JP3570558B2 - Ｄｎａ断片およびそれを含むベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該ベクターを用いる蛋白質の産生方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
組換えＤＮＡ技術を用いて蛋白質を産生させる際に有用なＤＮＡ断片、および当該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを用いた形質転換体、およびこれらを用いた蛋白質の生産方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、生理活性物質等の蛋白質を生産する方法の１つとして、遺伝子工学的技術が広く利用されている。すなわち、目的とする蛋白質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換体の培養混合物から精製するという方法である。近年、より効率的に目的蛋白質を生産させ、最終的な生産量を増加させるための改良が進んでいる。
例えば、宿主として大腸菌を使用する際には以下の方法により目的の蛋白質の発現量を増加させ、最終的な生産量を増加させることが可能になった。すなわち、強力なＳＤ配列を用いることによってリボソームへの会合を起きやすくさせる（Ｊ．Ｓｈｉｎｅ， Ｌ．Ｄａｌｇａｎｏ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１；１３４２， １９７４）、組換えＤＮＡ分子の各菌体あたりのコピー数を増加させる（Ｒ．Ｎａｇａｒａｊａｒａｏ， Ｓ．Ｇ．Ｒｏｇｅｒｓ，；Ｇｅｎｅ，６，；２４７， １９７８）、転写量を増加させる目的で強力なプロモーターを用いる（Ｈ．Ａ．ＤｅＢｏｒｅ，Ｌ．Ｊ．Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，Ｍ．Ｖａｓｓｅｒ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０；２１，１９８０ ）、大腸菌自身に存在するプロテアーゼによる生成した有用な目的とする蛋白質の分解を防ぐためにプロテアーゼ欠損の菌株（例えばｌｏｎ− 株）を用いる（Ｍ．Ｆ．Ｃｈａｒａｔｔｅ，Ｇ．Ｗ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８；４７２８，１９８１ ）（Ｃ．Ｈ．Ｃｈｕｎｇ，Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８；４９３１，１９８１ ）等である。
【０００３】
一方、目的の蛋白質を積極的に宿主細胞外へ分泌発現させる方法も既に開発され、目的蛋白質の生産に応用されている。蛋白質を細胞内から分泌させることにより、目的タンパク質が宿主細胞内で分解されたり修飾されたりすることを回避できる。また、インクルージョンボディーを形成する事を回避できるので蛋白質の精製がより容易になる。目的とする蛋白質を分泌発現させるには、そのＮ末端に２０〜４０アミノ酸程度のシグナルペプチドを融合させた形で発現させる事が必要である。ここでいうシグナルペプチドとは、宿主細胞由来の分泌型蛋白質のシグナルペプチドである。これまでに、種々のシグナルペプチドが蛋白質の分泌発現に使用され、様々なタンパク質の分泌発現が報告されてきた（Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ，；ＥＭＢＯ Ｊ．，１；７７１， １９８２）（渡辺三登利、菊地泰弘、依田幸司、日下巌、山崎真狩、田村学造、日本農芸化学会昭和５９年度大会要旨集 ｐ．４２５ １９８４）。しかしながら、一般に、タンパク質を分泌発現させた場合の生産量は、タンパク質を宿主内に蓄積させた場合の生産量に比べて、かなり低い。そのため、先に述べたようなメリットがあるにも関わらず、分泌発現方法によるタンパク質の生産は、工業的には十分利用されていないのが現状である。
以上のように、遺伝子工学的に蛋白質を生産するための技術は、まだ十分とは言ず、生産量の増加、すなわち、発現量を増加させ、また、分泌発現量を増加させるのための技術の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、形質転換体を使用して遺伝子工学的に目的のタンパク質を産生させる場合に、生産量を増加させるために有用なＤＮＡ断片およびそれを含むベクターを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
生産量を増加させるためには、形質転換体による目的タンパク質の発現量の増加、形質転換体内での目的タンパク質の安定化、もしくは分泌発現量の増加の少なくとも１つ以上が改善されればよい。
本発明者は鋭意研究の結果、驚くべき事に、ある特定のポリペプチドとの融合タンパク質として目的のタンパク質を発現させる事により、目的タンパク質の生産量が極めて増加する事を見いだした。すなわち、所望するタンパク質を特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現させることにより、発現量が増加し、また、宿主体内からの分泌される量が増加する。本発明者らはこれらの知見に基づき、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の態様は、目的蛋白質を特定のポリペプチドとの融合蛋白質として発現させるために使用できる、特定のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を提供する。
【０００７】
本発明第２の態様は、上記ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とするベクターを提供する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、本発明第２の態様のベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様のベクターを使用した所望の蛋白質の産生方法を提供する。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸は、当該分野で慣用されている、以下に示す３文字表記もしくは１文字表記の略号を用いて表される。なお、アミノ酸に関し光学異性体が有り得る場合には、特に明示しない場合は、Ｌ体を表すものとする。更に、特に明示しない場合は、蛋白質のアミノ酸配列の左端および右端は、それぞれＮ末端およびＣ末端である。
【００１１】
Ｇｌｎ または、 Ｑ ： グルタミン残基
Ａｓｐ または、 Ｄ ： アスパラギン酸残基
Ｐｒｏ または、 Ｐ ： プロリン残基
Ｔｙｒ または、 Ｙ ： チロシン残基
Ｖａｌ または、 Ｖ ： バリン残基
Ｌｙｓ または、 Ｋ ： リジン残基
Ｇｌｕ または、 Ｅ ： グルタミン酸残基
Ａｌａ または、 Ａ ： アラニン残基
Ａｓｎ または、 Ｎ ： アスパラギン残基
Ｌｅｕ または、 Ｌ ： ロイシン残基
Ｐｈｅ または、 Ｆ ： フェニルアラニン残基
Ｇｌｙ または、 Ｇ ： グリシン残基
Ｈｉｓ または、 Ｈ ： ヒスチジン残基
Ｓｅｒ または、 Ｓ ： セリン残基
Ｔｈｒ または、 Ｔ ： スレオニン残基
Ｉｌｅ または、 Ｉ ： イソロイシン残基
Ｔｒｐ または、 Ｗ ： トリプトファン残基
Ａｒｇ または、 Ｒ ： アルギニン残基
Ｍｅｔ または、 Ｍ ： メチオニン残基
Ｃｙｓ または、 Ｃ ： システイン残基
【００１２】
本明細書中で使用する核酸の塩基配列は、以下の略号で表される。さらに、特に明示しない限り核酸の塩基配列の左端および右端はそれぞれ５’末端および３’末端である。
【００１３】
Ａ：アデニン
Ｃ：シトシン
Ｇ：グアニン
Ｔ：チミジン
【００１４】
次に、本明細書中で用いられるＸ、Ｊ、Ｙ、Ｚおよびｘ、ｊ、ｙ、ｚの記号について説明する。
本明細書中でＸは下記式１〜８より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８に対応する）を表わし、ｘはそれをコードする塩基配列を表わす。
【００１５】
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
【００１６】
現在の技術を持ってすれば、上記の配列の一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列や、上記配列のＮ末端および／またはＣ末端に、任意のアミノ酸が任意の数付加することは現在の技術を使用すれば可能である。たとえば、式２の配列は式１の配列のＣ末端に１５個のアミノ酸が付加したものである。また、式５、６、７の配列は式１の配列のＣ末端に１個ないし３個のアミノ酸が付加したものである。式３、４、８に示した配列は式１の配列の一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した配列である。目的のタンパク質を、これらの配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として産生させた場合、何れの場合も、式１のポリペプチドとの融合タンパク質として産生させた場合と同様に、目的タンパク質の分泌発現量は増加する。特に、後に記載する実施例２では式３、４、５、６の配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として目的タンパク質を産生させた場合、分泌発現量に与える効果はより大であった。
これらのことを考慮すると、上記式１ないし８のアミノ酸配列に限らず、その一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、Ｎ末端および／またはＣ末端に、任意のアミノ酸を、任意の数、付加もしくは欠損させるなどして得られる配列も、蛋白質の生産量を増加させるために使用できるものと考えられる。したがって、Ｘでしめされるポリペプチドには、上記式１ないし８のアミノ酸配列に、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加が生じたアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００１７】
ｘは、Ｘで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であればいかなる塩基配列であってもよい。すなわち、コドンの縮重を考慮したすべての可能なコドンの組み合わせが含まれる。
ｘのより好ましい具体的な塩基配列は下記式９ないし１５より選ばれる少なくとも１つの配列である（式９〜１５は、それぞれ配列表の配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６に対応する）。
【００１８】
【００１９】
本明細書中でＪはシグナルペプチドのアミノ酸配列を意味し、ｊはそれをコードする塩基配列を意味する。
ここでシグナルペプチドとは、原核生物由来、真核生物由来に関わらずあらゆる種類の分泌蛋白質のシグナルペプチドを意味する。例えば、一般的に使用されているシグナルペプチドには、大腸菌外膜リポ蛋白質（Ｌｐｐ）、大腸菌外膜蛋白質（ＯｍｐＦ）、λファージレセプター蛋白質（ＬａｍＢ）等のシグナルペプチド等がある。本発明でＪで示されるシグナルペプチドは、特に限定されないが、好ましくは大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドがよい。以下に大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドのアミノ酸配列を示した（配列表の配列番号１７に対応する）。
【００２０】
式１７
ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ
【００２１】
ｊが意味する塩基配列は、上記Ｊで示されるシグナルペプチドをコードする塩基配列であればいかなる配列でもよい。周知のように、１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、ｊには、コドンの縮重を考慮した、すべての可能な組み合わせが含まれる。
ｊのより好ましい具体例を以下の式１８に示した（配列表の配列番号１８に対応する）。
【００２２】
【００２３】
本明細書中でＹは化学物質や酵素等によって認識され切断されうるアミノ酸もしくはアミノ酸配列を意味し、ｙはそれをコードする塩基配列を意味する。
目的とする蛋白質が他のタンパク質との融合蛋白として産生されている場合には、他のタンパク質と目的蛋白質を切断分離することが必要になる。このような目的のために、現在、特定のアミノ酸配列部分でポリペプチドを切断する化学物質や酵素が使用されている。例えば、化学物質としては、臭化シアン、酸、２−（２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｂｒｏｍｏｉｎｄｏｌｅｎｉｎｅ（ＢＮＰＳ−ｓｋａｔｏｌｅ）、ヒドロキシルアミン等がある。また、部位特異的切断に用いられる酵素としては、エンテロキナーゼ、トリプシン、血液凝固系第Ｘａ因子、コラゲナーゼ、トロンビン等がある。
【００２４】
Ｙは、このような化学物質や酵素によって認識され切断されるアミノ酸もしくはアミノ酸配列であればいかなるアミノ酸およびアミノ酸配列であってもよい。例えば、臭化シアンによって認識されるＭｅｔ、トリプシンによって認識されるＬｙｓもしくはＡｒｇ、血液凝固第Ｘａ因子によって認識されるアミノ酸配列ＩｌｅーＧｌｕーＧｌｙーＡｒｇ等（バイオトレンド Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．４ ｐ１１１ １９９０ 丸善 参照）、いかなる配列であってもよい。これらのアミノ酸もしくはアミノ酸配列の中から適宜選択する事ができる。ｙが意味する塩基配列は、上記Ｙで示されるアミノ酸またはアミノ酸配列であればいかなる配列でもよい。周知のように１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、ｙには、コドンの縮重を考慮した、すべての可能な組み合わせが含まれる。ｙのより好ましい具体例は、ＭｅｔをコードするＡＴＧおよび、ＦＸａにより認識されるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードする配列である。
【００２５】
本明細書中でＺは目的とする蛋白質のアミノ酸配列を意味し、ｚはそれをコードする塩基配列を意味する。
Ｚが意味する目的蛋白質には、ヒト由来タンパク質に限らず、いかなる由来のタンパク質、いかなる性質および物性のタンパク質が含まれる。例えば、インターロイキン１〜１１、各種コロニー刺激因子、ＴＮＦやＩＦＮα、β、γ等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＦＧＦ等の増殖因子、インスリン等のホルモン、ｔ−ＰＡ等の酵素、もしくはこれらのインヒビターやレセプター、また、コラーゲン等の生体成分等である。Ｚが意味する目的蛋白質は、特に限定されないが、好ましくは、生理活性を有する蛋白質がよく、より好ましくは以下のＰＳＴＩ（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を示す ［Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｒｏｃｈｅｍ． １０２巻、６０７〜６１２頁、１９８７年］ 式１９、ＡＮ６８を示す式２０（特願平４−１１９２８９号）、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを示す式２１（特願平４−２９７３４４号）、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを示す式２２（特願平４−２９７３４４号）の配列を有するタンパク質、もしくは、これらのアミノ酸配列にアミノ酸の置換、付加、欠失が生じてなるアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。これらのタンパク質は、それぞれ記載の公知の物質または特許出願明細書中に詳細に記載されており、これらの特許出願明細書中の記載を引用して本出願の内容とする。
【００２６】
【００２７】
【００２８】
【００２９】
【００３０】
以下に本発明の第１の態様を説明する。
説明で用いるＸ、ｘの示す意味およびそれらの好ましい例については先に説明した通りである。
本発明第１の態様はｘで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片である。本発明のＤＮＡ断片はｘで示される塩基配列に加え、その５’末端や３’末端に制限酵素認識部位や任意のアミノ酸やアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する物であってもよい。例えば、その５’末端に、ｊで示されるシグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、すなわち、Ｊ−Ｘ（例えば配列表、配列番号２３〜３０参照）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片は、本発明第１の態様のＤＮＡ断片として好ましい（例えば配列表、配列番号３１〜３８参照）。また、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、ｊ−ｘ−ｚで示されるＤＮＡ断片も、本発明第１の態様のＤＮＡ断片として好ましい。
また、本発明のＤＮＡ断片はいかなる方法で得られた物であっても良い。例えば化学合成する場合には、目的の塩基配列、およびその相補鎖の塩基配列を有するＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡ断片として設計する。次に各オリゴマーをＤＮＡ合成機（例えばアプライドバイオシステムズ社製、３９２Ａ型）を化学合成し精製する。その後、引き続いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端のリン酸化処理、アニーリング、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等によるライゲーション等の処理をすることにより目的のＤＮＡ断片を得る事ができる。また、プライマーを化学合成により作成して、適当なｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法等を使用して所望の変異を導入しながら得る事もできる。Ｊ−Ｘの好ましいアミノ酸配列の例を配列表の配列番号２３〜３０に示し、ｊ−ｘの好ましい塩基配列の例を配列表の配列番号３１〜３８に示した。
【００３１】
目的タンパク質を、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合、少なくとも、発現量および／または分泌量が増加する。本発明第１の態様のＤＮＡ断片は、組換えＤＮＡ技術を用いて産生させようとする目的の蛋白質を、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質として発現させるために有用であり、すなわち、目的蛋白質を高収率で産生させるために使用できる。
【００３２】
以下に本発明の第２の態様を説明する。
説明の中で使用するＸ，Ｊ，Ｙ，Ｚおよびｘ，ｊ，ｙ，ｚの意味およびそれらの好ましい例については、それぞれ先に説明した通りである。
本発明第２の態様はｘで示される塩基配列を有することを特徴とするベクターである。
ｘで示される塩基配列は、タンパク質の生産量を増加させるために有効なので、本発明のベクターは、蛋白質の発現ベクターを構築する際の材料として使用できる。
【００３３】
本発明のベクターは、好ましくはｘに加えその５’末端にｊで示される配列を有するものがよい。すなわち、ｊ−ｘで表される塩基配列を有するベクターである。蛋白質がＪ−Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合、その蛋白質の分泌発現量は増加する。したがって、ｊ−ｘで示される塩基配列は、少なくとも物質の分泌発現量を増加させるために有用である。ｊ−ｘで示される塩基配列を有するベクターは、物質を分泌発現させるための発現ベクターの構築の際の材料として使用する事ができる。
【００３４】
