JPS6236183A - サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａ−
ｒＯｍ７（ｅ８　ＣｅｒｅｖｉＢｉａｅ　）酵母の遺伝
子修飾された菌株におけるポリペプチドの改良された発
現、およびその菌株からのポリーＥ’プチドの改良され
た分泌のための物質および方法に関する。より詳細には
、本発明は酵母細胞からの約２００個以上のアミノ酸か
ら成る大きなポリペプチドを含めた異種ポリペプチドの
分泌を一層効果的に促進する組換え体ベクター、該ベク
ターで形質転換された酵母細胞、ならびに該形質転換酵
母細胞を培養することから成る異種ｙｌ　ＩＪ−？プチ
ドの生産方法に関する。

従来の技術 意図するばＩＪ　Ｏプチドを産生させるために、酵母菌
株を遺伝子修飾することは多くの利点をもたらすと認め
られている。通常組換え体ベクターの宿主として使用さ
れる原核細胞のように、酵母はすみやかに増殖し且つ特
定のタンパク質を大量に生産する能力を有している。さ
らに、酵母細胞は真核細胞であって、組換え体ベクター
から発現された異種融合ポＩＪ　Ｏプチビを正確にプロ
セッシングして意図する異種タンパク質の生物学的に活
性な形を生産するための酵素（原核生物は含まない）を
保有する。

酵母菌株を組換え体ＤＮＡ−、’クターの宿主として使
用することへの重大な制限は、酵母細胞の細胞壁がポリ
はプチドの培地への分泌に対して示す障害である。酵母
内で発現されるが細胞壁を通って培地へ分泌されない異
種タンパク質を高収率で精製することは困難であり、し
かも費用がかかることである。

酵母細胞からタンパク質を分泌するだめの複雑な経路が
存在し、これらには小胞体、ゴルジ装置および分泌小胞
が含まれる。

酵母細胞内で発現されたポ１７０プチビが酵母の分泌経
路を横切り、細胞壁を通って、培地へ分泌されるために
はいくつかの因子が関係する。第一に、遺伝子の発現の
過程において、分泌されるべきポリはプチドのＮ−末端
に適当なリーダーペプチドが融合されねばならない。リ
ーダーペプチドの第一の機能は、分泌されるべきポリベ
プチドヲ小胞体の中へ導入することである。その後、リ
ーダーペプチド−ポリベプチト９融合タンパク質はいく
つかの工程を経てグリコジル化される。これらのグリコ
ジル化工程のあるものは、融合タンパク質の一次および
三次構造の状態と同様に、分泌されるべきホリハプチド
が小胞体からゴルジ装置へ、ゴルジ装置から培地への分
泌のために分泌小胞へ移行する（細胞周辺腔、原形質膜
、リソソームまたは液胞のような他の場所には移行しな
い）際の信号として役立つ。分泌経路の１つまたはそれ
以上の箇所で、リーダーペプチドまたはその一部は、少
なくとも若干の分泌されるべきポリＲプチドがそのＮ−
末端にリーダー由来のアミノ酸を保有しない状態で培地
に分泌されるように、タンパク質加水分解により切断さ
れる。

酵母の分泌過程は非常に複雑であり、しかもリーダーペ
プチビーポリはプチド融合タンパク質の一次および三次
構造の変化過程に対する作用がほとんど理解されていな
いので、特定の異種融合タンノクク質（酵母を形質転換
した異種遺伝子から発現および分泌される対象のポリＲ
プチドに融合された特定のリーダーを含む）が改良され
た収率で意図するポリーｅプチドの培地への分泌をもた
らすかどうかについては相当に不確かである。

組換えＤＮＡ−コード化ポリはプチト＃全サッカロミセ
ス・セレビシエから分泌させる手段として、サッカロミ
セス・セレビシエのα交配因子（’ＡＭＦ’）の８９個
のアミノ酸から成るリーダー配列は相当に興味が持たれ
ている。また１α因子１と呼ばれるＡＭＦはＳ．セレビ
シエ酵母のα−株によって分泌される短い１３個のアミ
ノ酸から成るペプチドであり、次の配列： ｔｒｐ−ｈｉｓ−ｔｒｐ−ｆｉｅｕ−ｇＱｎ４ｅｕ４ｙ
ｓ　−ｐｒｏ−ｇ４ｙ−ｇｆｌｎ−ｐｒｏ−ｍｅｔ−ｔ
ｙｒで表わされる。このはプチドはＳ．セレビシエ酵母
のａ−株の注意を引いて、α−株とａ−株の間の接合（
交配）を促進するフェロモンとして作用する。α因子は
元来比較的長い前駆体タンパク質であるプレプロα因子
（リーダーペプチドヲ含む）のセグメントとして発現さ
れる。プレプロα因子のアミノ末端部分であるリーダー
にプチトゝはＳ。

セレビシェ酵母の分泌経路を通って４つの短いα因子は
プチド単位を分泌させるのに役立つ。

α因子のリーダーはプチト９は他のポＩＪ　Ｓプチドを
分泌させるために使用できることが認められている。α
因子、その前駆体タンパク質、および他のＲプチドの分
泌を促すためのα因子リーダーはプチビの使用に関する
論文は、例えばビター（Ｇ。

ＵＳＡ　８１，５３３０へ５３３４（１９８４）；シン
９３３へ９４３（１９８２）；欧州特許出願第（１１２
３２２８号、同第（１１２３２９４号、同第（１１１４
６９５号および同第（１１１６２（１１号の各明細書に
開示されている。例えば、欧州特許出願第（１１２３２
２８号は、合成ヒトインシュリン様成長因子−工（工Ｇ
Ｆ−））およびヒトインシュリン様成長因子−ＩＩ　（
ＩＧＦ’−ｎ）ポＩＪ　ＯプチビのＳ。

セレビシェによる発現および分泌を得るために、合成Ｉ
ＧＦ’−ｉおよびＩＧＦ’−［遺伝子のα因子リーダー
ペプチドへの結合を述べている。

これらの機構において、α因子リーダーペプチドヲコー
ドするＤＮＡ配列はα因子はプチド単位をコードする下
流のＤＮＡ配列から切断され、そしてこのリーダーベプ
チｈ”ｔ−コードするＤＮＡ配列（またはリーダーのカ
ルボキシ末端のプロセッシング部位における一定のアミ
ノ酸のためのコーディング配列を含まないその一部分）
がＳ．セレビシエから分泌させたい外来性または異種ポ
リペプチドヲコードする外来性ＤＮＡ配列と組み合わさ
れた。この種の融合遺伝子で形質転換した酵母を培養す
る場合、いくつかの例においてそのポリはプチドの発現
および培地への分泌が得られる。

しかしながら、この方法は一般に成功しない。多くの場
合、培地への分泌は極めて低いレベルである。また他の
例においては、意図する生産物がたとえ発現されても細
胞内で加水分解により切断されないならば細胞内に残存
したままであるので、培地への分泌は全く起こらない。

明らかなように、約１００個以上のアミノ酸から成る完
全な大きいポリペプチドの分泌をα因子リーダーを用い
て得ることは困難であることが観察された。大きいポリ
ペプチドヲ分泌経路中のオルガネラからオルガネラへ効
率よく輸送することの失敗が一部原因している。また、
分泌経路の適当な箇所例えばゴルジ装置内でこの種のポ
リペプチドをα因子リーダーペプチドから切断する機構
の失敗も、ポリペプチド分泌の失敗をもたらす。

α因子リーダーにＮ−末端で結合した大きな、球状の異
種ポリペプチドをα因子リーダーペプチドから切断する
機構の失敗は、少なくとも一部、リーダーのカルボキシ
末端に存在し且つその大きな、球状の、異種ポリペプチ
ドのアミン末端に隣接するプロセッシング部位に対する
タンパク質分解プロセッシング酵素作用の立体障害が原
因である。

たとえ若干の異種ポリペプチドが酵母細胞から培地へ分
泌されるとしても、分泌前、分泌中または分泌後に起こ
りうるポＩＪ　　６プチドの加水分解またはその他の修
飾によって、十分な生物活性を有する完全なポリペプチ
ドの回収が制限される。例えば、Ｓ．セレビシエ酵母細
胞（β−二ノンドルフィンコードするＤＮＡ配列がα因
子リーダーＲプチドヲコードするＤＮＡ配列に結合され
ている）からのβ−二ノンドルフィン効率のよい分泌が
観察されたが、培地からの全長β−エンドルフィンの回
収はその分泌ペプチドが加水分解されることにより非常
に低い。同様に、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）をコ
ードするＤＮＡ配列がリーダーペプチドヲコードするＤ
ＮＡ配列に結合されたベクターを使って形質転換した酵
母細胞からＧＲＦが分泌された。しかしながら、ＧＲＦ
ポリホプチビのメチオニン残基のスルホキシド化ならび
にそのポＩＪ　＜プチドの加水分解は、十分なＧＲＦ’
活性を有する全長ベゾチドの回収を制限すると考えられ
る。

Ｓ．セレビシエ酵母細胞の培養物から培地へのポＩＪ　
＆プチドの一層効率のよい分泌に対する要求、特にα因
子により促進される生物学的に活性な形のポリペプチド
の酵母細胞から培地への分泌に対する要求が依然として
残っている。さらに、Ｓ。

セレビシェ酵母から培地へ分泌させたいポリはプチドヲ
安定化して、加水分解やその他の修飾によるそれらの生
物活性の消失を防ぐ必要性が存在する。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、８９個のアミノ酸から成るα因子リーダーに
プチビまたはそのリーダーにプチト９の修飾体ヘアミノ
末端で融合された対象ホリハプチドから成る融合ホリハ
プチトヲコードシ且つＳ．セレビシエ酵母細胞内で発現
される遺伝子を含むベクターを使って、形質転換した該
酵母細胞からの対象ポＩＪ　＜プチトゝの改良された分
泌を提供する。

本発明の１つの面において、ある種の異種ポリはプチド
（とりわけ約２００個以上のアミノ酸を有する大きい、
球状のホリハプチビ）の培地への分泌は、１つまたは２
５）（３つまたは４つではない）のα因子はプチビ単位
（その単位が１つより多い場合は介在プロセッシング部
位を含む）のセグメントがα因子リーダーはプテドのカ
ルボキシ末端に結合されたままであり且つ対象の異種（
外来性）ポリペプチドのアミン末端に結合された融合ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現（フタ−
（例えば組換え体プラスミド）ヲ作製することにより、
高められることが見出された。

このＤＮＡ配列はα因子単位セグメントのアミン末端に
融合したプロセッシング部位セグメントおよびα因子単
位セグメントと異種ペプチドの間のプロセッシング部位
ベプチ）−＃ヲコービする。リーダーペプチドとα因子
単位セグメントの間のプロセッシング部位は、通常８９
個のアミノ酸から成るα因子リーダーペプチドのカルボ
キシ末端へキサペプチドａｘｙｓ−ａｒｇ’−ｇｆｔｕ
−ａｆｉａ−ｇｆｉｕ−ａｆｉａである。α因子単位セ
グメントと対象の異種ポリはプチドの間のプロセッシン
グ部位は、以下で詳細に述べるような多数の配列のうち
のいずれかを有する。明らかに、この種のベクターによ
ってコードされる融合タンパク質において改良された分
泌が達成される１つの理由（恐らくはいくつかの理由の
うちの１つ）は次の通りである：すなわち、１つまたは
２５）のα因子単位がリーダーペプチドと異種生産物ホ
リハプチドとを空間的に分離する前駆体ポリペプチド″
を作ることにより、プロセッシング部位（これらの部位
で生産物ポＩＪ−Ｚプチドがリーダーペプチドおよびα
因子単位から分泌過程中に加水分解により切断されて、
所望配列の異種ホ＋Ｊ　Ｏプチドが培地へ分泌される）
がα因子単位の不在下にあるものよりもタンパク質分解
酵素に一層接近しやすくなる。その結果、異種ポＩＪ　
ハプチドからのリーダーペプチドとα因子はプチドの切
断がリーダーペプチド単独の切断よりも一層効果的に進
行し、正確にプロセッシングされた異種ポリペプチドは
培地へ分泌されやすくなる。ここで述べた立体効果以外
にも本発明のこの面に関与する他の要因が恐らく存在す
るであろうが、これらの他の要因は明らかでない。

本発明の特定の面によれば、ヒトプロウロキナーゼ（す
なわち、英国特許出願第２１２１０５０号に記載の高分
子量の、４１２個のアミノ酸から成るヒトプロウロキナ
ーゼ）がＳ．セレビシエ細胞内で生産される。プロウロ
キナーゼの分泌は、ウロキナーゼ−コード化ヌクレオチ
ド配列がリーダーはブチビーコード化配列（リーダーＲ
プチド−コード化配列の３′末端にプロセッシング部位
−コード化配列を含む）および１つまたは２５）の因子
ぼブチビーコード化配列によって先行され、さらにα因
子ぼブチビーコード化配列の後にプロセッシング部位−
コード化配列を有するＤＮＡ配列ヲ用いて、融合前駆体
ポリはプチドをコード化することにより促進される。

さらに本発明によれば、タンノξり質の加水分解および
その他の活性−低下修飾を抑制する修飾によって、実質
的な生物活性が発現および分泌されたタン・ξり質にお
いて保持された。ＤＮＡ−コード化され、修飾された類
似体異種はプチド（特に修飾ＧＲＦ’）が提供される。

さらに本発明によれば、Ｓ．セレビシエ酵母のａ−株（
すなわち交配型ａまたはＭａｔ　ａ−株）が、α因子遺
伝子プロモーターの制御下で、α因子リーダーはプチト
ゝおよび分泌されるべき異種はプチドを含む融合ポリペ
プチドを発現する発現ベクターで形質転換される。驚く
べきことに、ａ−株においてこの種の発現ベクターを使
用することによる異種ポリペプチドの発現および分泌は
、α−株（すなわち交配型αまだはＭａｔα−株）にお
いてそのベクターを使用することによる発現および分泌
と同等である。

本発明はまた、ある種のタン・ξり質分解機能を破壊す
ることにより異種生産物ポリはプチドの分解を抑えるよ
うに修飾されたＳ．セレビシエ菌株の使用により、Ｓ．
セレビシエ酵母からのポＩＪ　−ｅプチドの改良された
回収を提供する。

最後に、本発明は本発明によるＳ．セレビシエ細胞（す
なわち、本発明による発現ベクターで形質転換されるこ
とにより、異種ポリペプチドのＮ−末端に融合されたα
因子リーダーペプチドまたはその修飾体を含む融合タン
パク質の一部として異種ポリはプチドヲ発現するＳ．セ
レビシエ細胞）を培養することによる異種ポリＲプチド
の生産方法を提供する。

問題点を解決するだめの手段 本明細書において、”　ＡＭＦ”は“α交配因子を意味
し；１α因子リーダーＲプチドはカージャンらの七ｋ　
（Ｃｅｌｌ）　３０．９３３〜９４３　（１９８２）に
よって報告されたＳ．セレビシエα交配因子遺伝子によ
りコードされるタンパク質の最初の８９個のアミノ酸か
ら成るポリはプチドを意味し、その８９個のアミノ酸の
カルボキシ末端にヘキサはプチト’　Ｑｙｓ−ａｒｇ−
ｇｆｌｕ−ａｆｉａ−ｇｆｉｕ−ａｌａから成るプロセ
ッシング部位を含み；１プレα因子セグメント１または
ｌ　ＡＭＦ’プレセグメント１はα因子リーダーはプチ
ト９の最初の８３個のアミノ酸を意味し；１α因子ペプ
チドまたは１α因子単位“は遊離ＡＭＦ’と同じ配列を
有する１３個のアミノ酸から成るポリペプチドを意味し
；そして１分泌“は、特に指定しない限り、細胞壁を通
って細胞外培地へ分泌されることを意味する。

本発明は、サッカロミセス・セレビシエ酵母からの組換
えＤＮＡ生産物の発現、分泌および回収における改良を
提供する。より詳細には、本発明はα因子リーダーペプ
チドにより促進される異種ポリペプチドの酵母からの分
泌の有用性全高め、この場合異種ポリハプチト９は最初
融合ポＩＪ　ｄプチドのカルボキシ末端部分として発現
され、融合ポリペプチドのアミノ末端部分はα因子リー
ダーまたはその修飾体である。

本発明の改良には、今までＳ．セレビシエ酵母から分泌
されたことがない生物学的に十分活性な異種ポリペプチ
ドの酵母からの分泌を達成する物質および方法が含まれ
る。組換えＤＮＡによりコード化されたポリはプチド、
すなわち自然界に存在するポリハプチビへ類似体が生産
および分泌され、これらの類似体は自然界に存在する対
応ペプチドの生物活性と等しいかまたはそれより優れた
生物活性を有し、しかもそれらはアミノ酸残基を変化さ
せる化学反応または分泌中や分泌後のタンパク質分解に
よって完全に失活されることがないのでＳ．セレビシエ
内での生産に適している。本発明はさらにＳ．セレビシ
エのａ−株からの意図するポリはプチドのα因子リーダ
ーペプチドにより促進された分泌を提供する。

さらに本発明は、タンパク質（特に異種タンパク質）を
加水分解により減成する能力がそこなわれたＳ．セレビ
シエ菌株を提供し、これらの菌株は本発明による発現ベ
クターで有利に形質転換され、α因子リーダーＲプチド
により促進された分泌の結果として、形質転換株から分
泌された生物学的に活性な異種タンパク質の改良された
回収を提供する。

本発明の１つの面によれば、これまでに生物学的に活性
な形でＳ．セレビシエから首尾よく分泌された異種ｔ　
＋）　ｄプチド（約１００個以下のアミノ酸から成る）
よりも一層大きい異種ポリペプチドの分泌がα因子リー
ダーにより仲介される発現はフタ−が提供される。より
大きいペプチドのα因子リーダーはプチトゝ−促進分泌
を得るために、１つまたは２５）のα因子はプチド（２
５）存在する場合はそれらの間にプロセッシング部位に
含む）が、α因子リーダー（またはその修飾体）と異種
生産物ポリペプチドとの間の、発現ベクターから発現さ
れる融合４１Ｊペプチド内に挿入される。従って、例え
ば組換え体ベクターがＳ．セレビシエを遺伝子修飾する
ために作製され、その組換え体ベクターは一般式： ＮＦ２−α因子プレセグメント−（’ロセツシング部位
）１−（α因子）ｎ−（プロセッシング部位）２一対象
ポリはプチド で表わされる融合前駆体ペプチドをコードシ、上記式中
ｎ＝１または２、好ましくはｎ＝１であり；（プロセッ
シング部位）、　およヒ（プロセッシング部位）２は同
一または異なるアミノ酸配列をもつことができ；ｎ＝２
である場合は２５）のα因子はプチビの間に別のプロセ
ッシング部位が存在し、その別のプロセッシング部位は
（プロセッシング部位）１　または（プロセッシング部
位）２と同じ配列であってもよく、また（プロセッシン
グ部位）、および（プロセッシング部位）２の両方と異
なる配列であってもよい。今まで、当分野においては、
異種ポＩＪ　ハプチドのα因子リーダーにより仲介され
る分泌が、自然界に存在する１６５個のアミノ酸から成
るプレプロ−α因子タンパク賞中でリーダーはプチト９
単位の後に続く４つのα因子（および第１と第２、第２
と第３、および第３と第４の間のプロセッシング部位）
を排除することにより、最も良く達成されると一般に信
じられてきた。

