JPH06315386A

JPH06315386A - Ｄｎａ断片およびそれを含むベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該ベクターを用いる蛋白質の産生方法

Info

Publication number: JPH06315386A
Application number: JP5128528A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Morishita; 下英昭森; Toshiyuki Kanamori; 森利至金; Masahiro Nobuhara; ▲原▼ 正弘延
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-05-01
Filing date: 1993-05-01
Publication date: 1994-11-15
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: AU6181494A; US5840518A; EP0624644A1; AU676277B2; JP3570558B2; CA2122556A1

Abstract

(57)【要約】【構成】ｘで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片、ま
た、これらを有するベクター。（ただし、ｘは、下記式
１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコード
する塩基配列を表わす。）式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ【効果】所望のタンパク質を、本発明のＤＮＡ断片を用
いる組換えＤＮＡ技術により本発明のベクターを用い
て、これらのＤＮＡ断片のコードする特定のポリペプチ
ドとの融合タンパク質として発現させると、所望のタン
パク質の発現量が増加し、また、宿主体内からの分泌量
が増加する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】組換えＤＮＡ技術を用いて蛋白質
を産生させる際に有用なＤＮＡ断片、および当該ＤＮＡ
を有するベクター、該ベクターを用いた形質転換体、お
よびこれらを用いた蛋白質の生産方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】現在、生理活性物質等の蛋白質を生産す
る方法の１つとして、遺伝子工学的技術が広く利用され
ている。すなわち、目的とする蛋白質をコードする遺伝
子を適当な発現ベクターに組み込み、該ベクターで宿主
細胞を形質転換し、該形質転換体の培養混合物から精製
するという方法である。近年、より効率的に目的蛋白質
を生産させ、最終的な生産量を増加させるための改良が
進んでいる。例えば、宿主として大腸菌を使用する際に
は以下の方法により目的の蛋白質の発現量を増加させ、
最終的な生産量を増加させることが可能になった。すな
わち、強力なＳＤ配列を用いることによってリボソーム
への会合を起きやすくさせる（J.Shine, L.Dalgano,;Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,71;1342, 1974）、組換えＤＮＡ
分子の各菌体あたりのコピー数を増加させる（R.Nagara
jarao, S.G.Rogers,;Gene,6,;247, 1978）、転写量を増
加させる目的で強力なプロモーターを用いる（H.A.DeBo
re,L.J.Comstock,M.Vasser,;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0;21,1980 ）、大腸菌自身に存在するプロテアーゼによ
る生成した有用な目的とする蛋白質の分解を防ぐために
プロテアーゼ欠損の菌株（例えばｌｏｎ^-株）を用いる
（M.F.Charatte,G.W.Henderson,A.Markovitz,;Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,78;4728,1981 ）（C.H.Chung,A.L.Gold
berg,;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78;4931,1981 ）等であ
る。

【０００３】一方、目的の蛋白質を積極的に宿主細胞外
へ分泌発現させる方法も既に開発され、目的蛋白質の生
産に応用されている。蛋白質を細胞内から分泌させるこ
とにより、目的タンパク質が宿主細胞内で分解されたり
修飾されたりすることを回避できる。また、インクルー
ジョンボディーを形成する事を回避できるので蛋白質の
精製がより容易になる。目的とする蛋白質を分泌発現さ
せるには、そのＮ末端に２０〜４０アミノ酸程度のシグ
ナルペプチドを融合させた形で発現させる事が必要であ
る。ここでいうシグナルペプチドとは、宿主細胞由来の
分泌型蛋白質のシグナルペプチドである。これまでに、
種々のシグナルペプチドが蛋白質の分泌発現に使用さ
れ、様々なタンパク質の分泌発現が報告されてきた（K.
Nakamura,M.Inouye,;EMBO J.,1;771, 1982）（渡辺三登
利、菊地泰弘、依田幸司、日下巌、山崎真狩、田村学
造、日本農芸化学会昭和５９年度大会要旨集 p.425 19
84）。しかしながら、一般に、タンパク質を分泌発現さ
せた場合の生産量は、タンパク質を宿主内に蓄積させた
場合の生産量に比べて、かなり低い。そのため、先に述
べたようなメリットがあるにも関わらず、分泌発現方法
によるタンパク質の生産は、工業的には十分利用されて
いないのが現状である。以上のように、遺伝子工学的に
蛋白質を生産するための技術は、まだ十分とは言ず、生
産量の増加、すなわち、発現量を増加させ、また、分泌
発現量を増加させるのための技術の開発が望まれてい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、形質
転換体を使用して遺伝子工学的に目的のタンパク質を産
生させる場合に、生産量を増加させるために有用なＤＮ
Ａ断片およびそれを含むベクターを提供することにあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】生産量を増加させるため
には、形質転換体による目的タンパク質の発現量の増
加、形質転換体内での目的タンパク質の安定化、もしく
は分泌発現量の増加の少なくとも１つ以上が改善されれ
ばよい。本発明者は鋭意研究の結果、驚くべき事に、あ
る特定のポリペプチドとの融合タンパク質として目的の
タンパク質を発現させる事により、目的タンパク質の生
産量が極めて増加する事を見いだした。すなわち、所望
するタンパク質を特定のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドとの融合タンパク質として発現させることにより、
発現量が増加し、また、宿主体内からの分泌される量が
増加する。本発明者らはこれらの知見に基づき、本発明
を完成させた。

【０００６】すなわち、本発明の第１の態様は、目的蛋
白質を特定のポリペプチドとの融合蛋白質として発現さ
せるために使用できる、特定のポリペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡ断片を提供する。

【０００７】本発明第２の態様は、上記ポリペプチドを
コードする塩基配列を有することを特徴とするベクター
を提供する。

【０００８】本発明の第３の態様は、本発明第２の態様
のベクターで形質転換された形質転換体を提供する。

【０００９】本発明の第４の態様は、本発明の第２の態
様のベクターを使用した所望の蛋白質の産生方法を提供
する。

【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本明細書
において、アミノ酸は、当該分野で慣用されている、以
下に示す３文字表記もしくは１文字表記の略号を用いて
表される。なお、アミノ酸に関し光学異性体が有り得る
場合には、特に明示しない場合は、Ｌ体を表すものとす
る。更に、特に明示しない場合は、蛋白質のアミノ酸配
列の左端および右端は、それぞれＮ末端およびＣ末端で
ある。