本発明のベクターは、ｊ−ｘの５’末端および／または３’末端に制限酵素認識部位を有していてもよい。その場合には、当該ｊ−ｘで示される塩基配列を、適当な市販のベクターに組み込んだり、ｊ−ｘの下流に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列を組み込んだりする場合に有用である。
【００３５】
本発明のベクターは、ｊ−ｘの３’末端にｙで示される塩基配列を有するもの、すなわち、ｊ−ｘ−ｙで表される配列を有するものであってもよい。本発明のベクターは、ｊ−ｘ−ｙの５’末端および／または３’末端に制限酵素認識部位を有していてもよい。その場合には、当該ｊ−ｘ−ｙで示される塩基配列を、適当な市販のベクターに組み込んだり、ｊ−ｘ−ｙの下流に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列を組み込んだりする場合に有用である。
【００３６】
本発明のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙで表される配列の３’末端に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列が接続されたものであってもよい。すなわち、ｊ−ｘ−ｚもしくはｊ−ｘ−ｙ−ｚで表される配列をその内部に有するベクターであってもよい。このような場合、化学物質や酵素により認識されるアミノ酸もしくはアミノ酸配列Ｙは、Ｚで示される目的蛋白質のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸もしくはアミノ酸配列であることが好ましく、従って、ｙもそのようなＹをコードする塩基配列がよい。
【００３７】
本発明のベクターはｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚのいずれかで表される配列に加え、その上流および／または下流の任意の位置に、発現に必要な配列や、マーカーとなる配列、リンカー配列等を有していてもよい。例えば、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚの上流に、一つ以上のプロモーター配列、ＳＤ配列を有していてもよいし、上流もしくは下流の任意の位置に、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子もしくはアンピシリン耐性遺伝子を有していてもよい。また、プラスミドのコピー数の増幅を目的として、デヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）の配列等を上流に有していてもよい。
【００３８】
以上に述べた本発明のベクターは、いかなる目的で使用されてもよい。例えば、遺伝子をクローニングするために使用されてもよいし、他のベクターを構築する際の材料として使用されてもよい。
【００３９】
本発明のベクターは自己複製可能なベクターが好ましい。本発明第１の態様でも説明したように、ｘで示される塩基配列は少なくともタンパク質の発現量および／または分泌量を増加させるために有用である。従って、ｘで示される塩基配列を有する本発明のベクターは、好ましくは、タンパク質の発現用に使用されるのがよい。すなわち、本発明のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚのいずれかの配列に加えて、少なくともプロモーター配列を有するものが好ましい。また、より好ましくは、プロモーター配列に加え、オペレーター配列、ＳＤ配列も合わせ持つものが好ましい。
宿主が原核細胞である場合に機能するプロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λファージＰＬ プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｂｌａプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｏｍｐＡプロモーター、ｏｍｐＣプロモーター、ｏｍｐＦプロモーター等がある。宿主細胞が真核細胞である場合に機能するプロモーターの例としては、アクチン遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０のプロモーター、アデノウイルスＩＩのプロモーター、エロンゲーションファクター遺伝子のプロモーター等がある。
本発明のベクターが有するプロモーター配列は特に限定されないが好ましくは、下記〔１〕ないし〔３〕の群より選ばれる少なくとも１つの配列が好ましい。
〔１〕ｔｒｐプロモーター
〔２〕ｔａｃプロモーター
〔３〕ｌａｃプロモーター
【００４０】
本発明の第１の態様のＤＮＡ断片、例えば、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｚ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片は、いずれも公知のＤＮＡ技術で得る事ができる。例えば化学合成したり、適当なＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ法等を使用して変異を導入しながら、作製することも可能である。もちろん、ｊ，ｘ，ｙ，ｚで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を個々に得てライゲーションさせてもよい。ｊで示されるシグナルペプチドは、市販のベクターに適当なものが組み込まれている場合があるので、適当な制限酵素で切断後、分離して得る事ができる。
【００４１】
本発明の第２の態様のベクターはいかなる方法で得られた物であっても良い。例えば、本発明の第２の態様のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ，ｊ−ｘ−ｚ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列およびその相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡ断片を作成して、それを市販のベクターに正しい読みとり枠で組み込む事により得る事ができる。また、適当なプロモーター配列やマーカー配列をもつＤＮＡ断片をそれぞれ作成して、上記配列と共に任意の位置に組み込んでもよい。ベクターにＤＮＡ断片を組み込む方法は公知である（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ａ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ等編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）。使用する市販のベクターの由来は特に限定されず、あらゆる種類のプラスミド、ファージ、ウイルス由来のベクターから適宜選択して使用できる。ベクターの代表的なものを列挙すると、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、λＺａｐＩＩ、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＡｃＮＰＶ、ＹＡＣ、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＥＦＮ−ＩＩ等があげられる。
【００４２】
次に、本発明の第３の態様の形質転換体について説明する。
本発明の第３の態様の形質転換体は、本発明の第２の態様のベクターを宿主となる細胞や微生物に導入する事によって形質転換体とされる。宿主細胞の例としては、大腸菌、枯草菌、酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｓｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞等がある。また、温度感受性株や栄養要求性等、ミュータントも本発明の形質転換体を得るための宿主細胞として使用できる。本発明の形質転換体は、由来は特に限定されないが、しかしながら、好ましくは下記〔１〕ないし〔３〕よりなる群より選ばれる少なくとも１つがよい。
〔１〕大腸菌
〔２〕枯草菌
〔３〕酵母
【００４３】
本発明の形質転換体は、好ましくは、目的とする蛋白質を発現し、産生するものがよい。この場合には、形質転換に使用するベクターはプロモータ等発現に必要な配列を有している事が必要であり、当該発現に必要な配列と宿主細胞とは互いに機能し得るように組み合わせる必要がある。代表的な組み合わせ例としてはＳＶ４０の初期プロモーターを有するベクターとＣＯＳ細胞、トリプトファンプロモーターとトリプトファンＳＤ配列を有するベクターと大腸菌等がある（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック、１９９１年３月２０日発行、羊土社
参照）。
【００４４】
形質転換体の作成方法は公知である（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック、既出、参照）。すなわち、本発明の第２の態様の発現ベクターを、エレクトロポレイション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウムゲル法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いてインフェクションさせる方法等の操作を行った後、薬剤耐性や、酵素要求性、もしくは発現産物等を指標にして、宿主が当該ベクターにより形質転換されたクローンを選択すればよい。
【００４５】
本発明の第３の態様の形質転換体は、本発明の第２の態様のベクターを大量に製造する目的や、目的とする蛋白質を製造するために使用できる。
【００４６】
次に、本発明の第４の態様の所望のタンパク質の産生方法について説明する。説明で用いるＪ、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｊ、ｘ、ｙ、ｚの意味およびそれぞれの好ましい例については、先に説明した通りである。
本発明の第４の態様は、本発明第１の態様のＤＮＡ断片を利用した蛋白質の産生方法、すなわち、本発明の第２の態様のベクターを使用した蛋白質の製造方法である。当該方法では、目的とする蛋白質Ｚを、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚいずれかで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質として発現させる工程を含む事を特徴とする。すなわち、本発明の産生方法において、目的とするタンパク質Ｚは、そのＮ末端に、Ｊ−ＸもしくはＪ−Ｘ−Ｙのアミノ酸配列を有する融合タンパク質として発現されたのち、融合タンパク質として宿主細胞もしくは培地に存在していてもよいし、切断されて、例えばＸ−Ｚ、Ｘ−Ｙ−Ｚ、Ｚのような形で、宿主や培地中に存在していてもよい。またこのような融合蛋白質の形で単離・精製されてもよい。
【００４７】
以下に本発明の産生方法の工程の一例を説明する。
当該産生方法は、例えば、下記ａ）からｆ）の工程を順次行えばよい。
ａ）ｊ−ｘ−ｚもしくはｊ−ｘ−ｙ−ｚで表されるＤＮＡ断片を有する発現ベクターを得る。
ｂ）ａ）で得た発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換する。
ｃ）得られた形質転換体を培養し必要な場合は導入した遺伝子の発現を誘導する。
ｄ）得られた形質転換体の培養上清中および／あるいは、形質転換体そのものから、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を回収し精製する。
ｅ）得られた融合タンパク質より、目的とする蛋白質Ｚを単離精製する。
【００４８】
上記ａ）の発現ベクターは本発明第２の態様のベクターであって、発現に必要な塩基配列を有するベクターである。当該ベクターを得るための方法は本発明第２の態様で説明した。ｂ）の工程では形質転換体を作製するが、ここで用いる宿主細胞はａ）で得られた発現ベクターが機能し得るような宿主細胞である。形質転換の方法は、本発明第３の態様で説明した通りである。
【００４９】
上記ｃ）の工程では形質転換体を培養するが、培養方法は宿主細胞に応じた公知方法で行えばよい（例えば、生物化学工学、合葉修一等、１９７６年、東京大学出版会および微生物遺伝学実験法 ｐ９６〜１１５、石川辰夫編 共立出版１９８２年参照）。通常、大腸菌であればＬ−ブロース培地やＭ９培地（カザミノ酸含有）を培地として、３７℃にて１〜２日間ジャーファーメンターにて培養する。枯草菌の場合はＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ、Ｄｉｆｃｏ社）プレートやＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ｎｏ．３、 Ｄｉｆｃｏ社）等を培地とし、３０℃〜３５℃にて１〜２日間培養する。また、酵母であれば８％ショ糖を含むＹＰ培地を用い、２８℃にて約１〜２日間培養する。
近年では、目的蛋白質の分泌発現量を増加させる目的で形質転換体を低温（約２０℃〜２５℃）で培養する方法も確立されているので、必要に応じて低温培養を行っても良い。このように、蛋白質の生産量を増加させるための工夫がされた培養方法と本発明の産生方法を組み合わせれば、目的蛋白質の最終的な生産量はより高くなる事が予想される。
【００５０】
また、産生誘導刺激の必要性およびその方法は、導入された組換えＤＮＡ分子の持つプロモーターの種類によって決定される。例えば、導入されたプロモーターがトリプトファンプロモーターであれば、Ｍ９培地（最小必須培地）を使用し、３β−インドールアクリル酸を添加して産生誘導刺激を行う。すなわち、本発明の製造方法においては産生誘導刺激は形質転換に使用した発現ベクターや形質転換体に応じた方法で行えば良い。
【００５１】
上記ｄ）の工程では、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を回収、精製する。通常シグナルペプチドを有するタンパク質は、細胞から培養上清中に分泌されるが、宿主細胞内にインクルージョンボディーとして蓄積されることもある。
培養上清より回収するには、培養上清もしくはその濃縮液をスターティングマテリアルとして精製を行う。また、目的の蛋白質がペリプラズムに蓄積される場合は、Ｗｉｌｌｓｋｙ等の方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．ｐｐ５９５ １９７６）等で蛋白質を回収後精製する。細胞内に蓄積された融合タンパク質を回収するには、リゾチーム、界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破壊した後、遠心分離、濾過等の方法により抽出する。その後リフォールディング処理を行い（例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ８７巻、５６３ー５７７頁、１９７４年参照）、更に精製すればよい。
【００５２】
通常行われるタンパク質の精製方法としては、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等がある。したがって、工程ｄ）においても、目的とする融合タンパク質を、その分子量や生理活性を指標として、通常使用され得る精製方法を適宜組み合わせ、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して行えば良い。
【００５３】
工程ｅ）では、得られた融合タンパク質から、目的とする蛋白質Ｚを単離精製する。工程ｄ）で培養上清もしくはペリプラズムから融合タンパク質を回収している場合には、Ｊで表されるシグナルペプチド部分は既に切断されている場合が多いので、融合タンパク質からＸもしくはＸ−Ｙで表される部分を切断除去すればよい。また、細胞内より回収している場合にはＪ−Ｘ、もしくはＪ−Ｘ−Ｙで表される部分を切断除去する。
切断除去には、特定のアミノ酸もしくはアミノ酸配列（融合タンパク質がＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表される場合には、Ｙで示されるアミノ酸もしくは表されるアミノ酸配列）を認識して、それと反応し、結果的にポリペプチド鎖を切断する効果を有する化学物質や酵素を使用する。ここで用いる化学物質や酵素は特に限定されないが、目的とする蛋白質Ｚの活性を失わないような物質を選択する事が必要である。目的とする蛋白質Ｚは、そのアミノ酸配列を完全に有した形で切断単離されるのが好ましいが、その活性や特性を失わない範囲であれば、化学物質等の処理によりそのＮ末端側やＣ末端側の一部が欠失される事があってもかまわない。また、同様に、目的とする蛋白質ＺのＮ末端側に、ＸやＹに由来するペプチド断片が存在していてもかまわない。
いうまでもないが、形質転換体によりＪ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚとして発現された融合蛋白質から、余分なＪーＸやＪ−Ｘ−Ｙが宿主細胞自身によって除去されるような場合には化学物質や酵素を用いての切断処理は必要ない。
【００５４】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらによって、何等、限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。なお、実施例中の諸操作は、下記の雑誌、成書を参考として実施した。
【００５５】
１．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐｅｒｂａｌ著、１９８４年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．
２．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐｅｒｂａｌ著、１９８７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．
３．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、１９８０年、講談社
４．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、１９８２年、講談社
５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等編、１９８２年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
６．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６５巻、Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ 等編、１９８０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
７．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６８巻、Ｒ． Ｗｕ 編、１９７９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
８．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 、ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、 Ｍｉｃｈａｄｅｌ Ａ． Ｉ 等編、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等編、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
１０．実験医学別冊、細胞工学的技術総集編、１９８９年、羊土社
１１．実験医学別冊、遺伝子工学ハンドブック、１９９１年、羊土社
【００５６】
実施例１．プラスミドｐＫＫ２２３Ｍの作成
ｊ−ｘで示される塩基配列を有するベクターであって、ｊとして前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、ｘとして前記式９の塩基配列を有するプラスミドｐＫＫ２２３Ｍを以下の方法で作成した。