アミノ酸残基が約５０個以下の比較的小さなペプチドの
場合は、ＤＮＡ−コード化融合ポリペプチド中にα因子
単位全挿入することが必ずしも必要でないが、より大き
いポリペプチドは球状になりやすく、融合ポリはプチド
内に少なくとも１個のα因子単位を挿入しないと、リー
ダーペプチドから生産物４１Ｊ−？プチドを切断するタ
ンツク質分解酵素がそのプロセッシング部位に対する作
用を立体的に妨害されると思われる。根元的な原因が何
であろうと、本発明者らは、対象ポリペプチドからリー
ダー（またはその修飾体）を隔離する１つまたは２５）
のα因子単位を組み入れることにより、α因子単位の両
側に存在するプロセッシング部位が明らかにプロセッシ
ング酵素による加水分解を受は入れやすくなり、それに
より正確にプロセッシングされた対象ポリペプチドが分
泌されるということを見出した。一方、３つまたは４つ
の完全なα因子単位がリーダーペプチド（またはその修
飾体）と生産物ポリペプチドの間に挿入される場合は、
分泌が低下することが見出された。

本発明はまたＳ．セレビシエ酵母内でのＧＲＦ’類似体
の生産、ならびにそれらからの分泌を提供する。”　Ｇ
ＲＦ’類似体”という用語は、脳下垂体からの成長ホル
モンの放出を刺激することができ且つ自然界に存在する
ＧＲＦ分子よりも酵母の発酵条件による不活化に対して
抵抗する生物学的に活性なタンパク質を意味するために
特に使用される。ＧＲＦ類似体の例は次のアミノ酸配列
：Ｈ−Ｒ□−Ａｉａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ　−Ｐｈ
ｅ−Ｔｈｒ−Ｒｓ　−Ｓｅ　ｒ−Ｒ１０−Ａｒｇ−Ｒ□
２−Ｒ，”３−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｒ，
８−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｒ２４
−Ｒ２ｓ　−１１６）−Ｒ２７−Ｒ２ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｒ３４−Ａ８ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｒ３ｓ　−Ｒａ　、−Ｒ４ｏ　−Ｒ４□−Ｒ４２−Ｒ
４３−Ｒ４４−ＯＨ 〔式中Ｒ０はＴｙｒ　、　Ｐｈｅ　、　Ｌ６ｕまたはＨ
ｉｓ　；　Ｒ８はＡｓｎまだはＳｅｒ　ｐ　Ｒ１０はＴ
ｙｒまたはＰｈｅ　；　Ｒ，□はＡｒｇまたはＬｙｅ：
Ｒ１３はＩｌｅまたは■ａ１；Ｒ１８はＳｅｒ　ｉたは
Ｔｙｒ　；Ｒ２４はＨｌｓまだはＧｌｎ；Ｒ２５はＧｌ
ｕまたはＡｓｐ　ｐ　Ｒ２７はＡｈａ　、　Ｉｌｅ　、
　Ｌｅｕまたはｖａｌ；Ｒ２８はＳｅｒまたはＡｓｎ　
；　Ｒ３４はＳｅｒ　、　ＡｌａまたはＡｒｇ；Ｒ３８
はＡｒｇ　、　ＳｅｒまたはＧｌｎ：Ｒ３９はＡｒｇま
たはＧｌｙ　：　Ｒ４０はＡｌａ　、　Ａｒｇ　ｉたは
Ｓｅｒ　：Ｒ４１はＡｒｇまたはＬｙｓ　；　Ｒ４２は
Ｐｈｅ　、　Ａｌａまたはｖａｌ；Ｒ４３はＡｒｇまた
はＡｓｎ　；そしてＲ４４は天然アミノ酸（但しＣｙｅ
またはＭθｔを除く）であり；この際Ｒ２８からＲ４４
’でのアミノ酸傅基のいくつかまたは全部は欠失されう
る〕を有する。

上記略号は自然界に存在するアミノ酸を意味し、すなわ
ち ａｌａ　　は　アラニン ａｒｇ　　は　アルギニン。

８ｅｕ　は　アスパラギ／ ａｓｐ　　は　アスパラギン酸 ｃｙθ　は　システィン ｇｌｕ　　は　グルタミン酸 ｇｌｎ　　は　グルタミン ｇ１７　　は　グリシン ｈｌＧ　は　ヒスチジン １１６）　　は　インロイシン ｌｅｕ　　は　ロイシン ｌｙｓ　　は　リシン ｍ８ｔ　　は　メチオニン ｐｈｅ　　は　フェニルアラニン θｅｒ　　は　セリン ｔｙｒ　　は　チロシン ｖａｌ　　は　バリンである。

１つの修飾において、ＧＲＦをコードするＤＮＡ配列は
分泌されたＧＲＦ分子の２７位のメチオニン残基がアラ
ニン、インロイシン、ロイ・シンまたはバリンで置換さ
れるように修飾される。得られた類似体分子は自然界に
存在するＧＲＦに匹敵する生物活性を有し、一方ＧＲＦ
’を不活化しうるメチオニン残基のスルホキシド化が避
けられる。従って、生物学的に活性なＧＲＦ’類似体が
、天然ｈＧＲＦ（ヒトＧＲＦ’）に対して実質的に増大
された収量で分泌および回収される。

ｈＧＲＦ類似体をコードするＤＮＡ配列の別の特定修飾
において、４個のＣ−末端アミノ酸残基をコードする配
列が欠失される。ＧＲＦ’分子のこの修飾はＧＲＦの生
物活性にほとんど影響を及ぼさない。両方の修飾、すな
わち２７位のメチオニンの置換およびＣ−末端でのペプ
チドの短縮化、ならびに上記のアミノ酸配列によって示
唆されるその他のアミノ酸置換およびＣ−末端でのペプ
チドのそれ以上の短縮化は単一のＧＲＦ’類似体分子中
で組み合わせることができる。実質的に完全なＧＲＦ’
の生物活性を保持する目下の好適なＧＲＦ’類似体には 〔Ｌｅｕ　）−ｈＧＲＦ（１−４０）−ＯＨｔｙｒ−ａ
ｌａ−ａｓｐ−ａｌａ−ｉｌｅ−ｐｈｅ−ｔｈｒ−ａｓ
ｎ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ａｒｇ−１ｙｓ−ｖａｌ−１６）
ｕ−ｇｌｙ−ｇｌｎ−１６）ｕ−ｓｅｒ−ａｌａ−ａｒ
ｇ−１ｙｅ−１６）ｕ−１６）ｕ−ｇｌｎ−ａｓｐ−１
１６）−ｍｅｔ−ｓ　ｅｒ−ａｒｇ−ｇｌｎ−ｇｌｎ−
ｇｌｙ−ｇｌｕ−８１３ｒ−ａｓｎ−ｇｌｎ−ｇｌｕ−
ａｒｇ−ｇ１７−ａ’ｌａ−ａｒｇ−ａｌａ−ａｒｇ−
１＋３ｕ−Ｈ２ を有する。

自然界に存在するＧＲＦ−’？プチドはアミド化されて
おり、そして本明細書中で述べる異種遺伝子コード化Ｇ
ＲＦ類似体は遊離酸の形体であるので、本発明による組
換え体ベクターによりコードされる遊離酸Ｇ−ＲＦ類似
体は、Ｓ．セレビシエ酵母から分泌された後にｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　　でアミド化されうる。

しかしながら、ここに記載の酵母によって生産される類
似体はアミド化しなくても十分な生物活性を保有する。

今や、遺伝子の単離および修飾、発現ベクターの作製、
酵母菌株内への発現ベクターの組み込み、意図する異種
ポリペプチドを得るだめの形質転換酵母菌株の培養およ
び宿主酵母菌株の開発を含めた種々の実験操作法をより
詳細に述べるであろう。

実施例 α因子のゲノム配列はサッカロミセス・セレビシエ菌株
ＡＢ　３２Ｑ　（ＨＯ，ａｄｅ２−　Ｌ　　１ｙｓ２−
１　ｙ　ｔｒｐ５−２゜１６）ｕ２−１　、　ｃａｎｌ
−１００、ｕｒａ３−１　、　ｕｒａｌ−１、ｍｅｔ４
−１　）からの酵母ＤＮＡ配列のライブラリーをスクリ
ーニングすることにより単離した。このライブラリーの
ゲノム配列は’ＩＴｐ１３のＢａｍＨ工部位工部口−ン
化されたＳａｕ　３Ａ部分のコレクション（集団）トし
て保有される。ＹＥｐ１３　は酵母および大腸菌のどち
らの細胞中でも選択および複製しうる当業者に広く入手
可能な群母−大腸菌シャトルベクターである。菌株ＹＥ
ｐ１３　　は米国メリーランド州ロックビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）か
ら寄託番号３７１１５として入手できる。ＹＥｐ１３で
大腸菌を形質転換する場合、その選択はｐＢＲ３２２由
来のアンピシリン耐性（β−ラクタマーゼ）遺伝子によ
ってもたらされ、一方複契はｐＢＲ３２２からの複製開
始点を用いることにより達成される。ＹＥｐ１３で酵母
を形質転換する場合、その選択はＳ．セレビシエのＬＥ
Ｕ　２遺伝子よりもたらされる。野生型ＩＪＵ２遺伝子
は１６）ｕ２−欠損株を補足するのに必要な酵素活性を
与え、それらの欠損株をロイシン原栄養株へと形質転換
する。酵母内でのＹＥｐ１３の複製は２μプラスミド（
本明細書中では時々″２μ２μサークルぶ）の複製開始
点から誘導される。

大腸菌はコンピテントＭＣ１０６１細胞および熱シヨツ
ク工程を使用することによりＹＩｐ１３で形質転換した
。基本的に、これらの細胞はそれらを中間対数（ｍｉｄ
−１ｏｇ　；　ＯＤ６００＝０．３　）まで増殖させ、
４容量の冷たい（０℃）　５０　ｍ　Ｍ　ＣａＣ１２中
で３０分それらをインキュイードすることにより受容能
力を持つようになシ、その際それらを氷上で３０分増殖
させた。それらを遠心分離し、もと（Ｄ容量の″’５０
容量の１０％グリセロール、５ｏｒｎＭＣａＣ１２中に
再懸濁し、５００μｌの部分に分け、エラはンドル７管
中に入れ、液体Ｎ２　で急速冷凍し、そして−７０℃で
保存した。大腸菌を形質転換するために、コンピテント
ＭＣ１０６１細胞のアリコートを氷上で溶かす。その細
胞懸濁液１００μｌを上記ＤＮＡ（こｏ場合はｚｏｎｇ
）に加え、０℃で１５分放置した。次に、その細胞を３
７℃に５分置き、その後２３℃で５分インキュイードし
た。

この時点で細胞は選択（５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　）の準備
ができる。形質転換の頻度はおおよそ１０個形質転換細
胞／ｎ９　　プラスミド”ＤＮＡである。

形質転換細胞はアンピシリン耐性によって同定する。ア
ンピシリン耐性は細胞をＬ−ブロス（１チバクトートリ
プトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）お
よび５０μ９／−アンピシリンを含む１．５％寒天平板
上に直接塗シっけることにより測定する。次に、この平
板を３７℃でインキュイードする。３７℃で１６時間後
に形成されるコロニーはアンピシリン耐性であると考え
られる；１０個のアンピシリン耐性コロニーの集団カＹ
Ｅｐ１３ライブラリーから得られた。各平板は５０μ９
７−のアンピシリンを含むＬ−ブロス１ｄでおおい、コ
ロニーを集め、５ｄ容量を７％ジメチルスルホキシド責
ＤＭＳＯ）へと調整して一２０℃で保存した。

ハイブリダイゼーション用フィルターを調製した。Ｌ−
ブロスおよび５０μ９　／　ｍｅアンピシリンを含む５
つの平板（直径１５ｃｍ）上に４０００コロニー／平板
の密度でコロニーを保型した。ハイブリダイゼーション
のために二通りのフィルターを次のようにして調製した
。直径が１５ｃｍの単一のニトロセルロースフィルター
を平板上にのせ、そして持ち上げた。今や平板からの細
胞を含むこのフィルターはマスター（印形）として役立
つ。第１フイルターをこのマスターと接触させ、こレラ
のフィルターを互いに対して一定に位置づけるために３
箇所に印をつけた。第２フイルターも同じ方法でマスタ
ー上に別個に配置した。その後、これらの３枚のフィル
ターはＬ−ブロスおよび５０μ９／ｄアンピシリンを含
む１．５％寒天の１５信平板上にのせて、３７℃で１８
時間増殖させた。次の日、マスター（４℃で保存）を除
く二通りのフィルターは１．５　Ｍ　ＮａＣ１，Ｑ、５
　Ｍ　ＮａＯＨ中に浸した数枚のワットマン濾紙上に５
分置き、その後フィルターを同じ溶液中に３０秒浸漬す
ることにょシハイプリダイゼーション用に調製した。続
いて、それらをトリス−ＨＣＡ！　（ｐＨ８，０）　、
　　１．５　Ｍ　　ＮａＣＪ中に３０秒浸漬した。その
フィルターを２ｘＳＳＣ（０，３Ｍ　　ＮａＣＪ、　　
０．０３Ｍクエン酸Ｎａ＊　　ｐＨ７０）中に１分浸漬
した後室温で２０分自然乾燥させた。

その後、それらを真空炉内８０℃で２時間ベーキングし
、この時点でフィルターはハイブリダイゼーションの準
備ができた。

調製されたフィルターはカージャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら
の上記文献によシ発表されたび因子の既知配列（ヌクレ
オチド３６−５６のコーディング領域）から誘導される
配列：　ＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＡＧＣ
を有する２１塩基のプローブを用いて徹底的に調べた。

このプローブは次のようにして　Ｐで標識した。５０ｍ
Ｍ）リス−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇｃ１
２．５ｍＭジチオトレイトール、Ｑ、１ｍＭｍイスミジ
ン、Ｑ、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１００／ｊｃｉのガ
ンマ−３２Ｐ　ＡＴＰ　（ＳＡ＝　７０００　Ｃ１／ミ
リモル）および１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを
含む反応混合物５０μｊ中でオリゴヌクレオチド１００
ｎ９を３７℃、３０分インキュベートした。組み込まれ
なかった放射性ヌクレオチドを１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ
、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中のセファデックスＧ−５０に
よるゲル濾過によシ除き、標識されたオリゴヌクレオチ
ドは１０ｍＭ）リス、Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で保存した
。

プレハイブリダイゼーションは４２℃において６ｘＳＳ
ＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１８　Ｍ　Ｎａ（Ｊ、　Ｉ　
ＱｍＭＮａＰＯ４（ｐ　Ｈ７，０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
″′Ｃある〕、１０Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　（ｌ　
ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　は０．０２％ウシ血清アルブ
ミン、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピ
ロリドンである）、０．５％ＳＤＳ中で３時間実施した
。ハイブリダイゼーションも上記のようにして実施した
が、１０％デキストラン硫酸およびハイブリダイゼーシ
ョン液１　ｒｕｔ　アたりｌ　Ｑ　’　ｃｐｍ　　のプ
ローブを用いて４２℃で１８時間行った。フィルターは
２ｘＳＳＣおよび０゜５％ＳＤＳを用いて室温で洗い、
次に４２℃で再び洗い、その後コダックＸ−ＡＲ５Ｘ線
フィルムに増感板を使って一７０℃で１８感元した。７
つの陽性コロニーを同定した。

プローブによる強いハイブリダイゼーション信号を示す
平板の領域を単離し、５０μ９　／　ａｔアンピシリン
を含む１．５％ＬＢ寒天平板〔すなわち、ＬＢ培地（０
，５％バクトートリプトン、０．５％酵母エキス、０．
２５％ＮａＣＡ！　、　ＮａＯＨでｐＨ７，５に調整）
を含む１．５％寒天〕に塗りつけた。この平板から単一
コロニーを単離して、１００μ！液状ＬＢ＋５０μ９／
ｙｔｌアンピシリンを含む８×１２ウエルのマイクロタ
イター皿のウェル（凹所）内に配置した。３７℃で１８
時間増殖後、それらを１５％グリセロールへと調整して
一７０℃で貯蔵した。

８×１２ウエルのマイクロタイター皿（９６ウエル）の
全てのコロニーを、１．５％ＬＢ＋５０μ９／−アンピ
シリン平板上で増殖させる１５信フイルターへ移すこと
ができるスタンピング装置（ｓｔａ−ｍｐｉｎｇ　ｄθ
ｖｉａθ）ｔ−使って、それぞれの陽性ノ・イブリダイ
ゼーション領域からの単一コロニー単離物を二通シのニ
トロセルロースフィルターへ移した。

これらのコロニーを３７℃で１８時間増殖させ、フィル
ターを上記の２１塩基オリゴマーと７１イブリダイズさ
せた。この方法で４つの陽性コロニーを単離し、ＬＢ＋
５０μ９／ｍｌアンピシリン（ＬＢ−ＡＭＰ（５０））
の２耐液状培地中３７℃で撹拌しながら５〜１８時間増
殖させた。

ＤＮＡはこの培養物１．５−から、細胞を遠心して培地
をデカントすることにより調製した。１１０（１１１１
ｆ）５０ｒｎグルコース、ｌＱｍＭＥＤＴＡ、２５ｍＭ
トリス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ８，０）　中に細胞を懸濁した。

それらを氷上で５分間放置し、その後２００μｌの０、
２　Ｎ　ＮａＯＨ，１％ＳＤＳを加え、コ（７）混合物
を０℃で５分インキュベートした。この混合物に１５０
μｊの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）　　を加えた
。

０℃で１０分後、この試験管をマイクロ遠心分離機で１
０分遠心した。沈殿物をつまようじで取り出り、４００
μＩｆ）フェノール／クロロホルムｌ：１混合物（１０
ｍＭ）リスｐ　Ｈ７，５，１ｍＭ　ＥＩＤＴＡ　テ飽和
したもの）を加えた。遠心後水層（４００μｊ未満）１
−取り出して、それに８００μ１０９５％エタノールを
加えた。−７０℃で２０分インキュベーション後、試料
をマイクロ遠心分離機で５分遠心した。沈殿物を１−の
９５％エタノールで洗い、自然乾燥させ、２０〜５０μ
ｊの１０ｍＭ１−リス−ＨＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡｌ　
１０μ９／ｍリボヌクレアーゼＡ中に溶解した。

ＥｃｏＲＩ　　制限消化は、１０μｌの容量の製造業者
によシ処方された緩衝液に１μｌの微量調製され＊Ｉ）
ＮＡ　（２００〜５００ｎ９）を加えることによシ実施
した。適当な制限酵素を５〜１０単位の！１度で加え、
３７℃で１〜２時間インキュイードすることにより消化
した。消化物はアガロースゲル電気泳動（０，８〜１．
２％）により分析し、既知標準品に対比させてフラグメ
ントの大きさを定量化した。

２５）のコロニーすなわちＡＭＦ’−ＢおよびＡＭＦ’
−Ｄがシン（Ｓｉｎｇｈ）らの上記文献によって発表さ
れたものと同じ領域を有していた。それらは両方ともα
因子のプロモーター、構造遺伝子および転写ターミネー
タ−を含む１，７ＫｂのＥｃ　ｏＲ工７ラグメントを持
っていた（第１図参照）。このＥｃ　ｏＲ工領領域ニト
ロセルロースに移して、ライブラリーをスクリーニング
する際にプローブとして使用したオリゴヌクレオチドで
調べたとき、このフラグメントはそのオリゴヌクレオチ
ドと強くハイブリダイズした。

電気泳動後、制限消化物と移動度マーカー（この場合は
バクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄ　ｍ消化物
）の写真をとり、起点に対するフラグメントの移動度を
測定した。その後、ゲルは５ＣＪｍｌの容量の０．５　
Ｎ　ＮａＯＨ１１，５Ｍ　ＮａＣＡ’を用いて室温で撹
拌しながら３０分処理した。続いて、５０ｍ／の容量の
１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、ＩＭＮａＣｌを
用いて室温で撹拌しながら３０分処理することにより・
中和した。このゲルを２０ｘｓｓｃ（３ＭＮａＣＡ’、
０．３Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７，０）中に浸漬した数枚
のワットフッ３ＭＭＦ紙上にのせた。