【００１１】Ｇｌｎまたは、Ｑ：グルタミン残基Ａｓｐまたは、Ｄ：アスパラギン酸残基Ｐｒｏまたは、Ｐ：プロリン残基Ｔｙｒまたは、Ｙ：チロシン残基Ｖａｌまたは、Ｖ：バリン残基Ｌｙｓまたは、Ｋ：リジン残基Ｇｌｕまたは、Ｅ：グルタミン酸残基Ａｌａまたは、Ａ：アラニン残基Ａｓｎまたは、Ｎ：アスパラギン残基Ｌｅｕまたは、Ｌ：ロイシン残基Ｐｈｅまたは、Ｆ：フェニルアラニン残基Ｇｌｙまたは、Ｇ：グリシン残基Ｈｉｓまたは、Ｈ：ヒスチジン残基Ｓｅｒまたは、Ｓ：セリン残基Ｔｈｒまたは、Ｔ：スレオニン残基Ｉｌｅまたは、Ｉ：イソロイシン残基Ｔｒｐまたは、Ｗ：トリプトファン残基Ａｒｇまたは、Ｒ：アルギニン残基Ｍｅｔまたは、Ｍ：メチオニン残基Ｃｙｓまたは、Ｃ：システイン残基

【００１２】本明細書中で使用する核酸の塩基配列は、
以下の略号で表される。さらに、特に明示しない限り核
酸の塩基配列の左端および右端はそれぞれ５’末端およ
び３’末端である。

【００１３】Ａ：アデニンＣ：シトシンＧ：グアニンＴ：チミジン

【００１４】次に、本明細書中で用いられるＸ、Ｊ、
Ｙ、Ｚおよびｘ、ｊ、ｙ、ｚの記号について説明する。
本明細書中でＸは下記式１〜８より選ばれる少なくとも
１つのアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号１、
２、３、４、５、６、７、８に対応する）を表わし、ｘ
はそれをコードする塩基配列を表わす。

【００１５】式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ

【００１６】現在の技術を持ってすれば、上記の配列の
一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配
列や、上記配列のＮ末端および／またはＣ末端に、任意
のアミノ酸が任意の数付加することは現在の技術を使用
すれば可能である。たとえば、式２の配列は式１の配列
のＣ末端に１５個のアミノ酸が付加したものである。ま
た、式５、６、７の配列は式１の配列のＣ末端に１個な
いし３個のアミノ酸が付加したものである。式３、４、
８に示した配列は式１の配列の一部のアミノ酸を他のア
ミノ酸に置換した配列である。目的のタンパク質を、こ
れらの配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質と
して産生させた場合、何れの場合も、式１のポリペプチ
ドとの融合タンパク質として産生させた場合と同様に、
目的タンパク質の分泌発現量は増加する。特に、後に記
載する実施例２では式３、４、５、６の配列を有するポ
リペプチドとの融合タンパク質として目的タンパク質を
産生させた場合、分泌発現量に与える効果はより大であ
った。これらのことを考慮すると、上記式１ないし８の
アミノ酸配列に限らず、その一部のアミノ酸を他のアミ
ノ酸に置換したり、Ｎ末端および／またはＣ末端に、任
意のアミノ酸を、任意の数、付加もしくは欠損させるな
どして得られる配列も、蛋白質の生産量を増加させるた
めに使用できるものと考えられる。したがって、Ｘでし
めされるポリペプチドには、上記式１ないし８のアミノ
酸配列に、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加が生
じたアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。

【００１７】ｘは、Ｘで表されるアミノ酸配列をコード
する塩基配列であればいかなる塩基配列であってもよ
い。すなわち、コドンの縮重を考慮したすべての可能な
コドンの組み合わせが含まれる。ｘのより好ましい具体
的な塩基配列は下記式９ないし１５より選ばれる少なく
とも１つの配列である（式９〜１５は、それぞれ配列表
の配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６に対応する）。

【００１８】式９ GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT 式１０ GCT GTG CTA CCC CAA GAA GAG GAA GGA TCA GGG GGT GGG CAA CTG GTA ACT GAA GTC ACC AAG AAA GAA GAC TCG GGT 式１１ GCT GTG CTA GAT CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT 式１２ GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC GAT GGT 式１３ GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT GAT 式１４ GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT GAT GAT 式１５ GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT GAT GAT GAT 式１６ GCT GAC GAC CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT

【００１９】本明細書中でＪはシグナルペプチドのアミ
ノ酸配列を意味し、ｊはそれをコードする塩基配列を意
味する。ここでシグナルペプチドとは、原核生物由来、
真核生物由来に関わらずあらゆる種類の分泌蛋白質のシ
グナルペプチドを意味する。例えば、一般的に使用され
ているシグナルペプチドには、大腸菌外膜リポ蛋白質
（Ｌｐｐ）、大腸菌外膜蛋白質（ＯｍｐＦ）、λファー
ジレセプター蛋白質（ＬａｍＢ）等のシグナルペプチド
等がある。本発明でＪで示されるシグナルペプチドは、
特に限定されないが、好ましくは大腸菌アルカリフォス
ファターゼのシグナルペプチドがよい。以下に大腸菌ア
ルカリフォスファターゼのシグナルペプチドのアミノ酸
配列を示した（配列表の配列番号１７に対応する）。

【００２０】式１７ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ

【００２１】ｊが意味する塩基配列は、上記Ｊで示され
るシグナルペプチドをコードする塩基配列であればいか
なる配列でもよい。周知のように、１つのアミノ酸に対
応するコドンは複数存在する。したがって、ｊには、コ
ドンの縮重を考慮した、すべての可能な組み合わせが含
まれる。ｊのより好ましい具体例を以下の式１８に示し
た（配列表の配列番号１８に対応する）。

【００２２】式１８ ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC

【００２３】本明細書中でＹは化学物質や酵素等によっ
て認識され切断されうるアミノ酸もしくはアミノ酸配列
を意味し、ｙはそれをコードする塩基配列を意味する。
目的とする蛋白質が他のタンパク質との融合蛋白として
産生されている場合には、他のタンパク質と目的蛋白質
を切断分離することが必要になる。このような目的のた
めに、現在、特定のアミノ酸配列部分でポリペプチドを
切断する化学物質や酵素が使用されている。例えば、化
学物質としては、臭化シアン、酸、2-(2-Nitrophenylsu
lphonyl)-3-methyl-3-bromoindolenine(BNPS-skatol
e)、ヒドロキシルアミン等がある。また、部位特異的切
断に用いられる酵素としては、エンテロキナーゼ、トリ
プシン、血液凝固系第Ｘａ因子、コラゲナーゼ、トロン
ビン等がある。