まず、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ にて二重消化し、得られたＤＮＡ断片混合物を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片をジエチルアミノエチルセルロ−ス紙（以後、ＤＥＡＥセルロース紙と略す）に吸着させ、残りのＤＮＡ断片と分離した。さらに、ＤＥＡＥセルロース紙を高濃度塩溶液（２Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて洗浄し、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥセルロース紙より回収した。
まず、図１の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント１ａ）を、４つの断片に分けて設計した。これら４つの断片のうち、Ｓ２、Ｓ３をＡＴＰの存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化した。続いて、オリゴヌクレオチドＳ１とＳ３およびＳ２とＳ４をそれぞれアニーリングさせた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を使用してライゲーションした。ライゲーション後のサンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、調製した。
次に、前記約４．５ｋｂのＤＮＡ断片と約１２０ｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望のアンピシリン耐性コロニーを分離した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＫＫ２２３Ｍと命名した（図２参照）。
【００５７】
実施例２．プラスミドｐＭ４７４の作成
本発明のプラスミドｐＭ４７４を以下の方法で作成した。当該プラスミドは、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示されるＰＳＴＩの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドである。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：式９の塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ＰＳＴＩをコードする塩基配列
【００５８】
〔１〕ｐＭ４７４の作成
プラスミドｐＭ４６３（ＫＡＮＡＭＯＲＩ Ｔ．等、ＧＥＮＥ、６６巻、２９５ー３００頁、１９８８年、図３参照）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＮｒｕＩにて二重消化し、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。
一方、ＳＤ配列、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列、式１のアミノ酸配列をコードする塩基配列およびＰＳＴＩのＮ末端側のアミノ酸配列の一部をコードする塩基配列から成るＤＮＡ断片を、６つの断片に分割して設計した（フラグメントＡ、図４参照）。実施例１の要領で化学合成し、最終的に、約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、調製した。前記約３．４ｋｂのＤＮＡ断片と約１４０ｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望のアンピシリン耐性コロニーを分離した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＭ４７４を得た。
プラスミドｐＭ４７４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＢａｍＨＩで二重消化し、目的とするサイズ約３００ｂｐの断片を抽出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（ＤＮＡシークエンサー３７０Ａ、アプライドバイオシステムズ社）を使用して、シークエンシングを行った。
プラスミドｐＭ４７４のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図５に示した（配列表の配列番号１９参照）
【００５９】
〔２〕分泌発現量の比較
本発明のプラスミドｐＭ４７４を使用した場合のＰＳＴＩ分泌発現量を、プラスミドｐＭ４６３（既出）を使用した場合のそれと比較した。プラスミドｐＭ４６３には、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に、直接、ＰＳＴＩをコードする塩基配列が組み込まれている。
まず、ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．著、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ． Ｃｏｌｉ、 Ｉｎ： ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｖｏｌ １， Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ． Ｍ． （ｅｄ．），１０９−１３６頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ 、１９８５年）により、プラスミドｐＭ４６３とｐＭ４７４でそれぞれｌｏｎ−株の大腸菌ＧＣ４６７０（ｌｏｎ：Ｔｎ１０ ｔｈｒ，ｌｅｕ，ｌａｃＹ）を形質転換し、大腸菌ＧＣ４６７０（ｐＭ４６３）およびＧＣ４６７０（ｐＭ４７４）を作製した。それぞれを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロース５ｍｌにて終夜培養後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸２％を含むＭ９ＣＡ培地５０倍量に、この培養液を植菌し、３７℃にて約１時間培養した。培地に終濃度１０μｇ／ｍｌの３β−インドールアクリル酸（和光純薬工業株式会社製）を添加し、さらに１６時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離器（ＣＲ２０Ｂ３、日立工機株式会社製）を使用して、遠心分離し、上清を回収した。
それぞれの培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その結果、ｘで示される塩基配列を有しているプラスミドｐＭ４７４で、極めて高い分泌発現量が確認された。以下に結果を示す。
【００６０】
【００６１】
実施例３．
ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有するポリペプチドＡＮ６８の発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドを、以下の〔２〕ないし〔９〕の方法で作成した。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：前記式９ないし１２いずれかの塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ポリペプチドＡＮ６８をコードする塩基配列
また、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に直接、ポリペプチドＡＮ６８をコードする塩基配列が組み込まれたプラスミドｐＭ５９４を〔１〕の方法で作成した。
【００６２】
〔１〕プラスミドｐＭ５９４の作成
ｐＭ５９４をプラスミドｐＭ５５２（特願平３−３２５２２０号明細書参照）から以下のように作成した。プラスミドｐＭ５５２は、下記式２３のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわち、下記式２４の塩基配列）を、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に有し、トリプトファンプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドである（図６、微工研条寄第３５６１号）。
【００６３】
【００６４】
【００６５】
まず、第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてＨｉｎｄＩＩＩ プライマー（図７）、ＡＮ６８プライマー（図８）を、おのおの化学合成し、これらをプライマーとして、プラスミドｐＭ５５２を鋳型とする第一次ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ジーンアンプキットＲ （宝酒造株式会社）を用いて行い、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、３分間を１サイクルとする反応を、３０サイクル繰り返した。第一次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とする、サイズ約１３０ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノール処理／エタノール沈殿で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これをセンスプライマーとして、プラスミドｐＭ５５２を鋳型とする第二次ＰＣＲを第一次ＰＣＲと同様に行なった。なお、アンチセンスプライマーとしては、ｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマー（図９）を化学合成して使用した。
第二次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノール処理／エタノール沈殿にて精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＢａｍＨＩで消化し、サイズ約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
プラスミドｐＭ４６３（既出）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＢａｍＨＩにて二重消化し、サイズ約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、上記ＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＭ５９４を得た。
【００６６】
〔２〕ｐＭ７１０の作製
図１０の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント１ｂ）を５つの断片に分割して設計し、実施例１の要領で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７１０を作製した。
プラスミドｐＭ７１０のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図１１に示した（配列表の配列番号２０参照）
【００６７】
〔３〕ｐＭ７７６の作製
図１２の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント２）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７６を作製した。
【００６８】
〔４〕ｐＭ７７７の作製
図１３の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント３）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７７を作製した。
【００６９】
〔５〕ｐＭ７７８の作製
図１４の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント４）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７８を作製した。
【００７０】
〔６〕ｐＭ７７９の作製
図１５の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント５）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７９を作製した。
【００７１】
〔７〕ｐＭ７８０の作製
図１６の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント６）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７８０を作製した。
【００７２】
〔８〕ｐＭ７８１の作製
図１７の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント７）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７８１を作製した。
【００７３】
〔９〕ｐＭ７１１の作製
図１８の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント８）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７１１を作製した。
【００７４】
〔１０〕分泌発現量の比較
〔１〕ないし〔９〕で得られたプラスミドを使用して、実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７６）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７７）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７８）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７９）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７８０）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７８１）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７１１）を得た。これらをそれぞれ培養して培養混合物を回収した。それぞれの培養混合物を遠心分離器を使用して、遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法で培養上清中のトリプシン阻害活性を測定した。測定結果を以下に示す。ｘで示される塩基配列を有するプラスミドにおいて、プラスミドｐＭ５９４と比較して極めて高い分泌発現量が得られた。本発明のベクターを使用し、ポリペプチドＡＮ６８をＸで示されるアミノ酸配列との融合蛋白として発現させることにより、分泌発現量が極めて低いＡＮ６８の分泌発現量が増加したことが確認された。
【００７５】
【００７６】
〔１１〕菌体内発現量の比較
〔１〕で得られた形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）および〔２〕で得られたＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）を培養し、培養混合物を回収した。分光光度計を使用して、波長５５０ｎｍの吸光度を測定したところＯＤ１６であった。この培養混合物６．３μｌ相当分を遠心分離し、ペレットを回収した。これに、終濃度が１５％グリセロール／０．００２５％ＢＰＢ／０．０６３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／２％ＳＤＳ／５％ β−メルカプトエタノールとなるように泳動バッファー１０μｌを加えた。全量を、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） の方法（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ． Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７巻、６８０−６８５ 頁、１９７０年）を参考にして、以下の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に供した。分子量マーカーとしては、ＢＲＬ社製のサイズ４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、６．２ｋＤのマーカーを使用した。
泳動終了後、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０にて染色を行なった。
その結果、ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）に比べ、ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）の方が明らかに、発現量が高い事が確認された（図１９）。
【００７７】
実施例４．プラスミドｐＭ７２７の作成
ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有する、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドを、以下の方法で作成した。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：前記式９の塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ
【００７８】
〔１〕プラスミドｐＭ７４８の構築
プラスミドｐＭ７１０を鋳型とし、２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、化学合成して得たＹ４６Ｄプライマー（図２０）を、アンチセンスプライマーとしてはｐＢＲＢａｍＨＩプライマーを使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約１２０ｂｐのバンドが認められた。この増副産物をアンチセンスプライマーとし、ＨｉｎｄＩＩＩ プライマーをセンスプライマーとして、プラスミドｐＭ７１０を鋳型とする第二次ＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領でプラスミドｐＭ４６３に組み込み、プラスミドｐＭ７４８を作製した。
【００７９】
〔２〕プラスミドｐＭ７２７の構築
プラスミドｐＭ７４８を鋳型として、２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてはＨｉｎｄＩＩＩ プライマーを、アンチセンスプライマーとしてはＱ１９Ｋプライマー（図２１）を化学合成し使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約２１０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をセンスプライマーとし、ｐＢＲＢａｍＨＩプライマーをアンチセンスプライマーとし、プラスミドｐＭ７４８を鋳型とする第二次ＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領で、プラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ７２７を作製した。
プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図２２に示した（配列表の配列番号２１参照）。
【００８０】
〔３〕分泌発現量の測定
実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を作成し、培養した。培養混合物を回収して遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その結果、培養上清中のトリプシン阻害活性は１１７Ｕ／ｍｌであり、比活性から算出したタンパク質量を求めると約１４μｇ／ｍｌであった。本発明のベクターを使用しない場合と比較して、明らかに高い分泌発現量が得られたことから、本発明のベクターを使用してポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６ＤをＸで示されるアミノ酸配列との融合蛋白質として発現させることにより、本来分泌発現しにくいＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの分泌発現量が増加することが確認された。