ゲルノ上面に、２ｘＳＳＣ（０，３ＭＮａＣＡ！、　０
．０３Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７，０）？しみ込ませたニ
トロセルロースフィルターを置いた。この上にさらに乾
イア’Ｃ＜−パータオルを重ねた。ゲルから、ニトロセ
ルロースフィルターを通過して乾燥タオルへの塩溶液の
拡散は、ゲルからフィルターへのＤＮＡの移行をおこさ
せる。このフィルターをその後２ｘＳＳＣですすぎ、８
０℃で２時間ベーキングした。ハイブリダイゼーション
は次のようにして実施した。フィルターを５ｘｓｓＰＥ
（１ｘｓｓＰＥ：０、１８　Ｍ　ＮａＣＡ’　、　　１
０ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ７，０）、１　ｍＭＥＤＴＡ
）、０．５％ＳＤＳ、　１７７９／ｍＡ’（７）変性、
せん断したサケ精子ＤＮＡ中で湿潤化した。この溶液に
・・イブリダイゼーション液１　ｍｌあたり５　Ｘ　１
１０５ｃｐの３２　ｐ−標識オリゴヌクレオチド（この
場合は２１塩基プローブ）を加えた。一定温度（オリゴ
ヌクノオチドプロープの場合はＴｍ　−５℃）で１２〜
１８時間ハイブリダイゼーション後、フィルターを２０
０ｄの容量の２ＸＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ中室温で撹拌
しながら１０分洗浄した。この洗浄を繰り返し、フィル
ターを同じ緩衝液で、しかしハイブリダイゼーション温
度で撹拌しながら１０分洗浄した。このフィルターは自
然乾燥させ、コダックＸ−ＡＲ５フィルムにデュポン増
感板を使って一７０℃で１２時間感光した。

カージャン（Ｋｕｒｊａｎ）らの上記文献により示され
た地図および塩基配列から、構造遺伝子の大部分は５０
０　ｂｐのＰｓｔｌ　−Ｓａｌり　　７ラグメント上に
存身すると推定された（第１図参照）。ＹＥｐ　１３ラ
イブラリーから単離したゲノムクローン１Ｐｓｔｉおよ
びＳａｌ　Ｉで消化して、８％ポリアクリルアミドによ
る電気泳動を行った。エチジウムプロミドにより染色し
たバンドｔ−ＵＶ励起により視覚化した後、ゲルからバ
ンドを切り取った。バンドの大きさく分子量）は分子量
標準（この場合はｐｈｉＸ１７４ファージＤＮＡのＨａ
ｅｌ消化物）に対比させて測定した。このゲルスライス
をこの場合は電気泳動緩衝液１ｘＴＢＥ（０，０８９Ｍ
　）リス−ホウ酸、０．０８９Ｍホウ酸、２ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ）を含む透析バッグの中に入れた。このバッグを電
気泳動室内に置き、１００ボルト（一定電圧）で１〜２
時間実施した。実施の最後に、電流ｔ−１分間逆方向に
流した。今やＤＮＡ’ｉ含む緩衝液を透析バッグから取
り出し、フェノール抽出および第ニブチルアルコール抽
出によシ濃縮し、０．３Ｍ酢醗ナトリウム（ＮａＯＡｃ
）へ調整した後エタノール沈殿させた。

回収されたＤＮＡはゲル電気泳動により、既知濃度の標
準に対比させて定量化した。

Ｐｓｔｉ　−ＳａＪ　Ｉ　７ラグメントはＭ１３ｍｐ８
およびＭ１３ｍｐ９ベクター内でクローン化した。これ
らのベクターは制限酵素消化に関する製造業者の説明書
を用いて、Ｓａｄ　ＩおよびＰｓｔｌで切断し、１０ｎ
９７μｌに希釈した。それらを６５℃に加熱して残存す
るすべてのエンドヌクレアーゼ活性を失活させた。制限
エンドヌクレアーゼが熱失活に対して耐性である場合は
、試料をフェノール抽出し、エーテル洗浄し、エタノー
ル沈殿させた後ＴＥ中１０ｎ９／μｌに希釈した。１０
ｎ９のベクターおよび５０〜１００　ｎ９の挿入物は５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍ　Ｍ
　ＭｇＣＡ’　２．１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍ
Ｍスにルミジン、１ｍＭＡＴＰおよび２００〜４００単
位にューイングランド・バイオラブズ）のＴ４リガーゼ
の存在下で連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた。一定期間
、すなわち２３℃で０．５〜２時間または１６℃で５〜
１６時間の経過後、この連結反応物を使って大腸菌、７
Ｍ１０３を形質転換した。

大腸菌ＪＭ１０３細胞は次のような方法で受容能力を持
つようになる。それら全最少平板培地に播種して０Ｄ５
５０＝０．３へ増殖させ、４℃で遠心し、ｈ容量の冷た
い５０ｍＭＣａＣＡ！２中に懸濁し、氷上に２０時間放
置して遠心した。それらをもとの培養物容量の將。の容
量中に再懸濁して、使用するまで４℃で保存した。

形質転換の間、１００〜２００μｌのこれらの細胞の培
養物を上記の連結反応混合物に加え、氷上に２０分装い
た。それらを４２℃で２分加熱した。

その間、１％ＬＢ寒天の溶融溶液にジメチルホルムアミ
ド中のＸ−ｇａＡ’（５−ブロム−４−クロル−３−イ
ンドール−β−ガラクトシド）の２０■／ゴ溶液３０μ
！およびイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトシドの２４
ｍ９／ｒｔｔｌ溶液２０μｌを加えた。４２℃で２分イ
ンキュベーション後、細胞とｆ）ＮＡ＝ｉ上部寒天に加
えて室温の１５％ＬＢ平板上に広げた。その後、３７℃
で１２〜１６時間インキユヘートシた。挿入物を含むク
ローンは白色プラークとして現われたが、再閉環または
非切断ベクターは青色のままだった。

Ｐｓｔｌ　−ＳａＡ’　Ｉフラグメントの挿入物を含む
プラークは、上記方法によ＃）Ｍ１３ｍｐ８とＭ１３ｍ
ｐ９の両方のベクター内に単離した。塩基配列決定のた
めの鋳型は次の方法で単離した。プラークの中心部を採
取して、１〜２ｍｌの液状ＬＢに入れ、３７℃で５〜６
時間振とうした。上清の１　ｙｒｔｌアリコートヲ遠心
して９００μＪ’に回収した。２００μｌの２、５　Ｍ
　Ｎａ（Ｊ、２０％ＰＥＧ６０００を加え、この混合物
を２３℃で１５分放置した。遠心後、上清を完全に除き
、沈殿物を１００μ）の１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ（ｐＨ
７，５）、０．１ｍＭ　］１ｉＤＴＡ（ＴＥ）中に再懸
濁した。５０μｌのＴＥ−飽和フェノールを加えて試料
を抽出した。遠心後、水相をジエチルエーテルで抽出し
、水相’ｔ　０．３　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）
へ調整した。２５０μｌのエタノールを加え、この溶液
をドライアイス−エタノール浴中で凍結した。５分遠心
後、沈殿物音５０μｌＴＥに再懸濁した。

５μ！アリコートはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）のジデ
オキシヌクレオチド法により塩基配列を決定した。

このことは、このクローンがα因子配列をコードすると
いうことを立証した。なぜなら、それらは実際に既知の
発表された塩基配列（カージャンらの上記文献）と同一
であったからである。

カージャンらの上記文献、シンらの上記文献に記載の方
法によりα因子をクローン化した後、２５）のα因子に
似た配列を単離した。第１のＭＦｌはカージャンらの上
記文献によってクローン化されたものと同一であった。

第２のＭＦ’２は、ＭＦｌが４つのα因子ペプチドのコ
ーディングセグメントを含むのに対して、それは２５）
のα因子イプテドコーディングセグメントのみを含有す
るという点でやや異なっていた。さらに、ＭＦ’２によ
りコードされるこれらの２５）のにブチどのうち一方は
α因子の変異型であり、それは４位と６位に２５）の保
存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ａｍｉ
ｎｏ　ａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　）　ｔ−有
していた。これらのび因子遺伝子のどちらもここに記載
のベクター構成体において利用されたが、カージャンら
の上記文献により特徴づけられるＥｃｏＲ工７ラグメン
トを使用す゛ることか選ばれた。なぜなら、それはα因
子ＩＪ−ダーコーディングセグメントと第１α因子ペプ
チド単位コーディングセグメントとの連結部にＨ１ｎｄ
■制限酵素部位を含み、それによりクローニングやその
他の遺伝子操作が簡単になるからである。

ＥｃｏＲＩ−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントを含むゲノム
クローｙＡＭＦＢは、ＥｃｏＲＩとＨｌｎｄｌｌで消化
した。この生成物を１ｘＴＢＥ中０，８％アガロースゲ
ルを使って５０ｖ（一定電圧）で−晩電気泳動した。

１２００ｂｐのフラグメントをマーカー（ｐｈｉＸ１７
４ファージＤＮＡのＨａｓ　［１消化物）と対比させて
同定した。シンらの上記文献に記載の制限地図に基づく
と、このフラグメントはプロモーターと第１組のプロセ
ッシング部位（リーダーのカルボキシ末端にある）をコ
ードするセグメントまでの構造遺伝子を含むが、α因子
単位−コード化配列部分とメツセージの３′−非翻訳領
域を欠失すると推定された。このフラグメントは電気溶
離して、エタノール沈殿させた。

ベクターｐＢＲ３２２を］ＥｃｏＲＩとＨｌｎｄｌｌｌ
　　で消化した。１５μｇの反応容量中の４０ｎ９のベ
クターおよび２０Ｏｎ９の１２００ｂｐ　ＥｃｏＲニー
Ｈ１ｎｄｌｌ１７ラグメントを１５℃で一晩連結させた
。この連結反応物を使って、大腸菌株ＭＣ１０６１’？
アンピシリン耐性へと形質転換した。先に述べたように
して、８つの微量調製物全用意してＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄ■で消化した。８つの形質転換細胞のうち６つが挿入
物として１２００ｂｐ　フラグメントを含んでいた。こ
のクローンはｐ−α因子と命名した。ＤＮＡの大規模調
製も行われ、そして広範囲の制限地図が作成された。次
の酵素：　Ｂａｘｌ　、　Ｂｇｌｌ　ｔ　Ｈｐａｌ。

Ｋｐｎｌ　、　Ｓｍａｌ　、　ＮｒｕＩ、　５ｔｕｌ　
、　Ｘｂａｌ　、　Ｘｈｏｌ　。

Ａｖａｌ　、　Ｂｃｌｌ　、　ＢａｍＨｌ　、　Ｃｏａ
ｌ　、　′ｆ２ｃｏＲＶ　、　Ｐｖｕｌ　。

Ｐｖｕｌ　、　５ａｌｌ　、　５ｐｈｌ　、　Ａｃｃｌ
　、　Ｈｉｎｄｌｌ金製造業者金製開業者従って使用し
た。

先に述べたように、５００　ｂｐのＰｓｔ）−８ａＡ’
ｌ　７ラグメントのＤＮＡ配列はサンガーのジデオキシ
塩基配列決定法により測定した。問題のＰｓｔ１部位は
コーディング領域のちょうど内側に位置するが、Ｓａ／
　１部位は翻訳終止コドンをちょうど越えたところに位
置する。

α因子遺伝子の機種はカージャンらの上記文献に図示さ
れている。簡単に述べれば、各々が１３個のアミノ酸か
ら成るα因子はプチドをコードする４つの直列配置セグ
メントが存在し、各１３アミノ酸ペプチドは、次のアミ
ノ酸配列：　ｌｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ
−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｈａを有するプロセッシング部位
またはその修飾体によって先行される。第１のプロセッ
シング部位（リーダーのカルボキシ末端の６個のアミノ
酸に相当する）において、ｇｌｕ−ａｈａ対のうち１つ
は欠失される。第３と第４のプロセッシング部位の両方
において、アスパルテートが３つのグルタメートの第２
番目と入れ換わる。

このα因子コーディング配列は唯一のＳａｄ　（部位の
３６ｂｐ上流寸終結する。α因子遺伝子から転写された
メツセージの３′　末端を定めるために、ＲＮＡの８１
ヌクレアーゼマツピングが試みられた。

ｍＲＮＡ末端を８１ヌクレアーゼによりマツピングする
ために、一端がｍＲＮＡへ転写されるセグメントの内側
にあり、他端が外側にあると考えられる制限酵素フラグ
メント（この場合はＳａ／）−ＥｃｏＲＩ　３００　’
ｂｐ　フラグメント）を、ポリアクリルアミドゲル（８
％アクリルアミド）により２００Ｖ（一定電圧）で２．
５時間電気泳動を行って単離した。このフラグメントは
アンチセンス鎖（非転写鎖）の３′末端上で標識され、
このアンチセンス鎖がα因子ｍＲＮＡとハイブリダイズ
したとき、標識ヌクレオチドがノ・イブリッド形成に含
まれる（すなわち、保護される）ようにした。１μ９の
このフラグメントの標識付けは、非標識ＴＴＰの存在下
にＳａＪ　１部位の５′−突出部分をα−３２ＰａＣＴ
Ｐで修復する（すなわち、３′末端を標識する）ことに
よシ達成された。４０μｌの反応混合物は６０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１１１０ｍＭ　）リス−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）、
１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．５　ｍＭＴＴＰおよび１
００μＣ１のα−３２Ｐ　ａｃ’ｒｐ（２０００〜３０
００Ｃ１／ミＩＪモル）を含んでいた。反応は５単位の
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（大フラグメ／ト）全添加す
ることにより開始され、２３℃で２０分実施した。標識
されたフラグメントはセファデックスＧ−５０によるカ
ラムクロマトグラフィーを使って、組み込まれなかった
放射性物質から単離した。全部で１６００００ｃｐｍが
回収された。

ＲＮＡはα−細胞およびａ−細胞（対照として）から単
離した。α交配因子の転写はα・〜細胞に特異的である
。この場合Ｘ２１８０−ＩＡ（Ｓ・セレビシェのａ　−
株＞および２１０２−α（Ｓ．セレビシエのα−株）を
中間対数まで増殖させ、遠心によシ収獲し、Ｈ４０で洗
い、次いでＲＮＡ抽出緩衝液（ＲＥＢ）　（０，１Ｍ　
　ＬＩＣｌ、　　０．１　Ｍ　）リス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７
，５）、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）で１回洗った。沈
殿物を等容量のＲＥＢに再懸濁し、酸洗浄したガラスピ
ーズ（直径０．４５μ）をもとの沈殿物に等しい容量加
えた。細胞破壊はポルテックスミキサーによる一連の４
×１５秒のバースト（破裂）および各メースト間の氷上
での１５秒静止によって達成した。その後、この混合物
ヲ０．２％ＳＤＳへ調整し、水性容量に等しい容量のフ
ェノール／クロロホルムを加えた。抽出後、水層を分離
して０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）へ調整した
。２倍容景のエタノールを加え、−２０℃でＲＮＡを沈
殿させた。沈殿したＲＮＡはＨ４０に溶解して一２０℃
で保存した。ポリＡ＋ＲＮＡはマニアテス（Ｔ　、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　）らのコールド・スプリング・ノ−ス
フリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）（以後
Ｃ３Ｈと略す）に記載の方法により単離した。

Ｓ１ヌクレアーゼマツピングの実験において、２０００
０（！１）ｍ未満の３′−標識ＤＮＡ２次のＲＮＡ試料
　（１）ａ−株ポリＡ　＋　１０　ａ　９　；　（２１
ａ−採音ＲＮＡ１００μ９；（３１α−株ポリＡ＋ＲＮ
Ａ　　１０μ９；（４１α−採音ＲＮＡＩＱＱμ９；に
加えた。混合物はエタノール沈殿させ、ハイブリダイゼ
ーション緩衝液〔８０％ホルムアミド、Ｑ、４Ｍ　　Ｎ
ａ（Ｊ、　　（１１０４Ｍピペス（Ｐｉｐｅｓ；ｐＨ６
，４）、”１ｍＭ　ＥＤＴＡ）２０ｔｔｌに溶解し、７
０℃で１０分加熱し、５２℃で一晩ハイプリダイズさせ
た。ハイブリダイゼーション反応混合物は１００００単
位の８１ヌクレアーゼ（米国インジアナ州インジアナポ
リス、ｋ−ＩＪ　７ガー・マンハイム・バイオケミカル
ズから購入）を加えたＳ１ヌクレアーゼ緩衝液（０，２
８ＭＮａＣＡ　１５０　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，
６）、４．５ｍＭ　Ｚｎ５Ｏ４）　４０（１１１１に加
えた。この試料ヲ４０℃で３０分インキュベートした。

次に、試料全フェノール抽出し、キャリアーｔＲＮＡ（
５μ９）を加え、この混合物をエタノール沈殿させた。

それを塩基配列決定用ゲル緩衝液（８０％ホルムアミド
、０、１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレン
シアツールおよび１ｘＴＢＥ）に溶解し、そして８Ｍ尿
素を含有する１ｘＴＢＥ中の８％ポリアクリルアミドゲ
ル上に加えた。標識制限フラグメントおよび放射性標識
分子量マーカーと共に、４つの試料ｔ”１５０ｍＡでブ
ロモフェノールブルーが底ニ到達するまで泳動させた。

その後、増感板を使用して、コダックＸ−ＡＲ５フィル
ムに一７０℃で６時間感光した。

プローブよシわずかに小さい分子量の特異的ハイブリッ
ド（５０〜１００ｔ）ｐ以下）はα株−特異的ｍＲＮＡ
中にのみ存在していた。その結果はポリＡ＋α−特異的
ＲＮＡの場合により鮮明であり、２５）のバンドがはっ
きり見える。正しいバンドはα−特異的全ＲＮＡに存在
するが、全ＲＮＡには劣った強度をもつバンドのパック
グラウンドが存在する。α因子ｍＲＮＡの推定上の３′
末端はａ−株由来のｍＲＮＡ中に決して見られない。結
果は、α細胞−特異的転写がＥｃｏＲ工制限部位のちょ
うど５′側のＳａｄ　Ｉ−ＥｃｏＲエフラグメントで終
結することを示した。

別のプロセッシング部位がいくつかのベクターのために
作製された。ｌｙｓ−Ａｒｇの醪素的切断はｇｌｕ−ａ
ｌａの切断よりも一層効果的であるので、２５）の方法
を試みて成功をおさめた。第１の方法は、ｌｙｅ−ａｒ
ｇ残基の位置をｇｌｕ−ａｌａ残基の位置に対して変更
することを含む。通常１ｙ８−ａｒｇ残基はｇｌｕ−ａ
ｌａ残基に先行する。１つのベクターが作製され、その
ベクターによってコードされる融合タンパク質において
、分泌されるべき対象の異糧ポリペプチドのアミノ末端
に奄も接近するプロセッシング部位のｇｌｕ−ａｌａま
たはａｓｐ−ａｌａ：）−！′プテドセグメントは、′
）″！′プチドｌｙｓ−ａｒｇによって先行および後続
される。天然遺伝子はそれらのカルボキシ末端にｇｌｕ
−ａｌａ　ｆ有するプロセッシング部位ペプチド配列を
コードし、そしてＢｉｎｄ１部位がこれらのカルボキシ
末端ｇ’ｌｕ−ａｌａジはゾチドのそれぞれをコードす
る遺伝子セグメント中に存在するので、適当なＨｉｎａ
　ｆｆＪ接着末端を有するオリイヌクレオチドヲ使用し
て、分泌されるべきポリはプチドのＮ−末端に最も接近
するプロセッシング部位のカルボキシ末端ｇｌｕ−ａｌ
ａ？コードする配列と、分泌されるべきポリペプチドを
コードする配列と、の間にｌｙｓ−ａｒｇをコードする
配列を挿入することができる。この構成物ハ制限エンド
ヌクレアーゼ消化およびＤＮＡ塩基配列分析によって証
明し得る。このような構成物の例はＴＲＰ２１１　　（
第７図）ｔ７’ｃはＹｓＶ３０３（第２図）である。Ｔ
ＲＰ２１１　オ！ヒＹｓＶ３０３（７）作製は以後に詳
しく述べるであろう。