【００２４】Ｙは、このような化学物質や酵素によって
認識され切断されるアミノ酸もしくはアミノ酸配列であ
ればいかなるアミノ酸およびアミノ酸配列であってもよ
い。例えば、臭化シアンによって認識されるＭｅｔ、ト
リプシンによって認識されるＬｙｓもしくはＡｒｇ、血
液凝固第Ｘａ因子によって認識されるアミノ酸配列Ｉｌ
ｅーＧｌｕーＧｌｙーＡｒｇ等（バイオトレンド Vol.
2 No.4 p111 1990 丸善参照）、いかなる配列であっ
てもよい。これらのアミノ酸もしくはアミノ酸配列の中
から適宜選択する事ができる。ｙが意味する塩基配列
は、上記Ｙで示されるアミノ酸またはアミノ酸配列であ
ればいかなる配列でもよい。周知のように１つのアミノ
酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、ｙに
は、コドンの縮重を考慮した、すべての可能な組み合わ
せが含まれる。ｙのより好ましい具体例は、Ｍｅｔをコ
ードするＡＴＧおよび、ＦＸａにより認識されるＩｌｅ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードする配列である。

【００２５】本明細書中でＺは目的とする蛋白質のアミ
ノ酸配列を意味し、ｚはそれをコードする塩基配列を意
味する。Ｚが意味する目的蛋白質には、ヒト由来タンパ
ク質に限らず、いかなる由来のタンパク質、いかなる性
質および物性のタンパク質が含まれる。例えば、インタ
ーロイキン１〜１１、各種コロニー刺激因子、ＴＮＦや
ＩＦＮα、β、γ等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＦＧＦ等
の増殖因子、インスリン等のホルモン、ｔ−ＰＡ等の酵
素、もしくはこれらのインヒビターやレセプター、ま
た、コラーゲン等の生体成分等である。Ｚが意味する目
的蛋白質は、特に限定されないが、好ましくは、生理活
性を有する蛋白質がよく、より好ましくは以下のＰＳＴ
Ｉ（Pancreatic Secretary Trypsin Inhibitor）を示す
[Kikuchi N. et al., J. Brochem. 102巻、６０７〜６
１２頁、１９８７年] 式１９、ＡＮ６８を示す式２０
（特願平４−１１９２８９号）、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを
示す式２１（特願平４−２９７３４４号）、Ｒ１１Ｓ／
Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを示す式２２（特願平４−２９７３
４４号）の配列を有するタンパク質、もしくは、これら
のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、付加、欠失が生じて
なるアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。これ
らのタンパク質は、それぞれ記載の公知の物質または特
許出願明細書中に詳細に記載されており、これらの特許
出願明細書中の記載を引用して本出願の内容とする。

【００２６】式１９ Asp Ser Leu Gly Arg Glu Ala Lys Cys Tyr Asn Glu Leu Asn Gly Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Pro Asn Glu Cys Val Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile Gln Lys Ser Gly Pro Cys

【００２７】式２０ Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn

【００２８】式２１ Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn

【００２９】式２２ Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Ser Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn

【００３０】以下に本発明の第１の態様を説明する。説
明で用いるＸ、ｘの示す意味およびそれらの好ましい例
については先に説明した通りである。本発明第１の態様
はｘで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片である。本
発明のＤＮＡ断片はｘで示される塩基配列に加え、その
５’末端や３’末端に制限酵素認識部位や任意のアミノ
酸やアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する物であ
ってもよい。例えば、その５’末端に、ｊで示されるシ
グナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、
すなわち、Ｊ−Ｘ（例えば配列表、配列番号２３〜３０
参照）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片は、本
発明第１の態様のＤＮＡ断片として好ましい（例えば配
列表、配列番号３１〜３８参照）。また、ｊ−ｘ−ｙ、
ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、ｊ−ｘ−ｚで示されるＤＮＡ断片も、
本発明第１の態様のＤＮＡ断片として好ましい。また、
本発明のＤＮＡ断片はいかなる方法で得られた物であっ
ても良い。例えば化学合成する場合には、目的の塩基配
列、およびその相補鎖の塩基配列を有するＤＮＡを、一
本鎖ＤＮＡ断片として設計する。次に各オリゴマーをＤ
ＮＡ合成機（例えばアプライドバイオシステムズ社製、
３９２Ａ型）を化学合成し精製する。その後、引き続い
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端のリン
酸化処理、アニーリング、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等による
ライゲーション等の処理をすることにより目的のＤＮＡ
断片を得る事ができる。また、プライマーを化学合成に
より作成して、適当なｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣ
Ｒ法等を使用して所望の変異を導入しながら得る事もで
きる。Ｊ−Ｘの好ましいアミノ酸配列の例を配列表の配
列番号２３〜３０に示し、ｊ−ｘの好ましい塩基配列の
例を配列表の配列番号３１〜３８に示した。

【００３１】目的タンパク質を、Ｘで示されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発
現させた場合、少なくとも、発現量および／または分泌
量が増加する。本発明第１の態様のＤＮＡ断片は、組換
えＤＮＡ技術を用いて産生させようとする目的の蛋白質
を、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
の融合蛋白質として発現させるために有用であり、すな
わち、目的蛋白質を高収率で産生させるために使用でき
る。

【００３２】以下に本発明の第２の態様を説明する。説
明の中で使用するＸ，Ｊ，Ｙ，Ｚおよびｘ，ｊ，ｙ，ｚ
の意味およびそれらの好ましい例については、それぞれ
先に説明した通りである。本発明第２の態様はｘで示さ
れる塩基配列を有することを特徴とするベクターであ
る。ｘで示される塩基配列は、タンパク質の生産量を増
加させるために有効なので、本発明のベクターは、蛋白
質の発現ベクターを構築する際の材料として使用でき
る。

