JPH02117384A - 酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は威勢ヒト血清アルブミンＡの酵母による製造方
法、及びそのための遺伝子系に関する。

この方法によれば成熟型のヒト血清アルブミンＡが細胞
外に分泌されるため、その回収・精製が簡単となり、工
業的製造のために極めて好ましい。

〔従来の技術〕

今まで、遺伝子工学的方法によりヒト血清アルブミンを
製造するための方法として、大腸菌を用いる方法（Ｌａ
ｗｎ　　等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
９　。

６１０３−６１１４．１９８１：Ｌａｔｔａ等、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｉｏｇｙ　５゜１３０９−１３１４、（１
９８７）　；特開昭５８−１５０５１７３　、枯草菌を
用いる方法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、■Ｌ。

２９１７−２９２５．　（１９８７）　）　、及び酵母
を用いる方法（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ等＋　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｉｏｇｙ土、７２６−７３０．　（１９８６）
　、１が知られている。しかしながら、これらの方法に
より製造される血清アルブミンは正常なヒトＩｆｌ清ア
ルブミンとはアミノ酸配列を幾分具にし、また生産され
た血清アルブミンは不溶化法Ｒとなったり、シグナルペ
プチドのプロセシング効率が低い、細胞外への分泌が困
難である、等の問題点を存すると報告されている。

〔発明が解決しようとする課２！ｌ］ 従って、本発明は成熟ヒト血清アルブミンＡを可溶性の
形で、且つ天然血清アルブミンＡと同じ立体構造におい
て細胞外に分泌せしめ、これによって回収・＄５！！！
を容易にすることにより大量のヒト血清アルブミンを工
業的に製造することができる方法を提供しようとするも
のである。

（課題を解決するための手段） 上記の目的を達成するため、本発明は（１）ヒト血清ア
ルブミンＡのプレプロ配列を酵母により効率的に翻訳さ
れるコドンによりコードしているリーダー配列と該リー
ダー配列の下流に存在するヒト血清アルブミンＡをコー
ドするｃＤＮＡとを有するＤＮＡ；　　（２）ヒト血清
アルブミンＡをコードするｃＤＮＡと該ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
の下流に存在するポリ　（Ａ）配列とを有するＤＮＡ；
　　（３）ヒト血清アルブミンＡのプレプロ配列を酵母
により多用されるコドンによりコードしているリーダー
配列、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡ、及
びポリ（Ａ）配列をこの順序でをするＤＮＡ；　　（４
）酵母で機能し得るプロモーターとターミネークーとの
間に前記（３）に記載のＤＮＡが発現可能な方向に挿入
されている発現プラスミド；　（５）前記（４）に記載
の発現ベクターにより形質転換された酵１往；及び（６
）前記（５）に記載の酵母を培養し、成熟ヒト血清アル
ブミンＡを産生・分泌せしめ、これを採取することを特
徴とする成熟ヒト血／？１アルブミンへの製造方法を提
供する。

（具体的な記載） 】、五抜ヱ糸 ■ユ 正常ヒト血清アルブミンは分子内に多くのジスルフィド
結合を含有しており、Ｍ１換えＤＮＡ法によって天然物
と同し立体構造を存する正常ヒト血清アルブミンを製造
するには、これらのジスルフィド結合が生産宿主細胞中
で正しく形成されることが必須である。正常な立体構造
の形成にはプロティンジスルフィドイソメラーゼ、ペプ
チジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ等の酵
素が関与していることが最近明らかになり、多数のＳ−
８結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆ど含まな
い大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞でばた。

とえあってもこのような立体Ｒ１ｒ形成（フォールディ
ング）関連酵素系の働きは強くないことが予想される。

一方、ヒトをはじめとする真（亥高等生物の細胞は数多
くの？３！雉な高次構造を有する蛋白質（υと蛋白質や
他の修前ｉ蛋白質も含む）を細胞外に分泌するこｔが知
られているが、下等真核微生物である酵母菌でも、咄乳
動物の細胞で蛋白１１゛が分泌されるのと非常によく似
た経路により蛋白質が分泌されることが知られている（
Ｈｕ［ａｋｃｒ、　Ｔ、Ｃ。

ａｎｄ　Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｐ、Ｗ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、　２５７．３２０３−３２１０（１９８２）；５
ｎｉｄｅｒ、Ｍ、Ｄ、　ｉｎ　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ
、　＆　ＲｏｂｂｉｎｓＰ、Ｗ、（ｅｄｓ、）Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、　Ｖｏｌ
、２゜Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１９８４）
、ｐｐ、］］６３−１９８　、このため異種生物由来（
特に咄乳動物）の遺伝子（主としてｃＤＮＡ　）を酵母
菌内で発現させ遺伝子産物である蛋白質を、細胞外に分
泌せしめようとする実験が最近多く試みられてきた。た
とえばヒトインターフェロンα１．α〜、　　ｙ　（Ｉ
Ｉｉｔｚｅ＋ｎａｎ、Ｒ，Ａ、、Ｌｅｕｎｇ。

Ｄ、Ｗ、　＋　Ｐｅｒｒｙ＋　Ｌ、Ｊ、　＋　Ｘｏｈｒ
＋　Ｗ、Ｊ、　＋　Ｌｅｖ　ｉｎｅ＋　Ｈ，Ｌ、　、　
Ｇｏｅｄｄｅｌ　。

Ｄ、Ｖ、５ｃｉｅｎｃｅ　２１９６２０−６２５（１９
８３）　）　、仔ウシプロキモシン（Ｓ＋ｉｔｈ、　Ｒ
，Ａ、　、　Ｄｕｎｃａｎ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｍｏ１ｒ、
　Ｄ、？。

５ｃｉｅｎｃｅ２２９１２１９−１２２４（１９８５）
　）　、ヒト上皮成長因子（Ｂｒａｋｅ、Ａ、Ｊ、、Ｍ
ｅｒｒｙｗｅａｔｈｅｒ、Ｊ、Ｐ、、Ｃｏ１ｔ、Ｄ、Ｇ
、。

Ｈｅｂｅｒ　１ｅｉｎ＋　Ｌｌ、Ａ、　、　Ｍａｓ　１
ａｒｚ＋　Ｆ、　Ｒ，、Ｍｕ　ｌ　Ｉｅｎｂａｃｈ　、
　Ｇ、Ｔ、　＋Ｕｒｄｅａ、　Ｍ、　Ｓ、　、　Ｖａ　
Ｉｅｎｚｕｅｌａ　、　Ｐ、　、　Ｂａｒｒ、　Ｐ、　
Ｊ　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１．４６４２−４６４
６（１９８４））　、マウスインターロイキン２　（Ｍ
ｉｙａｊｉｍａ、Ａ、、Ｂｏｎｄ、Ｍ、Ｗ、、０ｔｓｕ
。

Ｋ、　、Ａｒａｉ、に、　、　Ａｒａｉ、Ｎ、Ｇｅｎｅ
３７．１５５−１６１　（１９８５）　）　、ヒトβ−
エンドルフィン（Ｂｉｔｔｅｒ＋Ｇ、Ａ、＋Ｃｈｅｎ＋
に−に一＋ｆｌａｎｋｓ、Ａ、Ｒ，，Ｌａｉ、Ｐ、−Ｈ
，Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬｌｓＡ。

ｌ、　５５３０−５５３４　（１９８４）　）などで酵
母菌による細胞外分泌が報告されているが、その分泌効
率はマウスインターロイキン２の約８０％からヒトイン
ターフェロンの４〜１０％まで目的とする蛋白質により
かなりの差がある。又、これらのうちその蛋白質自身の
シグナルペプチドを用いて細胞内輸送を試み、そのシグ
ナルペプチドがうまく切断されて分泌することに成功し
ているものはヒトインターフェロンである。その他のも
のは酵母インベルターゼ（ＳＵＣ２）のシグナルペプチ
ドや接合因子α１（−Ｆα１）のシグナル配列など酵母
の蛋白質の細胞内輸送に必要なシグナル配列を目的とす
る成熟蛋白質に直接融合した形で発現させ、細胞内輸送
を行わせたものである。さらに正しい位置でプロセシン
グを受けてることが明らかなものは少なく、ヒトインタ
ーフェロンの場合は約半分が正しいプロセシングを受け
ているが、ヒトβ−エンドルフィンではペプチド内部で
も切断を受けている。

酵母菌を宿主として用いる遺伝子工学的物質生産系の特
徴としては以下のようなものがある。

１、大量高密度培養による発酵生産が容易かつ経済的で
ある。また動植物の培養細胞系と比較して厳密に管理制
御された培養装置を特別必要としない。

２、　発酵生産に多くの経験が蓄積されている。

３、　分子ｊユ伝学的な加工Δが９速に蓄積されつつあ
る。

４、外来性の遺伝物質を細胞内及びゲノム内に取り込ま
せることが容易である。

５、蛋白質の細胞内輸送及び、細胞外分泌の遺伝学及び
生理学に対する理解が急速に高まってきている。

６、　通切なプラスミドベクターを選択すれば、外来性
の遺伝子をエピソーム状Ｗ（ＹＥｐ系プラプラスミド使
用ゲノムに１■み込ませた状Ｑ　（Ｙ　１ｐプラスミド
使用）、酵母のセン［ロメアを含み細胞分裂に伴い染色
体ＤＮＡとともに複製できる状態（ＹＣｐプラスミド使
用）、及び酵母の自律複製配列（Ａ　ＲＳ　）を含み自
律的に？Ｉ製できる状１（ＹＲＰプラスミド使用）の４
種の状態におくことができる。

７、　シグナルペプチドやプロ配列などの細胞内プロセ
シング機能がある。

８、酵母菌で合成されるｔＪ！蛋白質に見い出される糖
鎖は高等動植物の糖蛋白質における複合型糖鎖とは異な
る高マンノース型１ノ！鎖ではあるが、酵母菌の小胞体
で起こるコアυ！鎖の付加は高等動物と共通した過程で
あり、両者における相違は外側の？！鎖の付加に見られ
るのみである。

９、　ビタミン、微量因子等の添加により完全合成培地
で形質転換体を生育させることができる。

１０、純粋なグルコースでなく粗製の糖源を利用しても
形質転換体を生育させることができる。

この様な背景に基づいて、本発明においては酵母を宿主
として使用する。

（プレプロ配列） ヒト血清アルブミンを酵母細胞中で発現せしめ、これを
効率よく分泌せしめるためには、成熟ヒト血清アルブミ
ンのＮ−末端にプレプロ配列が存在する必要がある。ま
た、このプレプロ配列は目的蛋白質の分泌の際に切除さ
れて該目的蛋白質が成熟型で分泌される必要がある。こ
のため本発明においては、この様な条件を満たすプレプ
ロ配列としてヒト血清アルブミンの本来のプレプロ配列
を使用する。

酵母における蛋白質の発現を増強するためには該蛋白質
のＮ−末端領域をコードするコドンとして、酵母中で効
率よく翻訳されるコドンを使用するのが好ましい、この
ため、本発明においては、前記プレプロ配列をコードす
るＤＮＡ配列として、酵母において効率よく発現される
遺伝子において高頻度で使用されるコドンから構成され
る合成りＮＡ配列を使用する。この様なコドンとして例
えば次のコドンを用いる。

