表１）を変異原性ブライマーとして用い
る。生じた１２個のファージの５ｓＤＮＡの配列決定を
、通常の１７ｍｅｒブライマーの他に、ｄＭ、７および
ｄＣ５（表１）を配列決定のブライマーとして用いて行
う。１２個のＤＮＡのうちの２個は、所望の４箇所全て
に突然変異を有する。すなわち、Ｍ５〜Ｍ８のコードン
は、イソロイシンのコードンに代わっている。これらの
ファージをＭＷＺＰｄＭ５．８と称する。

残りのメチオニンコードンを除くために、ＭＷＺＰｄＭ
５．８のＲＦ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、　１３
４５Ｂｐの大きざのＤＮＡフラグメントを脱燐酸済みＭ
　１３ｒｎｐ　１９　ａｍでクローニングする。このよ
うにして得たファージをＭＷＺＰｄＭ５．８ａｒｎと称
する。このファージの５ｓＤＮＡをｄＭｌ−ｄＭ４を変
異原性ブライマーとして用いるインビトロ突然変異に供
する。

得られたファージ１２個の５ｓＤＮＡの配列決定をする
。１２個のファージのうちの３個は所望の箇所の全てに
突然変異を受けている。すなわち、Ｍｌ〜Ｍ３のコード
ンは、ロイシンのコードンに代わっており、Ｍ４のコー
ドンは、イソロイシンのコードンに代わっている。これ
らのファージをＭＷＺＰｄＭと称する。プラスミドｐＷ
ＺＰｄＭを、これらのファージのＲＦ型からの１３４５
８ｐＥｃｏＲＩフラグメントを脱燐酸しておいたベクタ
ーｐＢＲ３２２でクローニングして得る。さらに、シス
ティンのコードンをセリンのコードンに変換するために
、ｐＷＺＰｄＭからの１３４５［３ｐＥｃｏＲＩフラグ
メントを分離して、脱燐酸した）７−ジベクターＭ１３
ｍｐ　１９ａｍでクローニングする。このようにして得
たファージＭ　Ｗ　Ｚ　Ｐ　ｄ　Ｍ　ａ　ｍの５ｓＤＮ
Ａを、変異原性ブライマーとしてｄｃ１〜ｄＣ６を用い
るインビトロ突然変異に供する。生じたファージ２４個
の５ｓＤＮＡの配列決定を行う。４個のファージクロー
ンが、全てのシスティンのコードンがセリンのコードン
に転換した正しいものであることがわかる。これらのフ
ァージをＭＷＺＰｄＭｄＣと称する。これらのファージ
のＲＦ　　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、１３４５Ｂ
ｐのＥｃｏＲＩフラグメントを脱燐酸したベクターｐＢ
Ｒ３２２でクローニングして、プラスミドｐＷＺ　ｐｄ
ＭｄＣを得る。

このようにして得たＥｃｏＲＩ切断部位にはさまれてい
るβガラク）・シダーゼ遺伝子のフラグメントを、細苗
のレギュレーター領域およびモンキープロインシュリン
をともにＥｃｏＲ１切断部位を介して連結しているプラ
スミドに、次のようにして組み込むことができる。

ｌＯμ８のプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＰ　ｖ　ｕ　ＩＩて消化し、次いで、ＥｃｏＲ
Ｉ切断部位でクレノウボリメラーゼを用いた埋填反応を
行わせる。５％ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電
気泳動による分画の後、２２９３Ｂｐの長さのプラスミ
ドフラグメントを電気溶出によって得ることができる（
第３Ａ図）。

プラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだモンキープレプロ
インシュリンＤＮＡ（表２、Ｗｅｔｅｋａｍら：Ｇｅｎ
ｅ　１９　（１９８２）　１７９−１８３）を制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＦｓｐｌで消化して、プラスミド
から分離し、これを次のようにしてプラスミドｐ　Ｕ　
Ｃ９で再クローニングする。すなわち、プラスミドｐＵ
Ｃ９を酵素Ｂａｍ）ｆＴで切断して、切断部位でクレノ
ウボリメラーゼ（大フラグメント）を用いた標準的な埋
填反応を行う。次いで、制限酵素）ｉ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ
で切断して、ＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で他のＤＮＡフラグメントから分離する。分離され
た約１２５０８ｐの長さのインシュリ・ンＤＮＡフラグ
メントを開環したプラスミドに組み込むととが可能であ
った。叩訳されない領域および前配列を除去するために
、Ｈａ　ｅ　ＩＩＩによる消化を行い、！４３Ｂｐの長
さのフラフメンｌ−を限定し、た酵素条件ＴＢａ１３１
て消化し・で、前配列から最後の２個のヌクレオチド°
を切り出す。このようにして、アミノ末端の最初のコー
ドンとしてＴＴＴを得る。これは、Ｂ鎖の最初のアミノ
酸としてのフェニールアラニンを表す。