【００３３】本発明のベクターは、好ましくはｘに加え
その５’末端にｊで示される配列を有するものがよい。
すなわち、ｊ−ｘで表される塩基配列を有するベクター
である。蛋白質がＪ−Ｘで示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合、
その蛋白質の分泌発現量は増加する。したがって、ｊ−
ｘで示される塩基配列は、少なくとも物質の分泌発現量
を増加させるために有用である。ｊ−ｘで示される塩基
配列を有するベクターは、物質を分泌発現させるための
発現ベクターの構築の際の材料として使用する事ができ
る。

【００３４】本発明のベクターは、ｊ−ｘの５’末端お
よび／または３’末端に制限酵素認識部位を有していて
もよい。その場合には、当該ｊ−ｘで示される塩基配列
を、適当な市販のベクターに組み込んだり、ｊ−ｘの下
流に任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列を組
み込んだりする場合に有用である。

【００３５】本発明のベクターは、ｊ−ｘの３’末端に
ｙで示される塩基配列を有するもの、すなわち、ｊ−ｘ
−ｙで表される配列を有するものであってもよい。本発
明のベクターは、ｊ−ｘ−ｙの５’末端および／または
３’末端に制限酵素認識部位を有していてもよい。その
場合には、当該ｊ−ｘ−ｙで示される塩基配列を、適当
な市販のベクターに組み込んだり、ｊ−ｘ−ｙの下流に
任意の目的とする蛋白質をコードする塩基配列を組み込
んだりする場合に有用である。

【００３６】本発明のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ
で表される配列の３’末端に任意の目的とする蛋白質を
コードする塩基配列が接続されたものであってもよい。
すなわち、ｊ−ｘ−ｚもしくはｊ−ｘ−ｙ−ｚで表され
る配列をその内部に有するベクターであってもよい。こ
のような場合、化学物質や酵素により認識されるアミノ
酸もしくはアミノ酸配列Ｙは、Ｚで示される目的蛋白質
のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸もしくはアミノ
酸配列であることが好ましく、従って、ｙもそのような
Ｙをコードする塩基配列がよい。

【００３７】本発明のベクターはｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、
ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚのいずれかで表さ
れる配列に加え、その上流および／または下流の任意の
位置に、発現に必要な配列や、マーカーとなる配列、リ
ンカー配列等を有していてもよい。例えば、ｊ−ｘ、ｊ
−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚの上流
に、一つ以上のプロモーター配列、ＳＤ配列を有してい
てもよいし、上流もしくは下流の任意の位置に、テトラ
サイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子もしく
はアンピシリン耐性遺伝子を有していてもよい。また、
プラスミドのコピー数の増幅を目的として、デヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）の配列等を上
流に有していてもよい。

【００３８】以上に述べた本発明のベクターは、いかな
る目的で使用されてもよい。例えば、遺伝子をクローニ
ングするために使用されてもよいし、他のベクターを構
築する際の材料として使用されてもよい。

【００３９】本発明のベクターは自己複製可能なベクタ
ーが好ましい。本発明第１の態様でも説明したように、
ｘで示される塩基配列は少なくともタンパク質の発現量
および／または分泌量を増加させるために有用である。
従って、ｘで示される塩基配列を有する本発明のベクタ
ーは、好ましくは、タンパク質の発現用に使用されるの
がよい。すなわち、本発明のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−
ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ、もしくはｊ−ｘ−ｚのいずれ
かの配列に加えて、少なくともプロモーター配列を有す
るものが好ましい。また、より好ましくは、プロモータ
ー配列に加え、オペレーター配列、ＳＤ配列も合わせ持
つものが好ましい。宿主が原核細胞である場合に機能す
るプロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーター、ｌ
ａｃプロモーター、λファージＰ_Lプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター、ｂｌａプロモーター、ｌｐｐプロモー
ター、ｏｍｐＡプロモーター、ｏｍｐＣプロモーター、
ｏｍｐＦプロモーター等がある。宿主細胞が真核細胞で
ある場合に機能するプロモーターの例としては、アクチ
ン遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０のプロモーター、ア
デノウイルスIIのプロモーター、エロンゲーションファ
クター遺伝子のプロモーター等がある。本発明のベクタ
ーが有するプロモーター配列は特に限定されないが好ま
しくは、下記〔１〕ないし〔３〕の群より選ばれる少な
くとも１つの配列が好ましい。〔１〕ｔｒｐプロモーター〔２〕ｔａｃプロモーター〔３〕ｌａｃプロモーター

【００４０】本発明の第１の態様のＤＮＡ断片、例え
ば、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ、ｊ−ｘ−ｚ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚ
で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片は、いずれも公
知のＤＮＡ技術で得る事ができる。例えば化学合成した
り、適当なＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ法等を使用
して変異を導入しながら、作製することも可能である。
もちろん、ｊ，ｘ，ｙ，ｚで示される塩基配列を有する
ＤＮＡ断片を個々に得てライゲーションさせてもよい。
ｊで示されるシグナルペプチドは、市販のベクターに適
当なものが組み込まれている場合があるので、適当な制
限酵素で切断後、分離して得る事ができる。

【００４１】本発明の第２の態様のベクターはいかなる
方法で得られた物であっても良い。例えば、本発明の第
２の態様のベクターは、ｊ−ｘ、ｊ−ｘ−ｙ，ｊ−ｘ−
ｚ、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列およびその相補
鎖からなる２本鎖ＤＮＡ断片を作成して、それを市販の
ベクターに正しい読みとり枠で組み込む事により得る事
ができる。また、適当なプロモーター配列やマーカー配
列をもつＤＮＡ断片をそれぞれ作成して、上記配列と共
に任意の位置に組み込んでもよい。ベクターにＤＮＡ断
片を組み込む方法は公知である（例えばＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａｌａｂｏｌａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等編、Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、１９８２）。使用する市販のベクターの由来は特に
限定されず、あらゆる種類のプラスミド、ファージ、ウ
イルス由来のベクターから適宜選択して使用できる。ベ
クターの代表的なものを列挙すると、ｐＵＣ１１８、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒ、λＺａｐII、λｇｔ１０、ｐＡｃ７
００、ＡｃＮＰＶ、ＹＡＣ、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＥＦＮ−
II等があげられる。