第２の方法に従って、分泌されるべき異種はプチドのＮ
−末端に最も接近するプロセッシング部位のｌｙｓ−Ｉ
Ｌｒｇ以外のアミノ酸（例えばｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ
−ａｌａ）ｔ−コードする配列が欠失されたベクター’
に作製することかで考、この場合融合タンパク質は分泌
されるべきペプチドがそのＮ−末端でプロセッシング部
位としてのただ１つのジペプチド１ｙｅ−ａｒｇ　　に
よって直接に先行される。

この種のベクターもまた作製された。欠失はＭ１３突然
変異変異法を使って行われた。α因子プロモーター、構
造遺伝子（ヘキサペプチドｌｙｅ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａ
ｌａ−ｇｌｕ−ａ１ａ″ｆｔ：有する８９個のアミノ酸
から成るリーダーペプチドをコードするセグメントを含
む）（欠失すべきヌクレオチドを含む）および外来性遺
伝子はプラスミドＹＳＶ２（１１　　（以後に詳しく述
べる）の制限消化によシ単離し、そして適当な制限酵素
で消化したＭ１３−？フタ−内でサブクローン化した。

一本鎖の鋳型はＭ１３塩基塩基法定反応について上述し
たように調製した。

欠失すべき領域の両側の配列に相同性のプライマーｔリ
ン酸化してその鋳型にアニーリングした。

伸長（エクステンション）および連結後に、アルカリ性
ショ糖密度勾配上で閉環した環状二本鎖（複製型）ＤＮ
Ａｔ−単離した。これらの超らせん分子は透析して、先
に述べたコンピテント大腸菌ＪＭ１０３細胞を形質転換
するのに使用した。

鋳型は上記のようにこれらのプラークから調製され、そ
の一本鎖ＤＮＡは真空装置、スロットプロッター（ｓ１
０ｔ　ｂ１０ｔｔｅｒ）を使ってニトロセルロースフィ
ルターに付着させた後そのフィルターをベーキングする
ことにより、フィルターに固定した。次に、このフィル
ターをプライマーより短いプローブ〔適切なストリンジ
エンシー（緊縮）のハイブリダイゼーション実験におい
て欠失を検出することができる〕とハイブリダイズさせ
た。意図する欠失ＤＮＡ１含むこれらの菌株はこのノ・
イブリダイゼーション技法によりスクリーニングされ、
突然変異はＤＮＡ塩基配列決定により証明された。この
ような構成物の例はＴＲＰ２１５　（第９図）であり、
その作製は以後に詳しく述べるであろう。

さらに、本発明のｌ要な面によれば、異種ポリペプチド
をα因子ペプチドから分離して、異種ポリペプチドの分
泌を促すためにリーダーペプチドのカルボキシ末端のプ
ロセッシング部位だけづくα因子ペプチド単位の後のプ
ロセッシング部位が融合ポＩＪ　６プチド内で使用され
る。α因子ペプチドをコードするα因子構造遺伝子の各
セグメント中にＢａＪ　１部位が存在する。α因子遺伝
子を含むプラスミドｔ　ＢａＪ　Ｉで切断して再び閉環
すると得られたプラスミドは完全なブロモ〒ターと構造
遺伝子の一部（その５′末端からリーダーベプテＢａＪ
　１部位から、α因子４プチドの下流に新しいプロセッ
シング部位（これはペプチドおよびタンパク質ｔα因子
から切断するのに役立つ）を作ることが可能である。こ
のような構成物の例はＴＲＰ２１３　　（第８図）であ
り、その作製は以後に詳しく述べるであろう。もちろん
、Ｂａｄ　１部分消化と適切なスクリーニングにより、
１つよシ多いα因子滅プチドを、意図するポリペプチド
の発現または分泌のために、遺伝子工学的に処理された
遺伝子中に残すことができるだろう。

発現はフタ−において異なる転写ターミネータ−が使用
された。α因子遺伝子の終止コドンの特徴はすでに述べ
た通りである。ＥｃｏＲニーＳａｌ　ｌフラグバンドの
３′方向のＥｃｏＲＩ　部位を次の方法でＨｌｎｄｌｌ
　７ラグメントに変換した。３８０　ｂｐのＥｃｏＲニ
ーＨ１ｎｄｌｌ　７ラグメント（第４α因子単位の前の
Ｈｉｎａｌ１部分からα因子転写信号の後ろのＥｃｏＲ
Ｉ　部位までのセグメント全表わす；第１図参照）はゲ
ノムクローンＡＭＦ’−ＢからのプラスミドＤＮＡの消
化物中で同定した。ＡＭＦ−Ｂ（１２０μｇ）の完全な
ＥｃｏＲＩ　消化物ｆ　５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　。

１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２５１０ｍＭ　　Ｆリス−ＨＣＩＪ
　（ｐＨ７，４）。

４０μＭ　ＴＴＰ、および４０μＭ　ｄＡＴｐ　　の存
在下ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメント（４０単位）
で２０℃、３０分処理し、それにより平滑末端フラグメ
ントを作った。Ｈｌｎｄ　ＩＩＩリンカ−（６μｇ）は
オリゴヌクレオチドの標識付けにおいて先に述べたよう
にしてリン酸化した。但し、ガンマ−３２Ｐ　ＡＴＰの
代わりにｌ　ｍＭの濃度の非標識ＡＴＰを用いた。その
後、平滑末端ＥｃｏＲＩ　　消化物とリン酸化リンカ−
とを−緒にして、１２００単位のＴ４ＤＮＡ　リガーゼ
の存在下１５℃で一晩連結させた。この連結反応物をフ
ェノール抽出し、エタノール沈殿させた。続いて、この
ＤＮＡを７００単位のＨｉｎｄ　■で５時間消化した。

消化物のゲル電気泳動によりＨｌｎｄ　［１消化が完了
したことを確かめた。それを製造業者の説明書に従って
１５０単位の５ａｌｌで３７℃、２時間消化した。３０
０　ｂｐの５ａｌｌ　−Ｈｌｎｄｌｌ　　消化フラグメ
ントは、８％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動ｔ
２００Ｖで２．５時間行うことにより分子量標準に対比
させて同定し念。このバンドヲ電気溶離により単離した
。このフラグメント８０ｎ９ｔプラスミドｐＵＣ８（米
国メリーランド州がイサースブルグ、ベテスダ・リサー
チ・ラボラトリーズから購入）のＨｌｎｄ［ｌ　−Ｓａ
／　ｌ消化物３２ｎ９と連結させた。このプラスミドは
５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１ｍＭＭｇ０Ａ’
　２．０．１　ｍＭ　ＺｎＣｌ２．１　ｍＭ　ス−！：
　Ａ、　ミジン中ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ
（１単位）で３７℃、３０分処理した。この脱リン酸化
の後、プラスミドｔ−７エノール抽出し、エタノール沈
殿させた。この連結反応物は１４℃で１６時間インキユ
ベートシ、そしてコンピテント大腸菌ＪＭ１０３細胞を
アンピシリン耐性へと形質転換するのに使用した。３０
（１１）ｐのＳａｄ　ｌ　−Ｈ１ｎｄｌ１７ラグメント
を含む形質転換細胞を同定した。プラスミドｐＵｃｆ９
はそのポリリンカーセグメント中の５ａｌｌｉ部位に非
常に接近してＢａｍＨＩ部位を有する。

その結果、α因子ターミネータ−配列はＴＲＰ４０３と
名づけたプラスミド（第３図参照、その作製は以後に詳
しく述べる）内にＨｌｎｄｌｌ　−ＢａｍＨＩセグメン
トとしてクローン化することができ、この場合Ｂａｍ　
Ｈ工部位はターミネータ−フラグメントの５′側に存在
する。

この構成物を得るために、ＴＲＰ４０３プラスミドｉＢ
ａｍＨ工で完全消化した。この線状分子をＨｌｎｄｌｌ
で部分消化して、最も長いＢｉｎｄｌｌ−ＢａｍＨエフ
ラグメント（約７ｓｏｏｂｐ）Ｔｈ電気溶離によりアガ
ロースゲルから単離した。フェノール抽出およびエタノ
ール沈殿後それをウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処
理した。α因子転写ターミネータ−フラグメントである
ＢａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌフラグメントを、ＢａｍＨ
ニーＨｉｎｄｌｌ−消化′ＰＲＰ２ｏ３へ連結した。こ
の混合物は大腸菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性へ
と形質転換するのに使用した。

その後、形質転換細胞は適切なフラグメントの存在につ
いて試験した。このベクターはＴＲＰ４０９と命名され
、その制限地図を第５図に示す。

α因子ターミネータ−に加えて、ムスチ（Ｍｕｓ　ｔ　
ｉ　）らのジーン　２５，１３３〜１４４（１９８３）
に記載される２０（１１）ｐの５ａｌＩ−Ｈｌｎｄ　［
１フラグメントに存在するＳ．セレビシエのグリセルア
ルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ遺伝子
（Ｇ３Ｐａｆ（）の３′末端からの配列が使用された。

１７５１）ｐの５ａｌｌ　−）ｉ１ｎｄｌｌフラグメン
トを単離し、Ｍ１３ｍｐ８内でサブクローン化し、そし
てサンガーのジデオキシ法によりその塩基配列を決定し
た。次いで、ＨｌｎｄｌおよびＢａｍＨＩによる制限消
化その後の１０％アクリルアミドによる電気泳動によシ
、挿入物全二本鎖プラスミドの形のＭ１３ｍｐ８から単
離した。適浩な大きさのバンドは、エチジウムプロミド
染色およびＵＶ励起により視覚化した後、分子量マーカ
ー（ｐｈｉＸ１７４７アージＤＮＡのＨａｅｌ消化物）
に対比させて同定した。このバンドヲゲルから切り取り
、上記のように電気溶離によりＤＮＡを回収した。次に
、このフラグメントはＢａｍＨ工　で完全消化し且つＨ
ｌｎｄ［ｌで部分消化したプラスミドＴＲＰ４０３内で
クローン化した。これを行うために、５０μ９のＴＲＰ
２０３ｆＢａｍＨＩＴ完全消化し、フェノール抽出し、
エタノール沈殿させた。Ｈｌｎｄ［による部分消化のた
めに、１６μ９ｔ＝０．６単位のＨｌｎｄ［ｌで３７℃
、２０分消化した。

ベクターは０．６％アガロースによるゲル電気泳動を行
って単離し、適当な大きさく約７．５Ｋｂ）のバンド全
分子量マーカー（バクテリオファージラムダＤＮＡのＨ
１ｎｄｌｌ消化物）に対比させて測定した。このバンド
を視覚化してゲルから切り取った。前記のように電気溶
離で回収して定量した。

ＴＲＰ４０３のテトラサイクリン耐性遺伝子のＨｉｎｄ
Ｉｌｌ　−ＢａｍＨＩ　７ラグメントがＧ３ＰａＨ転写
ターミネータ−のＨｉｎｄ　［［−ＢａｍＨＩ　　フラ
グメントによって置換されたＴＲＰ４０５とＩｌ’Ｍ％
ベクター　（第４図参照）を作製するために、５ｎ９の
ベクターを１０〜２５ｎ９のそのフラグメントと連結さ
せた。

連結反応は２３℃で３時間インキュベートした。

その後、この反応混合物は大腸菌株ＭＣ１０６１６）ア
ンピシリン耐性へ形質転換するために使用した。

形質転換細胞はＨｌｎｄｌｌ−ＢａｍＨＩ　　消化によ
り分析し、１７５１）ｐのＨｌｎｄｌｌ　−ＢａｍＨエ
フラグメントを含むクローンを同定した。

また、α因子を（−スとする構成物の転写を終結させる
ために、偶然にもＳ．セレビシエの２μサークルからの
ベクター配列が使用された。ＴＲＰ４０３において、Ｅ
ｃｏＲニーＨ１ｎｄｎｌ　　７　ラグバンドは２μサー
クルからの複製開始点を含む。２μサークルの塩基配列
はハートレー（Ｈａ？ｔｌｅｙ　）およびドネＡ／　：
／　７　（Ｄｏｎｅｌｓｏｎ）のネイチャー　２８６゜
８６０〜８６４（１９８０）によ□って決定された。こ
れは２μサークルの３体（このプラスミドは塩基配列が
同じであるが、制限酵素部位の位置が相異なる２５）の
形体で存在する）の２．２　Ｋｂ　ＥＣＯＨエフラグメ
ント中で終結するオープン・リーディング・フレーム（
その後ＫＬＰ遺伝子をコードすることが発見された）を
予言している。その結果、遺伝子がＴＲＰ４０３のＢａ
ｍＨ工部位内でクローン化されて、２μサークルのＨ１
ｎｄｌｌ末端の方向に転写される場合、その転写はＨ１
ｎｄ１部位から２００〜３０（１１）ｐ下流で終結する
と推定された。

ヒト膵ｐＩＧＲＦｉコードするＤＮＡフラグメントは、
プラスミドｐＵＣ９内に挿入されて大腸菌での発現のた
めに特に作られた化学合成ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨエ　フ
ラグメントとしてクリエイティブ・バイオモレキュルズ
（Ｃｒｅａｔｉｖｓ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）から
購入した。このフラグメントは人エイニジエータ−とし
てのメチオニンを有する４４個のアミノ酸から成るＧＲ
Ｆ”ｉニア−４”する。４４ａａ　ｈＧＲＦ’　、、：
プテト９のＣ−末端Ｌｅｕのコドンの後が停止コドンで
あり、従って自然界に存在するＣ−末端アミド化分子に
対して、合成遺伝子は遊離酸としてのｈＧＲＦをコード
する。

このフラグメントのセンス鎖の配列（アンチセンス釦の
一部とある種の制限部位を有する）は次の通りである： Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　　
　−５’　−ＡＡＴＴＣＡＴＧ　ＴＡＣＧＣＡ　ＧＡＣ
ＧＣＴ　ＡＴＣＶａＩＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ
　Ｓｅｒ　ＡｌａＧＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴ
Ｇ　ＴＣＴ　ＧＣＡｖｕｌ Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｉ
ｌｅＣＧＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＴ　
ＡＴＣＡＴＧ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧ
ＣＧＡＡｂａ　ｌ ５ｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｘｙ　Ａ
ｈａＴＣＴ　ＡＡＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＧＴ　ＧＧＣＧ
ＣＣａｒｌ Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　５ｔｏｐＣＧＴ　Ｇ
ＣＡ　ＣＧＣＣＴＧ　ＴＡＧ　−３’この合成ＧＲＦ遺
伝子をα因子ベクター内で使用するために修飾した。Ｇ
ＲＦ−α因子配列に対して行われた修飾は、ＧＲＦ−！
プチドおよびそれとα因子の融合体の両者を含めて３重
の修飾であった。

上記の化学合成されたＧＲＦ遺伝子フラグメントから出
発して実施された１つの修飾、すなわちＧＲＦＤ’　〔
Ｌｅｕ　　−ｈＧＲＦ　（１−４４）　−ＯＨ）は、ア
ミノ酸２７をメチオニンからロイシンへ変えることを包
含していた。これはＧＲＦ生物活性の起こりうる付随的
消失と共に、メチオニンのスルホキシド化の危険性をな
くすものである。また、この変更の技法はアミノ酸２２
の第３番目の塩基を変化させ、それによりＧＲＦ分子内
のＨｉｎｄｌ１１部位を排除する。

プラスミド３２２内でクローン化したＧＲＦ分子はこの
修飾の出発物質として使用した。このプラスミド２μ９
を製造業者の説明書に従ってＢｉｎｄｌｌとＸ’ｂａ　
Ｉで消化した。２５）のオリゴヌクレオチド（これらは
、対になったとき、意図する突然変異を起こさせるべ（
ＸｂａＩ／Ｈ１ｎｄｌｌ　−切断ベクター内に挿入する
ことができる）を合成し、ポリヌクレオチドキナーゼで
処理して５′−リン酸化し、そしてアニーリングさせた
。この対合オリゴヌクレオチドは次の配列： 含有する。５ｎ９のベクターｔ−５ｎ９のこのオリゴヌ
クレオチドと標準条件下で連結させた。この連結反応の
生成物を使用して一般的方法で大腸菌ＭＣ１０６１を形
質転換した。形質転換細胞は分子中の２５）のＰｖｕ１
１部位の存在についてスクリーニングした。連結反応は
（フタ−に対して大過剰の挿入物を含んでいた。その結
果多重挿入の危険性を除くために、このプラスミド（１
μ９）、’！？Ｘ１）ａＩで消化し、続いて消化の程度
を調べるために１×ＴＢＥ中の０．８％アガロースで電
気泳動を行った。

ベクターはプラスミドの再閉環と多重挿入物の排除に都
合のよい４０ｎ９７μＥ　の濃度で再連結させた。この
連結反応混合物を使って大腸菌株ＭＣ１０６１ｔ−アン
ピシリン耐性へと、標準方法によシ形質転換した。アン
ピシリン耐性形質転換細胞全同定し、その細胞由来のプ
ラスミドＤＮＡｙＥｃｏＲ工とＢａｍＨＩで消化し、そ
してブロモフェノールブルーマーカーが流れ去るまで８
％アクリルアミド上で電気泳動を行った。１９Ｑｂｐで
はなく、１４０ｂｐの挿入物を含むプラスミドが正しい
と思われ、これ１２ＧＲＦ’−Ｄ’と命名し次。

第二の修飾、すなわちＧＲＦ−Ｃ（ｈＧＲＦ（１−４０
）−ＯＨ）はＣ−末端から４個のアミノ酸残基金除いて
ＧＲＦ’ｊｉ４０個のアミノ酸に減らすこと全包含して
いた。最初、３′末端の７２ｂｐＢａｍＨ工　−Ｈｌｎ
ｄｌ［７ラグメントを次のようにしてｐＵＣ８内でサブ
クローン化した。供給体から得られたＧＲＦ遺伝子（プ
ラスミドｐＵＣ９中の挿入物）ｔ−Ｈｉｎａｌ［Ｉで、
次にＢａｍＨＩで消化した。この消化物をＬｘＴＢＥ中
の１０％アクリルアミド上で５０ボルト、４時間電気泳
動を行つ念。７２ｂｐのバンドを標準と対比させて同定
し、ゲルから溶離し声。その後、ｐＵｃ８のＢａｍＨＩ
　消化、次にＨｌｎｄ［ｌ　　消化を行つた。このベク
ター７ラグメントをウシ腸アルカリ性ホスファーゼで処
理することによシ脱リン酸化した。連結反応は１０ｎ９
０はフタ−フラグメントおよび未定量の７２１１ｐフラ
グメントヲ含有し、標準条件下１６℃で５時間行った。

その後、この連結混合物を使用して大腸菌ＭＣ１０６１
ｔアンピシリン耐性へと形質転換した。挿入物の存在は
微量溶菌液中のＸｂａＩ部位の存在により証明した。さ
らにＰｓｔＩ　、　ＢａｍＨＩおよびＨｌｎｄｌｌで消
化して、この構成物が正しいことを立証した。