八１ａ＝ＧＣＴ　　　　Ｔｙｒ−ＴＡＣＡｒｇ＝ＡＧＡ
　　　　Ｇｌｙ＝ＧＧＴプレプロ配列をコードするＤＮ
Ａ部分の一例として次の配列を用いることができる。

ＥｃｏＲ１ はＥｃｏＲＩ粘着末端が設けられており、この制限酵素
部位により上記配列はベクターに挿入される。

また、上記プレプロ配列のＣ−末端のＡｒｇのコドンと
しては、酵母での翻訳のために好ましいとルて上記した
コドンではなく、ＣＧＣが採用されており、これにより
５′−末端をＣ１ａ　Ｉにより切断した成熟ヒト血清ア
ルブミン遺伝子と連結することができる。

ヒト　′アルブミンＡ′ ヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
はすでにクローン化されており、その塩基配列及び該塩
基配列から推定されるアミノ酸配列は、特願昭６３−０
３７４５３に詳細に記載されている。

従って本発明においては、このｃＤＮＡを含有するプラ
スミドｐｕｃ　−ＨＳＡ　−ＣＩ＋等をヒト血清アルブ
ミンＡをコードする遺伝子の供給源として使用すること
ができる。なお、これらのプラスミドの作製方法を参考
例として後記する。

ポリＡ配　　びＡＡＴＡＡＡシグナル コード配列の３′−末端の下流に存在するポリＡ配列及
びＡＡＴＡＡＡシグナルが真核生物のｍＲＮＡの安定性
に寄与すると言われている（Ｂｅｒｇｍａｎｎ及びＢｒ
ａｗｅｒｏ＋ａｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６．
２５９−２６４（１９７７）；）ｌｕｅｚら、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８，９０８
−９１１（１９８１））　。

従って、本発明の好ましい態様においては、ヒト血゛請
アルブミンＡをコードするｃＤＮＡの下流にこれらの配
列を配亙する。ポリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナルと
しては、例えばヒト血′請アルブミンＡｃＤＮＡに自然
に付随しているこれらの配列を使用することができる。

これらの配列を含有するヒト血清アルブミンＡ遺伝子は
すでにクローン化されており、’Ｉ願昭６３−０３７４
５３に記載されている。これらの配列の供給源として例
えばλｇｔ　１１　（ＩＩｓＡ−ＩＡ）を使用すること
ができ、その作製方法を参考例において後記する。

１旦天二り二 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる。しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構成的プロモーターを使用するのが好ましい、誘導可
能なプロモーターを使用して誘導）桑作を行った場合に
はヒト血清アルブミンが細胞内に急激に蓄積し、分子間
ジスルフィド結合が形成されて非天然型の立体構造を有
する分子が生成する可能性があるからである。

弱い誘発性を示すか又は構成性の酵母プロモーターの内
、強力な活性を持つものとしては、例えば、アルコール
デヒドロゲナーゼ（ＡＤＩＩ　＋　）プロモーター、グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
Ｐ）プロモーター、及びグリセリン酸リン酸キナーゼ（
ＰＧＫ）プロモーターがあり、本発明においては、ＡＤ
ＨＩプロモーターを例にとって具体的に説明する。

酵母へ〇＋１１遺伝子（ＡＤＣ１）を含む約２，１００
塩基対の領域の塩基配列が既に決定されており、ＡＤＤ
Ｉをコードする約１．１００塩基対の配列の他に７５０
塩基対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３″側非翻
訳配列が判明している［Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、　Ｊおよ
びＨａｌｌ、Ｂ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７，３
０１８−３０２５（１９Ｂ２））　　、　　転写におい
てＲＮＡポリメラーゼによる認識配列と考えられている
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−）１ｏｇｎｅｓｓボックス（ＴＡＴ
＾ボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１２８塩基上流
（−１２８の位′ｆ１）にあり、ＡＤＨＩプロモーター
活性は、４１０の位置にあるＳｐｈ　１認識部位より上
流を欠失させても失われないといわれている（Ｂｅｉｅ
ｒ及びＹｏｕｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　３００．７２４−７
２８（１９８２）　）　、　　ＡＤＨＩプロモーターに
よる転写物は通常の酵母菌で全ポリ（Ａ）　ＲＮＡの少
な（とも１％に達する（Ａｍｍｅｒｅｒ。

Ｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ＋ｗｏ１．匪１９２−２
０１（１９８３）　）　。

叉二亙生二り二 転写における読み越しくｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）に
より遺伝子生成物の量が減少する例が報告されている〔
例えば、Ｚａｒｅｔ、に、Ｓ、及びＳｈｅｒｍｅｎ、Ｆ
、、Ｃｅ１ｌ　２Ｂ。

５６３−５７３．　（１９８２）　）　、この現象を防
止するためには発現されるべき構造遺伝子の下流にター
ミネータ−を設けるのが好ましい、酵母ターミネータ−
を外来遺伝子の下流に配置し、遺伝子の発現を上昇させ
た例としてはたとえばＰＣ，にプロモーター／ターミネ
ータ−からなるサンドインチベクターを用いて子牛キモ
シンを発現させた実験があり、ターミネータ−の導入に
より数倍〜十倍程度の発現上昇が報告されている（Ｍｅ
ｌｌｏｒらＧｅｎｅ　２４＋１−１４（１９８３））　
、このような目的のためのターミネータ−としてはさま
ざまな遺伝子由来のものが使用でき、たとえば丁ＲＰ５
（トリプトファン合成酵素）遺伝子やＣＹＣＩ（イソ−
１−チトクロームＣ）遺伝子などのターミネータ−が利
用されている０強力なプロモーターが関与する転写の場
合、リードスルーを防ぐために強力なターミネータ−が
その下流に配置されている方が発現の制御に好都合と考
えられる。このため本発明においては例えば強力なプロ
モーターを有する遺伝子のターミネータ−である＾Ｄ１
目ターミネーター１ＧＡＰターミネータ−等を用いるの
が好ましい。

丘り叉二皿工 以上、本発明の発現プラスミド中に含有される、発現に
直接関連する要素について説明したが、本発明の発現プ
ラスミドは、さらに、酵母複製起点及び標識遺伝子を含
有しなければならない、酵母複製起点としては、例えば
酵母由来の２１ＭプラスミドＤＮＡの複製起点等を使用
することができる。

標識遺伝子としては、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子
、宿主の栄養要求性を補完する遺伝子等、常用の標識遺
伝子を用いることができる。さらに、プラスミドの組換
え操作の際にプラスミドの？１製を大腸菌中で行わせる
必要があるため、本発明のプラスミドは大腸菌複製起点
及び！！識遺伝子を含有するシャトルベクターであるこ
とが好ましい。

この様な、シャトルベクターとしての基本的要件を備え
たベクターとして市販のプラスミドｐＪＤＢ２０７等を
用いることができる。このプラスミドｐＪ［ｌＢ　２０
７中の酵母標識遺伝子は、ロイシン生合成酵素であるβ
−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素をコードするＬＥＵ
　２遺伝子である。

生豆１立スｊ上 従って本発明の好ましい発現プラスミドにおいては、酵
母復製起点及び標識遺伝子並びに大腸菌？ｊＩ製起点及
び標識遺伝子を含んでなるシャトルベクターに、プロモ
ーター、プレプロ配列をコードするリーダー配列が連結
されたヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子、ポリ
Ａ配列及びクーミネーターがこの順序で挿入されている
。

２、腹１１＾ 本発明のプラスミドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例９に記載す
る。

３．１　　の立　　びヒト血′アルブミンの　収ヒト血
清アルブミンｃＤＮＡを含んだ発現プラスミドにより形
質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の培養法により培
養できる。たとえばＹＰＤのような天然完全培地やＳＤ
培地に１％の酵母エキスを加えたような不完全合成培地
でも培養できる。

培養後細胞外に分泌されたヒト血清アルブミンの回収は
種々の方法で可能である。エタノール、アセトン、硫酸
アンモニウムなどによる分別沈澱１等電点沈澱、限外ろ
過などによるＩ′Ａ縮及び部分精製を行った後に各種ク
ロマトグラフィーや上記部分精製法を組み合わせれば高
度に分泌ヒト血清アルブミンが精製されることが期待で
きる。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る。以下の実施例において、特にことわらない限り、酵
素反応は次の条件下で行った。

ＥｃｏＲＩ　　（＝　ッポンジーン；　１２　：Ｌニー
／ト／Ｊ１１）、Ｃ１ａｌにューイングランドバイオラ
ブス；５ニー’−７ト／ＪＪ１）、旧ｎｄｍＣニッポン
ジーン；１２ユニー／ト／ｕ１）、ＸｈｏＩ（宝酒造；
１２ユニット／ｕｌ）、及びＢａｍＨＩにッポンジーン
；３５ユニット／ｐりによるＤＮＡの消化：ＤＮＡ１イ
、酵素１　ｔｔｌ、及び１０　ＸＥｃｏＲＴ　Ｂ衝液（
Ｉ　ＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）。

１００ｍＭＭｇＣＩｚ、５００ｃＭＮａＣＩ　）　３　
ｔｌに滅菌蒸留水を加えて３０μｌとする。３７°Ｃ１
１時間保温して切断を完了させる。５ａｌｌにッポンジ
ーン、１５ユニット／ｌｌ＞の場合は１０　ＸＥｃｏＲ
Ｉ　１１衝液の代わりに１００ＩＲ１００ＩＲ−ＨＣＩ
　（ｐＨ７，５）、　７０　＊ＭＭｇＣ１ｚ、　１．７
５ＭＮａＣ１７０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２ｒ
ａＦＩＥＤＴＡ。

０．１％ウシ血清アルブミンを使用する。

バクテリアアルカリ性ホスファターゼ処理＝ＤＮＡ　ｌ
　ｎ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩ［各々１　ｔ
ｔｌ及び１０　ＸＥｃｏＲＩ緩衝液２１１１に滅菌蒸留
水を加えて２０ｕとし、３７℃で１時間保温した後、９
０°Ｃ１５分間加熱して酵素を失活させる０次に滅菌蒸
留水３８ＩＪ１、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ
２４（宝酒造０．５ユニット／Ｉ）を加えて３７°Ｃ１
１時間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた水
層をエタノール沈澱に用いる。

Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ処理：たとえばベクターＤＮＡ１
ｎ、ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメント、
ＩＯＸリガーゼ緩衝液（６６０＋ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）　、６６ｍＭ　ＭｇＣ２ｔ、１００ｍＭ
ジチオスライトール、１　ｍＭＡＴＰ　）　３　ｕｔ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼＩＩ（宝酒造、約４００ユニット
／ｌ、Ｇに滅菌蒸留水を加えて３０μｌとし１６°Ｃで
一晩保温する。