【００４２】次に、本発明の第３の態様の形質転換体に
ついて説明する。本発明の第３の態様の形質転換体は、
本発明の第２の態様のベクターを宿主となる細胞や微生
物に導入する事によって形質転換体とされる。宿主細胞
の例としては、大腸菌、枯草菌、酵母、ＣＯＳ細胞、Ｃ
ＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｓｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎａ
ｍａｌｗａ細胞等がある。また、温度感受性株や栄養要
求性等、ミュータントも本発明の形質転換体を得るため
の宿主細胞として使用できる。本発明の形質転換体は、
由来は特に限定されないが、しかしながら、好ましくは
下記〔１〕ないし〔３〕よりなる群より選ばれる少なく
とも１つがよい。〔１〕大腸菌〔２〕枯草菌〔３〕酵母

【００４３】本発明の形質転換体は、好ましくは、目的
とする蛋白質を発現し、産生するものがよい。この場合
には、形質転換に使用するベクターはプロモータ等発現
に必要な配列を有している事が必要であり、当該発現に
必要な配列と宿主細胞とは互いに機能し得るように組み
合わせる必要がある。代表的な組み合わせ例としてはＳ
Ｖ４０の初期プロモーターを有するベクターとＣＯＳ細
胞、トリプトファンプロモーターとトリプトファンＳＤ
配列を有するベクターと大腸菌等がある（実験医学臨時
増刊、遺伝子工学ハンドブック、１９９１年３月２０日
発行、羊土社参照）。

【００４４】形質転換体の作成方法は公知である（実験
医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック、既出、参
照）。すなわち、本発明の第２の態様の発現ベクター
を、エレクトロポレイション法、プロトプラスト法、ア
ルカリ金属法、リン酸カルシウムゲル法、ＤＥＡＥデキ
ストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒
子を用いてインフェクションさせる方法等の操作を行っ
た後、薬剤耐性や、酵素要求性、もしくは発現産物等を
指標にして、宿主が当該ベクターにより形質転換された
クローンを選択すればよい。

【００４５】本発明の第３の態様の形質転換体は、本発
明の第２の態様のベクターを大量に製造する目的や、目
的とする蛋白質を製造するために使用できる。

【００４６】次に、本発明の第４の態様の所望のタンパ
ク質の産生方法について説明する。説明で用いるＪ、
Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｊ、ｘ、ｙ、ｚの意味およびそれぞれ
の好ましい例については、先に説明した通りである。本
発明の第４の態様は、本発明第１の態様のＤＮＡ断片を
利用した蛋白質の産生方法、すなわち、本発明の第２の
態様のベクターを使用した蛋白質の製造方法である。当
該方法では、目的とする蛋白質Ｚを、Ｊ−Ｘ−Ｚもしく
はＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚいずれかで表されるアミノ酸配列を有
する融合タンパク質として発現させる工程を含む事を特
徴とする。すなわち、本発明の産生方法において、目的
とするタンパク質Ｚは、そのＮ末端に、Ｊ−Ｘもしくは
Ｊ−Ｘ−Ｙのアミノ酸配列を有する融合タンパク質とし
て発現されたのち、融合タンパク質として宿主細胞もし
くは培地に存在していてもよいし、切断されて、例えば
Ｘ−Ｚ、Ｘ−Ｙ−Ｚ、Ｚのような形で、宿主や培地中に
存在していてもよい。またこのような融合蛋白質の形で
単離・精製されてもよい。

【００４７】以下に本発明の産生方法の工程の一例を説
明する。当該産生方法は、例えば、下記ａ）からｆ）の
工程を順次行えばよい。ａ）ｊ−ｘ−ｚもしくはｊ−ｘ−ｙ−ｚで表されるＤＮ
Ａ断片を有する発現ベクターを得る。ｂ）ａ）で得た発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転
換する。ｃ）得られた形質転換体を培養し必要な場合は導入した
遺伝子の発現を誘導する。ｄ）得られた形質転換体の培養上清中および／あるい
は、形質転換体そのものから、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−
Ｘ−Ｙ−Ｚで表されるアミノ酸配列を有する融合タンパ
ク質を回収し精製する。ｅ）得られた融合タンパク質より、目的とする蛋白質Ｚ
を単離精製する。

【００４８】上記ａ）の発現ベクターは本発明第２の態
様のベクターであって、発現に必要な塩基配列を有する
ベクターである。当該ベクターを得るための方法は本発
明第２の態様で説明した。ｂ）の工程では形質転換体を
作製するが、ここで用いる宿主細胞はａ）で得られた発
現ベクターが機能し得るような宿主細胞である。形質転
換の方法は、本発明第３の態様で説明した通りである。

【００４９】上記ｃ）の工程では形質転換体を培養する
が、培養方法は宿主細胞に応じた公知方法で行えばよい
（例えば、生物化学工学、合葉修一等、１９７６年、東
京大学出版会および微生物遺伝学実験法ｐ９６〜１１
５、石川辰夫編共立出版１９８２年参照）。通常、大
腸菌であればＬ−ブロース培地やＭ９培地（カザミノ酸
含有）を培地として、３７℃にて１〜２日間ジャーファ
ーメンターにて培養する。枯草菌の場合はＴＢＡＢ（Ｔ
ｒｙｐｔｏｓｅＢｌｏｏｄＡｇａｒＢａｓｅ、Ｄ
ｉｆｃｏ社）プレートやＰｅｎａｓｓａｙｂｒｏｔｈ
（ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＭｅｄｉｕｍＮｏ．３、
Ｄｉｆｃｏ社）等を培地とし、３０℃〜３５℃にて１〜
２日間培養する。また、酵母であれば８％ショ糖を含む
ＹＰ培地を用い、２８℃にて約１〜２日間培養する。近
年では、目的蛋白質の分泌発現量を増加させる目的で形
質転換体を低温（約２０℃〜２５℃）で培養する方法も
確立されているので、必要に応じて低温培養を行っても
良い。このように、蛋白質の生産量を増加させるための
工夫がされた培養方法と本発明の産生方法を組み合わせ
れば、目的蛋白質の最終的な生産量はより高くなる事が
予想される。

【００５０】また、産生誘導刺激の必要性およびその方
法は、導入された組換えＤＮＡ分子の持つプロモーター
の種類によって決定される。例えば、導入されたプロモ
ーターがトリプトファンプロモーターであれば、Ｍ９培
地（最小必須培地）を使用し、３β−インドールアクリ
ル酸を添加して産生誘導刺激を行う。すなわち、本発明
の製造方法においては産生誘導刺激は形質転換に使用し
た発現ベクターや形質転換体に応じた方法で行えば良
い。