次いで、ＧＲＦのＣ−末端を修飾して４個のアミノ酸を
除いた。ＧＲＦ’３′一部分を有するｐＵｃ８プラスミ
ドをＢａｍＨＩで線状化し、　ＮａｒＩで部分消化した
。このはフタ−に第２のＮａｒ　１部位が存在するとは
予測できなかった。それにもかかわらず、ＧＲＦコーデ
ィングセグメンバンのＭａｒ１部位とＢａｍＨＩ部位と
が接近していたために、全長線状化ｐＵＣ８とほとんど
同じ大きさの所望のＢａｍＨＩ−ＮａｒＩ消化フラグメ
ントを単離することができた。所望フラグメントはＩＸ
ＴＢＥ中０，７％アガロースゲルによる電気泳動’１４
０Ｖで２０時間行うことにより単離した。バンドは標準
と対比して同定し、電気溶離した。続いて標準方法を使
ってそれ全つシ腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸
化した。このバクターは次のオリイヌクレオチド： ５’ＣＧＣＴＴＡＧＴＡＧ　３’ ３’　　　ＧＡＡＴＣＡＴＣＣＴＡＧ　５’と連結させ
た。この分子はＮａｒ　ｌ突出部分とノ・イブリダイズ
することができ、４０番目のアミノ酸全完成させる。そ
れはタンデム停止コドンとＢａｍＨＩ部位に連結する突
出部分とを含む。

オＩＪ　ｉヌクレオチド（各々１０ｎ９）は標準条件下
で冷ＡＴＰで標識した。５ｎ９のオリゴヌクレオチド対
全標準条件下で５ｎ９のベクターと連結させて、大腸菌
株ＭＣ１０６１’！ｒ形質転換するのに用いた。アンピ
シリン耐性形質転換細胞はそのプラスミドにおけるＮａ
ｒ１部位の欠失について分析した。さらに、このクロー
ンは短い（６５ｂｐ以下）ＢａｍＨニーＨｉｎｄ　■　
フラグメントを含んでいた。この分子中のＧＲＦ類似体
−コード化セグメン）ｔＧＲＦ’−Ｃと呼ぶ。続いて、
このセグメントｔ−ＧＲＦ−分と本質的に入れ換え念。

ＧＲＦ−Ｃによってコート。

されるＧＲＦ類似体は、ＧＲＦＤ／によってコードされ
るものと同様に、そのＮ−末端にまだ人エイニジエータ
−のメチオニンを含んでいる。

第３の修飾、すなわちＧＲＦ’−ｇ−３（α因子の修飾
）はＧＲＦ類似体−コード化セグメントの５′−末端の
人工メチオニン開始コドンを除き、このセグメントの５
′−末端をプレプロ−α因子−コード化セグメントの３
′末端へ正確に結合させることを包含する。２０μ９の
ＧＲＦ　−Ｄ’　ｔ−Ｈｇ　ａ　ｉおよびＢａｍＨＩで
製造業者の説明書に従いながら消化し、約１１８ｂｐの
７ラグメントｔ−Ｉ　ＸＴＢＥ中の１０チポリアクリル
アミドによる電気泳動を行って単離した。目的のバンド
を分子量マーカーと対比させて同定した。このバンドを
電気溶離し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた
。次に、このバンドはＨｇａＩ消化によシ排除されたア
ミノ酸のコドンを戻し、Ｎ−末端メチオニンの人工ＡＴ
Ｇを除き、且つＬ２．３または４個のα因子ペプチドお
よび３，２．１または０個のプロセッシング部位をそれ
ぞれ欠くプレプロα因子分子の修飾体をコードするセグ
メントのＨｉｎｄ　［１末端と連結し得る５′−エクス
テンション（突出部分）を有する次の対合オリゴヌクレ
オチド： と連結させた。

この連結反応は次の通りであった。１０ｎ９の７２グメ
ントと５０ｎ９対合オリゴヌクレオチド（オリビニフラ
グメントのモル比＝３０：１）ｔ−２３℃で３時間連結
させた。多ｌ挿大の可能性を排除するために、この連結
反応混合物ｉＢａｍＨＩおよびＨｌｎｄｌで、それぞれ
３０分消化した。次に、単量体化された挿入物をＨｉｎ
ｄｌｌ−ＢａｍＨＩ−消化ｐ−α因子（１０ｎ９）へ１
５℃で一晩連結させた。

これは大腸菌株ＭＣ１０６１ｆｆｉ形質転換するために
使用した。アンピシリン耐性形質転換細胞の微量調製物
１Ｐｓｔｌで消化し、正しい挿入物を含むクローンを同
定し、このクローン６ＧＲＦ’−Ｅ−，３、！：命名し
た。それはα因子単位の５′−上流域（Ｅｃ。

ＲＩ部位から開始コドンまで）およびα因子リーダーを
コードする完全な配列を含む。ＧＲＦ配列はその第１ア
ミノ酸がα因子リーダーのＣ−末端のプロセッシング部
位の最後のａｈａにすぐ続くように結合される。従って
、この遺伝子は次式：で表わされる融合ポリペプチドを
コードする。

人工メチオニｙ’ｌ欠（〔Ｌｅｕ　　）−ｈＧＲＦ（１
−４０）−〇Ｈに直接融合されたα因子プロセッシング
部位Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｈａ−Ｇｌｕ−Ａｈａ
　−ｆ　コードし且つＨｌｎｄｌｌ　突出部分を含む配
列へ連結することができるクローンを作るために、２５
）の異なるセグメントヲー緒に結合した。ＧＲＦ’類似
体のＮ−末端セグメントはＧＲＦ−Ｅ−３をＨｉｎｄｌ
ｌおよびＸｂａＩで消化することにより誘導した。この
８７ｂｐフラグメントは１　ｘＴＢＥ中の１０％ポリア
クリルアミド上で電気泳動を行って単離し、その後電気
溶離した。ＧＲＦ’類似体のＣ−末端部分の遺伝子セグ
メントはＧＲＦ’−ＣからのＸｂａＩ−ＢａｍＨエフラ
グメントであり、これはＮ−末端コード化フラグメント
と同じ電気泳動および電気溶離法により単離された４５
ｂｐの７ラグメントである。これらの２５）の部分を１
６℃で１６時間連結し、その後ＢａｍＨＩとＨｌｎｄｌ
ｌｌ　　で別々に消化した。それらはｐ−α因子（連結
のために標準条件下Ｈ１ｎｄｌ［およびＢａｍＨＩで消
化したもの）内で連結させた。この連結反応混合物を使
用して大腸菌株ＭＣ１０６１’にアンピシリン耐性へ形
質転換した。形質転換細胞は微量溶菌液６Ｐｖｕｌｌで
消化し、第２Ｐｖｕ１１部位の出現を捜すことにより同
定した。この種のクローンを単離してＹＳ■２（１１　
　と命名した。

７０個のアミノ酸から成るＩＧＦ−Ｉ−？プテドをコー
ドする遺伝子（Ｎ−末端に人エイニジエーターメチオニ
ンを有する）は他所　中−一一時から得た。この遺伝子
はＥＥｃｏＲＩ−Ｈ１ｎｄｌｌフラグメント上に存在す
る。このフラグメントを調製用８％アクリルアミドゲル
で単離し、視覚化して電気溶離した。次いで、２２（１
１）Ｉ）のバンドｆｔＡｖａｌｌ　（これは工ＧＦ’−
１アミノ酸＃２のコドンを切断する）で消化した。消化
の程度は消化物と未消化物とを１０％アクリルアミドゲ
ル上で比較することにより測定した。

α因子コード化ベクター内に挿入する工ＧＦ−（遺伝子
を修飾するために次のオリゴヌクレオチド対： ５’　ＡＧＣＴＡＡＧＡＧＡＧ　３’ ３’　　　ＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧ　ｓ／全合成した。こ
の対合オリゴヌクレオチド対Ａｖａ１１−　Ｈ１ｎｄｌ
フラグメントに連結されると、両末端にＨ１ｎｄｌｌ突
出部分を有し且つＣ−末端コード化末端にのみＨｌ　ｎ
ｄ　［１部位を有する分子が形成された。

この理由のために、このオリゴヌクレオチド対のアンチ
センス鎖のみ全標準キナーゼ法を使ってリン酸化した。

これによりオリイヌクレオチド対はこのフラグメントに
連結されるが、ひとたび連結されると、このフラグメン
トはＮ−末端コード化末端でそれ自体に連結することが
できない。もしもこの予防策を講じないとすると、この
フラグメントはＢｉｎｄｌｌ消化に対して抵抗性になる
ので、このことは重要な考察である。

このオリゴヌクレオチド−フラグメント連結のために、
６０ｎ９のフラグメン）ｔ３０ｎ９の対合オリゴヌクレ
オチドと１６℃で１８時間、標準反応条件下に連結させ
た。次に、この分子のＣ−末端コード化部分のＢｉｎｄ
］１部位に連結により形成された２量体を分割するため
に、得られた混合物をＨｌｎｄｌで消化した。その後、
得られた混合物はｐ−α因子のＨ１ｎｄｌｌ消化物２０
ｎ９と２３℃で１時間連結させた。この連結反応物を使
って大腸菌株ＭＣ１０６１ｋアンピシリン耐性へと形質
転換し、その形質転換細胞はＢｓｔＥ［部位を有するプ
ラスミドの存在についてスクリーニングした。１２の形
質転換細胞のうち３つだけが上記部位を有するプラスミ
ドを含んでいた。続いてこれらｆ　ＢａｍＨＩで消化し
て正しい方向性を有するものを同定した。

３つの挿入物含有クローンのうち１つだけが正しい方向
性を持っていた。このプラスミドをＹＳｖ３（１１　と
命名した。

ＹＳｖ３（１１　ｔａ因子発現ベクター（７）ＴＲＰ２
０９に適合させるために、このプラスミドＹＳＶ３（１
１ｔ−Ｈ１ｎｄｌｌで消化し、フラグメントを先に述べ
たようにしてＤＮＡｙｔリメラーゼの大フラグメントで
処理して平滑末端とした。フェノール抽出およびエタノ
ール沈殿後、このプラスミドをリン酸化ＢａｍＨＩ　Ｉ
Ｊンカーと１６℃で１５時間標準条件下で連結させた。

次に、この試料を希釈し、ＢａｍＨＩ（２００単位未満
）で６時間消化した。このプラスミド（２，５ｎ９）は
プラスミド閉環に有利な条件を用いて連結し、大腸菌株
ＭＣ１０６１ｋアンピシリン耐性へと形質転換するため
に使用した。

形質転換細胞はＢａｍＨ工消化により微量溶菌液中のＢ
ａｍＨ工部位の存在についてスクリーニングした。

この種のクローンを１つ単離してＹＳＶ３０２　　と命
名した。

ＹＳ’Ｖ　３０２　ｆ　ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌｌで
消化すると１３００ｂｐのフラグメントが生成した。こ
のフラグメントを６％アクリルアミドゲルから電気溶離
により単離し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させ
た。このフラグメント４０ｎ９ｉＴＲＰ２０９の脱リン
酸化ＢａｍＨ工消化物６ｎｌＪと標準条件下で連結させ
、そして大腸菌株ＭＣ１０６１ｔ−アンピシリン耐性へ
形質転換するのに使用した。形質転換細胞は微量溶菌液
のＸｂａＩ消化により分析した。

正しい方向性、すなわち転写ターミネータ−の隣りにＩ
ＧＦ−１遺伝子の３′末端を有するものは既知分子量の
標準に対する検定用制限フラグメントの同定により選択
した。このクローンはＹＳＶ３０３と命名され、第２図
にその制限地図を示す。

ベクター作製に関する次の記載において、全てのα因子
ベクターは野生型サッカロミセス・セレビシエＴＲＰ１
遺伝子を含む１組の２μサークルをベースとするベクタ
ーの誘導体である。大腸菌による選択および複製に関す
る全ての成分は、ｐＢＲ３２２全ベースとするプラスミ
ド内に含まれている。

この系列において最初のベクターであるＴＲＰ４０１は
、サツカロミセス内での複製に必要な信号を有する２μ
サークル”３体”由来の２，２　Ｋ　ｂＥｃｏＲＥｃｏ
ＲＩントを含有する。この挿入物はＹＥｐ２４　　（Ａ
ＴＣＣから入手可能；寄託番号３７０５１）ｔ−Ｅｃｏ
ＲＩで消化することによシ得られた。電気泳動後、標準
に対比させて２．２Ｋｂフラグメントを同定し、電気溶
離し、沈殿させた。このフラグメントｔ−ｐＢＲ３２２
の脱リン酸化ＥｃｏＲＩ消化物と連結させた。この連結
反応混合物を使ってＭＣ１０６１にアンピシリン耐性へ
形質転換した。アンピシリン耐性クローンは微量溶菌液
のＥｃ　ｏＲＩ消化によシ同定した。この作製において
は２５）の方向性が可能である。２μサークルのＨｉｎ
ｄＩｌｌ　部位がｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性
遺伝子中のＨｌｎｄ［部位に最も接近するもの全使用す
ることが選ばれた。このクローンはＴＲＰ４０１と命名
された。

１つのＥｃｏＲ工部位全部位させてプラスミドベクター
ＴＲＰ４０２ｅ作製した。正しい方向性を有するプラス
ミド”（ＴＲＰ４０１）を含む微量溶菌液をプールし、
プラスミド１Ｈ１ｎｄ［ｌで完全消化した。

次に、それらｔ−１Ｏｎ９／μｌに希釈し、１０ｎ９′
ｆ：５０μｌの反応混合物中で通常の方法により再連結
した。この連結反応混合物を使って大腸菌株ＭＣ１０６
１？アンピシリン耐性へ形質転換した。

形質転換細胞は微量溶菌液のＥｃｏＲ工消化により分析
した。Ｈｌｎｄｌｌ　での消化後のＴＲＰ４０１の再閉
環は２５）あるＥｃｏＲ工部位全部位１つ全欠失させる
であろう。

ＴＲＰ４０３（第３図）はＴＲＰ４０２をＥｃｏＲＩで
消化し、それをウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理
して線状化ベクターの５′末端を脱リン酸化することに
よシ作られた。ＴＲＰ１遺伝子（および関連したＡＲ３
１配列）を含む１．４５ＫｂＥｃｏＲエフラグメントは
、プラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣから入手可能；寄託番
号３７０６０　）　ＯＦｉ；ｃｏＲ工消化、その後の０
．８％アガロースによる電気泳動によって得られた。１
，４５Ｋｂのこのバンドは標準に対比させて同定した。

それ老電気溶離により単離して沈殿させた。１０ｎ９の
このベクター（ＴＲＰ４０２）を５０ｎ９り１．４５Ｋ
ｂ挿入物と室温で１時間連結させた。

この連結反応混合物を使って大腸菌株ＭＣ１０６１をア
ンピシリン耐性へと形質転換した。形質転換細胞は挿入
物の存在および２μサークルフラグメントに対するその
方向性について分析した。

ＴＲＰ１配列が２μフラグメントに最も接近するもの２
ＴＲＰ２０３　　（第３図）と命名し、他の方向性のも
のをＴＲＰ４０４と命名した。

ＴＲＰ４０５（第４図）およびＴＲＰ４０９（第５図）
の作製は先に記載した通りである。

ベクターＴＲＰ４０６（その制限地図を第６図に示す）
を作製すル念めに、ＧＲＦ’−Ｅ−３ｉ　Ｔｌ（Ｐ４０
５内に挿入した。ＴＲＰ４０５をＢａｍＨＩで消化して
脱リン酸化した。１０ｎ９のこのベクターを、ＧＲＦ″
−Ｅ−３から消化、電気泳動および電気溶離によシ単離
した１２００ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｂｇｘｌフラグメント
と連結させた。この連結反応はこのフラグバント全２５
〜７５ｎ９含有し、２３℃で２時間行った。この連結反
応混合物を使って大腸菌株ＭＣＩＱ６１　　ｅアンピシ
リン耐性へと形質転換した。

形質転換細胞は微量溶菌液のＰｖｕ［消化により同定し
た。正しい方向性を有するものｌＴＲＰ４０６と命名し
た。ＴＲＰ４０６ベクターは大腸菌と酵母の両方におい
て増殖でき、酵母細胞内でアミノ酸２７にロイシンを有
する４４アミノ酸ＧＲＦ類似体ペプチドを発現する。

ベクターＴＲＰ２１０　　（その制限地図を第７図に示
す）を作製するために、ＧＲＦ’−Ｅ−３をＴＲＰ４０
９内に挿入した。ＴＲＰ２０９ｉＢａｍＨＩで消化し、
ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理してベクターの
再閉環を防いだ。ＧＩ（Ｆ−Ｅ−３から単離したα因子
−ＧＲＦフラグメント２ＴＲＰ２０９　内へ連結させた
。この連結反応物を使って大腸菌株Ｍ（１１０６１にア
ンピシリン耐性へ形質転換した。これらの形質転換細胞
は正しい方向性（すなわち、ＧＲＦ遺伝子がα因子の５
′領域と３′領域の間に挿入される）全測定すべくスク
リーニングした。

プレプロα因子はリーダーのカルボキシ末端のプロセッ
シング部位に２５）のセグメントを有し、これらの部位
においてα因子ペプチド単位はリーダー堅プテドから遊
離する。これらのセグメントの第１は一対の塩基性アミ
ノ酸（１ｙｓ−ａｒｇ）である。第２は配列ｇｌｕ−ａ
ｌａ−ｇｌｕ−ａｌａを有する。塩基性アミノ酸におけ
る切断の方が配列ｇｌｕ−ａｌａ　−ｇｌｕ−ａｌａ　
よシも有利であることが知られている。

ＧＲＦ分子のＮ−末端付近のプロセッシングを改良する
ために、ＧＲＦ’−コード化配列の隣９にｌｙｓ−ａｒ
ｇ　　をコードする配列を配置して２５）の構成物ＴＲ
Ｐ２１１　およびＴＲＰ２１３　　を作った。

ＴＲＰ２１１はＴＲＰ４０６と同じ制限地図を有し、第
７図に示される。

ＴＲＰ２１１　によりコードされ且つそのプラスミドに
よってコードされる異種タンパク質のＮ−末端に融合さ
れたプロセッシング部位はｌｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａ
ｌａ−ｇｌｕ−ａ’ｌａ−１７８−ａｒｇと読み取れる
であろう。ＴＲＰ２１１　　によってコードされるＧＲ
Ｆ’成分は２７位にメチオニ／を有し且つ遊離酸カルボ
キシ末端を有する４４−アミノ酸ポリペプチドである。