合成フラグメントのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによ
る５′−リン酸化：　５０ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐ
Ｈ７，６）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、５ｆｆｉＭジ
チオスライトール、Ｑ、　’ｌ　ｍＭＡＴＰを含有する
？容゛液（２５μり中でＤＮＡフラグメントの各々の分
量（約３　Ｑ　ｐｎ＋ｏｌｅｓ）を６ユニツトのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）で３７°Ｃ１６０分
間処理することにより５′端をリン酸化する。リン酸化
されたフラグメントを含む？８液を混ぜ（計１００　Ｊ
）１００’Ｃの水浴に５分間放置した後室温で放冷しア
ニーリングを行う、２ＪＪＩのＴ４ＤＮＡ　リガーゼを
加え１６°Ｃで一晩保温し、フラグメント間を連結し、
二本鎖フラグメントとする。

大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１反応：ＤＮＡ１μｍ、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏ−フラグメント、宝
酒造３，５ユニット７μｔ）１ｔｄ、１ｍＭｄＸＴＰ（
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｃｉＣＴＰ、ＴＴＰの混合物）１ｍ及びＩＯＸ緩衝液〔
７０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）　、Ｉ　Ｉｌ
！ＭＥＤＴＡ、２００ｍＭＮａＣ１゜７０イＭＭｇＣ１
ｚ　〕３　ｕｌに滅菌蒸留水を加えて全〒を３０Ｊ１１
とし、３７°Ｃで３０分間保温する。

プローブの標識； １ｎの合成りＮＡ、５０ｐｃｉのｒ−”Ｐ−ＡＴＰ水７
Ｂ　’＋Ｆｌ　（３０００Ｃｉ　／　ｓ＠ｏｌり、（５
０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、ＩＯＩＩ
Ｍ門ｇｃｌｚ　、５ｍＭＤＴＴ　、　　１０ユニツトＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含む１０ｕの
溶液を３７°Ｃで１時間反応後、未反応のヌクレオチド
をＮｉｃｋ−ｃｏｌｕｍｎ（ファルマシア）を用い、メ
ーカーのプロトコールにのっとり除き、コｔｐで標識さ
れたＤＮＡを得る（　Ｉ　Ｘ１０”ｃｐｍ／　１、、Ｄ
ＮＡ／４ｏＯｍ　）　。

ハイブリダイゼーション： ＤＮＡを固定した膜をハイブリダイゼーション液（６ｘ
ｓＳＣ（１ｘｓｓｃ　はＯ，１５Ｍ　ＮａＣＥ、　０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、５Ｘデン
ハート液（０，１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィ
コール、０．１％ポリビニルピロリドン）、０．５％Ｓ
ＤＳ　。

１００ｎ変性サケ積子ＤＮＡ）ＩＯＪ中で、４２°Ｃ２
３時間保温する。液を捨て、プローブをＩＸＩＯｂＣ９
ｍ　／−加えたハイブリダイゼーション液１〇−を加え
、８０°Ｃ１３分保温する８次に、４２°Ｃで一夜保温
する。液を捨て、膜を２ＸＳＳＣにより室温で５分洗い
、さらに２ｘｓｓｃにより６０’Ｃで３０分洗う。

なお、酵素反応によりプラスミドを作製する場合には、
その酵素反応７Ｈ合物を用いて大腸菌ＨＢ　１０１を常
法に従って形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存して適
切な常法により形質転換体を選択し、目的とするプラス
ミドを含有するクローンを例えばミニプレバレージョン
法により形質転換体から抽出したＤＮＡを種々の制限酵
素で切断して電気泳動法により分析する方法（たとえば
Ｍａｎｉａｔｉｓ。

↑、Ｆｒ１ｒｓｃｈ４＋Ｆ、＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇＡ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒしａｂｏｒａＬｏｒｙ　１９８２）により
選択した。そして選択されたクローンを培養し、菌体か
ら常法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出することにより
、所望の組換えプラスミドを増幅・回収した。この方法
は組換え操作の各段階により必要に応じて行った。

！ＥＪｉｌＬ１．　　プレプロ　　　コード　るＤＮＡ
のＡ威 次の配列を有する４種類のオリゴヌクレオチド＝１、　
ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴ２、　ΔＧＡＡＣＡＡＧＡＡ
ＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣ
ＴＴＣＡＴＧ３、　ＣＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴ
ＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＣＧ４、
　　ＣＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧ
ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧを、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ
、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋Ｍ、）１．、Ｔｅｔｒａｈ
ｅ−ｄｒｏｎ　ＬｅＬｔｅｒｓ２１，７１９（１９８０
）に記載されているホスホアミダイト法により、自動Ｄ
ＮＡ合成！ｌ！ａ　（Ａｐｐｌ−ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）を用いて合成した。

オリゴヌクレオチド断片をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼにより５′−リン酸化した後、アニーリングせしめ、
次にＴ４ＤＮＡ　リガーゼにより連結して、プレプロ配
列をコードする一個の二本鎖ＤＮＡを得た。この二本鎖
ＤＮＡは前記の構造を有する。

正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡを含むプラスミド
ｐＵｃ−１１ｓＡ−ＣＨ（参考例２）を制限酵素Ｅｃｏ
１口及びＣ１ａ　１で二重消化して大きい方のフラグメ
ントを得、これを前記の合成りＮＡとＴ４ＤＮＡ　リガ
ーゼにより結合させプラスミドｐＵｃ−１１５Ａ−Ｅ）
ｌを作成した。

ｐＵｃ−）ＩＳＡ−Ｅ１１プラスミドをＥｃｏＲＥで処
理し開環し、バクテリアアルカリ性ホスファターゼで５
′−リン酸基を除去後、 ５’　　−ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡ　−５’ の配列から成るＸｈｏ　Ｉ認識部位を含むＸｈｏｌリン
カ−とＴ４ＤＮＡ　リガーゼにより結合させ環状ブー７
スミドｐＵｃ−Ｘ−Ｈ５Ａを作成した。

ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡの３′側領域を含有す
るλｇｔｌｌ（）ＩＳＡ−ＩＡ）　（参考例１、第８０
）をＥｃｏＲｌにより消化してヒト血清アルブミンＡの
ｃＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントを得、これをＥ
ｃｏＲＩにより切断したプラスミドｐＵｃ１Ｂに連結し
てプラスミドρＵＣ４１ＳＡ−１’を得た。このプラス
ミドｐｔｌｃ−ＨＳ＾−ビを旧ｎｄＩＩＩで切断しＨ３
ＡのポリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナルを含む小さい
方のフラグメントを得て、これを！ｌ１ｎｄＩＩＩ処理
で開環しアルカリ性ホスファターゼで処理して末端の５
′リン酸基を除去したｐｕＣ−Ｘ−１１ｓＡに組み込み
ｐＵｃ−ＸｉｌＳＡ−Ａプラスミドを作成した。

実２　　ブースミ　ＪＤＢ−ＮｅＯの 基本となる大腸菌−酵母菌シャトルベクターとして市販
されているプラスミドｐＪＤＢ２０７　（アマジャム）
を使用した。また、Ｎｅｏ　（アミノゲルコンドホスホ
トランスファラーゼ３’　　（１））遺伝子源として市
販されているプラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア）を使
用した。プラスミドｐＮＥｏを旧ｎｄｌＨ及びＥｃｏＲ
ｌにより二重消化し、大きい方のフラグメントを得た０
次に、下記の配列： を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、前記ｐＮＥ。

の大きい方のフラグメントにＴ４ＤＮＡ　リガーゼを用
いて連結・環状化してプラスミドｐＮｅＯ−ＰＬを得た
。

前記二本鎖オリゴヌクレオチドは５′−末端にＥｃｏＲ
Ｉ粘着末端配列を有し、３′−末端に１ｌｉｎｄｎｌ末
端を有するほか、内部にｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ　、　　Ｘ
ｈｏ　Ｉ及びＳｍａ　１部位を有する。従って前記プラ
スミドｐＮｐＯ−ＰＬはＮｅ０ｉｆｉ伝子の上流に複数
の制限酵素切断部位を有する。次に、このプラスミドｐ
ＮｅＯ−ＰＬをＨ４ｎｄＩＩＩ及びＢａｎ＋ＨＩにより
二重消化し、１．４　Ｋｂフラグメン［・を得た。プラ
スミドｐＪＤＢ２０７をｌ１ｉｎｄｌＩＩ及びＢａ１ｌ
ＨＩにより二重消化し、２μ酵母復製起点及び標識遺伝
子ＬＥ０２等を含有するベクターフラグメントを得た０
次に、これらのフラグメントを７４ＤＮＡ　リガーゼに
より連結することによりプラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏを
得た。

酵母菌４８２２株の染色体ＤＮＡ　ｌｏｎｇを１ユニツ
トの５ａｕ３ＡＴと３７℃、１５分反応させた（　２０
０Ｊ１１の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）１７．５　
）　、７ｍＭＭｇＣＩｔ　、５０＋ＭＮａＣｌ中３，１
０ｄの０．５　ＭＥＤＴＡ　（ｐＨｓ、　０　）を加え
、６５’Ｃ１０分反応させ、酵素を失活させた。５％シ
＝ｔｔ’ｆＡ−ＴＥ　［ＴＥ　：　１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＩＣＩ（ｐ）１７．５　）、１　ｒａｌ’１ＥＤＴ＾〕
と２０％シ！Ｉ糖　ＴＥを用い、密度勾配を全１１２ｄ
で作製した。この勾配の上に上記反応液を重層し、ベッ
クマン社のＳ−４１０−ターを用い、２２Ｋｒｐ＋ｓで
１５時間、１６℃で遠心した。

遠心後、各分画について電気泳動を行い、１５ｋｂ〜２
０ｋｂのフラグメントを含む両分に５０１の３Ｍ酢酸ナ
トリウム液（ｐＨ５，２）を加え、次に１−のエタノー
ルを加え、よく混合した後、−２０℃に一夜静置し、Ｄ
ＮＡを沈殿させた。遠心（１５Ｋｒｐｍ、５分、４°Ｃ
）により、ＤＮＡ沈渣を回収した。この沈渣を７０％エ
タノールで洗った後、減圧乾燥した６以上の操作により
、５ｎのＤＮＡを得た。

この０ＮＡＩＩ！Ｋを２ＪＩＩＩのＥＭＢＬ３のアーム
（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）、及び３５０ユニツトの
７４ＯＮ＾リガーゼ（宝酒造）と混ぜ、１６℃で一夜反
応させた〔反応液＝１０　Ｊｌｌの５０膳Ｈ丁ｒｉｓ　
　　ＩＩｃＩ（ｐＨ７，５）、１　０ｍＭＭｇＣ１ｇ。

１０　ｍＭＤＴＴ、　１　ｍＭ八へＰ　）　、上記反応
液１４を用い、ＧＩＧＡ−ＰＡＣＫ　Ｐｌｕｓキット（
Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、　＃ＧＰ６−Ｐ）により、イン
ビトロ・パッケージング反応を行った。