【００５１】上記ｄ）の工程では、Ｊ−Ｘ−Ｚもしくは
Ｊ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表されるアミノ酸配列を有する融合タ
ンパク質を回収、精製する。通常シグナルペプチドを有
するタンパク質は、細胞から培養上清中に分泌される
が、宿主細胞内にインクルージョンボディーとして蓄積
されることもある。培養上清より回収するには、培養上
清もしくはその濃縮液をスターティングマテリアルとし
て精製を行う。また、目的の蛋白質がペリプラズムに蓄
積される場合は、Ｗｉｌｌｓｋｙ等の方法（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．ｐｐ５９５１９７６）等で
蛋白質を回収後精製する。細胞内に蓄積された融合タン
パク質を回収するには、リゾチーム、界面活性剤、凍結
融解、加圧等の手段を用いて細胞を破壊した後、遠心分
離、濾過等の方法により抽出する。その後リフォールデ
ィング処理を行い（例えば、ＴｈｏｍａｓＥ．Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８７
巻、５６３ー５７７頁、１９７４年参照）、更に精製す
ればよい。

【００５２】通常行われるタンパク質の精製方法として
は、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、
電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性ク
ロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種ア
フィニティクロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラ
フィー等がある。したがって、工程ｄ）においても、目
的とする融合タンパク質を、その分子量や生理活性を指
標として、通常使用され得る精製方法を適宜組み合わ
せ、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して行えば良
い。

【００５３】工程ｅ）では、得られた融合タンパク質か
ら、目的とする蛋白質Ｚを単離精製する。工程ｄ）で培
養上清もしくはペリプラズムから融合タンパク質を回収
している場合には、Ｊで表されるシグナルペプチド部分
は既に切断されている場合が多いので、融合タンパク質
からＸもしくはＸ−Ｙで表される部分を切断除去すれば
よい。また、細胞内より回収している場合にはＪ−Ｘ、
もしくはＪ−Ｘ−Ｙで表される部分を切断除去する。切
断除去には、特定のアミノ酸もしくはアミノ酸配列（融
合タンパク質がＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚで表される場合には、Ｙ
で示されるアミノ酸もしくは表されるアミノ酸配列）を
認識して、それと反応し、結果的にポリペプチド鎖を切
断する効果を有する化学物質や酵素を使用する。ここで
用いる化学物質や酵素は特に限定されないが、目的とす
る蛋白質Ｚの活性を失わないような物質を選択する事が
必要である。目的とする蛋白質Ｚは、そのアミノ酸配列
を完全に有した形で切断単離されるのが好ましいが、そ
の活性や特性を失わない範囲であれば、化学物質等の処
理によりそのＮ末端側やＣ末端側の一部が欠失される事
があってもかまわない。また、同様に、目的とする蛋白
質ＺのＮ末端側に、ＸやＹに由来するペプチド断片が存
在していてもかまわない。いうまでもないが、形質転換
体によりＪ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚとして発現
された融合蛋白質から、余分なＪーＸやＪ−Ｘ−Ｙが宿
主細胞自身によって除去されるような場合には化学物質
や酵素を用いての切断処理は必要ない。

【００５４】

【実施例】以下に実施例をもって本発明を一層具体的に
説明するが、これらは一例として示すものであり、本発
明はこれらによって、何等、限定されるものではない。
また、以下の記載において用いる略号は、当該分野にお
ける慣用略号に基づくものである。なお、実施例中の諸
操作は、下記の雑誌、成書を参考として実施した。

【００５５】１．A Practical guide to molecular clo
ning,Bernard Perbal著、１９８４年、John Wiley & So
ns, Inc. ２．A Practical guide to molecular cloning, Second
edition、Bernard Perbal著、１９８７年、John Wiley
& Sons, Inc. ３．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、１９８０年、講
談社４．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、１９８２
年、講談社５．Molecular Cloning, a laboratory manual、T. Man
iatis 等編、１９８２年、Cold Spring Harbor Laborat
ory ６．Methods in Enzymology 、６５巻、L. Grossman 等
編、１９８０年、Academic Press ７．Methods in Enzymology 、６８巻、R. Wu 編、１９
７９年、Academic Press ８．PCR Protocols 、a guide to methods and applica
tions 、Michadel A. I 等編、１９９０年、Academic P
ress ９．Molecular Cloning, a laboratory manual、Second
edition T. Maniatis 等編、１９８９年、Cold Spring Harbor L
aboratory １０．実験医学別冊、細胞工学的技術総集編、１９８９
年、羊土社１１．実験医学別冊、遺伝子工学ハンドブック、１９９
１年、羊土社

【００５６】実施例１．プラスミドｐＫＫ２２３Ｍの作
成ｊ−ｘで示される塩基配列を有するベクターであって、
ｊとして前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼ
のシグナル配列をコードする塩基配列、ｘとして前記式
９の塩基配列を有するプラスミドｐＫＫ２２３Ｍを以下
の方法で作成した。まず、市販のプラスミドｐＫＫ２２
３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII にて二
重消化し、得られたＤＮＡ断片混合物を０．７％アガロ
ースゲル電気泳動に供し、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片を
ジエチルアミノエチルセルロ−ス紙（以後、ＤＥＡＥセ
ルロース紙と略す）に吸着させ、残りのＤＮＡ断片と分
離した。さらに、ＤＥＡＥセルロース紙を高濃度塩溶液
（２ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）／１ｍＭＥＤＴＡ）にて洗浄し、約４．５ｋ
ｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥセルロース紙より回収した。
まず、図１の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメ
ント１ａ）を、４つの断片に分けて設計した。これら４
つの断片のうち、Ｓ２、Ｓ３をＡＴＰの存在下、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化した。続
いて、オリゴヌクレオチドＳ１とＳ３およびＳ２とＳ４
をそれぞれアニーリングさせた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造株式会社製）を使用してライゲーションした。
ライゲーション後のサンプルを８％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供し、約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を分
離、調製した。次に、前記約４．５ｋｂのＤＮＡ断片と
約１２０ｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションし、大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望のアンピシリン耐性
コロニーを分離した。得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＫＫ２２３Ｍと命名し
た（図２参照）。