ＴＲＰ２１１　作製のための出発物質は、　ＢａｍＨニ
ーＥｃｏＲエフラグメントとしてｐＢＲ３２２内でクロ
ーン化された合成ＧＲＩ’遺伝子（クリエイティブ・バ
イオモレキュルズから入手）である。この遺伝子を含む
プラスミドは先に述べたようにＢａｍＨＩとＨｇａＩで
消化した。このフラグメントに次の配列： を次の方法で付加した。このセグメントのアンチセンス
鎖（１８０ｎ９）を上記のようにＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼとガンマ−３２Ｐ　ＡＴＰを使ってリン酸化し
、冷たいｌ　ｍＭ　ＡＴＰを追加した。この反応生成物
をセファデックスＧ−５０クロマトグラフイーにより精
製し、酵素は６５℃に加熱して失活させた。次に、この
セグメントのセンス鎖１５０ｎ９をこの混合物に加えて
室温まで徐々に冷却させた。この反応生成物１８０ｎ９
を単離したＨｇａＩ−Ｂａｍ）ｉ工７ラグバント９０ｎ
９と１６℃で１６時間連結させた。この反応において、
Ｈ１ｎｄｌｌ突出部分を有する末端は自己連結できず（
この種の２量体はＨｌｎｄｌｌ　で消化できないであろ
う）、従ってＢａｍＨＩ部位で連結したフラグメントの
２量体のみが連結反応の間に生成される。その後、連結
混合物を５単位のＢａｍＨＩで３７℃、２０分消化した
。この混合物を７エノール抽出し、５μ９のキャリアー
ｔＲＮＡを加え次後核酸をエタノール沈殿させ念。この
フラグメントは今やＨｌｎｄｌｌとＢａｍ　ＨＩで消化
したベクターに連結することができる。この場合、ベク
ターは再びｐ−α因子である。連結反応は５μ９未満の
ベクターおよび９０ｎ９の挿入物（上記二本鎖オリゴヌ
クレオチドを合成ＧＲＦ’遺伝子のＨｇａニーＢａｍＨ
エフラグメントに連結したもの）を含んでいた。この連
結生成物を使って大腸菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン
耐性へ形質転換した。形質転換細胞はＤＮＡ微量溶菌液
のＰｖＪ消化、０．８％アガロースゲルによる電気泳動
および既知分子量の７ラグメントに対するフラグメント
の大きさの比較によシ分析した。正しいス硬りトルを有
する形質転換細胞を単離してＧＲＦ’Ｉ　　と命名した
。

ＧＲＦ’ＩプラスミドをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで消化
して１２００ｂｌ）のフラグメントを同定し、電気溶離
により単離した。このフラグメントをＴＲＰ４０９のＢ
ａｍＨ工部位内でクローン化した。正しい方向性の７ラ
グメントをもつプラスミドを同定して、ＴＲＰ４０９（
第７図）と命名した。このプラスミドはコーディング配
列ｇ’ｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｌａとＧＲＦ’との間
に別の対の塩基性アミン酸（ｌｙｓ−ａｒｇ）のコドン
を有することを除いてＴＲＰ２１０　　と同じである。

これによりコードされる融合ポリペプチドは次式： ％式％ α因子により作動される異種遺伝子のプロセッシング信
号もまた、ＧＲＦ’−＜プチドが結合する第１α因子に
ブチどの後ろに配列１ｙｓ−ａｒｇを配置することによ
り変えられた。この構成物は一連の構成物：　ＹＳｖ４
（１１　；ＹＳＶ４０２；ＹＳＶ４０３；ＹＳＶ４０４
Ｂ；ＴＲＰ２１３（第８図参照）を用いて次の方法によ
り達成された。

完全なα因子遺伝子をコードする１、７ＫｂｌｃｏＲＩ
フラグメントはゲノムクローンＡＭＦ−Ｂから単離した
。これはゲノムクローンをＩｃｏＲＩで消化シその消化
物を０．７％ＴＢＥアガロースによる電気泳動を行うこ
とによシ達成された。この１．７に１）フラグメントは
ＤＮＡ分子量標準に対比させて同定し念。ノξンドを切
り取り、ＤＮＡを電気溶離して沈殿させた。次に、この
フラグメン）　（５０ｎ９）をｐＢＲ３２２の脱リン酸
化ＥｃｏＲＩ消化物（１０ｎ９）と室温で２時間連結さ
せ、この連結反応混合物を使って大腸菌株ＭＣ１０６１
をアンピシリン耐性へ形質転換した。アンピシリン耐性
形質転換細胞由来のプラスミドをＥｃ　ｏＲＩで、次に
５ａｘＩで消化して挿入物の方向性を決定した。好まし
い向きはα因子遺伝子の３′末端の５ａＩＩ部位がｐＢ
Ｒ３２２のＳａｌ工部位により接近しているものである
。このプラスミドをＹＳＶ４（１１と命名した。

次に、プラスミドｙｓｖ４（１１をＢａ１工で消化して
再び連結した。２μ９のＹＳＶ４Ｑｌ　を製造業者の説
明書に従ってＢａ１工で消化した。線状バンドを０．７
％アガロースによる電気泳動後に単離し念。

このバンドは再閉環に有利な標準条件下で自己連結させ
た。このプラスミドは第１α因子ペプチドのコーディン
グ配列中のＢａｌ工部位からの配列、およびｐＢＲ３２
２の完全なテトラサイクリン耐性遺伝子を含めてその下
流の全ての配列を欠失しており、これをＹＳＶ４０２　
　と命名した。

プラスミドｙｓｖ４０２をＰｖｕｌｌで線状化し、標準
条件下でリン酸化Ｂａｎｄニリンカーと連結した。

この連結生成物をＢａｍ　Ｈ工で広範囲に消化して、Ｐ
ｖｕ１部位に結合し７２ＢａｍＨニリンカーのポリマー
を除き且つＢａｍＨＩ接着末端を生成させた。どのベク
ターを再連結し、続いてＰｖＪで消化してＢａｍＨＩ　
リンカ−を取り込まなかった分子をすべて除いた。この
連結および消化の生成物を使って大腸菌株ＭＣ１０６１
をアンピシリン耐性へ形質転換した。形質転換細胞はＢ
ａｍＨＩ部位を有するプラスミドの存在、Ｐｖｕ［部位
の不在、および正しい線状フラグメントの大きさについ
て試験した。

このプラスミドをＹＳＶ４（１３　　と命名した。　　
　。

ＴＲＰ２１３　Ｏ前ＩＫ体はＹＳＶ４０４−Ｂ　と命名
さｈ、次の方法で作られた。構成物ＹＳＶ４０３　をＢ
ａｍＨＩおよびＢａＩＩで別々に消化した。線状バンド
を０．７％アガロースゲルから電気溶離により単離した
。プラスミドＹ８Ｖ２（１１　は先に述べたようにして
作製された。このプラスミドをＢａｍＨＩおよびＨｇａ
Ｉで消化した。１１（１１）Ｉ）フラグメントを８％ア
クリルアミドによる電気泳動、その後の電気溶離および
沈殿により単離した。

次のオリゴヌクレオチドの画鋲をリン酸化し、２０倍モ
ル過剰のオリゴヌクレオチドを１５ｎ９のそのフラグメ
ントへ１６℃で５時間連結することにより、オリゴヌク
レオチドを１１０ｂｐフラグメントへ付加した： ３’　ＧＧＴＩＧＧＴｒＡＣＡ’ＩＧ　ＴＩＴ　ＴＣｒ
　Ａ製缶ＴＣＴ）ＣＧＡＴＡＧＡＡＡＴＧＡ　５’次に
、この連結反応生成物を１０ｎ９のＢａ１）−ＢａｍＨ
ニー消化ｙｓｖ４０３に付加し、この混合物を使って大
腸菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性へ形質転換した
。これらの形質転換細胞はＬ−Ｂアンピシリン寒天平板
上およびその平板の上にのせたニトロセルロースフィル
ター上に保型した。その後、これらのフィルターを先に
述べたようにしてハイブリダイゼーションのために調製
した。それらはガンマ−３２ＰＡＴＰで放射性標識した
センス鎖オリゴヌクレオチド ５　’−ＣＣＡＡＣＣＡＡ’ＩＧＴＡＣＡＡＭＧＡＴＡ
ＯＧＣＡＧＡＯＧＣｒＡＴＣＴ−３’とハイブリダイズ
させた。このハイブリダイゼーションは５　Ｘ　５ＳＰ
ｈ：、　０．５％ＳＤＳおよび１巧／Ｗｔｌ変性サケ精
子ＤＮＡ中、１０ｍＡ！の容量において３Ｘ１０Ｃｐｍ
／履ｌを用いて６５℃で１６時間実施した。その後フィ
ルターをバッグから取り出し、２ｘＳＳＣ，０，５％Ｓ
ＤＳで室温においてそれぞれ５分と２０分の２回洗った
。次いでフィルターを６５℃で１５分洗い、自然乾燥さ
せ、そしてコダックＸＡＲ−５フィルムに増感板を使っ
て一７０℃で３時間感元した。

４つの陽性クローンを同定し、微量溶菌液をＢａｍＨＩ
とＢｇｌＩ［で消化することにより分析した。

これらのクローンのうち３つが正しい作製と一致する明
らかに同一のスペクトルを与えた。これらのうちの１つ
はＹＳＶ４Ｑ４−Ａと命名した。このクローンをＰｓｔ
ｌで消化すると約５００ｂｐのフラグメントが得られた
。これはクローン中に３つのα因子はプチドが存在する
ことと一致する。これは疑いなくＹＳＶ４０２の作製中
にＢａ１１での部分消化によりもたらされたものであっ
た。クローンｙｓｖ４０４−ＡをＨｌｎｄ［ｌで消化し
てα因子はプテドのうち２５）を除去した。２５０ｐｇ
を１０μｌの容量において２３℃で３時間連結させ、こ
れを使って大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性へ形
質転換した。２５）ねクローンがＰｅｔＩ消化物中の正
しい大きさのバンドについて分析された。これらのクロ
ーンの１つ（正しい大きさをもつ）はＹＳｖ４０４−Ｂ
　トｆｉｉｌ＋　Ｌ７ｔ。ＹＳＶ４０４−ＢＫおけるＧ
ＲＦ’コーディング配列とα因子コーディング配列との
融合の正確さはサンガーのジデオキシ塩基配列決定法に
より確かめた。

プラスミドＹＳＶ４Ｑ４−ＢをＢａｍＨＩとＢｇｌＩ［
で消化して、１２５（１１）ｐの７ラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動その後の電気溶離により単離した。

約５０ｎ９のそのフラグメントを５ｎ９のＴＲＰ４０９
の脱リン酸化ＢａｍＨＩ消化物と２３℃で２時間インキ
ュベートすることにより連結させ、その後その連結混合
物を使って大腸菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性へ
形質転換した。形質転換細胞はＹＳｖ４０４−２を同定
する際に使用した同じコロニーハイブリダイゼーション
法によりスクリーニングした。２５）のコロニーを同定
し、ＴＲＰ４０９（第８図）と命名した。それらは完全
なプレプロ−α因子リーダーセグメントおよび第１α因
子ペプチドをコードする配列を含むα因子遺伝子の５′
末端を含有する。この配列によりコードされる融合タン
パク質において、第１α因子４プチドはジペプチド１ｙ
８−ａｒｇにそのカルボキシ末端で結合し順次そのジ４
プチドはそのａｒｇカルボキシ基ではプチドセグメント
ｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｈａに結合し、そのペプチ
ドセグメントはそのカルボキシ末端のａｈａで〔Ｌｅｕ
　　）−ＧＲＦ”（１−４０）−ＯＨのＮ末端ｔｙｒに
結合する。

’Ｌ’ＲＰ２１３　によシコードされるα因子−ＧＲＦ
融合ポリイプテド中のα因子ペプチドとＧＲＦ類似体の
間のプロセッシング部位のｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａ
’ｌａセグメントをコードする配列を欠失させるたメニ
、ＹＳＶ２（１１　カラＯ１，２Ｋｂ（７）ＥｃｏＲＩ
　−ＢａｍＨエフラグメントバン１３ｍｐ１８内でサブ
クローン化した。ｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｌｌＬを
コードする１２塩基を除くために、以下に述べるような
Ｍ１３突然変異変異性を使用した。プライマーはα因子
−ＧＲＦ’の融合連結部のアンチセンス鎖に相同であっ
た： ３’　ＣＩＴ　ＣＴＩ’　ＣＣＣＣＡＴ　ＡＧＡ　ＡＡ
ＣＣｒＡ　’Ｉ′ＩＴ　’１’Ｃ’Ｌ”−ＧＡＡ　ＧＡ
Ａ　ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＴＩＧ　ＣＡＴ　Ａ／野
ＡＧＡ−ｇｌｕ　ｇｌｕ　ｇｌｙ　ｖａｌ　ｓｅｒ　１
ａＬＬａｓｐ　ｌｙｓ　ａｒｇ−ＡＩＩＧωＴσＸ）　
５／ ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣｒ　ＧＡＡ　ＧＣＩ’　
ＴＡＣＧＣＡ　ＧＡＣｇｌｕ　ａｌａ　ｇｌｕ　ａｈａ
　ｔｙｒ　ａｈａ　ａｓｐ欠失　　欠失 この突然変異誘発法はｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｌａ
残基をコードする塩基配列を排除した。意図する欠失を
有する突然変異体ば　Ｐ−標識オＩＪ　ｄヌクレオチド
： ５’ＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧ
Ａ　３’を使用するハイブリダイゼーションにより選択
した。

突然変異誘発後、二本鎖複製型ＤＮＡを調製しそのＤＮ
ＡをＢａｍＨＩ　およびＢｇｌｌで消化した。

このフラグメントを単離して’ｒＲｐ２０ｇのＢａｍＨ
工部位内でサブクローン化した。正しい方向性の挿入物
を有するこれらのクローンをＴＲＰ２１５　　と命名し
、その制限地図を第９図に示す。

α因子プレセグメントからＩＧＢ’−１の正しいプロセ
ッシングを妨げる恐れのある配列を除くために、プロセ
ッシング部位が修飾されたＹＳＶ　３０３の類似体を作
製した。ＹＳＶ３０３　　（第２図）は次のポリープチ
ド配列： α因子プレセグメント・・響 ｌｙｓ−ａｒｇＴｇ’ｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｌａ−
１ｙｅ−ａｒｇ−ＩＧＦ−Ｉ（プロセッシング部位） をコードするセグメントを含む。１７８−ａｒｇおよび
配列ｇｌｕ−ａ１ａ−ｇ’１ｕ−ａｌａの１つのコピー
が排除された。

この仕事を達成するために、ＹＳＶ３０２からのＥｃｏ
ＲニーＢａｍＨエ　フラグメントをＭ１３１ｎｐ１８内
でサブクローン化した。ＹＳＶ３０２　をＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、ＩｘＴＢＥ中の０．８　％　
７ガロースによる電気泳動を行った。１３００ｂｐのバ
ンドを同定して電気溶離した。２０ｎ９のアリコートを
、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化したＭ
１３ｍｐ１８のＢａｍＨＩ−Ｅｃ　ｏＲＩ消化物１０ｎ
９と連結させた。この連結反応は室温で数時間進行させ
、得られた生成物を大腸菌ＪＭ１０３内でクローン化し
た。プラークはＭ１３ファージゲノムの二本鎖複製型Ｄ
ＮＡのＥｃｏＨＩ−ＢａｍＨＩ消化により同定した。正
しい挿入物を保有するファージを標準法により増殖させ
、−重鎖鋳型を調製した。センス鎖を有するこの一本鎖
鋳型は次の配列を有するプライマーとｌ　Ｘ　Ｈ１ｎｄ
ｌｌ緩衝液（２０ｍＭ　　）リス−ｐＨ７，５，１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１１２，５０ｍＭＮａ（Ｊ、１ｍＭジチオト
レイトール）中で６５℃に加熱し、室温まで徐々に冷却
することによりアニーリングした。

ＨＷ　　５’　ＧＴＡＴＣＩＴＩＸ３ＧＡＴＡＡＡＡＧ
ＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴ−プライ？−３’　　　　
ＡＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴＩＴＣｒ　　　　　　　　　　
　−このアニーリング反応は２０ｍＭ１−リス−ＨＣＪ
　。

１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）、２５ｍＭＮａ（Ｊｌ　５００μＭＡＴＰ、１０
μｃｉ３２ＰａＡＴＰ、５００μＭ（７）ｄＣＴＰ、ａ
ＧＴＰ、ＴＴＰ、４μＭｄＡＴＰおよび３単位のＴ４リ
ガーゼならびに２．５単位のＤＮＡｙＩ′？リメラーゼ
（大フラグメント）中室源で５分インキユベートシ、せ
して１μｌのＩＱｍＭａＡＴＰを加えた。その後１５℃
で１２〜２０時間インキュベートした。

次に、この反応混合物は１．５　Ｍ　ＮａＣｌ／　１３
％ＰＥＧ６０００の１：１混合物を用いて閉環した環状
ＤＮＡＩ沈殿キせ、２０（ｕｎの１０ｍＭ）リス（ｐＨ
８）、１　ｍＭＥＤＴＡに再懸濁した。

アルカリ性ショ糖密度勾配（５〜２０％ショ糖、１ＭＮ
ａｃ／、０．２　Ｍ　ＮａＯＨ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）を
調製し、５Ｗ５０．１０−ターで遠心した。試料は０．
２　ＮＮａＯＨヘ調整し、上記勾配は３７０００ＲＰＭ
で４℃２時間遠心した。勾配をポンプで分取し、分画を
数えた。勾配の底半分の分画はプールして、１Ｍトリス
−クエン酸（ｐＨ５）で中和した。次いで、それらｆｔ
ＴＥに対して透析し次。その後それらを使って大腸菌Ｊ
Ｍ１０３を形質転換した。

形質転換細胞を増殖させ、鋳型を微量調製（ｍ１ｎｉｐ
ｒｅｐ　）法で単離して５０μ１ｌＴＥに溶解した。

５μｌｋスロツト・プロット装置でテトロセルロースフ
ィルター上に点在させた。このフィルターをベーキング
し、標準方法を用いて放射性標識オリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズさせた。この場合のプローブは ３’　ＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴ　５’で
あった。

ハイブリダイゼーションは６ｘｓｓｐｇ、ｌ０ＸＤｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ　　（２％ウシ血清アルブミン、０．２
％ポリビニルピロリドン）、０．２％ＳＤＳ中２３℃で
実施した。ハイブリダイゼーションに先立ってプレハイ
ブリダイゼーションを６７℃で１時間実施した。ハイブ
リダイゼーションは約５ｏｏｏｏ。

ｃｐｍ／ｍＡ’を使用して、２３℃で１時間行った。次
に、フィルターを２３℃において６ｘＳＳＣで洗い、フ
ィルムに１時間感光した。ハイブリダイゼーションが対
照鋳型（すなわち出発物質）に対するプラス−マイナス
法で観察されるまで、順次高い温度でそれを洗浄した。

これらの陽性試料は大規模培養で増殖させ、二本鎖ＤＮ
Ａ複製中間体を通常の方法で調製した。次に、このＤＮ
ＡをＢａｍｆ（Ｉおよび３ｇ１■で消化し、新規なα因
子−工ＧＦ’−Ｉ配列を含むフラグメントを一般方法に
より単離し、そ１．テＢａｍＨＩ−消化ＴＲＰ４０９と
連結させた。この連結反応混合物を使って大腸菌株ＭＣ
１０６１５−アンピシリン耐性へ形質変換し、形質転換
細胞中のプラスミドは微量溶菌液のＸｂａＩ消化により
分析した。正しい方向性を有するこれらのプラスミド１
ＹＳＶ３０４　　と命名した。

カルボキシ末端にヒトプロウロキナーゼを含む融合タン
パク質のＳ．セレビシエ内での発現のために、ｐＵＫ２
０３　　と呼ばれるプラスミドベクターを第１０図に示
す。このベクターはα因子遺伝子プロモーターから転写
される遺伝子（α因子遺伝子ターミネータ−を含む）か
らの融合ポリペプチド： をコードする組換えＤＮＡ配列を含む。

ｐＵＫ２０３はアミノ酸９（例えば発行された英国特許
出願第２１２１０５０号の第４Ａ図および第９図を参照
）から始まるヒトプロウロキナーゼの部分をコードする
ＴａｇニーＨ１ｎｄｌフラグメント、およびクローンＡ
ＭＦ−Ｂのプレプロα因子遺伝子を用いて次のようにし
て作製された。

標準特定部位−突然変異誘発法を用いることにより、α
因子遺伝子の第４α因子ペプチドをコードするセグメン
ト中のグリシンの一〇〇〇−コドンを、別のグリシンコ
ドン−ＧＧＧ−に変換した。これはこのコーディングセ
グメント中にＳｍａ　１部位を作った。