その結果、３　Ｘ１０’ｐｆｕの、大腸菌Ｐ２３９２株
（ｈｓｄＲ５１４（ｒｋ−＋ｍｋ”）＋　５ｕｐＥ４４
．５ｕｐＦ５Ｂ、　１ａｃＹ１．　ｇａｌＫ２＋ｇａｊ
　Ｔ２２．　ｗｅＬ　Ｂｌ、　Ｌｒｐ　Ｒ５５，ＣＦ２
）”ｌに感染しうるファージを得た。　１００Ｑｐｆｕ
のファージを５０ｍのＰ２３９２細胞に加え、３７°Ｃ
で２０分反応させた後、２．５ｄのＬ−Ｔｏｐ−Ａｇａ
ｒｏｓｅ　　（Ｌ　Ｂ培地（１％トリプトン、０．５％
酵母エキス、１％Ｎａ（、ｊり中０．７％アガロース〕
と共に、直径９０ｍｍのし一プレート（ＬＢ培地＋１．
５％寒天）にまいた、このようなプレートを５枚用意し
、３７゛Ｃにて一夜培養し、プラークを形成させた。プ
ラークの形成されたプレートを１時間４　’Ｃで保存し
た。

Ｈｙｂｏｎｄ　　Ｎ膜（アマジャム）をアガロース面に
密着させ、室温に２分静置した。膜をアガロースからは
がし、接着面を上に、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ１ｌ　ＭＮ
ａＣＬを浸した３ＭＭフィルター（Ｗｈａ　ｔｌａｎ）
上に５分間置いた。膜を０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ
（ｐＨ７，２）、　１．５ＭＮａＣｌを浸した３ＭＭフ
ィルター上に移し、５分静置した。２ｘｓｓｃ液で膜を
洗い、風乾させた。風乾したｎＩｉをサランランプで包
み、ＵＶ照射し、ＤＮ△を膜に固定した。この膜を、Ａ
ＤＣＩ遺伝子の翻訳頭載のアミノ末端より１０残基に相
当する塩基配列を化学合成したプローブＡＤＨ（５’Ａ
ＴＧＴＣＴ　ＡＴＣＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　
ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴＴ）とハイブリダイゼーションさ
せた。膜を洗浄後サランラップに包み、ＸＡＲ−５フイ
ルム（コダック社）に密着させ、１ｎＬｅｎｓｉｆｙ　
５ｃｒｅｅｎを用い、−７０°Ｃにて５時間露光させた
。

現像後、ハイブリダイゼーションシグナルを与えたプラ
ークをパスツールピペットの先でかきとり、　１００Ｉ
ｉ！ＯＴＭ液（ｌ　ＯｍＭＴｒｉｓ　−１１ＣＩ　（ｐ
Ｈ７，５）。

１０Ｔ＠問ｇｃ１□〕に懸濁し、室温に２０分間静置し
た。懸濁液０．５　ｐｌを１ｄのＴＭ液で希釈し、その
うち５　ｐｌを前述した方法で大腸菌Ｐ２３９２に惑染
させ、直径９　Ｇ　＋＋ｕｉのプレートにまきプラーク
を形成させた。形成させたプラークは、再度上記のよう
にプラークハイブリダイゼーションを行い、単一プラー
クからなるポジティブクローンを得た。ポジティブプラ
ークをパスツールピペットの先でかきとり、５０ｐ！の
Ｐ２３９２細胞に加え、３７°Ｃで２０分間静置した後
、液を２ｄのＬＢ培地、１０ｍ問ｇｓｏ、に加え、３７
°Ｃで６時間振とう培養した。

クロロホルムを１００ｕ７加え、ポルテックスミキサー
にかけ完全に溶菌させた−　　２．５００ｒｐｍで５分
遠心し、上・清を得た。この上清中に１０’°オーダー
のファージが含まれていた。この上清８００μｌに１０
０ｄの５門ＮａＣｌを加え、次に５４０１１１のイソブ
ロパノ−ルを加えよくまぜ−２０’Ｃで２０分間静置し
た。

遠心し、得た沈渣を５００　＃７の７０％エタノールで
洗い、２００ＩのＴＨに溶解させた。

１ｍ（６０ニー’−７ト／ＩＩＩ〕のＤＮａｓｅｌ　　
（宝酒造〕と、２ＩのＩ　ＭＭｇＣｌｇを加え、３７°
Ｃで３０分反応させた。１００ｕｌのＴＥ飽和フェノー
ルを加え、ポルテックスミキサーで処理した。１２Ｋｒ
ｐ■、５分遠心し、得られた水層をフェノール／クロロ
ホルム（１：１）で−回抽出した。得られた水層に２０
４の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）を加え、さらに
５００Ｉのエタノールを加え、遠心してＤＮＡを沈殿さ
せた。得られた沈渣を７０％エタノールで洗った後、減
圧乾燥させ、そして５０ＪｌｌのＴＥに溶解した。この
操作でｌＪ４相当のファージＤＮＡが得られた。得られ
た溶液２０μｌに、２．２ＩのｌＯ倍濃度ＥｃｏＲＩ　
緩衝液（０，５ＭＮａＣＩ　、　０．５ＭＴｒｉｓ−）
ＩＣＩ（ｐＨ７，５）、　７０ｍＭＭｇＣ１ｔ）を加え
、１Ｊ１１（５ニー’−７ト／ｉ）のＥｃｏＲＩにッポ
ンジーン）とｌｌ１ｌのＬｏｎｇ／ｄのＲＮａｓｅＡ（
Ｓｉｇｍａ）を加え、３７°Ｃで１時間反応させた０反
応後、０．７％アガロース電気泳動を行い、常法に従い
、ＤＮＡバンドをｌ１ｙｂｏｎｄ　Ｎｆｆｆｌにプロン
ティングさせた。ＤＮＡの結合したｌ１ｙｂｏｎｄ−Ｎ
膜は、プラークハイブリダイゼーションと同一の条件で
ハイブリダイゼーシヨンを行った。このようにして得ら
れたいくつかのクローンのうち、λ−ＭＤＩでは、８．
４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントにプローブが結合する
ことが分かった。

残りのＤ　Ｎ　Ａ　ｉＢ液のうち２０Ｉを、前述の条件
下で、ＥｃｏＲｒにより切断し、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動でフラグメントを分離した。　８．４　ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントを含むアガロース断片を切り出
し、グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎＴ″１．
　　Ｂｉｏ−１０１社）により、ＤＮＡをアガロースか
ら分離、精製した。

１０Ｉ１１のＴＥ中に溶出されたＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ
で切断したｐＨｃ１９と連結反応させ（３０ｎｇ　ｐＵ
ｃ１９゜５０ｍＭＴｒｉｓ　　ｔｌｃｌ（ｐＨ７、５）
、　１０ｍＭＭｇＣＩｒ、１０ｍＭＤＴＴ。

１　ｍＭＡＴＰ、　３５０ユニツトＴ４ＤＮ八リガーゼ
／３０μｌ中。

１６°Ｃ，２時間〕、反応液５μｌを用いて大腸閉ＪＭ
１０７を形質転換させた。形質転換した大腸菌を５０　
ｉｔｔ／ｒｒｄｌ　Ｘ　−Ｇａｌ　、　５−ＩＰＴＧ、
　　５０　ｐｇ／ｍｌアンピシリンを含むし一プレート
（Ｘ−Ｇプレート）にまき、コロニーを形成させた０発
色していないクローンを５０ｑ／ａｆアンピシリンを含
む５ｄのＬＢ培地に接種し、３７°Ｃで一夜培養し、菌
を増殖させた。ミニプレバレージョン法によりＤＮＡを
調製し、最終的に得られたエタノール沈澱を５０μｌの
ＴＥにン容解させた。３周製したＤ　Ｎ　Ａの内５ｐノ
をＥｃｏＲｌで切断しく　５０　＋ＲＭＴｒｉｓ　−ｔ
ｌｃｌ　（ｐＨ７，５＞７　ｍＭＭｇｃＩｇ、　５０　
ｍＭＮａｃＩ　、　１　ｍｇ／ｍｆｌＲＮａｓｅＡ　、
　５ユニｙ　トＥＣＯＲＩ　／１５μＺ　）　、０．７
％アガロースゲル電気床動を行い、８．４ｋｂのＥｃｏ
ＲＩフラグメントがｐｕＣに挿入されていることを確か
めた。さらに、サザーン法により、このフラグメントが
プローブと結合することを確かめた。このようにして得
られたクローンｐＥｃｏ８．４のＤＮＡを精製し、０．
５　Ａ！ｇを５ａｕ３ＡＩで完全分解しく５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ７、５）。

５０＋ａＭＮａＣ］　、　７ｍＭＭ５Ｃ１ｚ、　４ユニ
ツト５ａｕ３ＡＩ／１５μｆ中、　３７　’Ｃ１２時間
）、０．７％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡフラ
グメントを分離した。

１．６ｋｂフラグメンｌ−を含むアガロース断片より、
ＣｅｎｅＣｌｃａｎ”により、ＤＮＡをＩＯμ／ＴＥに
回収した。

これをＢａｍｔｌ　ｌで切断したｐＵｃ１１９と連結反
応させ、反応液の５　ｐｌを用い、大腸菌Ｈν１１８４
を形質転換した。形質転換した大腸菌をＸ−Ｇプレート
にまき、コロニーを形成させた０発色しないコロニーの
ＤＮＡをミニプレバレージョンで：ｍ　シし、分析を行
った＋１５ｊ’ＤＮＡを［ｃｏＲｌと旧ｎｄｌｌｌで切
断したもの、（５ニー’−７トＥｃｏＲＩ　、　５ニー
’−７ト１１ｉｎｄｌＴｌ）、及び６ユニント５ｐｈｌ
で切断したものをそれぞれゲル電気泳動で分析し、前考
においては１．６ｋｂのフラグメント、後者においては
、１．Ｏｋｂフラグメントを生ずるクローンを選別した
。このようにして得られたクローン、ρＳａｕ　１．６
のＤＮＡを調製し、以下の実験に用いた。

ＤＮＡＥｚｚｇをＳｍａ　ＩとＳａｃ　ｌで切断した（
１０ｍＭＴｒｉｓ　−１１ｃＩ　（ｐＨ７，５）　、　
２０　ｍＭにＣ１，７ｒ６ＭＭｇｃｌｔ、　２０ユニｙ
　ト５ｅａｌ　、　２０：Ｌ二ント５ａｃ１１５０ｔｒ
１　。

３７　”Ｃ、２時間〕６反応終了後、フェノール−クロ
ロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収
した。ＤＮＡ沈渣を５０μ！のＥｘｏｌＩＩｔｌ街液（
５０ｍＭＴｒｉｓ　−１４ＣＩ　（ｐＨ８，０）、ｌｏ
Ｏ＋ＭＮａｃＩ　、　５　＋５ＭＭｇＣ１ｔ、１０ＩＩ
ＩＭ２−メルカプトエタノール）に溶した。もう−本の
チューブに５０ＪのＭＢｉｌ街液（４０ｇ＋Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ４，５）＋　１００＋ｗＭＮａＣ１，２ｍ
ＭＺｎｃ１ｇ、１０％グリセロール）を入れ水中に薗い
た。