【００５７】実施例２．プラスミドｐＭ４７４の作成本発明のプラスミドｐＭ４７４を以下の方法で作成し
た。当該プラスミドは、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示されるＰＳ
ＴＩの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそ
れぞれ以下の塩基配列を有するプラスミドである。ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシ
グナル配列をコードする塩基配列、ｘ：式９の塩基配列ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列ｚ：ＰＳＴＩをコードする塩基配列

【００５８】〔１〕ｐＭ４７４の作成プラスミドｐＭ４６３（ＫＡＮＡＭＯＲＩＴ．等、Ｇ
ＥＮＥ、６６巻、２９５ー３００頁、１９８８年、図３
参照）を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＮｒｕＩにて二重
消化し、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。一方、
ＳＤ配列、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペ
プチドをコードする塩基配列、式１のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列およびＰＳＴＩのＮ末端側のアミノ酸
配列の一部をコードする塩基配列から成るＤＮＡ断片
を、６つの断片に分割して設計した（フラグメントＡ、
図４参照）。実施例１の要領で化学合成し、最終的に、
約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、調製した。前記約
３．４ｋｂのＤＮＡ断片と約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を
ライゲーションし、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換さ
せ、所望のアンピシリン耐性コロニーを分離した。得ら
れた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラス
ミドｐＭ４７４を得た。プラスミドｐＭ４７４を制限酵
素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化し、目的と
するサイズ約３００ｂｐの断片を抽出、精製した。ＤＮ
Ａシークエンサー（ＤＮＡシークエンサー３７０Ａ、ア
プライドバイオシステムズ社）を使用して、シークエン
シングを行った。プラスミドｐＭ４７４のＨｉｎｄIII
消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基
配列、および対応するアミノ酸配列を図５に示した（配
列表の配列番号１９参照）

【００５９】〔２〕分泌発現量の比較本発明のプラスミドｐＭ４７４を使用した場合のＰＳＴ
Ｉ分泌発現量を、プラスミドｐＭ４６３（既出）を使用
した場合のそれと比較した。プラスミドｐＭ４６３に
は、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチ
ドをコードする塩基配列の下流に、直接、ＰＳＴＩをコ
ードする塩基配列が組み込まれている。まず、ハナハン
の方法（Hanahan,D.著、Techniques for Transformatio
n of E. Coli、 In: ＤＮＡ cloning, vol 1, Glover,
D. M. (ed.),109-136頁、IRLPress 、1985年）によ
り、プラスミドｐＭ４６３とｐＭ４７４でそれぞれｌｏ
ｎ^-株の大腸菌ＧＣ４６７０（ｌｏｎ：Ｔｎ１０ｔｈ
ｒ，ｌｅｕ，ｌａｃＹ）を形質転換し、大腸菌ＧＣ４６
７０（ｐＭ４６３）およびＧＣ４６７０（ｐＭ４７４）
を作製した。それぞれを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含
有Ｌ−ブロース５ｍｌにて終夜培養後、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸２％を含むＭ９ＣＡ培地５０
倍量に、この培養液を植菌し、３７℃にて約１時間培養
した。培地に終濃度１０μｇ／ｍｌの３β−インドール
アクリル酸（和光純薬工業株式会社製）を添加し、さら
に１６時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離器
（ＣＲ２０Ｂ３、日立工機株式会社製）を使用して、遠
心分離し、上清を回収した。それぞれの培養上清を、
０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルと
し、後述の方法でトリプシン阻害活性を測定した。その
結果、ｘで示される塩基配列を有しているプラスミドｐ
Ｍ４７４で、極めて高い分泌発現量が確認された。以下
に結果を示す。

【００６０】形質転換体培養上清中の比活性より算出したトリプシン阻害活性タンパク質量 ──────────────────────────────────── GC4670（pM463）３１１Ｕ／ｍｌ５０μｇ／ｍｌ GC4670（pM474）８２７Ｕ／ｍｌ１４０μｇ／ｍｌ

【００６１】実施例３．ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基
配列を有するポリペプチドＡＮ６８の発現ベクターであ
って、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を
有するプラスミドを、以下の〔２〕ないし

〔９〕の方法
で作成した。ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシ
グナル配列をコードする塩基配列、ｘ：前記式９ないし１２いずれかの塩基配列ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列ｚ：ポリペプチドＡＮ６８をコードする塩基配列また、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチ
ドをコードする塩基配列の下流に直接、ポリペプチドＡ
Ｎ６８をコードする塩基配列が組み込まれたプラスミド
ｐＭ５９４を〔１〕の方法で作成した。

【００６２】〔１〕プラスミドｐＭ５９４の作成ｐＭ５９４をプラスミドｐＭ５５２（特願平３−３２５
２２０号明細書参照）から以下のように作成した。プラ
スミドｐＭ５５２は、下記式２３のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列（すなわち、下記式２４の塩基配列）
を、大腸菌アルカリフォスファターゼシグナルペプチド
をコードする塩基配列の下流に有し、トリプトファンプ
ロモーター、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミ
ドである（図６、微工研条寄第３５６１号）。

【００６３】式２３ Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn

【００６４】式２４ ACC GTC GCC GCC TGC AAT CTC CCC ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CAG CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC TAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC TTC TCC AAC

【００６５】まず、第一次ＰＣＲ用のセンスプライマー
としてＨｉｎｄIII プライマー（図７）、ＡＮ６８プラ
イマー（図８）を、おのおの化学合成し、これらをプラ
イマーとして、プラスミドｐＭ５５２を鋳型とする第一
次ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ジーンアンプキット
^R（宝酒造株式会社）を用いて行い、９４℃、１分間、
５５℃、２分間、７２℃、３分間を１サイクルとする反
応を、３０サイクル繰り返した。第一次ＰＣＲ後の増幅
産物の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動に供した
ところ、目的とする、サイズ約１３０ｂｐのＤＮＡ断片
が確認された。増幅産物をフェノール処理／エタノール
沈殿で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これを
センスプライマーとして、プラスミドｐＭ５５２を鋳型
とする第二次ＰＣＲを第一次ＰＣＲと同様に行なった。
なお、アンチセンスプライマーとしては、ｐＢＲＢａ
ｍＨＩプライマー（図９）を化学合成して使用した。第
二次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％アガロースゲ
ル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３５０
ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノール
処理／エタノール沈殿にて精製した後、制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＢａｍＨＩで消化し、サイズ約３００ｂｐ
のＤＮＡ断片を得た。プラスミドｐＭ４６３（既出）を
制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩにて二重消化
し、サイズ約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、上
記ＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＭ５９
４を得た。