α因子プロモーターと、第４α因子にブチどのコーディ
ングセグメント中の新しく作られたＳｍａ１部位に対す
るコーディング配列とを含むＥｃ　ｏＲ１−Ｓｍａ　ｌ
フラグメントはその後、Ｅｃ　ｏＲ工とＳｍａ　ｌで切
断したｐＵ（１１８内でサブクローン化した。

次に得られたプラスミドをＨｌｎｄｌｌで消化した後再
び閉環し、この閉環プラスミドを含む形質転換細胞は、
４つのα因子ペプチドのコーディングセグメントのうち
第１（すなわち最も５′側）以外の全てが欠失されたプ
ラスミドについてスクリーニングした。

プロウロキナーゼの部分を含むＴａｑ　ｌ　−Ｈｌｎｄ
　［１フラグメントは、　Ａｃｃｌと）（ｉｎｄ［ｌで
切断したｐＵ（１１８内でクローン化した。

プロウロキナーゼ−コード化挿入物を含むｐＵＣ１８は
Ｔａｑ　ｌとＨｉｎｄｌで切断し、プロウロキナーゼ−
コード化フラグメントを単離し、その後次のアダプター
： に連結した。

このアダプターはその３′末端のＴａｑ　ｉ接着末端：
′プロウロキナーゼの最初の８個のアミノ酸をコードす
る一連の８コドンと、その後に続く９番目のアミノ酸の
ためのコドン−ＴＣＧ−のＴに相当する３′末端のＴ：
プロウロキナーゼのＮ−末端セリンに融合した１１６）
−ａｒｇプロセッシング部位をコードするセグメントＡ
ＡＧＡＧＡ；　　５’末端のＸｍａ　ｌ接着末端；およ
びＸｍａ　ｌ接着末端から始まる配列：　５’　−ＣＣ
ＧＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣ−３’（この配列はα
因子ペプチドの８位に存在するプロリンのコドンの最後
の２５）の塩基を含み、α因子ヘフチドのアミノ酸９−
１３のコドンへ続く）を含む。連結反応および目的フラ
グメントの単離後、得られたフラグメントをＸｍａｌ−
Ｈｉｎｄ［ｌ−切断ｐＵＣ１８内でクローン化した。次
いでｐＵＣ１８をＸｍａｌとＨｌｎｄｌｌで切断するこ
とにより、このフラグメントラ単離し、そしてＥｃｏＲ
Ｉ部位の間にα因子挿入物を含み且つＸｍａ　Ｉで線状
化したｐＵＣ１８プラスミドへ連結した。得られたプラ
スミドはＥｃｏＲＩ−Ｈｌｎｄ［フラグメント上に、５
′から３′の順に、α因子プロモーターおよび第１α因
子Ｒプテドをコードするセグメントまでの構造遺伝子、
プロセッシング部位１７８−ａｒｇ−のためのコド／、
ならびにプロウロキナーゼをコードするセグメントヲ含
んでいた。

このフラグメントの３′末端に存在するＨ１ｎｄ■部位
は、標準方法に従って、Ｈｉｎｄ［ｌで切断し、α因子
−プロウロキナーゼ融合遺伝子を有するＥｃ　ｏＲニー
Ｈ１ｎｄ　［１フラグメントを単離し、修復し、そして
５ａ１１アダプター：　５’　−ＧＧＴＣＧＡＣＣ−３
’３’　−ＣＣＡＧＣＴＧＧ−５’ に連結することによりＳａｌ　１部位に変換した。

このフラグメントの５′末端およびα因子プロモーター
の５′末端（第１図参照）に近いＢｇｌＩＩ部位は、こ
のフラグメントｅＢｇｌＩＩで切断し、適当な大きさの
アラ２メントを単離し、修復してＸｈｏｌアダプター：
　５’　−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’３’　−ＧＧＡＧＣ
ＴＣＣ−５’ に連結することによりｘｈｏ１部位に変換した。

最後に、α因子−プロウロキナーゼ融合遺伝子をもつＸ
ｈｏ　ｌ　−５ａ１１フラグメントをプラスミドＴＲＰ
４０９のＳａｌ　１部位内でクローン化することによυ
ｐＵＫ２０３を作製した。ｓ’−Ｘｈｏ　Ｉ突出末端と
３’−３ａｌｌ突出末端との連結は、ｐＵＫ２０３中の
α因子プロモーターの５′末端付近にＴａｑ　１部位を
残存させた（第１０図参照）。

生物学的に活性なプロウロキナーゼの生産のために、Ｇ
ＲＦをコードするベクターに関して先に述へた方法を用
いて、Ｓ．セレビシエ酵ｔのＧＧ１０ｏ−１４Ｄ　菌株
をｐＵＫ２０３プラスミドで形質転換した。ＴＲＰ１遺
伝子に基づいて選択した形質転換細胞を培養した。

本明細書中の大部分の実施例はサッカロミセス・セレビ
シエ酵母株ＧＧ１００−１４Ｄ　ｅ使用する。

コノ菌株は菌株Ｄ１３−　ＩＡ（Ｍａｔ　ａ　、　ｈｉ
ｓ　３−５３２゜ｔｒｐｌ、　ｇａ１２，５ｕｃ２）と
ＤＢ４（Ｍａｔα、ｐｈ０５゜ｕｒａ　３−５２）　　
とを交雑することにより作られた。

この交雑の１つの半数菌株が表現型（Ｍａｔα。

ｔｒｐＬ　ｈｉｓ　３−５３２．　ｕｒａ　３−５２ｗ
　ｐｈｏ５）　’に有するＧＧ１０ｏ−１４Ｄである。

− ＧＧ１０ｏ−１４Ｄま念は本明細書中で記載したその他
の菌株を用いる酵母の形質転換は以下に記載の方法で行
われる。

ハイズリッドプラスミドＤＮＡによる酵母の形質転換性
：全ての方法は特に指定しない限り室温で行った。

θ白目＝１．白金耳−ばいの細胞を５ｆｆｉｌ培養試験
管に接種する。早朝にこれを行う。

２、細胞が後期対数期に到達した時点 （１０細胞／罰以上）で、１０〜１０ 個の細胞を５００ｄＹＥＰＤ（１％酵母エキス、２％ハ
フトン、２％デキス トロース）に接種する。これは夜に 行われるであろう。

１日目：　１．　２Ｘ１０７／ｍｌ以下（好適には１０
／ｄ）の細胞を収獲する。形質転換率は培 養物中の細胞密度が増加するにつれ て低下する。５００ｍ／滅菌ボトル中に２５０ｄ／ボト
ル、４０００ｒｐｍ、５分で収獲する。

２　沈殿物を２５−の１Ｍソルビトールに再懸濁する。

生存細胞をカウント する九めに０．１　ｍｌを分取する（下記参照）。

３、　５００　Ｏｒｐｍで５分遠心する。

４．２５ｙｎｌの１Ｍソルビトールに再懸濁する。生存
細胞をカウントするため ０、１　ｍｌ　′ｔ−分取する（下記参照）。

５、　スフェロプラスト形成のために１　ｒｒｒｌグル
スラーゼを加えて３０℃で１〜 ２時間振とうする。（グルスラーゼ は米国プラウエアー州つイルミント ン、エンド・ラボラトリーズから購 入） ６．１０Ｘ細胞培養物を顕微鏡用スライド・ガラス上の
５％ＳＤＳ　１滴中で希釈することによりスフェロプラ
ストの 形成を検定し、６ゴースト”を観察 する。

７、　スフェロプラスト形成後、生存細胞を再びカウン
トする。

８、　２５００　ｒｐｍ　１３分遠心することによりス
フェロプラストを取り出す。

９．１Ｍソルビトールで１回洗浄する。

１０、　３ＴＣ（ｌ　Ｍソルビトール、１０ｍＭ）リス
、１０　ｍ　Ｍ　ＣａＣｌ２　、ｐ　Ｈ７５）で再び洗
浄する。

１１１０扉Ｉ　　ＳＴＣ中に再懸濁する。

１２．２本の大きな使い捨て試験管のそれぞれに０．５
　ｒｒｔｅの懸濁されたスフェロプラスト細胞を加える
。

１３、各試験管に２０μｌのＤＮＡ溶液（ＤＮＡ濃度約
２５０ｐ９／μｌ〜約２５０ｎ９／μｌｌ）　？加え、
混合し、１０分放置させる。

１４、各試験管に４．５　ＷＬｌ！の４０％ＰＥＧ、１
０ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２を加え、試験管を逆さにして混
合する。細胞は塊状になるだ ろう。１０分待つ。

１５、　　卓上遠心機を使って低速（２５００ｒｐｍ）
で遠心する。

１６、　５　ｍＡ’　ＳＴＣ中に再懸濁する。５０℃で
再生用寒天（下記参照）を入れた １００ゴボトルに加える。

１７、　　逆さにして混合し、３つの空のにトリ皿に注
ぐ。

１８．３０℃で３日インキュ×−トする。

再生用寒天（１リツトルあたり）： １８２９　ソルビトール ２０９　寒天 ６．７９　　酵母窒素塩基（アミノ酸不含）２０９　グ
ルコース １工ｌ液状ＹＥＰＤ（任意） 必要に応じて（酵母菌株の要求性によシ）アミノ酸を添
加する。

生存細胞のカウント： １、１０ｍ１滅菌Ｈ２ｏ中に０．１荒ｊの細胞懸濁液を
加える。

２、　　Ｈ４０で１０００倍に希釈する（スフェロプラ
スト形成後は１０倍に希釈する） ３、　　ＹＫＰＤ平板上に０．１　ｒｔｔｌを塗りつけ
る。

４、　カウントする。

形質転換後、トリプトファン原栄養株への復帰について
選択された形質転換細胞ヲトリプトファン欠損合成平板
上に保型した。この平板は次の諸成分：　０．６７％酵
母窒素塩基（アミノ酸不含）、２％グルコースおよび２
％寒天を含有する。アミノ酸と窒素含有塩基は次の濃度
（カッコ内に■／Ｅで示す）を必要に応じて添加する：
アブ二ン（２０）、ウラシル（２０）、Ｌ−１リプトフ
アン（２０）、Ｌ−ヒスチジン（２０）、Ｌ−メチオニ
ン（２０）、Ｌ−チロシン（３０）、Ｌ−ロイシン（３
０）、Ｌ−インロイシン（３０）、Ｌ−リシン（３０）
、Ｌ−フェニルアラニン（５０）、Ｌ−グルタミン酸（
１００）、Ｌ−アスパラギン酸Ｃ１００）、Ｌ−バリン
（１５０）、Ｌ−スレオニン（２００）、Ｌ−セリ、ン
（３７５）。もちろん、当業者には理解されるように、
これらの塩基または酸のどれかの原栄養性に基づいて選
択された形質転換細胞に対して、その塩基または酸は加
えられないか、ま念は非形質転換細胞の増殖に必要な量
よりはるかに低い濃度で加えられるだろう。

これらの形質転換細胞がマスタープレート（ｍａｓｔｅ
ｒ　ｐｌａｔｅ）上で増殖した場合、それらはパラフィ
ルムでシールしたベトリ皿に４℃で保存した。

分泌効率は形質転換酵母の培養物から澄んだ培地（すな
わち、培養物のアリコートを遠心により沈殿させた後に
残った上清）を採取し、その澄んだ培地を目的生産物に
ついて検定することにより測定した。その後細胞を収穫
して３つの分画に分ける。第１はスフェロプラスト分画
であり、この場合培養物の２５ｍ１アリコートを沈殿さ
せ、細胞を１Ｍソルビトール２ｍＡ’の存在下グルスラ
ーゼ２０μｌで３０℃、３０分処理する。この抽出物を
遠心した後の上清をスフェロプラスト分画と呼ぶ。

次に沈殿物を２ｒｔｔｌの１０ｍＭ）す：ｙ、　−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７，５）１０．２％トリトン中に採取して細胞
を溶解し、それれらの膜成分を放出させる。これを膜分
画と呼ぶ。

細胞質分画は２５ｍＡ’の培養物を沈殿させ、その沈殿
物を３ｍ／ＰＭＳＦ緩衝液［１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ（
ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ’　　
（７ツ化フエニルメチルスルホニル）〕中に再溶解する
ことにより作られる。ガラスピーズ２９を加え、１５秒
おきに２分ポルテックスミキサーで混合する（その間の
１５秒は氷上に静置する）ことにより溶菌液を調製する
。次に、上清を分離し、沈殿物はＰＭＳＦ緩衝液ＩＷＬ
ｌで洗浄し、洗液は先に分離した上清に加える。その後
これらの分画を例えば抗ＧＲＦ″抗体および放射性標識
オーセンティックＧＲＦＩ用いるラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）により免疫反応性について検定する。膜分画
は細胞質分画を含むので、膜分画から細胞質分画を減じ
て膜に関連する分画のみの値を求める。培地中で測定さ
れた活性量を全活性量で割った比が分泌パーセントであ
る。全活性量は培地、スフェロプラスト分画、膜−関連
分画、および細胞質分画で測定された活性量の合計であ
る。

形質転換組数は連続発酵条件下で増殖させ、細胞を毎日
収穫し、細胞とその破砕物を濾過により除く。組換えＧ
ＲＦ−７ｉ含む澄明な培地は酸性化して、（１１８樹脂
にバッチ吸着させて濃縮する。

この濃縮物質を脱塩し、続いてＨＰＬＣによｐ分画化す
る。この方法は５０％以上のＲＩＡ活性物質をもたらす
。

ｐＴＲＰ２１３−形質転換ＧＧ１００−１４Ｄからの培
地のＲ工Ａ分析は２０〜３０■分泌Ｇ　ＲＦ　７１であ
る。

アミノ酸組成の分析は、ｐＴＲＰ２１３−形質転換ＧＧ
１００−１４Ｄにより分泌され且つ高圧逆相カラムで精
製されたＧＲＦペプチドすなわち〔Ｌｅｕ−２７）−ｈ
ＧＲＦ’（１−４０）−ＯＨが合成ポリはプチド標品の
ｈＧＲＦ（１−４０）−ＯＨ（２７位がＭｅｔ）と非常
に類似し、個々のアミノ酸のモルチ値の間の平均分散が
１０％より小さいことを示している。

さらに、ヒスチジンの不含およびプロリンとメチオニン
の極めて低いレベル（これらのアミノ酸ははプチド配列
中に含まれない）は、組換え生産物が遺伝子配列から予
期されたものと同一であることを強く支持するものであ
る。その上、不純物としてのプロリンおよびメチオニン
のレベルは酵母からのＲプチドの純度下限が８０％であ
ることを予測させる。

発明の効果 ＧＲＦについてのラット下垂体細胞による生物検定は、
ｐＴＲＰ２１３−形質転換Ｓ．セレビシエ細胞（ＧＧ１
０ｏ−１４Ｄ）から分泌された精製ＧＲＦ’類似体を用
いて実施した。ＧＲＦ類似体が下垂体細胞から成長ホル
モンを分泌させる能力を測定し、それを合成ｈＧＲＦ（
１−４０）−ＯＨ標品の分泌能力と比較した。この種の
分析は酵母によシ生産されたＧＲＦ類似体の生物活性を
評価するのに役立つ。

一般に、２０匹のラットの下垂体を摘出し、コラゲナー
ゼで処理して約８×１０個の細胞の懸濁液を得、その後
それらの細胞を適当な培地に保型した。細胞を組織培養
皿に付着させ、保型後３〜５日以内に簿冊−誘導はプチ
ドまたは合成標品で処理した。ＧＨ分泌に対するＧＲＩ
’の作用を高めるためにデキサメタシン全加えた。（こ
の方法で処理された細胞は、デキサメタジン不在下にＧ
ＲＦで処理された対照細胞より８〜９倍多量のＧＨを分
泌する）。成長ホルモンの分泌量は、合成標品に対して
標定された抗−ラツ）ＧＨＲＩＡ’ｅ用いて測定された
。

酵母から分泌された精製ＧＲＦ’類似体および合成ｈＧ
Ｒｒ（ｔ−４ｏ）−ＯＨによる下垂体細胞培養物の処理
の際の最大ラット成長ホルモン分泌百分率を測定した。

両方の処理の場合の分泌に対するＥＤ５ｏ値は約３２ｐ
Ｍであった。

酵母−誘導ＧＲＦ類似体と合成ＧＲＦ標品のＥＤ５ｏ値
が等しいことは、ｐＴＲＰ２１３−形質転換サツカロミ
セス細胞から分泌された溝母−誘導ＧＲＦ’類似体が十
分な生物活性をもつことを示している。

ベクターＹＳＶ３０３　によって形質転換され且つ連続
発酵培養で増殖されたＧＧ１０ｏ−１４Ｄ酵母からの培
地は分泌ＩＧＦ−４の存在について分析した。

ＥＩＪＳＡ　（酵素−結合免疫吸着検定法）分析は培地
１リツトルあたり７０〜８０〜のＩＧＦ−Ｉを示した。

ＧＧ１０ｏ−１４Ｄ形質転換株において観察された分泌
結果に加えて、生産物ポリペプチドのα因子リーダーペ
プチドー促進分泌は、Ｓ．セレビシエ酵母のａ−型株の
ある種の突然変異株において、全く予想されない驚くべ
き結果をもたらすことが見出された。自然界においてα
因子交配フェロモンはＳ・セレビシェ酵母のα−抹にの
み存在し、Ｓ．セレビシエ酵母のａ−株には全く存在し
ないことが知られている。Ｓ．セレビシエ酵母のａ−交
配型はα因子プレプロ投プチドの遺伝子を保有するが、
ａ−株の種々の細胞機構がα因子遺伝子の発現を抑えて
いると考えられる。これらの機構がなんであれ、ａ−株
からのα因子の分泌は今までに報告されたことがないの
で、それらは非常にその効力を発揮していると思われる
。従って、対象の遺伝子（特にＧＲＦ’）に結合された
び因子配列をコードするＤＮＡ配列を含む組換え体ベク
ターが、突然変異ａ−梨型Ｓ。レビシェ酵母菌株におい
て発現されるという発見は全く予測されなかった。最初
にこのような発現が観察された突然変異ａ−型Ｓ．セレ
ビシエ簿母菌株は５Ｂ３−５Ｂ　と命名された。この菌
株はα−株と接合し且つα因子フェロモンを分泌しない
ので、真正のａ−株である。

１つの実験において、発現ベクターｐ’ｒＲｐ２１　ｌ
はα−株を形質転換し、同様に突然変異ａ−株５Ｂ３−
５Ｂｆｔ、形質転換した。両菌株におけるＧＲＦ’生産
は約１．５η／ｌのレベルで約３０時間ピークに達した
。

ｉた、遺伝子修飾または突然変異によってタンパク質分
解機能がそこなわれた簿冊菌株を、組換え体ベクター（
ポリペプチド−コード化ＤＮＡ配列がα因子リーダーペ
プチド−コード化配列に結合されたもの）の宿主として
使用することによりポリペプチドの回収が増大する。

α因子をベースとするＧＲＦ’分泌ベクターｐＴＲＰ２
１３　で形質転換され次Ｓ．セレビシエ細胞＜ＧＧｔｏ
ｏ−１４Ｄ）によシ得られたデータは、組換えＧＲＩ’
のある部分が加水分解により減成されることを示した。

このタンパク質分解は恐らく内因性の分泌プロテアーゼ
により引き起こされる。

Ｓ．セレビシエの５Ｂ７−５０株は、１種の分泌プロテ
アーゼ（まだ同定されていない）を欠失させる５ＫＩ５
突然変異を有する。タンノξり質の加水分解による減成
を制限することにより生物活性（非分解）ＧＲＦのレベ
ルを増すために、５Ｂ７−５Ｄ細胞＠ｐＴＲＰ２１３　
で形質転換し、そしてＧＲＦの生産レベル、生物活性お
よびタンノξり質物性を分析した。