ＤＮＡ液に１８０ユニツトのＥｘｏ　ｍヌクレアーゼ（
宝酒造）を加え、３７℃に保温した。酵素添加後３０秒
ごとに５　ｐｌをサンプリングし、ＭＢ緩衝液の入った
チューブに移した。サンプリング終了後、氷上のチュー
ブを６５°Ｃ１５分保温し、次に３７°Ｃに冷し、５０
ユニツトのマング・ビーンヌクレアーゼを加え、３７°
Ｃ１３０分保温した。反応後、この液をＴＥで飽和させ
たフェノールで抽出し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収
した１回収したＤＮＡを３０ｕｌのＴＥに溶した。ＩＩ
Ｊ７をとり２　ｐｌのＩＯＸライケーション液（５００
＋ｅＭＴｒｉｓ−）１ｃＩ（ｐ）１７．５　）、　　１
００ｍＭＭｇＣｌ□、１００＋ｙ＋ｌ’１ＤＴＴ、　　
　１　０ｍＭＡＴＰ　　）を加え、Ｌ６ｐｌのＴＥ、１
ｍのＴ４ＤＮＡ　リガーゼ（３５０ユニント／μｌ）を
加え、１６°Ｃで一夜保温した０次に、７０°Ｃにて１
０分間保温し、リガーゼを失活させた後、０．２？１Ｋ
Ｃ１を２４、Ｓｅａ　１を１ａ１（１０ニー’−７ト／
ＩＪＩ）加え、３７°Ｃ，１時間保温した０次に７０°
Ｃにて５分間保温し、水中に移した。

これを用い、ＭＶ１１８４を形質転換させ、形質転換体
を一夜３７°Ｃで培養し、コロニーを形成させた。

コロニーからＤＮＡを調製し、欠失変異が生じているク
ローンを検出した０次に、欠失の起こっているクローン
の一本鎖ファージＤＮＡ８５Ａ製した。

ファージＤＮＡは、７−ＤＥＡＺＡ−ジデオキシ・シー
クエンシングキ・ント（宝酒造）を用い、メーカーマニ
ュアルに従い、配列決定を行い、ＡＴＧより上流−１０
ｂｐまで欠失したクローンｐＤＥ６−１０を１）だ、　
ｐＤＥ６−１０のＤＮＡを調製し、１埋ＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで完全消化し、１００ＩＪＩのＴＥに溶解させた。

この’ｔ８　液２　ｔｄに１１００ｎのＸｈｏリンカ−
（ＡＡＴＴＧＣ丁ＣにＡＧＣ）を加え、１０ＩＩＩの反
応液中で連結反応させた（１６°Ｃ１２時間）、７０°
Ｃにて１０分間保温し酵素を失活させ、１μ！の０．５
　Ｍ　ＮａＣｌ、５ユニントのＥｃｏＲＩを加え、３７
°Ｃ３０分間保温した後、これを用いて、大腸菌ＭＶ１
１８４を形質転換させた。得られたコロニーからＤＮＡ
を調製し、ＥｃｏＲｌで切断されず、Ｘｈｏ　Ｉで切断
されるクローンを選別した。このようにしてｐＤＥ６−
１０　（Ｘｈｏ）　（プロモーターカセットベクター）
を得た。

このベクターｐＤＥ６−１０　（Ｘｈｏ）を含有する大
腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＭＶ１１
８４／　ｐＤＥ６−１０（Ｘｈｏ）は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第１０３１１号（Ｆ［、ｌ
１１Ｍ　Ｐ−１０３１１＞として寄託されている。

ｐＥｃＯ８，４Ｉ　ｎを４ユニントの［（ａｌ　ｌで切
断した（　１０　ｆｆ１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃＩ（ｐＨ
７，５）、　７　ｍＭＭｇｃＩｚ　／２０ｄ、３１°Ｃ
，を時間）０次に、１ＭＮａｃｌを３μ！加え、４ユニ
ツトのＳｐｈ　Ｉを加え、１時間３７°Ｃに保温した０
反応後０．７％アガロースゲル電気詠動を行い、ｌｋｂ
のフラグメントを分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎでＤＮＡ
を抽出した０回収したＤＮＡを、Ｓｐｈ　ＩとＳ＋＋＋
ａ　ｒで切断したｐＵｃ１１８と連結反応させ、ＭＶ１
１８４を形質転換させた。形質転換クローンからＤＮＡ
を調製し、フラグメントの挿入されたクローンを捜した
。このＤＮＡを調製し、１ｐｔＤＮＡをＳｐｈ　１及び
旧ｎｄＩＩ［で切断しく　Ｉ　ＸＥｃｏＲ］　緩衝液。

４ユニット５ｐｈ１．１２ユニ・ントＨｉｎｄｌＩＩ　
）　、１．２％アガロースゲル電気床勤を行い、０．３
３ｋｂフラグメントを単離し、そしてＧｅｎｅ　Ｃ１ｅ
ａｎによりＤＮＡを抽出した。これを、プラスミドｐｈ
ｈ了り−ＰＬＩを１（ｉｎｄＩＩＩ及びｓｐｈ　Ｉによ
り二重消化して得られた５、７ｋｂフラグメン）５０ｎ
ｇと連結反応（全反応）８液！ｄ２０μりさせた。

反応後、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、アンピンリ
ンを含むし一プレー）　（Ｌ−ａｍｐプレート）上でコ
ロニーを形成させた。コロニーよりＤＮＡを調製し、制
限酵素分析により挿入ＤＮＡを調べ、目的とするフラグ
メントが挿入されたクローンをｊ′トた。そのクローン
からＤＮＡを調製し、その０．５Ｍｇを旧ｎｄｌＩＩで
切断した。７０°Ｃ５分保温して、氷上に１多し、１　
ｐｌ　（Ｄ　１　ｍＭｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴ
Ｐ、　ｄＣＴＰｄＴＴＩ’を各々１ｍＭ含む）、と２ユ
ニツトのＤＮＡボリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏ−フラグメン
ト）〔宝酒造）を加え、３７°Ｃで３０分間保温した。

フェノール・クロロホルムで除蛋白後、ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させた。ＤＮＡｌ０Ｊの１×ライゲーシヨン
液に溶かし、３５０単位の７４ＤＮＡ　リガーゼを加え
、１６°Ｃで一夜保温した。７０°Ｃで１０分間処理し
、リガーゼを失活させた後、０．５　ＭＮａＣｌを１゜
２ｊ１１．１１ｉｎｄＩ［１を１２ユニット加え、３７
°Ｃで３０分間処理した。これを用い、大腸菌ＪＭ１０
７を形質転換させた。　Ｌ−ａｍｐプレートに形成され
たコロニーの一部をＬ−ａ＋ｍｐ液体培地（Ｌ−ａｍｐ
プレートから寒天を除いたもの）中で培養し、得られた
菌体からＤＮＡを調製し、Ｈｉｎｄｌｌｌサイトが失わ
れたものを得た。

ＤＮＡをＡＦｌ製し、０．５　ｎＤＮＡを４ユニツトの
Ｂａ＋ＩＩＨＩ、１２単位のＳｐｈ　Ｉで切断した（　
１０　ｍＭＴｒｉｓ　・１１ｃＩ　　（ｐＨ７，５）、
　１５０ｍＭＮａＣ１、７ｍＭＭｇＣＩｚ　）　、　１
．４％アガロースゲル電気泳動で、０．３４ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを分離し、Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎでＤＮ
Ａを１０４のＴＨに回収した。これを３０ｎｇのｐＡＴ
Ｉ５３を、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈ　ｌで切断して得た３
、５ｋｂフラグメントとで連結反応させた。

反応液で大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、Ｌ−ａ＋ｎ
ｐプレートにコロニーを形成させた。コロニーの一部を
Ｌ−ａｍｐ液体液体中地中養し、得られた菌体からＤＮ
Ａを調製し、０．４２ｋｂのサイズのＢａｍＨＩ　−５
ａｌ　に重消化物（ＤＮＡフラグメント）を与えるクロ
ーンをさがした。得られたＤ　Ｎ　Ａ　０．５　ｎを、
ＢａｍＨＩ及びＳａｌ　　！で切断し、１．４％アガロ
ースゲル電気泳動により、０．４２ｋｂフラグメントを
分離し、Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎにより５　ｐｌのＴＥに
回収した。これを、ＢａＩＩ＋ＨＩ　　　Ｓａｌ　Ｉで
切断したｌｏｎｇのｐＬｌｃ４１９と連結反応させた０
反応液１　ｔｔｌを用い、大腸菌阿り１１８４を形質転
換させ、ＸＧプレートにまき、コロニーを形成させた。

白色のコロニーより、ＤＮＡを調製し、フラグメントの
挿入されたものを得た（ｐＵｃ八Ｔへ；ターミネータ−
カセット・ベクター）。

このベクターｐＵＣ−ＡＴＥを含有する大腸菌Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ且ノＶ１１８４（ｐＵｃ−ＡＴ
Ｅ）は工業技（１，ｉ院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１０３１０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３１０）とし
て寄託されている。

丈庭斑１．西　　　　ベクターの作撃 プロモーターカセットベクターｐＤＥ６−１０　（Ｘｈ
ｏ）０．５ｎを旧ｎｄＩ［Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで切断し、
０．７％アガロースゲル電気泳動により１．６ｋｂのフ
ラグメントを分離した。一方、ｐＪＤＢ−Ｎｅｏｎ、　
５　ｔｒｇを旧ｎｄＩＩ！及びＸｈｏ　［で切断し、８
ｋｂフラグメントを分離した。

両者を連結し大腸菌Ｊ旧０７に導入し、アンピシリン耐
性コロニーを得た。コロニーよりＤＮＡを得、挿入フラ
グメントを確認、シた（ｐＡＨＧ−１０−Ｎｅｏ）　。

ｐＪＤＢ−Ｎｅｏｏ、　５　ｎをＢａｍ１ｌ　Ｉ及び５
ａｌｌで切１析し、約８ｋｂのフラグメントを分、ｔｌ
だ、一方１ｇのｐＵｃ−ＡＴＥをＢａｎｔｌ　Ｉ及び５
ａｌｌで切断し、０．４２ｋｂのフラグメントを分離し
た０両者を連結し、形成されたプラスミドにより大腸閉
ＪＭ１０７を形質転換させ、アンピシリン耐性コロニー
を得た。これらのコロニーよりＤＮＡを調製し、目的の
プラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−Ａ　ＴＥ有していること
を確かめた。　ｐＪＤＢＮｅｏ−ＡＴＥｏ、　５　ｎを
１ＩｉｎｄＩｎ及びＸｈｏ　Ｉで切断し、約８ｋｂのフ
ラグメントを得た。一方、ｐＤＥ−６−１０（Ｘｈｏ）
より、１．６ｋｂの１ｌｉｎｄＩＩＩ　−Ｘｈｏ　ｌフ
ラグメントを回収した０両者を連結し、形成されたプラ
スミドにより大腸菌Ｊ！１１０７を形質転換させた。ア
ンピシリン耐性コロニーのＤＮＡを調べ、目的のプラス
ミド（ｐＡｌ１６−１０−　Ｎｅｏ−へＴヒ）を有して
いるクローンを見つけた。

、このベクターを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ　ＪＭ１０７／ｐＡＩＩＧ−１０−Ｎｅｏ−
ＡＴＥは工業技術院微生物工業技ｉネｉ研究所に微工研
菌寄第１０３０９号（ＦＥ）１Ｍｐ−ｘ０３０９）とし
て寄託されている。