ここで、ＥｃｏＲｌに特異的なアダプターを、このフラ
グメントと平滑末端連結反応で連結する。

鳳）　５１　　　＾Ａ丁ＴＡ？　Ｃ；ＡＡ　？ＴＣＣＣ
Ａ　ＧＯＡ　ＣＧｃＧＯＧ　Ｇｉ　ＧＧＣｅｏ’Ｔ　に
（Ｅｃｏ　Ｒ１）　　　τＡ　ＣＴＴ　ＡＡＣＣ（ｒ　
ＣＣＴ　ＣＣＯＣＣＣＣＣＡ　Ｃ（：ＣＣＣＡ　ＣＣＣ
ＣＣＣＧｃＡ　　Ｏｃ′Ｔ　ＣＣＴ　　ＣＴＣＣにＴ　
　にＧＯＡ　　（１４ｃ　　ＣＣＴ　ｃｃ八　ｃｓｃ　
　ｃｃｃＣＣＧ　　ＣＣＴ　　ＣＣＡ　　ＣＣＡ　　Ｃ
ＣＧ　ＣＣＡ　　ＣＣＴ　　ＣＣＯＣＣＡ　　Ｃ（Ｔ　
　ＣＣＯＣＣＣＣＣτ八τＧ Ｃ（へ　ＴＡＣ ＣＴＡＧＡ ＣＣＡ　２０丁 アダプターの重合反応を避けるために、連結反応ではこ
れらを燐酸化しないで用いた。アダプターａ）は末端に
メチオニンのコードンを、アダプターｂ）はアルギニン
のコードンを有している。したがって、ａ）を用いて得
た遺伝子産物は臭化シアンによる切断で細菌部分の除去
が可能であり、一方、ｂ）を用いた場合にはトリプシン
切断がＤＴ能である。

連結反応産物をＭ　ｂ　ｏ　Ｈで消化する。ゲル電気泳
動による分画によって、１３９Ｂｐの長さで、かつ、Ｂ
鎖のアミノ酸第】〜２１の情報を有するＤＮＡフラグメ
ントを得る。

プロインシュリン分子の残りの情報の遺伝子（クローニ
ングからのＧ−Ｃ配列および終止コードンに続＜　ｐＢ
Ｒ３２２からの２１８１を含む）を、完全なモンキープ
レプロインシュリンの情報を有するｐＵ　Ｃ９プラスミ
ドから、Ｍ　ｂ　ｏ　ＩＩ　／Ｓｍａ　Ｉによる消化お
よび約２４０８ｐの長さのＤＮＡフラグメントの分離に
よって得る。約３８０８ｐの長さの正しい連結反応産物
（７８８１１のアダプターを含む）を、二つのプロイン
シュリンフラグメントの連結によって得ろ。このように
して構築したプロインシュリンＤＮＡフラグメントは、
ここで、ＥｃｏＲＩ−陰性切断部位を介してレギュレー
ター領域と連結することができる。

反応の全組、過を第３Ｂ図に示す、図中、Ａ、　Ｂおよ
びＣは、プロインシュリン分子の関連ペプチド鎖のＤＮ
Ａを表し、Ａｄは（脱燐酸した）７ダブター（ａまたは
ｂ）を表し、Ｐｒａｅはモンキープレプロインシュリン
の前配列のＤＮＡである。

例３： ＢａｍＨＩ認識配列、ｌａｃオペレーター、細菌性プロ
モーターおよびリポソーム結合部位（ＲＢ）およびＲＢ
から６〜１４ヌクレオチド離れたところのＡＴＧ開始コ
ードン、さらに、それに続＜Ｅｃ　ｏＲＩ認識配列から
なる化学合成したレギュレーター領域く第３Ｃ図）を、
共通のＥｃｏＲＩ重複領域を介して上記の例で得たプロ
インシュリン遺伝子フラグメントと連結させる。