【００８１】
実施例５．プラスミドｐＭ７６５の作成
〔１〕プラスミドｐＭ７６５を以下の方法で作成した。プラスミドｐＭ７６５は、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有する、ポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するものである。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：前記式９なの塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ
【００８２】
プラスミドｐＭ７２７を鋳型として２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてはＨｉｎｄＩＩＩプライマーを、アンチセンスプライマーとしては、化学合成して得たＲ１１Ｓプライマー（図２３）を使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約１８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をセンスプライマーとし、ｐＢＲＢａｍＨＩプライマーをアンチセンスプライマーとして、プラスミドｐＭ７２７を鋳型とする第二次ＰＣＲを行った。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが確認された。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領でプラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ７６５を作製した。
プラスミドｐＭ７６５のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図２４に示した（配列表の配列番号２２参照）。
【００８３】
〔２〕分泌発現量の測定
実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）を作成し、培養した。培養混合物を回収して遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その結果、培養上清中のトリプシン阻害活性は４６０Ｕ／ｍｌであり、比活性から算出したタンパク質量を求めると約７５μｇ／ｍｌであった。本発明のベクターを使用しない場合と比較して、明らかに高い分泌発現量が得られ、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質として発現させることにより、分泌量が増加することが確認された。
【００８４】
実施例６．プラスミドｐＭ７６５を利用したポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産
〔１〕プラスミドｐＭ７６５を用い、実施例２の要領で大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）〔本願発明者によって、平成５年４月２８日、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８５として寄託されている〕を作製し、培養した。得られた培養混合物をＢｅｎｃｈｍａｒｋＧＸ（メンブレックス（Ｍｅｍｂｒｅｘ）社、孔径０．２μｍ）を使用して濃縮後、４℃にて、約１００００×ｇ、２０分間遠心分離を行い菌体を回収した。
【００８５】
〔２〕〔１〕で得られた菌体を破砕用溶液（０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、ミニラボ（ＲＡＮＮＩＥ社）を使用し、８００ｂａｒで加圧破砕した。その後、４℃、２０分間、約１００００×ｇで遠心分離し、ペレットを回収した。回収したペレットに破砕用溶液を添加し、再び、４℃、２０分間、約１００００×ｇで遠心分離した。この操作を更に２回行い、ペレットを回収した。回収したペレットに可溶化バッファー（５Ｍグアニジン塩酸，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ 還元型グルタチオン，０．０２ｍＭ 酸化型グルタチオン）を加え、更に、終濃度５０ｍＭとなるように２−メルカプトエタノールを添加し、４℃にて終夜撹拌した。この溶液を限外濾過膜（ＹＭ−５、グレースジャパン社）を使用して濃縮した後、孔径０．４４μｍのフィルターを使用して濾過した。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ ＨＲ（ファルマシア社製）を充填したカラム（５ｃｍφ×９５ｃｍ）を、前述の可溶化バッファーで平衡化し、これに濃縮濾液を添加した。前述の可溶化バッファーを展開液とし、波長２８０ｎｍにおける吸光度を指標として蛋白質含量をモニターしながら、流速３．５ｍｌ／分でゲル濾過を行った。３０ｍｌずつ分取し、各画分の一部を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＡＧＥＬＲ （ＳＰＵ−１５Ｓ、アトー社）を使用し、その使用説明書に従って行った。クマシーブリリアントブルーで染色し、目的の分子量のポリペプチドを多く含む画分を選択した。この画分の蛋白質含量がほぼ０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、可溶化バッファーを使用して調整し、リフォールディング処理用サンプルとした。
【００８６】
〔３〕〔２〕で得たリフォールディング処理用サンプルを、〔２〕で使用した可溶化バッファーからグアニジン塩酸を除いた溶液、約１５倍量に対し、２回透析した。次いで、約１５倍量の蒸留水に対して３回透析を行った。透析終了後、塩酸を使用してサンプルをｐＨ２に調整した。このサンプルについて以下のように精製を行った。
【００８７】
〔４〕予め０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化したＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、ポリマーラボラトリーズ社製）に、〔３〕で得たリフォールディング処理後のサンプルを添加し、０．１％ＴＦＡ溶液を用いて吸着させた。溶出は、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配（０−７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３０分、７０−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３分）により、流速５ｍｌ／分で、波長２８０ｎｍにおける吸光度をモニターしながら溶出を行い、５ｍｌずつ分取した。各画分のトリプシン阻害活性を、後述の方法で測定し、活性の認められた画分を凍結乾燥後、７０％蟻酸におよそ１００μＭとなるように溶解した。次いで、モル濃度比で２０００倍量となるように臭化シアンを加え、２５℃、２４時間暗所に静置した。これに蒸留水を加えて２倍希釈した。
【００８８】
〔５〕ＳＰ−トヨパール（３０ｍｍφ×１５０ｍｍ、東ソー株式会社）を１０％蟻酸溶液で平衡化した後、ＦＰＬＣシステム（既出）を用いて以下の方法で陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。すなわち、〔４〕で得られたサンプルをＳＰ−トヨパールに添加し、１０％蟻酸溶液を用いて吸着させた。ＮａＣｌ／１０％蟻酸を使用し、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０−１．２Ｍ ＮａＣｌ／１０％ 蟻酸溶液／１００分間）により、流速８ｍｌ／分で、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出した。３２ｍｌずつ分取し、各画分のトリプシン阻害活性を後述の方法で測定した。得られた活性画分を〔３〕の逆相クロマトグラフィー用サンプルとした。
【００８９】
〔６〕ＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、既出）を０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化した後、〔５〕で得られた活性画分を添加し、０．１％ＴＦＡ溶液を用いて吸着させた。溶出は０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を用い、アセトアニリルの直線濃度勾配（０−７０％／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／１５分、７０−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３分）により流速１０ｍｌ／分で行った。波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出を行い、ピークごとに分取し、各画分のトリプシン阻害活性を実施例８の方法で測定した。得られた活性画分を凍結乾燥して、精製標品を得た。
【００９０】
〔７〕〔６〕で得られた精製標品をＰＡＧＥＬＲ（既出）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。銀染色の結果、単一のバンドが認められた。
【００９１】
〔８〕アミノ酸配列の分析
〔６〕で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０Ａ ＰＴＨアナライザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いてアミノ酸配列の分析を行なった。ＰＴＨアミノ酸を２７０ｎｍの紫外部吸収にて検出して、その保持時間を測定し、予め同一の方法で分離した標準ＰＴＨアミノ酸（アプライドバイオシステムズ社）の保持時間を基準にしてアミノ酸の同定を行なった。その結果、目的とするタンパク質、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄが精製されたことが確認された。
【００９２】
実施例７．プラスミドｐＭ７２７を利用したポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産
〔１〕プラスミドｐＭ７２７を用い、実施例２の要領で大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を作製し、培養した。培養上清を回収して、６ＮのＨＣｌを加えてｐＨ２に調製した。孔径１．０μｍのフィルター（日本ポール社製）を使用して濾過した。濾液を、更に、ＣＮカートリッジ（孔径０．２２μｍ、ミリポア社製）を使用して濾過した。
【００９３】
〔２〕ＳＰ−トヨパール（５５０Ｃ、東ソー株式会社）を５０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で平衡化した後、〔１〕で得られた濾液を添加した。５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ３．０）で洗浄後、５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ５．０）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出した。各画分のトリプシン阻害活性を実施例８の方法で測定した。得られた活性画分を、分画分子量３０００の限外濾過膜（フィルトロン、富士フィルター社製）にて濃縮後、孔径０．２２μｍのフィルターを使用して沈澱を除去した。上清を回収して、以下のゲル濾過を行った。
【００９４】
〔３〕Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（２６ｍｍφ×６００ｍｍ、ファルマシア社製）を ５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で平衡化し、〔２〕で得られた上清を添加した。５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら、流速２ｍｌ／分で溶出を行った。６ｍｌごとに分取し、各画分のトリプシン阻害活性を後述の方法で測定した。得られた活性画分を凍結乾燥した。
【００９５】
〔４〕〔３〕で得た凍結乾燥品を、実施例６〔４〕、〔５〕、〔６〕の方法に準じて臭化シアン分解および精製した。得られた精製標品を実施例６〔７〕の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに共したところ単一のバンドが確認された。実施例６〔８〕の方法でアミノ酸分析を行った結果、目的とするタンパク質、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄであることが確認された。
トリプシン阻害活性の測定
培養混合物を遠心分離して得た培養上清に０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を加えて段階希釈し、ウシトリプシン阻害活性測定用のサンプルとした。これらの活性測定用サンプルのウシトリプシン阻害活性を、合成基質Ｓ−２４４４（第一化学薬品株式会社製）を基質として、カッセル（Ｋａｓｓｅｌｌ）の方法（Ｋａｓｓｅｌｌ Ｂ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９巻、８４４−８５２頁、１９７０年）に準じて以下のように測定した。
すなわち、まず、ウシトリプシン（Ｔｙｐｅ ＸＩＩＩ、シグマ社製）を、０．００１ＭＨＣｌに溶解し、１３６００ＢＡＥＥＵ／ｍｌに調製し、それを、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）にて希釈し、０．６ＢＡＥＥＵ／ｍｌのトリプシン溶液を調製した。一方、合成基質Ｓ−２４４４を蒸留水に溶解し、２ｍＭのＳ−２４４４溶液を調製した。
次に、上述のウシトリプシン阻害活性測定用サンプル１００μｌもしくはコントロールを、ウシトリプシン溶液１００μｌと混合した。３７℃にて１０分間静置した後、上記Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加え、反応を開始させた。３７℃にて２０分間反応後、５０％酢酸５０μｌを加えて反応を停止させ、分光光度計にて、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、データ処理の際に、ここで用いた各種溶液の吸光度への影響を差し引くための対照としては、上記ウシトリプシン溶液１００μｌに、予め、５０％酢酸５０μｌを加え、ウシトリブシン阻害活性測定用サンプルもしくはコントロール１００μｌ、Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加えたものを使用した。
【００９６】
【発明の効果】
組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を生産する際に、本発明のＤＮＡ断片を有する本発明のベクターを用いて、所望のタンパク質を特定のポリペプチドの融合タンパク質として発現させると、所望のタンパク質の発現量および／または宿主体内からの分泌量が増加する。
したがって、本発明は、組換えＤＮＡ技術で所望のタンパク質を生産する際のタンパク質の生産量を増加させ、また、本来分泌発現しにくいようなタンパク質の分泌発現を可能にする。
【００９７】
【配列表】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】フラグメント１ａの塩基配列を示す図。
【図２】プラスミドｐＫＫ２２３Ｍを示す図。
【図３】プラスミドｐＭ４６３を示す図。
【図４】フラグメントＡの塩基配列を示す図。
【図５】プラスミドｐＭ４７４のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【図６】プラスミドｐＭ５５２を示す図。
【図７】ＨｉｎｄＩＩＩ プライマーの塩基配列を示す図。
【図８】ＡＮ６８プライマーの塩基配列を示す図。
【図９】ｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーの塩基配列を示す図。
【図１０】フラグメント１ｂの塩基配列を示す図。
【図１１】プラスミドｐＭ７１０のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【図１２】フラグメント２の塩基配列を示す図。
【図１３】フラグメント３の塩基配列を示す図。
【図１４】フラグメント４の塩基配列を示す図。
【図１５】フラグメント５の塩基配列を示す図。
【図１６】フラグメント６の塩基配列を示す図。
【図１７】フラグメント７の塩基配列を示す図。
【図１８】フラグメント８の塩基配列を示す図。
【図１９】形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）の菌体より得られた蛋白質のＳＤＳーＰＡＧＥの結果を示す図。
【図２０】Ｙ４６Ｄプライマーの塩基配列を示す図。
【図２１】Ｑ１９Ｋプライマーの塩基配列を示す図。
【図２２】プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【図２３】Ｒ１１Ｓプライマーの塩基配列を示す図。
【図２４】プラスミドｐＭ７６５のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【産業上の利用分野】
組換えＤＮＡ技術を用いて蛋白質を産生させる際に有用なＤＮＡ断片、および当該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターを用いた形質転換体、およびこれらを用いた蛋白質の生産方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、生理活性物質等の蛋白質を生産する方法の１つとして、遺伝子工学的技術が広く利用されている。すなわち、目的とする蛋白質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換体の培養混合物から精製するという方法である。近年、より効率的に目的蛋白質を生産させ、最終的な生産量を増加させるための改良が進んでいる。
例えば、宿主として大腸菌を使用する際には以下の方法により目的の蛋白質の発現量を増加させ、最終的な生産量を増加させることが可能になった。すなわち、強力なＳＤ配列を用いることによってリボソームへの会合を起きやすくさせる（Ｊ．Ｓｈｉｎｅ， Ｌ．Ｄａｌｇａｎｏ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１；１３４２， １９７４）、組換えＤＮＡ分子の各菌体あたりのコピー数を増加させる（Ｒ．Ｎａｇａｒａｊａｒａｏ， Ｓ．Ｇ．Ｒｏｇｅｒｓ，；Ｇｅｎｅ，６，；２４７， １９７８）、転写量を増加させる目的で強力なプロモーターを用いる（Ｈ．Ａ．ＤｅＢｏｒｅ，Ｌ．Ｊ．Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，Ｍ．Ｖａｓｓｅｒ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０；２１，１９８０ ）、大腸菌自身に存在するプロテアーゼによる生成した有用な目的とする蛋白質の分解を防ぐためにプロテアーゼ欠損の菌株（例えばｌｏｎ− 株）を用いる（Ｍ．Ｆ．Ｃｈａｒａｔｔｅ，Ｇ．Ｗ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８；４７２８，１９８１ ）（Ｃ．Ｈ．Ｃｈｕｎｇ，Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８；４９３１，１９８１ ）等である。
【０００３】