久」１片ｌ、光瓜プラノミドの毘製コ皿工１花と前記の
様にして調製した、Ｎｅｏ遺伝子の上流にＡ　Ｄ　Ｈプ
ロモーターを有し、そしてＮｅ０ｉｆｌ伝子の下流にＡ
　Ｄ　Ｈターミネータ−を有するプラスミドｐＡＩＩ（
ｉ−１Ｏ−Ｎｅｏ−ＡＴＥをＸｈｏ　ｌ及びＢａｍＨＩ
により二車消化することによりＮｃＯｉｆｉ伝子が除去
されたヘクターフラグメントを得た。他方、ヒト血清ア
ルブミンＡのｃＤＮＡを含有するプラスミＦｐＵＣ−Ｘ
１１ｓＡ−Ａ　（実施例３）をＸｈｏ　ｌ及びｒｌａｍ
）Ｉ　ｌで二重消化し、人工リーダー配列を含むプレプ
ロヒト血’（ｌｌｊアルブミンＡのｃＤＮＡ及びポリ八
を含有するフラグメントを得た。これらを７４　ＤＮＡ
リガーゼにより連結することにより、発現プラスミドｐ
ＪＤＢ−ＡＤＨ−１１ｓＡ−＾を得た。

このプラスミドを含有する酵母ｎ胚町田１匹競ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　　ＡＨ２２／ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＩＳＡ
−Ａは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１０３０７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３０７）として寄託
されている。

発現プラスミＦによる酵母菌の形質転換は基本的には橋
本英明、木材光〔発酵と工業４３　、６３０−６３７（
１９８５）　）のＫｔＪＲ法に従い、少し改良した方法
によって行った。まずＹＰＤ培地（２％ポリペプトン（
Ｄｉｒｃｏ）　、１％酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　、２
％グルコース）５ｍｌにＡＨ２２株（ＭＡＴａ、　Ｉｅ
ｕ２−３．１ｅｕ２−１１２゜ｈｉｓ４−５１９．Ｃａ
ｎ　ｌ　）のＹＰＤ培地による一晩培養液０、１　ｍｌ
をカロえ３０°Ｃで約４時間（説度が００６００で０．
５に達するまで）振盪培養を行った。４°Ｃで２、　Ｏ
ＯＯｒｐｍ、５分間の遠心を行い集菌し、菌体を分取し
、２．００Ｏｒｐｍ＋、　５分間または１０，０ＯＯｒ
ｐａ＋　、、１分間の遠心で集菌した。得られた菌体を
２ＭＬｉＳＣＮ１０ｍ、５０％ＰＥＧ４００８４６　ｍ
に再懸濁し、そこにｌＯｍのＤ　Ｎ　Ａ　溶液（５〜１
０ｎのＤＮＡを含む）を加え、３０″Ｃで一晩保温する
。その懸濁液に１！ｄの滅菌蒸留水を加えゆるくポルテ
ックスミキサーにて［１する０次に２．００Ｏｒｐｍ、
５分間または１０．ＯＯＯｒｐｍ　、　　１分間の遠心
を行い、得られた菌体を１００μｌの滅菌蒸留水に再懸
濁し、選択用の寒天培地〔ＳＤ培地：２０ｎ／ＩＲ１ア
デニン硫酸塩、２０ｎ／ｒａアルギニン塩酸塩、２０ｐ
ｇ／ｒｔｄｌメチオニン、２０ｔｔｔｒ／１ｒｄｌヒス
チジン塩酸塩、２０ｐｇ／ｌｎｌトリプトファン、２０
ｎ／ｍｌウラシル、３０ｐｇ／ｄイソロイシン、３０ｎ
／ｍｌ塩酸塩リジン、３０ｕｇ／ＩＲ１チロシン、５０
ｎ／ｄフエニルアラニン、１５０ｎ／ｍｆｆ１バリン、
０．１５％アミノ酸不含イースト・ニトロゲン・ベース
（Ｄｉｒｃｏ）、０．５％塩酸アンモニウム、２％デキ
ストロースに１．５％の寒天を加えたもの〕にまいた、
生じたコロニー（Ｌｅｕ”　）をＳＤ培地５　ｍｌに懸
濁し、２日間３０°Ｃで振盪培養した。　２，０００　
ｒｐ鋼５分間、４　”Ｃでの遠心により集菌し、菌体を
０．５　ｍｌの１Ｍソルビトールに再懸濁し、遠心後、
菌体を０．５−の１Ｍソルビトール、０．１％２−メル
カプトエタノール、４００μｇ　／　ｍｌのザイモリエ
ース（７，ｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ生化学工業）に
再懸濁した。３０°Ｃで３０分間保温後生成したスフ上
口プラストを遠心（２，ＯＯＯｒｐｍ、５分間）して集
め、　ｌ００Ｉｉ１の溶液１（５０ｍＭグルコース、１
０ｍＭＥＤＴＡ、２５　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ
８，０））　に再懸濁し、次に２００．ｖ／の溶液ＩＩ
　（０，２ＮＮａ０Ｉ１．１％５ＵＳ）を加え、よく混
合した後、水上に５分間放置した。　　１５０Ｉｒ７の
５Ｍｔ９酸カリウムを加え、よくｔＲ合し水上に１０分
間放置した後、１５，０ＯＯｒｐａ＋　、５分間、４°
Ｃでの遠心を行い、得た上清を新しいチ二−ブに移した
０等量のフェノール／クロロホルム（１：１混合液）を
加え激しく撹拌し、遠心（１２，ＯＯＯｒｐｍ、５分間
）して１）だ水層を新しいチ二−プに移し、７５０　ｕ
ｌのエタノールとポルテックスミキサーを用いてよく混
合した。混合液を１５．ＯＯＯｒｐｍ　、５分間遠心し
、得られた沈澱に０．５　ｍｌの７０％エタノールを加
えポルテックスミキサーを用いて振盪した後、１５．０
００ｒｐｍ、５分間の遠心で沈澱を回収した。

このＤＮＡの沈澱を真空中で減圧乾燥し、次に３０ｐ！
のＴ巳緩ｔＪｉ７夜に？宕解した。プラスミドｐＪＤＢ
−ＡＤＩ＋−１１ｓＡ−Ａを含む八Ｈ２２の形質転換株
から得られたＤＮＡｔ！品を各種酵素（たとえばｌｌ１
ｎｄＩ！Ｉ　、　　ＸｈｏｌＥｃｏＲＩ　、　［ｌａａ
＋ｌｌ　Ｉ　、　　Ｓａｌ　１など）単独または、組合
せにより制限酵素分解し、得られたフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で分析することによりプラスミドの構造を確認した。

５Ｏ（−Ｌｅｕ）培地上に生じた単一のコロニーを５．
０−の新鮮な５Ｄ（−Ｌｅｕ）培地に懸°濁し、３０°
Ｃで２日間振盪培養し、００．。。が約２．０になった
時点で培養液の０．１　ｄを５．０　ｄのＹＰＤ培地に
加えた。これを２４時間３０°Ｃで、ＯＤ、。。が約３
．０になるまで培養した。培１を５．００Ｏｒｐｍ、　
　１０分間、４°Ｃで遠心し、上清画分を回収した。上
清画分に等量の９９％エタノールを加え、混合した後３
０分間４°Ｃに放置した０次に１２．ＯＯＯｒｐｍ　、
　　ｌ　Ｑ分間、４゛Ｃで遠心し、沈澱物を得た。この
沈澱物を１００．１１１のｌ×ローディング（Ｌｏａｄ
ｉｎｇ）緩衝液（５％２−メルカプトエタノール、０．
００２５％ブロモフェノールブルー、２％ＳＯ５，０，
０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、８％グリセロール）に
溶解し、そのうち１０ｄを電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル：４〜２０％濃度勾配ゲル８４（輻
）Ｘ９０（高さ）×１．０（厚み）（単位は−）〕に重
層して分析した。

泳動は泳動緩衝液（０，０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ
（ｐＨ８，４）、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＯ
５）を用い、６０ｎ＋Ａの定電流下６０分間行った。同
時に泳動したマーカーは卵白リゾチーム（分子ｆｆ１１
４，４００）　、）リプシンインヒビター（分子ｆ！２
１，５００）　、炭酸脱水酵素（分子ｉ３１．ｏｏｏ）
　、オバルプミン（分子量４５．０００）　、子牛血清
アルブミン（分子ｆｆ１６６．２００）、ホスホリラー
ゼＢ（分子量９２．５００）　（全てＢＩＯ−ＲＡＤ社
製）であった、泳動終了後、常法に従いクマシー・ブリ
リアント・ブルーにより染色し、または以下に示すよう
にウェスタンブロッティング後免疫検出を行った。泳動
後、分離された蛋白質を５ａｒｔｏｒｉｕｓ社製のセミ
ドライブロック−を用いてニトロセルロースフィルター
（ＢＩＯ−ＲＡＤ　社）に移した。フィルターを、１時
間メタノールに浸した後、５分間２５＋ａＭＴｒｉｓ−
ＩＣＩ（ｐＨ１０，４）　／　２０％メタノールに浸し
泳動ゲルと密着させた。これを上記緩衝液、及び２０メ
タノールを含む０．３　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐ
Ｈ１０，０）と２５ｎ＋ＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ９
，４）　／４０ａＭ６−アミノ−ｎ−カプロン酸等の緩
衝液に各々浸したろ紙ではさみプロッターに装着した。

６■の定電圧を約１．５時間かけた後、フィルターを３
％ゼラチンを含む２０　ＩｉＭＴｒｉｓ　−１１ｃＩ　
（ｐＨ７，５）１５００ｍＭ　ＮａＣ１（ＴＢＳ）溶液
中で３７°Ｃ，１時間振盪した後ＴＢＳ１０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ　−２０中で５分間振盪することによりペーパ
ーを洗浄した０次に抗ヒト血清アルブミンウサギ抗体（
カッベル社）を１％ゼラチンを含むＴＢＳで２．０００
倍に希釈した溶液４０ｄ中でペーパーを室温でｌ晩振侵
した。ペーパーを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む
Ｔ［ＩＳ（＄）１１７．５　（Ｔ−ＴＢＳ）で５分間振
盪しながら洗浄した。この操作をもう一度繰り返した後
第二抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ
抗つサギＩｇＧ抗体、ＢＩＤ−ＲＡＤ社製）を１％ゼラ
チンを含むＴＢＳで３．０００倍に希釈した溶液４０　
ｒａｎ中でペーパーを室温で１時間振盪した０次にＴ−
ＴＢＳで５分間ずつ２回およびＴＢＳで５分間１回上述
のように洗浄した。当該バンド（ＩＳＡ）の検出は４−
クロロナフトール３０■を１０ｄのメタノールに溶かし
た１８液とＴＢＳ　５０ｒｔｄｌ、３０％過酸化水素３
０ｕｌをγ■Ｌぜた溶液に？Ｓ　？ｎすることにより行
い、発色反応は蒸留水で希釈することにより停止させた
。結果を第７図に示す０図中、（Ａ）は５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の後クマシー・ブリリアント
・ブルーで染色したものであり、左側が分子量マーカー
で右側が酵母で産生・分泌されたヒト血清アルブミンを
含む試料の結果であり、（Ｂ）は５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動の後、ウェスタンブロンティングを
行い抗ヒト血清アルブミン抗体と結合させ、ヒト血清ア
ルブミン支びこのフラグメントを特異的に染色したもの
であって、左側が対照として用いた精製ヒト血清アルブ
ミンで右側が酵母で産生・分泌されたヒト血・請アルブ
ミンを含む試料についての結果である。