Ｓｍａ　Ｉ／ＢａｍＨＩによる二重消化およびフレノウ
フラグメントによるＢａｍＨＩ切断部位の埋填反応の後
、連結反応産物く約４８０８ｐ）をゲル電気泳動で分離
する。

このようにして得たフラグメントを平滑末端連結によっ
て第３Ａ図に示すｐＢＲ３２２の部分プラスミドに連結
することができる（第３Ｄ図）。

複合プラスミドｐＷＩ６が得られる。

大腸菌株ｉ（Ｂ　１０１ての形質変換およびアンピシリ
ンプレート上での選択の後、個々のクローンのプラスミ
ドＤＮＡを、レギュレーター領域およびＢａ１３１によ
る短縮プロインシュリン遺伝子を有する１Ｌ８０Ｂｐフ
ラグメントの取り込みについて調べたａ　　Ｂａ１３１
によるプロインシュリンの正しい短縮（第３Ｂ図）を確
かめるために、組み込まれたプロインシュリンフラグメ
ントを有するプラスミドについて、ＥｃｏＲＩ切断部位
から始めて配列決定を行った。

配列決定した６０個のクローンのうちの３個のクローン
が二つのヌクレオチドの所望の短縮を有していたく第３
Ｄ図）。

複合プラスミドｐＷＩ６を、第１ＡおよびＢ図に示した
βガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントの組み込みの出
発材料としてここで用いる。この反応を、第１Ａ図の２
．に細部を示し、かつ、メチオニンおよびシスティンの
コードンの全てを他のアミノ酸のコードンに置換した短
縮βガラクトシダーゼ遺伝子のクローニングによって、
例示する。すなわち、短縮・修飾したβガラクトシダー
ゼ遺伝子配列（約１２０８ρのアミノ末端領域および１
．２２０８ｐのカルボキシル末端領域からなり、２個の
ＥｃｏＲＩ切断部位を両側に有する）およびＥｃｏＲＩ
で切断した複合プラスミドｐＷ［６く第３Ｄ図）の、等
量モルを連結する（第４図）。

βガラクトシダーゼΔＭ１５欠失のインディケータ−細
菌（Ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｓｅ　０ｐｅｒｏｎ、　Ｅｄ、
　Ｊ。

＆ｅｃｋｗｉ　Ｌｈおよびり、　Ｚｉｐｓｅｒ：　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｔｌ　ａ　ｌ″ｂ　ｏ　ｒ、１９７
０）で形質転換を行う。その結果、インディケータ−染
料Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルβ−ローガラクトシド）と反応して青色になる細菌コ
ロニーのみが、正しい位置方向にβガラクトシダーゼ遺
伝子フラグメントを鞘み込んでいるものである。種々の
短縮βガラクトシダーゼ遺伝子のプラスミドへの組み込
みは、いずれも制限酵素を用いる標準法によって検出で
きる。

このようにして得たプラスミドｐＷＺＩＰｄＭｄＣを、
βガラクトシダーゼ合成のインデューサーであるＩＰＴ
Ｇ（イソプロとルーβ−ローチオガラクトピラノシド）
で誘発して、次いて、βガラクトシダーゼタンパク質お
よびプロインシュリンの融合産物を産生ずる能力を調べ
る。この産物の全細胞タンパク質に占める割合は、約１
５〜２０％である。産物は不溶性で、他の細胞成分およ
びタンパク質から遠心分離によって容易に分離される。

第１ＡおよびＢ図に列挙した他の短縮βガラクトシダー
ゼ遺伝子も同様にしてプラスミドｐＷＩ６（第３Ｄ図）
に組み込むことができ、大腸菌で同様の合成能を有する
不溶性融合タンパク質を得る。

アダプターａを選゛ぶかｂを選ぶかによって、プロイン
シュリンを臭化シアンによって融合タンパク質から切り
出すか、または、トリプシン消化後にインシュリン誘導
体Ｂ　３１　Ａ　ｒ　ｇを得ごとができる。この誘導体
からは、カルボキシペプチダーゼＢによる酵素切断によ
ってアルギニンを除去する。このようにして遊離してく
るプロインシュリンまたはインシュリンを、標準法にて
精製することができる。