一方、目的の蛋白質を積極的に宿主細胞外へ分泌発現させる方法も既に開発され、目的蛋白質の生産に応用されている。蛋白質を細胞内から分泌させることにより、目的タンパク質が宿主細胞内で分解されたり修飾されたりすることを回避できる。また、インクルージョンボディーを形成する事を回避できるので蛋白質の精製がより容易になる。目的とする蛋白質を分泌発現させるには、そのＮ末端に２０〜４０アミノ酸程度のシグナルペプチドを融合させた形で発現させる事が必要である。ここでいうシグナルペプチドとは、宿主細胞由来の分泌型蛋白質のシグナルペプチドである。これまでに、種々のシグナルペプチドが蛋白質の分泌発現に使用され、様々なタンパク質の分泌発現が報告されてきた（Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ，；ＥＭＢＯ Ｊ．，１；７７１， １９８２）（渡辺三登利、菊地泰弘、依田幸司、日下巌、山崎真狩、田村学造、日本農芸化学会昭和５９年度大会要旨集 ｐ．４２５ １９８４）。しかしながら、一般に、タンパク質を分泌発現させた場合の生産量は、タンパク質を宿主内に蓄積させた場合の生産量に比べて、かなり低い。そのため、先に述べたようなメリットがあるにも関わらず、分泌発現方法によるタンパク質の生産は、工業的には十分利用されていないのが現状である。
以上のように、遺伝子工学的に蛋白質を生産するための技術は、まだ十分とは言ず、生産量の増加、すなわち、発現量を増加させ、また、分泌発現量を増加させるのための技術の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、形質転換体を使用して遺伝子工学的に目的のタンパク質を産生させる場合に、生産量を増加させるために有用なＤＮＡ断片およびそれを含むベクターを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
生産量を増加させるためには、形質転換体による目的タンパク質の発現量の増加、形質転換体内での目的タンパク質の安定化、もしくは分泌発現量の増加の少なくとも１つ以上が改善されればよい。
本発明者は鋭意研究の結果、驚くべき事に、ある特定のポリペプチドとの融合タンパク質として目的のタンパク質を発現させる事により、目的タンパク質の生産量が極めて増加する事を見いだした。すなわち、所望するタンパク質を特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現させることにより、発現量が増加し、また、宿主体内からの分泌される量が増加する。本発明者らはこれらの知見に基づき、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の態様は、目的蛋白質を特定のポリペプチドとの融合蛋白質として発現させるために使用できる、特定のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を提供する。
【０００７】
本発明第２の態様は、上記ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とするベクターを提供する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、本発明第２の態様のベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様のベクターを使用した所望の蛋白質の産生方法を提供する。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸は、当該分野で慣用されている、以下に示す３文字表記もしくは１文字表記の略号を用いて表される。なお、アミノ酸に関し光学異性体が有り得る場合には、特に明示しない場合は、Ｌ体を表すものとする。更に、特に明示しない場合は、蛋白質のアミノ酸配列の左端および右端は、それぞれＮ末端およびＣ末端である。
【００１１】
Ｇｌｎ または、 Ｑ ： グルタミン残基
Ａｓｐ または、 Ｄ ： アスパラギン酸残基
Ｐｒｏ または、 Ｐ ： プロリン残基
Ｔｙｒ または、 Ｙ ： チロシン残基
Ｖａｌ または、 Ｖ ： バリン残基
Ｌｙｓ または、 Ｋ ： リジン残基
Ｇｌｕ または、 Ｅ ： グルタミン酸残基
Ａｌａ または、 Ａ ： アラニン残基
Ａｓｎ または、 Ｎ ： アスパラギン残基
Ｌｅｕ または、 Ｌ ： ロイシン残基
Ｐｈｅ または、 Ｆ ： フェニルアラニン残基
Ｇｌｙ または、 Ｇ ： グリシン残基
Ｈｉｓ または、 Ｈ ： ヒスチジン残基
Ｓｅｒ または、 Ｓ ： セリン残基
Ｔｈｒ または、 Ｔ ： スレオニン残基
Ｉｌｅ または、 Ｉ ： イソロイシン残基
Ｔｒｐ または、 Ｗ ： トリプトファン残基
Ａｒｇ または、 Ｒ ： アルギニン残基
Ｍｅｔ または、 Ｍ ： メチオニン残基
Ｃｙｓ または、 Ｃ ： システイン残基
【００１２】
本明細書中で使用する核酸の塩基配列は、以下の略号で表される。さらに、特に明示しない限り核酸の塩基配列の左端および右端はそれぞれ５’末端および３’末端である。
【００１３】
Ａ：アデニン
Ｃ：シトシン
Ｇ：グアニン
Ｔ：チミジン
【００１４】
次に、本明細書中で用いられるＸ、Ｊ、Ｙ、Ｚおよびｘ、ｊ、ｙ、ｚの記号について説明する。
本明細書中でＸは下記式１〜８より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８に対応する）を表わし、ｘはそれをコードする塩基配列を表わす。
【００１５】
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
【００１６】
現在の技術を持ってすれば、上記の配列の一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列や、上記配列のＮ末端および／またはＣ末端に、任意のアミノ酸が任意の数付加することは現在の技術を使用すれば可能である。たとえば、式２の配列は式１の配列のＣ末端に１５個のアミノ酸が付加したものである。また、式５、６、７の配列は式１の配列のＣ末端に１個ないし３個のアミノ酸が付加したものである。式３、４、８に示した配列は式１の配列の一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した配列である。目的のタンパク質を、これらの配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として産生させた場合、何れの場合も、式１のポリペプチドとの融合タンパク質として産生させた場合と同様に、目的タンパク質の分泌発現量は増加する。特に、後に記載する実施例２では式３、４、５、６の配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として目的タンパク質を産生させた場合、分泌発現量に与える効果はより大であった。
これらのことを考慮すると、上記式１ないし８のアミノ酸配列に限らず、その一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、Ｎ末端および／またはＣ末端に、任意のアミノ酸を、任意の数、付加もしくは欠損させるなどして得られる配列も、蛋白質の生産量を増加させるために使用できるものと考えられる。したがって、Ｘでしめされるポリペプチドには、上記式１ないし８のアミノ酸配列に、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加が生じたアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００１７】
ｘは、Ｘで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であればいかなる塩基配列であってもよい。すなわち、コドンの縮重を考慮したすべての可能なコドンの組み合わせが含まれる。
ｘのより好ましい具体的な塩基配列は下記式９ないし１５より選ばれる少なくとも１つの配列である（式９〜１５は、それぞれ配列表の配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６に対応する）。
【００１８】
本明細書中でＪはシグナルペプチドのアミノ酸配列を意味し、ｊはそれをコードする塩基配列を意味する。
ここでシグナルペプチドとは、原核生物由来、真核生物由来に関わらずあらゆる種類の分泌蛋白質のシグナルペプチドを意味する。例えば、一般的に使用されているシグナルペプチドには、大腸菌外膜リポ蛋白質（Ｌｐｐ）、大腸菌外膜蛋白質（ＯｍｐＦ）、λファージレセプター蛋白質（ＬａｍＢ）等のシグナルペプチド等がある。本発明でＪで示されるシグナルペプチドは、特に限定されないが、好ましくは大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドがよい。以下に大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドのアミノ酸配列を示した（配列表の配列番号１７に対応する）。
【００２０】
式１７
ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ
【００２１】
ｊが意味する塩基配列は、上記Ｊで示されるシグナルペプチドをコードする塩基配列であればいかなる配列でもよい。周知のように、１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、ｊには、コドンの縮重を考慮した、すべての可能な組み合わせが含まれる。
ｊのより好ましい具体例を以下の式１８に示した（配列表の配列番号１８に対応する）。
【００２２】
本明細書中でＹは化学物質や酵素等によって認識され切断されうるアミノ酸もしくはアミノ酸配列を意味し、ｙはそれをコードする塩基配列を意味する。
目的とする蛋白質が他のタンパク質との融合蛋白として産生されている場合には、他のタンパク質と目的蛋白質を切断分離することが必要になる。このような目的のために、現在、特定のアミノ酸配列部分でポリペプチドを切断する化学物質や酵素が使用されている。例えば、化学物質としては、臭化シアン、酸、２−（２−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｂｒｏｍｏｉｎｄｏｌｅｎｉｎｅ（ＢＮＰＳ−ｓｋａｔｏｌｅ）、ヒドロキシルアミン等がある。また、部位特異的切断に用いられる酵素としては、エンテロキナーゼ、トリプシン、血液凝固系第Ｘａ因子、コラゲナーゼ、トロンビン等がある。
【００２４】
Ｙは、このような化学物質や酵素によって認識され切断されるアミノ酸もしくはアミノ酸配列であればいかなるアミノ酸およびアミノ酸配列であってもよい。例えば、臭化シアンによって認識されるＭｅｔ、トリプシンによって認識されるＬｙｓもしくはＡｒｇ、血液凝固第Ｘａ因子によって認識されるアミノ酸配列ＩｌｅーＧｌｕーＧｌｙーＡｒｇ等（バイオトレンド Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．４ ｐ１１１ １９９０ 丸善 参照）、いかなる配列であってもよい。これらのアミノ酸もしくはアミノ酸配列の中から適宜選択する事ができる。ｙが意味する塩基配列は、上記Ｙで示されるアミノ酸またはアミノ酸配列であればいかなる配列でもよい。周知のように１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、ｙには、コドンの縮重を考慮した、すべての可能な組み合わせが含まれる。ｙのより好ましい具体例は、ＭｅｔをコードするＡＴＧおよび、ＦＸａにより認識されるＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードする配列である。
【００２５】
本明細書中でＺは目的とする蛋白質のアミノ酸配列を意味し、ｚはそれをコードする塩基配列を意味する。
Ｚが意味する目的蛋白質には、ヒト由来タンパク質に限らず、いかなる由来のタンパク質、いかなる性質および物性のタンパク質が含まれる。例えば、インターロイキン１〜１１、各種コロニー刺激因子、ＴＮＦやＩＦＮα、β、γ等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＦＧＦ等の増殖因子、インスリン等のホルモン、ｔ−ＰＡ等の酵素、もしくはこれらのインヒビターやレセプター、また、コラーゲン等の生体成分等である。Ｚが意味する目的蛋白質は、特に限定されないが、好ましくは、生理活性を有する蛋白質がよく、より好ましくは以下のＰＳＴＩ（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を示す ［Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｒｏｃｈｅｍ． １０２巻、６０７〜６１２頁、１９８７年］ 式１９、ＡＮ６８を示す式２０（特願平４−１１９２８９号）、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを示す式２１（特願平４−２９７３４４号）、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを示す式２２（特願平４−２９７３４４号）の配列を有するタンパク質、もしくは、これらのアミノ酸配列にアミノ酸の置換、付加、欠失が生じてなるアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。これらのタンパク質は、それぞれ記載の公知の物質または特許出願明細書中に詳細に記載されており、これらの特許出願明細書中の記載を引用して本出願の内容とする。
【００２６】
以下に本発明の第１の態様を説明する。
説明で用いるＸ、ｘの示す意味およびそれらの好ましい例については先に説明した通りである。
本発明第１の態様はｘで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片である。本発明のＤＮＡ断片はｘで示される塩基配列に加え、その５’末端や３’末端に制限酵素認識部位や任意のアミノ酸やアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する物であってもよい。例えば、その５’末端に、ｊで示されるシグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、すなわち、Ｊ−Ｘ（例えば配列表、配列番号２３〜３０参照）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片は、本発明第１の態様のＤＮＡ断片として好ましい（例えば配列表、配列番号３１〜３８参照）。また、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、ｊ−ｘ−ｚで示されるＤＮＡ断片も、本発明第１の態様のＤＮＡ断片として好ましい。
また、本発明のＤＮＡ断片はいかなる方法で得られた物であっても良い。例えば化学合成する場合には、目的の塩基配列、およびその相補鎖の塩基配列を有するＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡ断片として設計する。次に各オリゴマーをＤＮＡ合成機（例えばアプライドバイオシステムズ社製、３９２Ａ型）を化学合成し精製する。その後、引き続いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端のリン酸化処理、アニーリング、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等によるライゲーション等の処理をすることにより目的のＤＮＡ断片を得る事ができる。また、プライマーを化学合成により作成して、適当なｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法等を使用して所望の変異を導入しながら得る事もできる。Ｊ−Ｘの好ましいアミノ酸配列の例を配列表の配列番号２３〜３０に示し、ｊ−ｘの好ましい塩基配列の例を配列表の配列番号３１〜３８に示した。
【００３１】
目的タンパク質を、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合、少なくとも、発現量および／または分泌量が増加する。本発明第１の態様のＤＮＡ断片は、組換えＤＮＡ技術を用いて産生させようとする目的の蛋白質を、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質として発現させるために有用であり、すなわち、目的蛋白質を高収率で産生させるために使用できる。
【００３２】
以下に本発明の第２の態様を説明する。
説明の中で使用するＸ，Ｊ，Ｙ，Ｚおよびｘ，ｊ，ｙ，ｚの意味およびそれらの好ましい例については、それぞれ先に説明した通りである。
本発明第２の態様はｘで示される塩基配列を有することを特徴とするベクターである。
ｘで示される塩基配列は、タンパク質の生産量を増加させるために有効なので、本発明のベクターは、蛋白質の発現ベクターを構築する際の材料として使用できる。
【００３３】
本発明のベクターは、好ましくはｘに加えその５’末端にｊで示される配列を有するものがよい。すなわち、ｊ−ｘで表される塩基配列を有するベクターである。蛋白質がＪ−Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合、その蛋白質の分泌発現量は増加する。したがって、ｊ−ｘで示される塩基配列は、少なくとも物質の分泌発現量を増加させるために有用である。ｊ−ｘで示される塩基配列を有するベクターは、物質を分泌発現させるための発現ベクターの構築の際の材料として使用する事ができる。
【００３４】
本発明のベクターは、ｊ−ｘの５’末端および／または３’末端に制限酵素認識部位を有していてもよい。その場合には、当該ｊ−ｘで示される塩基配列を、適当な市販のベクターに組み込んだり、ｊ−ｘの下流に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列を組み込んだりする場合に有用である。
【００３５】
本発明のベクターは、ｊ−ｘの３’末端にｙで示される塩基配列を有するもの、すなわち、ｊ−ｘ−ｙで表される配列を有するものであってもよい。本発明のベクターは、ｊ−ｘ−ｙの５’末端および／または３’末端に制限酵素認識部位を有していてもよい。その場合には、当該ｊ−ｘ−ｙで示される塩基配列を、適当な市販のベクターに組み込んだり、ｊ−ｘ−ｙの下流に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列を組み込んだりする場合に有用である。
【００３６】
本発明のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙで表される配列の３’末端に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列が接続されたものであってもよい。すなわち、ｊ−ｘ−ｚもしくはｊ−ｘ−ｙ−ｚで表される配列をその内部に有するベクターであってもよい。このような場合、化学物質や酵素により認識されるアミノ酸もしくはアミノ酸配列Ｙは、Ｚで示される目的蛋白質のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸もしくはアミノ酸配列であることが好ましく、従って、ｙもそのようなＹをコードする塩基配列がよい。
【００３７】
本発明のベクターはｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚのいずれかで表される配列に加え、その上流および／または下流の任意の位置に、発現に必要な配列や、マーカーとなる配列、リンカー配列等を有していてもよい。例えば、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚの上流に、一つ以上のプロモーター配列、ＳＤ配列を有していてもよいし、上流もしくは下流の任意の位置に、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子もしくはアンピシリン耐性遺伝子を有していてもよい。また、プラスミドのコピー数の増幅を目的として、デヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）の配列等を上流に有していてもよい。
【００３８】
以上に述べた本発明のベクターは、いかなる目的で使用されてもよい。例えば、遺伝子をクローニングするために使用されてもよいし、他のベクターを構築する際の材料として使用されてもよい。
【００３９】