（１）分王ヱ 酵母画壇養液より＜Ｂ離した正常ヒト血清アルブミンＡ
試オー１を２−メルカプトエタノールで還元し、そして
ＳＤＳ処理を施した後に、ＳＤＳ中１２？イから３０％
のポリアクリルアミド濃度勾配ゲルに添加し、Ｌａｃｍ
ｎ＋Ｉｉ、Ｌｌ、に、（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ、２２
７，６８０　　Ｃ８５に記載の条件で電気泳動を行った
０分子量［１ことしてホスホＢ（分子！１ｉ９４，００
０）　、牛血゛清アルブミン（分子１０７．０００）　
、オハルブミン（分子ｑ４３．０００）　、炭酸脱水素
酵素（分子量３０，０００）　、大豆ｌ・リプシンイン
ヒビター（分子￥２０．０００）　及ヒラクトアルブミ
ン（分子量１４．４００）を使用し、りマシー・ブリリ
アント・ブルー染色により蛋白質の検出を行った。ヒト
血清より精製された市販の血清アルブミンを対象として
同時に泳動し、酵母により分泌されたアルブミンとその
移動度を比較した。その結果、酵母菌産生正常ヒト血清
アルブミンＡとヒト血清から精製されたヒト血清アルブ
ミンは、ともに同じ移動度を示し、分子１６７．０００
であった。この結果を第１２図に示す。

（２）工λ血挙動 （ＮａＬｉシｅゲル電気泳動〕 酵母菌培養液より単離した正常ヒト血清アルブミンＡ試
料をそのまま、上記と同じ１２％から３０％のポリアク
リルアミド濃度勾配ゲルであるがＳＤＳを除いたゲルに
添加し、ＳＤＳを除いた上記の条件で電気泳動を行った
。蛋白質のバンドを、クマシー・ブリリアント・ブルー
染色によって検出した。ヒト血清より精製された市販の
ヒト血清アルブミンを対象として同時に泳動し、酵母菌
産生正常ヒト血清アルブミンＡとの電気泳動ゲルでの挙
動を比較した。ＳＤＳを除いたＮａｔｉｖｅゲル電気泳
動においても、酵母菌産生正常ヒト血清アルブミンＡは
、ヒト血清より精製されたヒト血清アルブミンモノマー
と同じ挙動を示した。この結果を第１３図に示す。

〔等電点電気泳動〕

等電点電気泳動は、ＬＫＢ社製Ａｓｐｈｏｌｉｎｅ　Ｐ
ＡＧｐｌａｔｅ　ｐＨ範囲３．５−９．５を用い、同社
のマニュアルに添って行った０等電点標準として、同社
ＰＩママ−−；Ｃ−フィコシアニン（ｐ１４．７５，４
．８５）、アズリン（ρ１５．６５）　、）リフルオロ
アセチルミオグロビン（ブタｐ１５．９）、ミオグロビ
ン（ブタ、ｐｒ６．４５）　、ミオグロビン（ウマ、ｐ
１７．３）、ミオグロビン（クジラ、ｐ１８．３）及び
チトクロムＣ（ａｌｌｏ、６）を使用した。酵母菌産生
正常ヒト血清アルブミンＡは、ヒト血”清から精製され
たヒト血１ｎアルブミンと同様にｐ１４．９の主要バン
ドとｐ＋４．７，４．６５の二本のマイナーバンドに分
離した。

この結果を第１４図に示す。

（３）免反北茅カニ１ 免疫拡散を、０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　、　０．Ｐｒｏ
　ｒ　Ａ１１ｅｒ　　。

６　（１９６２）３０、に記載の条件で行った。沈降線
形成後生理食塩水で脱蛋白質を行った後、クマシー・ブ
リリアント・ブルーにより沈降線の染色を行った。用い
た抗血清は、Ｃａｐｐｅ１社より入手したウサギ抗−ヒ
ト血清アルブミン抗血清及びベル・フリーズ社よりのヤ
ギ抗−ヒト血清アルブミン抗血清の二種類である。どち
らの抗血清を用いた場合でも、酵母菌産生正常ヒト血清
アルブミンＡはヒト血清より精製されたヒト血清アルブ
ミンとは完全に融合した沈降線を形成し、この方決では
抗原性における両者の違いはみられなかった。結果を第
１５図に示す。

（４）アミノ　−　アミノ 酵母菌産生正常ヒト血清アルブミンＡ１００μｇを用い
、アプライド・バイオシステム社製気相法プロテインシ
ークエンサー４７７Ａにより、同社のマニュアルに従っ
てアミノ酸配列の決定を行った。その結果以下に示すと
おり、アミン末端アミノ酸Ａｓｐより、３２番目のＧｌ
ｎまでアミノ酸残店が同定され、すでに報告のあるヒ）
ｔｉｌｌ清アルブミンのアミノ末端から３２番目までの
アミノ酸配列と完全に一敗していた。アミノ末端側アミ
ノ酸の回収率より、用いた標品は、少なくとも９３％は
アミノ末端アミノ酸がそろっていると考えられる。この
結果からは、不完全なプロセッシングによるプロ配列等
の残存は認められなかった。

酵母菌産生正常ヒト血清アルブミンへのアミノ末端側ア
ミノ酸配列はＡｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
４１ｕ−Ｖａ　ｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ
−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　
１ｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ・Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａ　１−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｐｈｃ−Ａ　Ｉａ
−（：Ｉｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ （５）肛ｙコＪ礪梵弛 〔逆相カラムクロマトグラフィー〕 高速液体クロマトグラフィー装置は、アプライド・バイ
オシステムズ社製１３０Ａセパレーションシステムを使
用し、Ａｑｕａｐｏｒｃ　ＲＰ−３００カラム（２，１
ｍｍ１．Ｄ　Ｘ３０ｎｎ）によって分離を行った。カラ
ムは、０、１％トリフルオロ酢酸で平衡化を行い、蛋白
質の溶出は、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニ
トリルの濃度勾配溶出法によって行った。濃慶勾配は、
アセトニトリル濃度０％から１００％までの直線濃度勾
配を４５分間の間で形成することによって行った。この
時の流速は２００ｐＺ／ｌ１ｌｉｎである。

この条件で、酵母菌産生正常ヒト血清アルブミンＡは単
一の鋭いピークとして得られ、ヒト血清から精製された
ヒト血清アルブミンのピークとカラム上での保持時間及
びピークの形において区別できなかった。さらに、これ
ら二つのヒト血清アルブミンを混合し、同カラムで溶出
した場合でも、単一の鋭いピークとして得られ、二つの
アルブミンの逆相カラム上での挙動は、まったく同一で
あった。

この結果を第１６図に示す０図中、Ａはヒト血清より精
製されたヒト血清アルブミン、Ｂは酵母菌産生正常ヒト
血清アルブミンＡ、そしてＣはヒト血清由来ヒト血清ア
ルブミンと酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとの混合
物の逆相カラムクロマトグラフィーの結果である。

〔ハイドロキンアパタイトクロマトグラフィー〕高速液
体クロマトグラフィー装置として品性製作所社製５ＣＬ
−６Ａ、　ＬＣ−６Ａシリーズシステムを使用し、東亜
燃料工業製高分離分析用ハイドロキシアパタイトカラム
ＴＡＰＳ−０２０８１０（７，５鴫１．ＤＸｌｏｃｍ）
によって分離を行った。溶出は、１０−リン酸！！街液
１０．０５％アジ化ナトリウムから０．３Ｍリン酸緩衝
Ｍ１０．０５％アジ化ナトリウムへの直線濃度勾配を３
０分間で形成させるように行った。この時の流速は１ｍ
／ｓｉｎである。試料としては、酵母培養分泌液をＤＥ
ＡＥ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６８で濃縮したもの
を、４０％飽和の硫安沈殿で得られた上清を、さらに６
０％飽和の硫安で沈殿させたものを用いた。酵母産生正
常ヒト血清アルブミンＡのピークの溶出時間は１１．５
分であり、その溶出時間は、ヒト血清より精製されたヒ
ト血清アルブミンの溶出時間と一敗していた。したがっ
て、ハイドロキシアパタイトカラム上での挙動において
も、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡは、ヒト血゛清
由来のものと区別できなかった。

この結果を第１７図に示す。図中Ａは酵母培養液′ａ縮
分画、Ｂはヒト血清からの精製ヒト血清アルブミンのハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す
。

正常ヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡを含むクローンの
プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
のため米国ＣＬＯＮＴＥＣ１１社のλｇｔｌｌをベクタ
ーとして作成されたヒト肝ｃＯＮＡライブラリィ−を用
いた。λｇｔｌ１組換え体ファージを大腸菌Ｙ　１０９
０を宿主として感染させ、形質転換プラーク計５．５×
１０Ｓ個をＬＢ寒天１合地上に形成させ組換えＤＮＡを
メンブランフィルタ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｉｔ　ｙ　
ｂ　。

ｎｄ　−Ｎ）に移した後、ｉｔｐ放射性同位元素で標識
した合成オリボブヌクレオチド３種（比活性≧１１０７
ｃｐ／ｇ）をプローブとして用いスクリーニングした（
Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６
．１８０−１８２（１９７７））　、この３種のプロー
ブは各々Ｌａｗｎら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ　９　、６１０３６１１４（１９８１））によって
報告されたヒト血清アルブミンｃＤＮＡの配列のうち５
′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴＧコドンより１２ヌクレ
オチド上流からＡＴＣコドンの前のヌクレオチドまでの
部分）と翻訳領域（アミノ末端のメチオニンコドンすな
わちＡＴＣより９番目のアミノ酸ロイシンをコードする
部分）を含むもの（ＩＩＳＡ−１）、２４８番目のグリ
シンから２６０番目のロイシンをコードするもの（ＨＳ
Ａ−２”）　、並びに５７６番目のバリンからカルボキ
シル末端５８５番目のロイシンをコードする部分とそれ
に続く６ヌクレオチトから成る３′−非翻訳領域を含む
もの（ＨＳＡ−３）と同じ配列である。これらのプロー
ブの塩基配列を第９［Ｍに示す、このプローブの合成は
自動ＤＮＡシンセサイザーにより行い、＋５−２には（
ｒ−”ｐ　）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用い
て行った。ｌ５Ａ−２で陽性のシグナルを与えた２００
個のλｇｔ１１クローンのうち４個のクローンからＤＮ
Ａを調製（ＢｌａＬｔｎｅｒら５ｃｉｅｎｃｅ　２０２
　。

１２７９−１２８４（１９７８）　）　Ｌ、これをＥｃ
ｏＲＩで消化し、消化物のサザーンブロントを１１３へ
一２プローブとハイブリダイズさせた（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ’。