例４ニ プロインシュリンおよびβガラクトシダーゼ遺伝子フラ
グメントを有する融合発現プラスミドの調製のための出
発構造物として用いるｐｗｒｅのようなプラスミドは、
他の遺伝子産物の発現にも有利に利用できる。この目的
のために、１０μｇのプラスミドｐＷＩＢを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＰｖｕｌｌで切断する（第５図）。開環
・短縮されたプラスミドをプロインシュリン遺伝子フラ
グメント（長ざ３２４　Ｈｐ）から５％ポリアクリルア
ミドゲル上で分離する。プラスミドフラグメントをポリ
アクリルアミドゲルから調製分離した後、このよう【こ
して開環したブラスミｌ−に、Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　ＬＪＪ
１析部位を別にしてその他のそれぞれ単一の制限酵素切
断部位１部位を多数有する化学合成りＮＡ配列を連結す
ることが可能である。

（ＥｃｏＲｌ）　　ｇｓｔ！　　　！ｆｍａ！　　Ｂ−
Ｉ　　Ｘｂａ！　　ｇｍｌ！　　ＰｓｔＸコ’　　　Ａ
Ａ　’ｎ’ｃ　ａｘＧｃ’ｒｃ−ａｃＣｃｃｃ　ｃｃＡ
　’ｒｃｃ　ＴＣＴ　ＡＯＡ　ＣＴＣにＡ（：　ｃτｃ
　ＣＡＧｓ’　　　　　　　　（：　ＣＴＣＣＡａ　　
ＣｃＧ　ｃｃｃ　　ｃｃ；τ＾Ｇｃ　ＡＣＡ　丁Ｃτ　
ＣＡＯＣ’！’Ｇ　　ＯＡＣＣ；Ｔにのようにしてプラ
スミドｐ＼ＶＢ−１＜第５図）を得る。このプラスミド
：よ、レギュレーター領域の他に、多数の各々単一の制
限酵素切断部位を有し、天然由来および合成による［憂
々の遺伝子のクローニングに適したＤ　Ｎ　Ａ配列を包
含している。

１クリ２と同様にして、ポリ（アミノ該）配列のＤＮＡ
および適当な切断部位を有する化学合成アダプターを各
遺１云子の上流に挿入することができる。レギュレータ
ー領域とマルチプルクローニングサイト（ＭＣ５）との
間にはＥｃｏＲ［の単一制限酵素切断部位があって、例
３と同様にしてこの中に種々の変異型の各短縮βガラク
トシダーゼ遺伝子を連結することが′できる。

２μ８のプラスミドｐＷＢ−１のＤＮＡをＥｃｏＲＪで
切断し、次いで、脱燐酸する。

ＥｃｏＲＩによる切断によってｐｗｚ　Ｉ　ＰｄＭｄＣ
から得ておいた短縮・修飾βガラクトシダーゼ遺伝子フ
ラグメントな、このように処理したベクター内に連結す
る。大腸菌細胞の形質転換および発現の選択の結果、短
縮・ｆ１蒼飾βガラクトシダーゼ遺伝子の下流に上記の
マルチプルクローニングサイトを含有するｐＷＺＰＷＢ
ｌ　　ｄＭｄＣを得る（第５図）。

例５： 化学合成した遺伝子の組み込みの例として、カルボキシ
ル末端にグリシンを付加したサケカルシトニンのアミノ
酸配列を有する融合タンパク質の調製法を以下に述べる
。

表３に示したカルシトニンの化学合成りＮＡ配列は、ヌ
クレオチド配列が大腸菌のコードン利用に特異的に適す
るものであって、５゛末端にＢａｍＨＩｒ突出」を有し
、最初のアミノ酸のコードンの上流に１５個のグリシン
残基なコードするアダプターおよびメチオニンコードン
を有し、さらに、３゛末端にはプロリンコードンに続い
てグリシンコードン、２個の終止コードンおよび５ｐｈ
ｌ　ｒ突出」を有している。このカルシトニンＤＮＡ配
列を制限酵素ＢａｍＨＩおよび５ｐｈＩで開環しておい
たプラスミド ｐＷＺＰＷＢＩ　　ｄＭｄＣ中でクローニングする。