本発明のベクターは自己複製可能なベクターが好ましい。本発明第１の態様でも説明したように、ｘで示される塩基配列は少なくともタンパク質の発現量および／または分泌量を増加させるために有用である。従って、ｘで示される塩基配列を有する本発明のベクターは、好ましくは、タンパク質の発現用に使用されるのがよい。すなわち、本発明のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚのいずれかの配列に加えて、少なくともプロモーター配列を有するものが好ましい。また、より好ましくは、プロモーター配列に加え、オペレーター配列、ＳＤ配列も合わせ持つものが好ましい。
宿主が原核細胞である場合に機能するプロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λファージＰＬ プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｂｌａプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｏｍｐＡプロモーター、ｏｍｐＣプロモーター、ｏｍｐＦプロモーター等がある。宿主細胞が真核細胞である場合に機能するプロモーターの例としては、アクチン遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０のプロモーター、アデノウイルスＩＩのプロモーター、エロンゲーションファクター遺伝子のプロモーター等がある。
本発明のベクターが有するプロモーター配列は特に限定されないが好ましくは、下記〔１〕ないし〔３〕の群より選ばれる少なくとも１つの配列が好ましい。
〔１〕ｔｒｐプロモーター
〔２〕ｔａｃプロモーター
〔３〕ｌａｃプロモーター
【００４０】
本発明の第１の態様のＤＮＡ断片、例えば、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｚ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片は、いずれも公知のＤＮＡ技術で得る事ができる。例えば化学合成したり、適当なＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ法等を使用して変異を導入しながら、作製することも可能である。もちろん、ｊ，ｘ，ｙ，ｚで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を個々に得てライゲーションさせてもよい。ｊで示されるシグナルペプチドは、市販のベクターに適当なものが組み込まれている場合があるので、適当な制限酵素で切断後、分離して得る事ができる。
【００４１】
本発明の第２の態様のベクターはいかなる方法で得られた物であっても良い。例えば、本発明の第２の態様のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ，ｊ−ｘ−ｚ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列およびその相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡ断片を作成して、それを市販のベクターに正しい読みとり枠で組み込む事により得る事ができる。また、適当なプロモーター配列やマーカー配列をもつＤＮＡ断片をそれぞれ作成して、上記配列と共に任意の位置に組み込んでもよい。ベクターにＤＮＡ断片を組み込む方法は公知である（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ａ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ等編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）。使用する市販のベクターの由来は特に限定されず、あらゆる種類のプラスミド、ファージ、ウイルス由来のベクターから適宜選択して使用できる。ベクターの代表的なものを列挙すると、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、λＺａｐＩＩ、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＡｃＮＰＶ、ＹＡＣ、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＥＦＮ−ＩＩ等があげられる。
【００４２】
次に、本発明の第３の態様の形質転換体について説明する。
本発明の第３の態様の形質転換体は、本発明の第２の態様のベクターを宿主となる細胞や微生物に導入する事によって形質転換体とされる。宿主細胞の例としては、大腸菌、枯草菌、酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｓｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞等がある。また、温度感受性株や栄養要求性等、ミュータントも本発明の形質転換体を得るための宿主細胞として使用できる。本発明の形質転換体は、由来は特に限定されないが、しかしながら、好ましくは下記〔１〕ないし〔３〕よりなる群より選ばれる少なくとも１つがよい。
〔１〕大腸菌
〔２〕枯草菌
〔３〕酵母
【００４３】
本発明の形質転換体は、好ましくは、目的とする蛋白質を発現し、産生するものがよい。この場合には、形質転換に使用するベクターはプロモータ等発現に必要な配列を有している事が必要であり、当該発現に必要な配列と宿主細胞とは互いに機能し得るように組み合わせる必要がある。代表的な組み合わせ例としてはＳＶ４０の初期プロモーターを有するベクターとＣＯＳ細胞、トリプトファンプロモーターとトリプトファンＳＤ配列を有するベクターと大腸菌等がある（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック、１９９１年３月２０日発行、羊土社
参照）。
【００４４】
形質転換体の作成方法は公知である（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック、既出、参照）。すなわち、本発明の第２の態様の発現ベクターを、エレクトロポレイション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウムゲル法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いてインフェクションさせる方法等の操作を行った後、薬剤耐性や、酵素要求性、もしくは発現産物等を指標にして、宿主が当該ベクターにより形質転換されたクローンを選択すればよい。
【００４５】
本発明の第３の態様の形質転換体は、本発明の第２の態様のベクターを大量に製造する目的や、目的とする蛋白質を製造するために使用できる。
【００４６】
次に、本発明の第４の態様の所望のタンパク質の産生方法について説明する。説明で用いるＪ、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｊ、ｘ、ｙ、ｚの意味およびそれぞれの好ましい例については、先に説明した通りである。
本発明の第４の態様は、本発明第１の態様のＤＮＡ断片を利用した蛋白質の産生方法、すなわち、本発明の第２の態様のベクターを使用した蛋白質の製造方法である。当該方法では、目的とする蛋白質Ｚを、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚいずれかで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質として発現させる工程を含む事を特徴とする。すなわち、本発明の産生方法において、目的とするタンパク質Ｚは、そのＮ末端に、Ｊ−ＸもしくはＪ−Ｘ−Ｙのアミノ酸配列を有する融合タンパク質として発現されたのち、融合タンパク質として宿主細胞もしくは培地に存在していてもよいし、切断されて、例えばＸ−Ｚ、Ｘ−Ｙ−Ｚ、Ｚのような形で、宿主や培地中に存在していてもよい。またこのような融合蛋白質の形で単離・精製されてもよい。
【００４７】
以下に本発明の産生方法の工程の一例を説明する。
当該産生方法は、例えば、下記ａ）からｆ）の工程を順次行えばよい。
ａ）ｊ−ｘ−ｚもしくはｊ−ｘ−ｙ−ｚで表されるＤＮＡ断片を有する発現ベクターを得る。
ｂ）ａ）で得た発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換する。
ｃ）得られた形質転換体を培養し必要な場合は導入した遺伝子の発現を誘導する。
ｄ）得られた形質転換体の培養上清中および／あるいは、形質転換体そのものから、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を回収し精製する。
ｅ）得られた融合タンパク質より、目的とする蛋白質Ｚを単離精製する。
【００４８】
上記ａ）の発現ベクターは本発明第２の態様のベクターであって、発現に必要な塩基配列を有するベクターである。当該ベクターを得るための方法は本発明第２の態様で説明した。ｂ）の工程では形質転換体を作製するが、ここで用いる宿主細胞はａ）で得られた発現ベクターが機能し得るような宿主細胞である。形質転換の方法は、本発明第３の態様で説明した通りである。
【００４９】
上記ｃ）の工程では形質転換体を培養するが、培養方法は宿主細胞に応じた公知方法で行えばよい（例えば、生物化学工学、合葉修一等、１９７６年、東京大学出版会および微生物遺伝学実験法 ｐ９６〜１１５、石川辰夫編 共立出版１９８２年参照）。通常、大腸菌であればＬ−ブロース培地やＭ９培地（カザミノ酸含有）を培地として、３７℃にて１〜２日間ジャーファーメンターにて培養する。枯草菌の場合はＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ、Ｄｉｆｃｏ社）プレートやＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ｎｏ．３、 Ｄｉｆｃｏ社）等を培地とし、３０℃〜３５℃にて１〜２日間培養する。また、酵母であれば８％ショ糖を含むＹＰ培地を用い、２８℃にて約１〜２日間培養する。
近年では、目的蛋白質の分泌発現量を増加させる目的で形質転換体を低温（約２０℃〜２５℃）で培養する方法も確立されているので、必要に応じて低温培養を行っても良い。このように、蛋白質の生産量を増加させるための工夫がされた培養方法と本発明の産生方法を組み合わせれば、目的蛋白質の最終的な生産量はより高くなる事が予想される。
【００５０】
また、産生誘導刺激の必要性およびその方法は、導入された組換えＤＮＡ分子の持つプロモーターの種類によって決定される。例えば、導入されたプロモーターがトリプトファンプロモーターであれば、Ｍ９培地（最小必須培地）を使用し、３β−インドールアクリル酸を添加して産生誘導刺激を行う。すなわち、本発明の製造方法においては産生誘導刺激は形質転換に使用した発現ベクターや形質転換体に応じた方法で行えば良い。
【００５１】
上記ｄ）の工程では、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を回収、精製する。通常シグナルペプチドを有するタンパク質は、細胞から培養上清中に分泌されるが、宿主細胞内にインクルージョンボディーとして蓄積されることもある。
培養上清より回収するには、培養上清もしくはその濃縮液をスターティングマテリアルとして精製を行う。また、目的の蛋白質がペリプラズムに蓄積される場合は、Ｗｉｌｌｓｋｙ等の方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．ｐｐ５９５ １９７６）等で蛋白質を回収後精製する。細胞内に蓄積された融合タンパク質を回収するには、リゾチーム、界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破壊した後、遠心分離、濾過等の方法により抽出する。その後リフォールディング処理を行い（例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ８７巻、５６３ー５７７頁、１９７４年参照）、更に精製すればよい。
【００５２】
通常行われるタンパク質の精製方法としては、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等がある。したがって、工程ｄ）においても、目的とする融合タンパク質を、その分子量や生理活性を指標として、通常使用され得る精製方法を適宜組み合わせ、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して行えば良い。
【００５３】
工程ｅ）では、得られた融合タンパク質から、目的とする蛋白質Ｚを単離精製する。工程ｄ）で培養上清もしくはペリプラズムから融合タンパク質を回収している場合には、Ｊで表されるシグナルペプチド部分は既に切断されている場合が多いので、融合タンパク質からＸもしくはＸ−Ｙで表される部分を切断除去すればよい。また、細胞内より回収している場合にはＪ−Ｘ、もしくはＪ−Ｘ−Ｙで表される部分を切断除去する。
切断除去には、特定のアミノ酸もしくはアミノ酸配列（融合タンパク質がＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表される場合には、Ｙで示されるアミノ酸もしくは表されるアミノ酸配列）を認識して、それと反応し、結果的にポリペプチド鎖を切断する効果を有する化学物質や酵素を使用する。ここで用いる化学物質や酵素は特に限定されないが、目的とする蛋白質Ｚの活性を失わないような物質を選択する事が必要である。目的とする蛋白質Ｚは、そのアミノ酸配列を完全に有した形で切断単離されるのが好ましいが、その活性や特性を失わない範囲であれば、化学物質等の処理によりそのＮ末端側やＣ末端側の一部が欠失される事があってもかまわない。また、同様に、目的とする蛋白質ＺのＮ末端側に、ＸやＹに由来するペプチド断片が存在していてもかまわない。
いうまでもないが、形質転換体によりＪ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚとして発現された融合蛋白質から、余分なＪーＸやＪ−Ｘ−Ｙが宿主細胞自身によって除去されるような場合には化学物質や酵素を用いての切断処理は必要ない。
【００５４】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらによって、何等、限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。なお、実施例中の諸操作は、下記の雑誌、成書を参考として実施した。
【００５５】
１．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐｅｒｂａｌ著、１９８４年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．
２．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐｅｒｂａｌ著、１９８７年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．
３．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、１９８０年、講談社
４．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、１９８２年、講談社
５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等編、１９８２年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
６．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６５巻、Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ 等編、１９８０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
７．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６８巻、Ｒ． Ｗｕ 編、１９７９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
８．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 、ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、 Ｍｉｃｈａｄｅｌ Ａ． Ｉ 等編、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等編、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
１０．実験医学別冊、細胞工学的技術総集編、１９８９年、羊土社
１１．実験医学別冊、遺伝子工学ハンドブック、１９９１年、羊土社
【００５６】
実施例１．プラスミドｐＫＫ２２３Ｍの作成
ｊ−ｘで示される塩基配列を有するベクターであって、ｊとして前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、ｘとして前記式９の塩基配列を有するプラスミドｐＫＫ２２３Ｍを以下の方法で作成した。
まず、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ にて二重消化し、得られたＤＮＡ断片混合物を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片をジエチルアミノエチルセルロ−ス紙（以後、ＤＥＡＥセルロース紙と略す）に吸着させ、残りのＤＮＡ断片と分離した。さらに、ＤＥＡＥセルロース紙を高濃度塩溶液（２Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて洗浄し、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥセルロース紙より回収した。
まず、図１の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント１ａ）を、４つの断片に分けて設計した。これら４つの断片のうち、Ｓ２、Ｓ３をＡＴＰの存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化した。続いて、オリゴヌクレオチドＳ１とＳ３およびＳ２とＳ４をそれぞれアニーリングさせた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を使用してライゲーションした。ライゲーション後のサンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、調製した。
次に、前記約４．５ｋｂのＤＮＡ断片と約１２０ｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望のアンピシリン耐性コロニーを分離した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＫＫ２２３Ｍと命名した（図２参照）。
【００５７】
実施例２．プラスミドｐＭ４７４の作成
本発明のプラスミドｐＭ４７４を以下の方法で作成した。当該プラスミドは、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示されるＰＳＴＩの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドである。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：式９の塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ＰＳＴＩをコードする塩基配列
【００５８】
〔１〕ｐＭ４７４の作成
プラスミドｐＭ４６３（ＫＡＮＡＭＯＲＩ Ｔ．等、ＧＥＮＥ、６６巻、２９５ー３００頁、１９８８年、図３参照）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＮｒｕＩにて二重消化し、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。