５０３−５１７（１９７５）　）　、ハイブリダイズし
たフラグメントは３つのクローンから得られ各々１．８
　Ｋｂ　。

１．４Ｋｂ、１．３にｂの長さであった。このうち１．
８にｂと１．３Ｋｂの長さのフラグメントをｐｕｃ　１
９ベクターにサブクローニングした。このサブクローン
を）ＩＳＡ−１とｌ５Ａ−３を各々プローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーション（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎおよ
びＨｏｇｎｅｓｓ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ　７２．３９６１−３９６５（１９７５）
　）によりスクリーンした。この結果Ｉｓ＾−３のみに
ハイブリダイズするクローンλｇｔｌｌ　（ＩＳＡｌ−
Ａ）が得られた。このクローンの各種ＤＮＡ断片を塩基
配列決定用ベクターＭ１３ｍｐ１ＢおよびＩＩＩｐ１９
　ＲＦ−ＤＮＡ上に移し、グイデオキシヌクレオチドタ
ーミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅ
ｎ、Ｓ、およびＣｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、
　Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　７４５４６３
−５４６７　（１９７７）　）により塩基配列を決定し
た。

一方Ｈ５Ａ−２をプローブとして行ったλｇｔｌｌクロ
ーンのプラークハイブリダイゼーションにおいて陽性の
シグナルを与えたクローンのうち２０個についてｌ５Ａ
−１をプローブとして再びプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行い、１個の陽性のシグナルを与えるクローンλ
ｇｔｌｌ（ＩＳＡ−ＩＩ　’）を得た。

これからファージＤＮＡを調製しＥｃｏＲｌ消化物につ
いてＨＳＡ−１をプローブとして用いサザーンハイブリ
ダイゼーションを行い１．２５にｂのフラグメント（Ｉ
ＳＡ−ｎ　）がプローブとハイブリダイズすることを確
認した。このフラグメントの塩基配列をグイデオキシヌ
クレオチドターミネーション法で決定した。　　ｌ５Ａ
−Ｉｔはｌ５Ａ−３プローブとは交雑しなかった。この
結果ｌ５Ａ−ＩＩはカルボキシル末端側をコードする部
分を欠きＨＳＡ　Ｉ　−Ａはヒト血清アルブミンのアミ
ノ末端側をコードする部分を欠き、さらに３０４番目の
セリンをコードするコドン（ＴＣＡ）が翻訳終止コドン
のオパールコドンＴＧＡに変化していることがわかった
。この２つのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を第８
図に示す、酵素認識サイトの正確な位置は最終的な塩基
配列から得た。

第８図かられかるように）ＩＳＡ　Ｉ　−Ａとｌｌ５Ａ
　ＩＩの２つのＤＮＡを適当な位置（例えばＸｂａ　ｌ
やＰｓｔ１サイト）で切断し互いに再結合すればシグナ
ルペプチドやプロ配列の結合したヒト血清アルブミンの
前駆体タンパク質の全長をコードできるｃＤＮＡを構築
することができる。

ユ支尉主、ブースミドＰｔ１Ｃ−Ｈ５＾、Ｃ）１の　　
　　１０大腸閉アルカリ性ホスフアターゼ（ｐｈｏＡ）
のシグナルペプチドと正常ヒト血清アルブミンＡが融合
したタンパクｎをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐ
Ｕｃ−ｐｈｏＡ−ＨＳ＾−Ａを次の様にして造成した。

ヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−から得たｌｌ５ＡｃＤＮ
Ａを含むクローンλｇｔｌｌ（ＨＳＡ−■）からＥｃｏ
ＲＩとＸｂａ　１消化によって生じるフラグメントを調
製し、これをｐｕｃ　１９プラスミドのＥｃｏＲＩとＸ
ｂａ　Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラグメント
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させｍｌＡえプラス
ミドｐＵｃ−１ｔｓ＾−ＥＸを構築した。

このプラスミドからＡｈａ　Ｉ［Ｉと５ａｌｌの二重消
化により生ずる小さい方のフラグメントを精製した。

このフラグメントは成熟正常ヒト血清アルブミンＡタン
パク質の１２番目のＬｙｓから３５６番目のＴｈｒまで
をコードする。成熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク
質をアミノ末端からコードする遺伝子を構築するために
５′端に相当するＤＮＡ配列を、化学合成したフラグメ
ント２本をアニールすることにより作成した。この合成
りＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列と融合できるようにＨｐａ
　［及びＣ１ａ　Ｉ酵素切断によって生ずる粘着末端配
列ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルブミンＡ
タンパクｎの１番目のアミノ酸Ａｓｐから１１番目のア
ミノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している。このアニ
ールさせたＤＮＡ配列にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を作用させて５′端をリン酸化させたものと、ｐＵｃ−
ＨＳＡ−ＥＸから生じたＡｈａＩＩＩ／５ａｉｌ二重消
化物とを混合し、さらにこれに大腸菌のマルチコピーク
ローニングベクターの代表的なものの一つｐＡＴ　１５
３（Ａｎｔｅｒｓｈａｓ社製、Ｔｈｉｇｈ！。

Ａ、」、及び５ｈｅｒｒａＬｔ、Ｄ、Ｎａｔｕｒｅ２８
３２１６−２１８．１９８０）のＣ１ａ　Ｉ　／　Ｓａ
ｌ　Ｉの二重消化物のうち大きなフラグメントと混合し
この３者を７４　ＤＮＡリガーゼにより結合させ、組換
えプラスミドｐＡＴ−Ｈ５Ａ−ＣＸを得た。

このプラスミド上で正常ヒト血清アルブミンＡの１位の
アミノ酸Ａｓｐから１１位のアミノ酸Ｐｈｅをコードす
るＤＮＡ配列がつながった。　ｐＡＴ−）ＩＳＡ−ＣＸ
をＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉで二重消化し、正常ヒト
血清アルブミンＡの＾ｓｐｌ〜Ｐｈｅ３５６をコードす
るＤＮＡ配列を含む小さい方のフラグメントを得た。

一方）ＩＳＡ−Ａのカルボキシル末端側をコードするｃ
ＤＮＡは、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリィ−から得たクロ
ーンλｇｔｌｌ（）ＩＳＡ　Ｉ　−Ａ）から外来ｃＤＮ
Ａ配列の挿入されているＥｃｏＲ１フラグメントを調製
し、ｐｕｃ　１ＢプラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入
することにより組換えプラスミドｐＵＣ−）ＩＳＡ−１
中にクローニングした。

これよりｌｌ５Ａ−Ａの３５８番目のアミノ酸Ｌｅｕか
らカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコードし、
さらに３′側の非翻訳領域６２ヌクレオチドを含むＸｂ
ａ　ｌ　／　Ｈｉｎｄ　ｍの二重消化物を調製した。こ
れをｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸより得たＥｃｏＲｌ　／　Ｘ
ｂａ　に二重消化物及びｐｕｃ　１ＢのＥｃｏＲＩ　／
Ｈｉｎｄ　ｍ二重消化物のうち太きなフラグメントと混
ぜてＴ４ＤＮＡ　リガーゼにより連結反応を行い、成熟
正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡ全体を含む組換え
プラスミドｐｔｌｃ−）１ｓ＾−ＣＨを得た。

成熟正常ヒト血清アルブミンＡの全アミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第１１−１図〜第１１−３図に示す。

【図面の簡単な説明】

ｍ１図は、ブー７４ミドｐＵｃ−Ｘ−１１ｓＡ−Ａの作
製の過程を示す。 第２図は、プラスミドｐＪＤＢ−ＮｃＯの作製の過程を
示す。 第３−１図及び第３−２図は本発明のＭＤＩ１１プロモ
ーターカセットベクターｐＤＥ６〜１０（Ｘｈｏ）の作
製の過程を示す。 第４−１図及び第４−２図は、ＡＤＤ　Ｉターミネータ
ーカセントベクターｐｔｌｃ−ＡＴＨの作製の過程を示
す。 第５図は、酵母用発現ベクター（ＡＤＨ１９２１インチ
ベクター）　ｐＡｔ１６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴＨの作製
の過程を示す。 第６回は、発現プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤ）Ｉ−ＨＳＡ
−Ａの作製の過程を示す。 第７図は、ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含む形ｎ転喚
体ＡＨ２２（ｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＩＳＡ−Ａ）の培養に
より産生された成熟ＨＳ　Ａを５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動し、クマシー・ブリリアント・ブルー
染色により検出したもの（Ａ）及びウェスタンブロッテ
ィングにより検出したもの（Ｂ）を示す。 第８図はこの発明の正常ヒト血清アルブミンへの全体を
コードするｃＤＮＡ　（ｌＩｓＡｃＤＮＡ　）　、並び
にこのｃＤＮＡの造成に使用された、３′末端側をコー
ドするｃＤＮＡ　（ＨＳＡ−ＩＡ）及び５′末端側をコ
ードするｃＤＮＡ（ＩＩｓＡ−■）の制限酵素地図を示
す。 第９図は、ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した３種のプローブの塩基配列を示す。 第１０図は、プラスミドρＬＩＣ−Ｈ５Ａ−ＣＨの作製
の過程を示す。 第１１−１図〜第１１−３図は、ヒト血清アルブミンＡ
の全体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。 第１２図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト
血清由来ヒト血清アルブミンの分子鼠を、ＳＤＳ中ポリ
ポリアクリルアミド濃度勾配ゲル電気泳動って比較した
結果を示す。 第１３図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト
血清由来ヒト血清アルブミンのＮａｔｉｖｅポリアクリ
ルアミド濃度勾配ゲル電気泳動における挙動を比較した
結果を示す。 第１４図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト
血°清山来ヒト血／ＩＩｌアルブミンとを等電点電気泳
動において比較した結果を示す。 第１５図１よ、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒ
ト血゛清山来ヒト血清アルブミンとを０ｕｃｈ　−ｔｅ
ｒｌｏｎｙ法により比較した結果を示す。 第１６図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト
血’ｔ？Ｉ由来ヒト血清アルブミンの逆相クロマトグラ
フィーにおけるｚＸ動を比較したものである。 第１７図は、酵母産生正常ヒト血清アルブミンＡとヒト
血清由来ヒト血清アルブミンのハイドロキシアパタイト
クロマトグラフィーにおける挙動を比較した結果を示す
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト血清アルブミンＡのプレプロ配列を酵母により
   効率的に翻訳されるコドンによりコードしているリーダ
   ー配列と該リーダー配列の下流に存在するヒト血清アル
   ブミンＡをコードするｃＤＮＡとを有するＤＮＡ。 ２、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡと該ｃ
   ＤＮＡの下流に存在するポリ（Ａ）配列とを有するＤＮ
   Ａ。 ３、ヒト血清アルブミンＡのプレプロ配列を酵母により
   多用されるコドンによりコードしているリーダー配列、
   ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡ、及びポリ
   （Ａ）配列をこの順序で有するＤＮＡ。 ４、前記リーダー配列が次の式： 【遺伝子配列があります】 で表わされる、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。 ５、酵母で機能し得るプロモーターとターミネーターと
   の間に請求項３に記載のＤＮＡが発現可能な方向に挿入
   されている発現プラスミド。 ６、請求項５に記載の発現プラスミドにより形質転換さ
   れた酵母。 ７、請求項６に記載の酵母を培養し、成熟ヒト血清アル
   ブミンＡを産生・分泌せしめ、これを採取することを特
   徴とする成熟ヒト血清アルブミンＡの製造方法。