プラスミドＩ）　ＷＺ　Ｐ　　ｄ　Ｍ　ｄ　Ｃｃａｌｃ
、を得る。

既知の方法によってこのプラスミドで大腸菌を形質変換
させることができ、プロインシュリン融合タンパク質の
場合と同様にして対応する融合タンパク質をそこで発現
させて分離する。ガラクトシダーゼ部分を臭化シアンで
切り通して、次いで、既知の方法で精製を行う。

表二１ メチオニンのコードンをロイシンまたはイソロイシンの
コードンに変換する、またはシスティンのコードンをセ
リンのコードンに変換する、変異原性ブライマー： 区６５’−ＣＣＧ　ＣＣＴＣＣＣＣｆ１Ａ　Ｃ；ＣＣ；
　ＣＡＯＡＣＣ去二２ Ｂ１、Ｃ１およびＡ１は、モンキープロインシュリンの
Ｂ、　　Ｃおよびへ鎖の開始点を表す。

去二１ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｍ　ＶａＩＬｅｕ　Ｃ１
ｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　５ｅｒＣＴＴ　ＴＣＣＡＣＴ　Ｔ
ＣＣＣＡＴ’！’　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ｋＡＧ　ＣＴＴ　
ＴＣ’ｒＣＡＣＡＯＣＴＧＡ　ＡＣに　ＣＡＡ　ＣＡＡ
　ＣＣＡ　ＴＴＣＧｋＡ　ＡにＡユ４　　　ｉｓ　　　
１６　　１７　　１８　　　ユ９　２０　　２１　　２
２　　２３ｃｌｎ　にｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　
Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

ＣＡＯＣＡＡ　　ＣＴｉ’　　ＣＡＴ　　ＡＡＡ　ＣＴ
Ｇ’ＣＡＧ　　ＡＣＣτへＴ　　ＣＣＣ（ＴＣＣＴＴ　
ＧＡＡ　（ｉＴＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣにＴＣ丁ＧＯＡＴＡ
　（ＸＩ；Ｃ２４２５２６２］　　２Ｂ　　　２９　　
３０　　３１　　３２　　　コ３ＣＣＩ；ＣＡＣＴ　Ａ
ＡＴ　ＡＣＣ（、ＣＴＣＴＣＴ　ＧｏτＡＣＣＣ（：Ｔ
　ｒＧＣＧ　“ゴ゛ＧＡ　　ＴＴＡ　　ＴＧＧ　　（：
ＣＧ　ＡにＧＡ　　ＣＣＡ　　ＴＯＯ（１；ＧＡ　　Ｃ
ＣＡＳｔｐ　　５ｔｐ τＡＡ　ＴＡＣＣＡＴ　Ｇ　　３’ ％ＴＴ　ＡＴＣＳ’