一方、ＳＤ配列、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列、式１のアミノ酸配列をコードする塩基配列およびＰＳＴＩのＮ末端側のアミノ酸配列の一部をコードする塩基配列から成るＤＮＡ断片を、６つの断片に分割して設計した（フラグメントＡ、図４参照）。実施例１の要領で化学合成し、最終的に、約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、調製した。前記約３．４ｋｂのＤＮＡ断片と約１４０ｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望のアンピシリン耐性コロニーを分離した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＭ４７４を得た。
プラスミドｐＭ４７４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＢａｍＨＩで二重消化し、目的とするサイズ約３００ｂｐの断片を抽出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（ＤＮＡシークエンサー３７０Ａ、アプライドバイオシステムズ社）を使用して、シークエンシングを行った。
プラスミドｐＭ４７４のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図５に示した（配列表の配列番号１９参照）
【００５９】
〔２〕分泌発現量の比較
本発明のプラスミドｐＭ４７４を使用した場合のＰＳＴＩ分泌発現量を、プラスミドｐＭ４６３（既出）を使用した場合のそれと比較した。プラスミドｐＭ４６３には、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に、直接、ＰＳＴＩをコードする塩基配列が組み込まれている。
まず、ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．著、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ． Ｃｏｌｉ、 Ｉｎ： ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｖｏｌ １， Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ． Ｍ． （ｅｄ．），１０９−１３６頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ 、１９８５年）により、プラスミドｐＭ４６３とｐＭ４７４でそれぞれｌｏｎ−株の大腸菌ＧＣ４６７０（ｌｏｎ：Ｔｎ１０ ｔｈｒ，ｌｅｕ，ｌａｃＹ）を形質転換し、大腸菌ＧＣ４６７０（ｐＭ４６３）およびＧＣ４６７０（ｐＭ４７４）を作製した。それぞれを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロース５ｍｌにて終夜培養後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸２％を含むＭ９ＣＡ培地５０倍量に、この培養液を植菌し、３７℃にて約１時間培養した。培地に終濃度１０μｇ／ｍｌの３β−インドールアクリル酸（和光純薬工業株式会社製）を添加し、さらに１６時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離器（ＣＲ２０Ｂ３、日立工機株式会社製）を使用して、遠心分離し、上清を回収した。
それぞれの培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その結果、ｘで示される塩基配列を有しているプラスミドｐＭ４７４で、極めて高い分泌発現量が確認された。以下に結果を示す。
【００６０】
実施例３．
ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有するポリペプチドＡＮ６８の発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドを、以下の〔２〕ないし〔９〕の方法で作成した。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：前記式９ないし１２いずれかの塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ポリペプチドＡＮ６８をコードする塩基配列
また、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に直接、ポリペプチドＡＮ６８をコードする塩基配列が組み込まれたプラスミドｐＭ５９４を〔１〕の方法で作成した。
【００６２】
〔１〕プラスミドｐＭ５９４の作成
ｐＭ５９４をプラスミドｐＭ５５２（特願平３−３２５２２０号明細書参照）から以下のように作成した。プラスミドｐＭ５５２は、下記式２３のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわち、下記式２４の塩基配列）を、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に有し、トリプトファンプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドである（図６、微工研条寄第３５６１号）。
【００６３】
まず、第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてＨｉｎｄＩＩＩ プライマー（図７）、ＡＮ６８プライマー（図８）を、おのおの化学合成し、これらをプライマーとして、プラスミドｐＭ５５２を鋳型とする第一次ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ジーンアンプキットＲ （宝酒造株式会社）を用いて行い、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、３分間を１サイクルとする反応を、３０サイクル繰り返した。第一次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とする、サイズ約１３０ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノール処理／エタノール沈殿で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これをセンスプライマーとして、プラスミドｐＭ５５２を鋳型とする第二次ＰＣＲを第一次ＰＣＲと同様に行なった。なお、アンチセンスプライマーとしては、ｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマー（図９）を化学合成して使用した。
第二次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノール処理／エタノール沈殿にて精製した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＢａｍＨＩで消化し、サイズ約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
プラスミドｐＭ４６３（既出）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＢａｍＨＩにて二重消化し、サイズ約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、上記ＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＭ５９４を得た。
【００６６】
〔２〕ｐＭ７１０の作製
図１０の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント１ｂ）を５つの断片に分割して設計し、実施例１の要領で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７１０を作製した。
プラスミドｐＭ７１０のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図１１に示した（配列表の配列番号２０参照）
【００６７】
〔３〕ｐＭ７７６の作製
図１２の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント２）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７６を作製した。
【００６８】
〔４〕ｐＭ７７７の作製
図１３の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント３）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７７を作製した。
【００６９】
〔５〕ｐＭ７７８の作製
図１４の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント４）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７８を作製した。
【００７０】
〔６〕ｐＭ７７９の作製
図１５の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント５）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７９を作製した。
【００７１】
〔７〕ｐＭ７８０の作製
図１６の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント６）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７８０を作製した。
【００７２】
〔８〕ｐＭ７８１の作製
図１７の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント７）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７８１を作製した。
【００７３】
〔９〕ｐＭ７１１の作製
図１８の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント８）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７１１を作製した。
【００７４】
〔１０〕分泌発現量の比較
〔１〕ないし〔９〕で得られたプラスミドを使用して、実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７６）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７７）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７８）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７９）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７８０）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７８１）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７１１）を得た。これらをそれぞれ培養して培養混合物を回収した。それぞれの培養混合物を遠心分離器を使用して、遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法で培養上清中のトリプシン阻害活性を測定した。測定結果を以下に示す。ｘで示される塩基配列を有するプラスミドにおいて、プラスミドｐＭ５９４と比較して極めて高い分泌発現量が得られた。本発明のベクターを使用し、ポリペプチドＡＮ６８をＸで示されるアミノ酸配列との融合蛋白として発現させることにより、分泌発現量が極めて低いＡＮ６８の分泌発現量が増加したことが確認された。
【００７５】
〔１１〕菌体内発現量の比較
〔１〕で得られた形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）および〔２〕で得られたＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）を培養し、培養混合物を回収した。分光光度計を使用して、波長５５０ｎｍの吸光度を測定したところＯＤ１６であった。この培養混合物６．３μｌ相当分を遠心分離し、ペレットを回収した。これに、終濃度が１５％グリセロール／０．００２５％ＢＰＢ／０．０６３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／２％ＳＤＳ／５％ β−メルカプトエタノールとなるように泳動バッファー１０μｌを加えた。全量を、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） の方法（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ． Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２２７巻、６８０−６８５ 頁、１９７０年）を参考にして、以下の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に供した。分子量マーカーとしては、ＢＲＬ社製のサイズ４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、６．２ｋＤのマーカーを使用した。
泳動終了後、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０にて染色を行なった。
その結果、ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）に比べ、ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）の方が明らかに、発現量が高い事が確認された（図１９）。
【００７７】
実施例４．プラスミドｐＭ７２７の作成
ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有する、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドを、以下の方法で作成した。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：前記式９の塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ
【００７８】
〔１〕プラスミドｐＭ７４８の構築
プラスミドｐＭ７１０を鋳型とし、２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、化学合成して得たＹ４６Ｄプライマー（図２０）を、アンチセンスプライマーとしてはｐＢＲＢａｍＨＩプライマーを使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約１２０ｂｐのバンドが認められた。この増副産物をアンチセンスプライマーとし、ＨｉｎｄＩＩＩ プライマーをセンスプライマーとして、プラスミドｐＭ７１０を鋳型とする第二次ＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領でプラスミドｐＭ４６３に組み込み、プラスミドｐＭ７４８を作製した。
【００７９】
〔２〕プラスミドｐＭ７２７の構築
プラスミドｐＭ７４８を鋳型として、２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてはＨｉｎｄＩＩＩ プライマーを、アンチセンスプライマーとしてはＱ１９Ｋプライマー（図２１）を化学合成し使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約２１０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をセンスプライマーとし、ｐＢＲＢａｍＨＩプライマーをアンチセンスプライマーとし、プラスミドｐＭ７４８を鋳型とする第二次ＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領で、プラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ７２７を作製した。
プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図２２に示した（配列表の配列番号２１参照）。
【００８０】
〔３〕分泌発現量の測定
実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を作成し、培養した。培養混合物を回収して遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その結果、培養上清中のトリプシン阻害活性は１１７Ｕ／ｍｌであり、比活性から算出したタンパク質量を求めると約１４μｇ／ｍｌであった。本発明のベクターを使用しない場合と比較して、明らかに高い分泌発現量が得られたことから、本発明のベクターを使用してポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６ＤをＸで示されるアミノ酸配列との融合蛋白質として発現させることにより、本来分泌発現しにくいＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの分泌発現量が増加することが確認された。
【００８１】
実施例５．プラスミドｐＭ７６５の作成
〔１〕プラスミドｐＭ７６５を以下の方法で作成した。プラスミドｐＭ７６５は、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有する、ポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するものである。
ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナル配列をコードする塩基配列、
ｘ：前記式９なの塩基配列
ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列
ｚ：ポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ
【００８２】
プラスミドｐＭ７２７を鋳型として２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてはＨｉｎｄＩＩＩプライマーを、アンチセンスプライマーとしては、化学合成して得たＲ１１Ｓプライマー（図２３）を使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約１８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をセンスプライマーとし、ｐＢＲＢａｍＨＩプライマーをアンチセンスプライマーとして、プラスミドｐＭ７２７を鋳型とする第二次ＰＣＲを行った。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが確認された。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領でプラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ７６５を作製した。
プラスミドｐＭ７６５のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図２４に示した（配列表の配列番号２２参照）。
【００８３】
〔２〕分泌発現量の測定
実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）を作成し、培養した。培養混合物を回収して遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その結果、培養上清中のトリプシン阻害活性は４６０Ｕ／ｍｌであり、比活性から算出したタンパク質量を求めると約７５μｇ／ｍｌであった。本発明のベクターを使用しない場合と比較して、明らかに高い分泌発現量が得られ、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質として発現させることにより、分泌量が増加することが確認された。