５Ｂ７−５Ｄ形質転換株は通常の振とうフラスコ増殖条
件を用いて振とうフラスコ内で増殖させた。

生産されたＧＲＦのレベルをラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）で測定して、振とうフラスコ内で増殖させたＧＧ
１０ｏ−１４Ｄ菌株の場合のＧＲＦ’レイルと比較した
。このＧＲＦは半精製形体においても十分な生物活性を
有していた（ＥＤ５ｏ約５ｏｐＭ）。

ｐＴＲＰ２１３で形質転換したＧＧ１０ｏ−１４Ｄの生
物活性は、同じ精製段階（振とうフラスコ増殖）で測定
したとき約１０倍低かった。タンパク質特性の試験は、
５Ｂ７−５Ｄ　により生産された組換えタンパク質の約
５０％がオーセンティックＧＲＦと同時に泳動すること
を示し友。このタンパク質はＨＰＬＣカラムから２５）
のピークで溶離するが、ＧＧ１０ｏ−１４Ｄ−生産タン
パク質は３つのピークで溶離した。従って、ＧＲＦの生
産は両菌株とも実質的に同じであると考えられるが、生
物学的に活性なＧＲＦ’の回収はタンパク質分解機能が
そこなわれた突然変異５Ｂ７−５Ｄ株の方が有意に高。

Ｓ．セレビシエ菌株ＧＧ１００−１４Ｄ、５Ｂ３−５Ｂ
および５Ｂ７−５Ｄの培養物は、特許手続のための微生
物の寄託の国際認可に関するブダペスト条約およびその
条約のもとで発布された規則によりＡＴＣＣに寄託され
た。上記培養物の試料は、上記条約および規則により、
およびこの出願が提出されたかまたはこの出願に基づく
特許が与えられた国際機関のそれぞれの特許法および規
則に従って、それらの試料を受は取る権利を合法的に与
えられた会社およびその他の者が利用できるであろう。

これらの菌株のＡＴＣＣ寄託番号は次の通りである。

ＧＧ１０ｏ−１４Ｄ　　２０７６２ ＳＢ３−５Ｂ　　　　２０７６１ ＳＢ７−５Ｄ　　　　２０７６０ 本発明は特定の好適な実施態様について説明したが、当
技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかな各種
の修飾が本発明の精神および範囲を逸脱することなく可
能であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は全α交配因子遺伝子の制限地図であり；第２図
はクローニングベクターＹＳＶ３０３の制限地図であり
； 第３図はクローニングベクターＴＲＰ４０３の制限地図
であり； 第４図はクローニングベクターＴＲＰ、２．０５の制限
地図であり； 第５図はクローニングはフタ−ＴＲＰ４０９の制限地図
であり； 第６図はクローニングはフタ−ＴＲＰ４０６の制限地図
であり； 第７図はクローニングはフタ−ＴＲＰ２ＩＱ　およびＴ
ＲＰ２１１　の制限地図であり； 第８図はクローニング（フタ−ＴＲＰ２１３　の制限地
図であり： 第９図はクロー二ングイクターＴＲＰ２１５の制限地図
であり；そして 第１０図はα因子ペプチドを含む修飾されたα因子リー
ダーペプチドにＮ−末端で融合したヒトプロウロキナー
ゼを含む融合ポＩＪ　＜プチドヲコードするｐＵＫ　２
０３　の制限地図である。 （外４名） −因与 ＦＩＧ、ＩＯ。 ウロ矢ｆ−で発曵々７７− ５社１

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. （１）α因子リーダーペプチドが対象の異種ポリペプチ
   ドに結合された融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
   列を有するプラスミドで形質転換され、それにより該融
   合ポリペプチドを発現し得るサッカロミセス・セレビシ
   エ（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
   ａｅ）のａ−菌株。
2. （２）ａ−菌株はＳＢ３−５Ｂである特許請求の範囲第
   １項記載の菌株。
3. （３）タンパク質分解機能を損なう遺伝子欠失を有し、
   α因子リーダーペプチドが対象の異種ポリペプチドに結
   合された融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有
   するプラスミドで形質転換され、それにより該融合ポリ
   ペプチドを発現し得るサッカロミセス・セレビシエの菌
   株。
4. （４）タンパク質分解機能が損なわれた菌株はＳＢ７−
   ５Ｄである特許請求の範囲第３項記載の菌株。
5. （５）ベクターをＳ．セレビシエ酵母でのその形質転換
   および継続した生存に対して適合せしめるＤＮＡ配列；
   融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；および該融
   合ポリペプチドの発現を促進するＤＮＡ配列；を含むサ
   ッカロミセス・セレビシエを形質転換するための組換え
   ＤＮＡベクターであつて、該融合ポリペプチドが一般式
   ： ＮＨ＿２−プレプロα因子リーダーペプチド−（α因子
   ペプチド）＿ｎ−タンパク質分解プロセッシング部位−
   異種ポリペプチド （式中ｎは１または２であり、ｎが２であるときは２つ
   のα因子ペプチドの間に配列 ｌｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ｇｌｕ−ａｌａ−ｇ
   ｌｕ−ａｌａ−のタンパク質分解プロセッシング部位が
   存在する）で表わされることを特徴とする組換えＤＮＡ
   ベクター。
6. （６）ｎは１である特許請求の範囲第５項記載の組換え
   ＤＮＡベクター。
7. （７）プレプロα因子リーダーペプチド−（α因子単位
   ）＿ｎ−（ｌｙｓ−ａｒｇ）−異種ポリペプチドのため
   のＤＮＡ配列を含む、特許請求の範囲第５項記載の組換
   えＤＮＡベクター。
8. （８）ｎは１である特許請求の範囲第７項記載の組換え
   ＤＮＡベクター。
9. （９）異種ポリペプチドはウロキナーゼである特許請求
   の範囲第５項または第７項記載の組換えＤＮＡベクター
   。
10. （１０）異種ポリペプチドはＩＧＦ−Ｉである特許請求
    の範囲第５項記載の組換えＤＮＡベクター。
11. （１１）異種ポリペプチドはＧＲＦまたはその生物学的
    に活性な類似体である、特許請求の範囲第５項記載の組
    換えＤＮＡベクター。
12. （１２）異種ポリペプチドは一般式： 【遺伝子配列があります】 （式中Ｒ＿１はＴｙｒ、Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓで
    あり；Ｒ＿８はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｒ＿１＿０
    はＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｒ＿１＿２はＡｒｇまた
    はＬｙｓであり；Ｒ＿１＿３はＩｌｅまたはＶａｌであ
    り；Ｒ＿１＿８はＳｅｒまたはＴｙｒであり；Ｒ＿２＿
    ４はＨｉｓまたはＧｌｎであり；Ｒ＿２＿５はＧｌｕま
    たはＡｓｐであり；Ｒ＿２＿７はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅ
    ｕまたはＶａｌであり；Ｒ＿２＿８はＳｅｒまたはＡｓ
    ｎであり；Ｒ＿３＿４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＡｒｇで
    あり；Ｒ＿３＿８はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり
    ；Ｒ＿３＿９はＡｒｇまたはＧｌｙであり；Ｒ＿４＿０
    はＡｌａ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり；Ｒ＿４＿１はＡ
    ｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ＿４＿２はＰｈｅ、Ａｌａ
    またはＶａｌであり；Ｒ＿４＿３はＡｒｇまたはＡｓｎ
    であり；そしてＲ＿４＿４はＣｙｓまたはＭｅｔを除く
    天然アミノ酸であり；この際Ｒ＿２＿８からＲ＿４＿４
    までのアミノ酸残基のいくつかまたは全部は欠失されう
    る） で表わされるポリペプチドの群から選択されるＧＲＦ類
    似体である、特許請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮ
    Ａベクター。
13. （１３）ＧＲＦ類似体は〔Ｌｅｕ＾２＾７〕−ｈＧＲＦ
    （１−４０）−ＯＨである特許請求の範囲第１２項記載
    の組換えＤＮＡベクター。
14. （１４）ＧＲＦ類似体は〔Ｌｅｕ＾２＾７〕−ｈＧＲＦ
    （１−４４）−ＯＨである特許請求の範囲第１２項記載
    の組換えＤＮＡベクター。
15. （１５）特許請求の範囲第５項記載のベクターで形質転
    換され、それにより異種ポリペプチドを発現および分泌
    し得るＳ．セレビシエ酵母菌株。
16. （１６）異種ポリペプチドはＧＲＦまたはその生物学的
    に活性な類似体である、特許請求の範囲第１５項記載の
    Ｓ．セレビシエ酵母菌株。
17. （１７）ＧＲＦまたはＧＲＦ類似体を１ｍｇ／ｌ／ＯＤ
    以上の濃度で培地中に分泌する、特許請求の範囲第１６
    項記載のＳ．セレビシエ酵母菌株。
18. （１８）ＧＲＦ類似体の少なくとも２０％が十分な生物
    活性を保有する、特許請求の範囲第１６項記載の菌株か
    ら分泌されたＧＲＦ類似体。
19. （１９）異種ポリペプチドは一般式： 【遺伝子配列があります】 （式中Ｒ＿１はＴｙｒ、Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓで
    あり；Ｒ＿８はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｒ＿１＿０
    はＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｒ＿１＿２はＡｒｇまた
    はＬｙｓであり；Ｒ＿１＿３はＩｌｅまたはＶａｌであ
    り；Ｒ＿１＿８はＳｅｒまたはＴｙｒであり；Ｒ＿２＿
    ４はＨｉｓまたはＧｌｎであり；Ｒ＿２＿５はＧｌｕま
    たはＡｓｐであり；Ｒ＿２＿７はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅ
    ｕまたはＶａｌであり；Ｒ＿２＿８はｓｅｒまたはＡｓ
    ｎであり；Ｒ＿３＿４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＡｒｇで
    あり；Ｒ＿３＿８はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり
    ；Ｒ＿３＿９はＡｒｇまたはＧｌｙであり；Ｒ＿４＿０
    はＡｌａ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり；Ｒ＿４＿１はＡ
    ｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ＿４＿２はＰｈｅ、Ａｌａ
    またはＶａｌであり；Ｒ＿４＿３はＡｒｇまたはＡｓｎ
    であり；そしてＲ＿４＿４はＣｙｓまたはＭｅｔを除く
    天然アミノ酸であり；この際Ｒ＿２＿８からＲ＿４＿４
    までのアミノ酸残基のいくつかまたは全部は欠失されう
    る） で表わされるＧＲＦ類似体である、特許請求の範囲第１
    ６項記載のＳ．セレビシエ酵母菌株。
20. （２０）ポリペプチドは式：〔Ｌｅｕ＾２＾７〕−ｈＧ
    ＲＦ（１−４０）−ＯＨのＧＲＦ類似体である、特許請
    求の範囲第１９項記載のＳ．セレビシエ酵母菌株。
21. （２１）ＧＲＦ類似体を１ｍｇ／ｌ／ＯＤ以上の濃度で
    培地中に分泌する、特許請求の範囲第２０項記載のＳ．
    セレビシエ酵母菌株。
22. （２２）ＧＲＦ類似体の少なくとも２０％は十分な生物
    活性を保有する、特許請求の範囲第２０項記載の菌株か
    ら分泌されたＧＲＦ類似体。
23. （２３）ポリペプチドは式：〔Ｌｅｕ＾２＾７〕−ｈＧ
    ＲＦ（１−４４）−ＯＨのＧＲＦ類似体である、特許請
    求の範囲第１９項記載のＳ．セレビシエ酵母菌株。
24. （２４）異種ポリペプチドはウロキナーゼである特許請
    求の範囲第１５項記載のＳ．セレビシエ酵母菌株。
25. （２５）異種ポリペプチドはＩＧＦ−Ｉである特許請求
    の範囲第１５項記載のＳ．セレビシエ酵母菌株。
26. （２６）タンパク質分解機能を損なう遺伝子欠失を有し
    、特許請求の範囲第５項記載のベクターで形質転換され
    たサッカロミセス・セレビシエ酵母菌株。
27. （２７）タンパク質分解機能が損なわれた菌株はＳＢ７
    −５Ｄである特許請求の範囲第２６項記載の菌株。
28. （２８）α因子リーダープレセグメント−コード化配列
    部分；〔Ｌｅｕ＾２＾７〕−ｈＧＲＦ（１−４４）−Ｏ
    Ｈおよび〔Ｌｅｕ＾２＾７〕−ｈＧＲＦ（１−４０）−
    ＯＨから成る群より選択されるＧＲＦ類似体をコード化
    する配列部分；および該プレセグメント−コード化配列
    部分と該ＧＲＦ類似体−コード化配列部分の間の少なく
    とも１つのタンパク質分解プロセッシング部位−コード
    化配列部分；を含む組換えＤＮＡ配列であつて、該組換
    えＤＮＡ配列が該プレセグメントと該ＧＲＦ類似体とを
    単一の融合ポリペプチドの一部としてコードすることを
    特徴とする組換えＤＮＡ配列。
29. （２９）プレセグメント−コード化配列部分とＧＲＦ類
    似体−コード化配列部分の間に１つまたは２つのα因子
    −コード化配列部分を含み、該α因子−コード化配列部
    分はタンパク質分解プロセッシング部位−コード化配列
    部分によつてはさまれる、特許請求の範囲第２８項記載
    の組換えＤＮＡ配列。
30. （３０）タンパク質分解プロセッシング部位−コード化
    配列はジペプチドｌｙｓ−ａｒｇおよび／またはジペプ
    チドｇｌｕ−ａｌａをコードする、特許請求の範囲第２
    ９項記載の組換えＤＮＡ配列。
31. （３１）下垂体からの成長ホルモンの放出を刺激し得る
    生物学的に活性なポリペプチドをサッカロミセス・セレ
    ビシエにて生産する方法であつて、ポリペプチドをコー
    ドする組換えＤＮＡベクターで形質転換した宿主酵母細
    胞を、該宿主細胞がコード化ポリペプチドを発現する条
    件下で培養することから成り、その際上記組換えＤＮＡ
    ベクターが α因子リーダープレセグメント−コード化配列部分； 次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 （式中Ｒ＿１はＴｙｒ、Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓで
    あり；Ｒ＿８はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｒ＿１＿０
    はＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｒ＿１＿２はＡｒｇまた
    はＬｙｓであり；Ｒ＿１＿３はＩｌｅまたはＶａｒであ
    り；Ｒ＿１＿８はＳｅｒまたはＴｙｒであり；Ｒ＿２＿
    ４はＨｉｓまたはＧｌｎであり；Ｒ＿２＿５はＧｌｕま
    たはＡｓｐであり；Ｒ＿２＿７はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅ
    ｕまたはＶａｌであり；Ｒ＿２＿８はＳｅｒまたはＡｓ
    ｎであり；Ｒ＿３＿４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＡｒｇで
    あり；Ｒ＿３＿８はＡｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり
    ；Ｒ＿３＿９はＡｒｇまたはＧｌｙであり；Ｒ＿４＿０
    はＡｌａ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり；Ｒ＿４＿１はＡ
    ｒｇまたはＬｙｓであり；Ｒ＿４＿２はＰｈｅ、Ａｌａ
    またはＶａｌであり；Ｒ＿４＿３はＡｒｇまたはＡｓｎ
    であり；そしてＲ＿４＿４はＣｙｓまたはＭｅｔを除く
    天然アミノ酸であり；この際Ｒ＿２＿８からＲ＿４＿４
    までのアミノ酸残基のいくつかまたは全部は欠失されう
    る） を有するＧＲＦ類似体をコードする配列部分；および 該プレセグメント−コード化配列部分と該 ＧＲＦ類似体−コード化配列部分の間の少なくとも１つ
    のタンパク質分解プロセッシング部位−コード化配列部
    分； を含み、この場合該組換えＤＮＡベクターが該プレセグ
    メントと該ＧＲＦ類似体とを単一の融合ポリペプチドの
    一部としてコードすることを特徴とする上記ポリペプチ
    ドの生産方法。
32. （３２）組換えＤＮＡベクターが該ベクターをＳ．セレ
    ビシエ酵母でのその形質転換および継続した生存に対し
    て適合せしめるＤＮＡ配列、および該融合ポリペプチド
    の発現を促進するＤＮＡ配列をさらに含む、特許請求の
    範囲第３１項記載の方法。
33. （３３）融合ポリペプチドは一般式： ＮＨ＿２−プレプロα因子プレセグメントペプチド−（
    タンパク質分解プロセッシング部位）＿１−（α因子ペ
    プチド）＿ｎ−（タンパク質分解プロセッシング部位）
    ＿２−ポリペプチド 〔式中ｎは１または２であり、（タンパク質分解プロセ
    ッシング部位）＿１と（タンパク質分解プロセッシング
    部位）＿２の配列は同一かまたは相異なり、そしてｎが
    ２であるときは２つのα因子ペプチドの間に第３のタン
    パク質分解プロセッシング部位が存在し、該第３タンパ
    ク質分解プロセッシング部位の配列は他の２つのプロセ
    ッシング部位の両方の配列と異なるか、または他の２つ
    のプロセッシング部位の少なくとも１つの配列と同じで
    ある〕 で表わされる特許請求の範囲第３１項記載の方法。
34. （３４）Ｒ＿１はＴｙｒである特許請求の範囲第３１項
    記載の方法。
35. （３５）Ｒ＿８はＡｓｎである特許請求の範囲第３１項
    記載の方法。
36. （３６）Ｒ＿１＿０はＴｙｒである特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。
37. （３７）Ｒ＿１＿２はＬｙｓである特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。
38. （３８）Ｒ＿１＿３はＶａｌである特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。
39. （３９）Ｒ＿１＿８はＳｅｒである特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。
40. （４０）Ｒ＿２＿４はＧｌｎである特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。
41. （４１）Ｒ＿２＿５はＡｓｐである特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。
42. （４２）アミノ酸残基Ｒ＿２＿８からＲ＿４＿４までが
    欠失される特許請求の範囲第３１項記載の方法。
43. （４３）Ｒ＿１はＴｙｒ、Ｒ＿８はＡｓｎ、Ｒ＿１＿０
    はＴｙｒ、Ｒ＿１＿２はＬｙｓ、Ｒ＿１＿３はＶａｌ、
    Ｒ＿１＿８はＳｅｒ、Ｒ＿２＿４はＧｌｎ、Ｒ＿２＿５
    はＡｓｐ、Ｒ＿２＿７はＬｅｕ、Ｒ＿２＿８はＳｅｒ、
    Ｒ＿３＿４はＳｅｒ、Ｒ＿３＿８はＡｒｇ、Ｒ＿３＿９
    はＧｌｙ、Ｒ＿４＿０はＡｌａ、Ｒ＿４＿１はＡｒｇ、
    Ｒ＿４＿２はＡｌａ、Ｒ＿４＿３はＡｒｇ、およびＲ＿
    ４＿４はＬｅｕである特許請求の範囲第３１項記載の方
    法。
44. （４４）Ｒ＿１はＴｙｒ、Ｒ＿８はＡｓｎ、Ｒ＿１＿０
    はＴｙｒ、Ｒ＿１＿２はＬｙｓ、Ｒ＿１＿３はＶａｌ、
    Ｒ＿１＿８はＳｅｒ、Ｒ＿２＿４はＧｌｎ、Ｒ＿２＿５
    はＡｓｐ、およびＲ＿２＿７はＬｅｕである特許請求の
    範囲第３１項記載の方法。
45. （４５）アミノ酸残基Ｒ＿４＿１からＲ＿４＿４までが
    欠失され、そしてＲ＿２＿７はＬｅｕである特許請求の
    範囲第３１項記載の方法。