【図面の簡単な説明】

第１図は、リンカ−を含まない（Ａ１．〜５．）および
リンカ−を含む（Ｂ１．　〜５．）、短縮したβガラク
トシダーゼ配列の構造を示す、説明図である。 第２図は、プラスミドｐＷＺＲＩ　（ｐＵｃ９およびｐ
ＵＲ２７０からの、βガラクトシダーゼフラグメントを
含むプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体）の構築を示す、
説明図である。 第３Ａ〜３Ｄ図は、モンキープロインシュリンＤＮＡを
有するプラスミドｐ　Ｗ　Ｉ　６の構築を示す、説明図
である。 第４図は、ｐＷＩ６（第３Ｄ図）からのプラスミドｐＷ
ＺＩＰＷＢｌ　　ｄＭｄＣの構築を示す、説明図である
。 第５図は、ｐＷＩ６（第３Ｄ図）およびｐｗｚｒｐ　　
ｄＭｄＣ（第４図）からのプラスミドｐＷＺＰＷＢ１　
　ｄＭｄＣの構築を示す、説明図である。ｐｗｚｐｗＢ
ｉ　　ｄＭｄＣは、所望のポリペプチドの発現のための
遺伝子の挿入を可能にするポリリンカー（ＭＣＳ）を含
有する。 出１原人代理人　　　　　　　　佐二Ｓ−・ｌユ５′３
゛ ＥｃｏＲＩ ＦＩＧ、３Ｃ Ｐｖｕｌｌ−／Ｓｍａｌ− ＦＩＧ、４ ρＷ＋６ ＭＬ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、遺伝子的にコード可能なポリペプチドの構造遺伝子
   を、正しい読み枠中においてβガラクトシダーゼまたは
   βガラクトシダーゼフラグメント遺伝子を介してレギュ
   レーター領域と結合させ、この遺伝子構造物を細菌内に
   導入し、そこで不溶性融合タンパク質を発現させ、細胞
   破砕後にこれを単離して、所望のポリペプチドを化学的
   または酵素的に切り出す方法であって、βガラクトシダ
   ーゼまたはβガラクトシダーゼフラグメントの遺伝子中
   のメチオニンおよび／またはアルギニンおよび／または
   システインのコードンを一部または全体的に他のアミノ
   酸のコードンに置換することを特徴とする、遺伝子的に
   コード可能なポリペプチドの製造法。 ２、遺伝子構造物が、２５０個より多いがβガラクトシ
   ダーゼの全配列よりは有意に少ない数のアミノ酸を有す
   るβガラクトシダーゼフラグメントをコードする、請求
   項１に記載の製造法。 ３、βガラクトシダーゼフラグメントがアミノ末端およ
   び／またはカルボキシル末端の部分配列の融合物からな
   る、請求項１または２に記載の製造法。 ４、βガラクトシダーゼフラグメントが約 ３００〜約８００個のアミノ酸を有する、請求項１、２
   または３に記載の製造法。 ５、βガラクトシダーゼフラグメントが約 ３２０〜約６５０個のアミノ酸を有する、請求項１〜４
   のいずれか１項に記載の製造法。 ６、βガラクトシダーゼフラグメントの遺伝子が第１図
   に示したＤＮＡ配列に対応する、請求項１〜５のいずれ
   か１項に記載の製造法。 ７、遺伝子的にコード可能なポリペプチドの構造遺伝子
   が、アダプターを介して、修飾されたβガラクトシダー
   ゼまたはβガラクトシダーゼフラグメントの遺伝子と連
   結している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造
   法。 ８、アダプターがポリ（アミノ酸）配列をコードする、
   請求項７に記載の製造法。 ９、βガラクトシダーゼ部分からのポリペプチドの化学
   的または酵素的な分離を可能にするアミノ酸のコードン
   が構造遺伝子のアミノ末端のすぐ上流に位置している、
   請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造法。 １０、遺伝子的にコード可能なポリペプチドが、成長ホ
   ルモン放出因子の誘導体、インターフエロン、プロイン
   シュリン、セクレチン、インターロイキン２、カルシト
   ニンまたはヒルディンである、請求項１〜９のいずれか
   １項に記載の製造法。 １１、レギュレーター領域、メチオニンおよび／または
   アルギニンおよび／またはシステインのコードンを一部
   または全体的に他のアミノ酸のコードンに置換してある
   修飾したβガラクトシダーゼまたはβガラクトシダーゼ
   フラグメント、および遺伝子的にコード可能なポリペプ
   チドの構造遺伝子を含んでなる、遺伝子構造物。 １２、遺伝子的にコード可能なポリペプチドの構造遺伝
   子が、正しい読み枠を保証するアダプターを介して、修
   飾したβガラクトシダーゼまたはβガラクトシダーゼフ
   ラグメントの遺伝子に連結した、請求項１１に記載の遺
   伝子構造物。 １３、請求項１１または１２に記載の遺伝子構造物を含
   むベクター。 １４、請求項１３に記載のベクターを含む細菌。 １５、請求項１３に記載のベクターを含む大腸菌（Ｅｓ
   ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）。 １６、請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾したβ
   ガラクトシダーゼまたはβガラクトシダーゼフラグメン
   トと真核細胞の遺伝子的にコード可能なポリペプチドと
   を含んでなる、融合タンパク質。 １７、真核細胞の遺伝子的にコード可能なポリペプチド
   部分が、成長ホルモン放出因子の誘導体、インターフエ
   ロン、プロインシュリン、セクレチン、インターロイキ
   ン２、カルシトニンまたはヒルディンである、請求項１
   ６に記載の融合タンパク質。