【００８４】
実施例６．プラスミドｐＭ７６５を利用したポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産
〔１〕プラスミドｐＭ７６５を用い、実施例２の要領で大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）〔本願発明者によって、平成５年４月２８日、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８５として寄託されている〕を作製し、培養した。得られた培養混合物をＢｅｎｃｈｍａｒｋＧＸ（メンブレックス（Ｍｅｍｂｒｅｘ）社、孔径０．２μｍ）を使用して濃縮後、４℃にて、約１００００×ｇ、２０分間遠心分離を行い菌体を回収した。
【００８５】
〔２〕〔１〕で得られた菌体を破砕用溶液（０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、ミニラボ（ＲＡＮＮＩＥ社）を使用し、８００ｂａｒで加圧破砕した。その後、４℃、２０分間、約１００００×ｇで遠心分離し、ペレットを回収した。回収したペレットに破砕用溶液を添加し、再び、４℃、２０分間、約１００００×ｇで遠心分離した。この操作を更に２回行い、ペレットを回収した。回収したペレットに可溶化バッファー（５Ｍグアニジン塩酸，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ 還元型グルタチオン，０．０２ｍＭ 酸化型グルタチオン）を加え、更に、終濃度５０ｍＭとなるように２−メルカプトエタノールを添加し、４℃にて終夜撹拌した。この溶液を限外濾過膜（ＹＭ−５、グレースジャパン社）を使用して濃縮した後、孔径０．４４μｍのフィルターを使用して濾過した。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ ＨＲ（ファルマシア社製）を充填したカラム（５ｃｍφ×９５ｃｍ）を、前述の可溶化バッファーで平衡化し、これに濃縮濾液を添加した。前述の可溶化バッファーを展開液とし、波長２８０ｎｍにおける吸光度を指標として蛋白質含量をモニターしながら、流速３．５ｍｌ／分でゲル濾過を行った。３０ｍｌずつ分取し、各画分の一部を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＡＧＥＬＲ （ＳＰＵ−１５Ｓ、アトー社）を使用し、その使用説明書に従って行った。クマシーブリリアントブルーで染色し、目的の分子量のポリペプチドを多く含む画分を選択した。この画分の蛋白質含量がほぼ０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、可溶化バッファーを使用して調整し、リフォールディング処理用サンプルとした。
【００８６】
〔３〕〔２〕で得たリフォールディング処理用サンプルを、〔２〕で使用した可溶化バッファーからグアニジン塩酸を除いた溶液、約１５倍量に対し、２回透析した。次いで、約１５倍量の蒸留水に対して３回透析を行った。透析終了後、塩酸を使用してサンプルをｐＨ２に調整した。このサンプルについて以下のように精製を行った。
【００８７】
〔４〕予め０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化したＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、ポリマーラボラトリーズ社製）に、〔３〕で得たリフォールディング処理後のサンプルを添加し、０．１％ＴＦＡ溶液を用いて吸着させた。溶出は、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配（０−７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３０分、７０−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３分）により、流速５ｍｌ／分で、波長２８０ｎｍにおける吸光度をモニターしながら溶出を行い、５ｍｌずつ分取した。各画分のトリプシン阻害活性を、後述の方法で測定し、活性の認められた画分を凍結乾燥後、７０％蟻酸におよそ１００μＭとなるように溶解した。次いで、モル濃度比で２０００倍量となるように臭化シアンを加え、２５℃、２４時間暗所に静置した。これに蒸留水を加えて２倍希釈した。
【００８８】
〔５〕ＳＰ−トヨパール（３０ｍｍφ×１５０ｍｍ、東ソー株式会社）を１０％蟻酸溶液で平衡化した後、ＦＰＬＣシステム（既出）を用いて以下の方法で陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。すなわち、〔４〕で得られたサンプルをＳＰ−トヨパールに添加し、１０％蟻酸溶液を用いて吸着させた。ＮａＣｌ／１０％蟻酸を使用し、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０−１．２Ｍ ＮａＣｌ／１０％ 蟻酸溶液／１００分間）により、流速８ｍｌ／分で、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出した。３２ｍｌずつ分取し、各画分のトリプシン阻害活性を後述の方法で測定した。得られた活性画分を〔３〕の逆相クロマトグラフィー用サンプルとした。
【００８９】
〔６〕ＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、既出）を０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化した後、〔５〕で得られた活性画分を添加し、０．１％ＴＦＡ溶液を用いて吸着させた。溶出は０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を用い、アセトアニリルの直線濃度勾配（０−７０％／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／１５分、７０−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３分）により流速１０ｍｌ／分で行った。波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出を行い、ピークごとに分取し、各画分のトリプシン阻害活性を実施例８の方法で測定した。得られた活性画分を凍結乾燥して、精製標品を得た。
【００９０】
〔７〕〔６〕で得られた精製標品をＰＡＧＥＬＲ（既出）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。銀染色の結果、単一のバンドが認められた。
【００９１】
〔８〕アミノ酸配列の分析
〔６〕で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０Ａ ＰＴＨアナライザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いてアミノ酸配列の分析を行なった。ＰＴＨアミノ酸を２７０ｎｍの紫外部吸収にて検出して、その保持時間を測定し、予め同一の方法で分離した標準ＰＴＨアミノ酸（アプライドバイオシステムズ社）の保持時間を基準にしてアミノ酸の同定を行なった。その結果、目的とするタンパク質、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄが精製されたことが確認された。
【００９２】
実施例７．プラスミドｐＭ７２７を利用したポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産
〔１〕プラスミドｐＭ７２７を用い、実施例２の要領で大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を作製し、培養した。培養上清を回収して、６ＮのＨＣｌを加えてｐＨ２に調製した。孔径１．０μｍのフィルター（日本ポール社製）を使用して濾過した。濾液を、更に、ＣＮカートリッジ（孔径０．２２μｍ、ミリポア社製）を使用して濾過した。
【００９３】
〔２〕ＳＰ−トヨパール（５５０Ｃ、東ソー株式会社）を５０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で平衡化した後、〔１〕で得られた濾液を添加した。５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ３．０）で洗浄後、５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ５．０）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出した。各画分のトリプシン阻害活性を実施例８の方法で測定した。得られた活性画分を、分画分子量３０００の限外濾過膜（フィルトロン、富士フィルター社製）にて濃縮後、孔径０．２２μｍのフィルターを使用して沈澱を除去した。上清を回収して、以下のゲル濾過を行った。
【００９４】
〔３〕Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（２６ｍｍφ×６００ｍｍ、ファルマシア社製）を ５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で平衡化し、〔２〕で得られた上清を添加した。５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら、流速２ｍｌ／分で溶出を行った。６ｍｌごとに分取し、各画分のトリプシン阻害活性を後述の方法で測定した。得られた活性画分を凍結乾燥した。
【００９５】
〔４〕〔３〕で得た凍結乾燥品を、実施例６〔４〕、〔５〕、〔６〕の方法に準じて臭化シアン分解および精製した。得られた精製標品を実施例６〔７〕の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに共したところ単一のバンドが確認された。実施例６〔８〕の方法でアミノ酸分析を行った結果、目的とするタンパク質、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄであることが確認された。
トリプシン阻害活性の測定
培養混合物を遠心分離して得た培養上清に０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を加えて段階希釈し、ウシトリプシン阻害活性測定用のサンプルとした。これらの活性測定用サンプルのウシトリプシン阻害活性を、合成基質Ｓ−２４４４（第一化学薬品株式会社製）を基質として、カッセル（Ｋａｓｓｅｌｌ）の方法（Ｋａｓｓｅｌｌ Ｂ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９巻、８４４−８５２頁、１９７０年）に準じて以下のように測定した。
すなわち、まず、ウシトリプシン（Ｔｙｐｅ ＸＩＩＩ、シグマ社製）を、０．００１ＭＨＣｌに溶解し、１３６００ＢＡＥＥＵ／ｍｌに調製し、それを、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）にて希釈し、０．６ＢＡＥＥＵ／ｍｌのトリプシン溶液を調製した。一方、合成基質Ｓ−２４４４を蒸留水に溶解し、２ｍＭのＳ−２４４４溶液を調製した。
次に、上述のウシトリプシン阻害活性測定用サンプル１００μｌもしくはコントロールを、ウシトリプシン溶液１００μｌと混合した。３７℃にて１０分間静置した後、上記Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加え、反応を開始させた。３７℃にて２０分間反応後、５０％酢酸５０μｌを加えて反応を停止させ、分光光度計にて、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、データ処理の際に、ここで用いた各種溶液の吸光度への影響を差し引くための対照としては、上記ウシトリプシン溶液１００μｌに、予め、５０％酢酸５０μｌを加え、ウシトリブシン阻害活性測定用サンプルもしくはコントロール１００μｌ、Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加えたものを使用した。
【００９６】
【発明の効果】
組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を生産する際に、本発明のＤＮＡ断片を有する本発明のベクターを用いて、所望のタンパク質を特定のポリペプチドの融合タンパク質として発現させると、所望のタンパク質の発現量および／または宿主体内からの分泌量が増加する。
したがって、本発明は、組換えＤＮＡ技術で所望のタンパク質を生産する際のタンパク質の生産量を増加させ、また、本来分泌発現しにくいようなタンパク質の分泌発現を可能にする。
【００９７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】フラグメント１ａの塩基配列を示す図。
【図２】プラスミドｐＫＫ２２３Ｍを示す図。
【図３】プラスミドｐＭ４６３を示す図。
【図４】フラグメントＡの塩基配列を示す図。
【図５】プラスミドｐＭ４７４のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【図６】プラスミドｐＭ５５２を示す図。
【図７】ＨｉｎｄＩＩＩ プライマーの塩基配列を示す図。
【図８】ＡＮ６８プライマーの塩基配列を示す図。
【図９】ｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーの塩基配列を示す図。
【図１０】フラグメント１ｂの塩基配列を示す図。
【図１１】プラスミドｐＭ７１０のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【図１２】フラグメント２の塩基配列を示す図。
【図１３】フラグメント３の塩基配列を示す図。
【図１４】フラグメント４の塩基配列を示す図。
【図１５】フラグメント５の塩基配列を示す図。
【図１６】フラグメント６の塩基配列を示す図。
【図１７】フラグメント７の塩基配列を示す図。
【図１８】フラグメント８の塩基配列を示す図。
【図１９】形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）の菌体より得られた蛋白質のＳＤＳーＰＡＧＥの結果を示す図。
【図２０】Ｙ４６Ｄプライマーの塩基配列を示す図。
【図２１】Ｑ１９Ｋプライマーの塩基配列を示す図。
【図２２】プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
【図２３】Ｒ１１Ｓプライマーの塩基配列を示す図。
【図２４】プラスミドｐＭ７６５のＨｉｎｄＩＩＩ 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す図。
Claims (11)
- ｘで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片。
（ただし、ｘは、
下記式１〜８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を表わす。）
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ - 請求項１に記載のＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクター、ただし、該ベクターが請求項 1 に記載のＤＮＡ断片に加え、他の任意の塩基配列が組み込まれたベクターである場合であって、請求項１に記載のＤＮＡ断片と該任意の塩基配列とが、ＨＩ−３０全体の塩基配列からなる配列となる場合を除く。
- ｊ−ｘで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片。
（ただし、
ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ｘは、
下記式１〜８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を表わす。）
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ - ｊ−ｘ−ｙで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片。
（ただし、
ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ｘは、
下記式１〜８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
ｙは酵素および／または化学薬品によって切断されうるアミノ酸もしくはアミノ酸配列をコードする塩基配列、
を表わす。） - ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片。
（ただし、
ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ｘは、
下記式１〜８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
ｙは酵素および／または化学薬品によって切断されうるアミノ酸もしくはアミノ酸配列をコードする塩基配列、
ｚは所望の蛋白質をコードする塩基配列、
を表わす。） - ｊ−ｘ−ｚで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片。
（ただし、
ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、
ｘは、
下記式１〜８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
ｚは所望の蛋白質をコードする塩基配列、
を表わす。） - 請求項３〜６のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクター。
- 以下の群より選択されるプロモーターを、さらに有する請求項２または７に記載のベクター。
〔１〕ｔｒｐプロモーター
〔２〕ｔａｃプロモーターおよび
〔３〕ｌａｃプロモーター - 請求項２、７および８のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
- 前記形質転換体の宿主が大腸菌、枯草菌および酵母よりなる群より選択される請求項９に記載の形質転換体。
- 請求項９または１０に記載の形質転換体を培養して、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚのアミノ酸配列で表される融合タンパク質を発現させる工程を含むことを特徴とするＺの産生方法。
（ただし、
Ｊはシグナルペプチド、
Ｘは、
下記式１〜８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ
式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫＥＤＳＧ
式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ
式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ
式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ
式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ
式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ
式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
Ｙは酵素および／または化学薬品によって切断されうるアミノ酸またはアミノ酸配列、
Ｚは所望の蛋白質のアミノ酸配列、
を表わす。）
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