【００６６】〔２〕ｐＭ７１０の作製図１０の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
１ｂ）を５つの断片に分割して設計し、実施例１の要領
で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を得
た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄII
I およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片と
をライゲーションし、プラスミドｐＭ７１０を作製し
た。プラスミドｐＭ７１０のＨｉｎｄIII 消化部位から
ＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および
対応するアミノ酸配列を図１１に示した（配列表の配列
番号２０参照）

【００６７】〔３〕ｐＭ７７６の作製図１２の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
２）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約２００ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７６を作製
した。

【００６８】〔４〕ｐＭ７７７の作製図１３の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
３）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７７を作製
した。

【００６９】〔５〕ｐＭ７７８の作製図１４の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
４）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７８を作製
した。

【００７０】〔６〕ｐＭ７７９の作製図１５の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
５）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７７９を作製
した。

【００７１】〔７〕ｐＭ７８０の作製図１６の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
６）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７８０を作製
した。

【００７２】〔８〕ｐＭ７８１の作製図１７の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
７）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約１６０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７８１を作製
した。

【００７３】

〔９〕ｐＭ７１１の作製図１８の塩基配列で示されるＤＮＡ断片（フラグメント
８）を６つの断片に分割して設計し、実施例１と同様の
方法で化学合成し、最終的に約１５０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。一方、プラスミドｐＭ５９４を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＡｐａＩで二重消化し、約３．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断
片とをライゲーションし、プラスミドｐＭ７１１を作製
した。

【００７４】〔１０〕分泌発現量の比較〔１〕ないし

〔９〕で得られたプラスミドを使用して、
実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形
質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）、ＪＥ５５０５
（ｐＭ７１０）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７６）、ＪＥ５
５０５（ｐＭ７７７）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７７８）、
ＪＥ５５０５（ｐＭ７７９）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７８
０）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７８１）、ＪＥ５５０５（ｐ
Ｍ７１１）を得た。これらをそれぞれ培養して培養混合
物を回収した。それぞれの培養混合物を遠心分離器を使
用して、遠心分離し、上清を回収した。培養上清を、
０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈してサンプルと
し、後述の方法で培養上清中のトリプシン阻害活性を測
定した。測定結果を以下に示す。ｘで示される塩基配列
を有するプラスミドにおいて、プラスミドｐＭ５９４と
比較して極めて高い分泌発現量が得られた。本発明のベ
クターを使用し、ポリペプチドＡＮ６８をＸで示される
アミノ酸配列との融合蛋白として発現させることによ
り、分泌発現量が極めて低いＡＮ６８の分泌発現量が増
加したことが確認された。

【００７５】形質転換体ｘがコードするアミノ酸配列培養上清中の比（ｘの塩基配列）トリプシン阻害活性 ──────────────────────────────────── 実験１ JE5505（pM594） − 4.5 1 JE5505（pM710）式１（式９） 220 48.9 実験２ JE5505（pM710）式１（式９） 105 1 JE5505（pM776）式２（式１０） 75 0.7 実験３ JE5505（pM710）式１（式９） 188 1 JE5505（pM777）式３（式１１） 356 1.9 JE5505（pM778）式４（式１２） 891 4.7 JE5505（pM779）式５（式１３） 572 3.0 JE5505（pM780）式６（式１４） 737 3.9 JE5505 (pM781) 式７（式１５） 168 0.9 実験４ JE5505 (pM710) 式１（式９） 131 1 JE5505 (pM711) 式８（式１６） 81 0.6

【００７６】〔１１〕菌体内発現量の比較〔１〕で得られた形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５９
４）および〔２〕で得られたＪＥ５５０５（ｐＭ７１
０）を培養し、培養混合物を回収した。分光光度計を使
用して、波長５５０ｎｍの吸光度を測定したところＯＤ
１６であった。この培養混合物６．３μｌ相当分を遠心
分離し、ペレットを回収した。これに、終濃度が１５％
グリセロール／０．００２５％ＢＰＢ／０．０６３Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／２％ＳＤＳ／５％
β−メルカプトエタノールとなるように泳動バッファー
１０μｌを加えた。全量を、ラエムリ(Laemmli) の方法
（Laemmli U. K., Nature, 227巻、680-685 頁、1970
年）を参考にして、以下の方法でＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に
供した。分子量マーカーとしては、ＢＲＬ社製のサイズ
４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、
６．２ｋＤのマーカーを使用した。泳動終了後、クマシ
ーブリリアントブルーＲ−２５０にて染色を行なった。
その結果、ＪＥ５５０５（ｐＭ５９４）に比べ、ＪＥ５
５０５（ｐＭ７１０）の方が明らかに、発現量が高い事
が確認された（図１９）。

【００７７】実施例４．プラスミドｐＭ７２７の作成ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有する、ポリペプ
チドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの発現ベクターであって、ｊ，
ｘ，ｙ，ｚとしてそれぞれ以下の塩基配列を有するプラ
スミドを、以下の方法で作成した。ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシ
グナル配列をコードする塩基配列、ｘ：前記式９の塩基配列ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列ｚ：ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ

【００７８】〔１〕プラスミドｐＭ７４８の構築プラスミドｐＭ７１０を鋳型とし、２度のＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一次
ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、化学合成して得
たＹ４６Ｄプライマー（図２０）を、アンチセンスプラ
イマーとしてはｐＢＲＢａｍＨＩプライマーを使用し
た。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳
動に供したところ、目的とするサイズ約１２０ｂｐのバ
ンドが認められた。この増副産物をアンチセンスプライ
マーとし、ＨｉｎｄIII プライマーをセンスプライマー
として、プラスミドｐＭ７１０を鋳型とする第二次ＰＣ
Ｒを行った。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲ
ル電気泳動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂ
ｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェノール処
理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要
領でプラスミドｐＭ４６３に組み込み、プラスミドｐＭ
７４８を作製した。

【００７９】〔２〕プラスミドｐＭ７２７の構築プラスミドｐＭ７４８を鋳型として、２度のＰＣＲを行
った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従った。第一
次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてはＨｉｎｄIII プ
ライマーを、アンチセンスプライマーとしてはＱ１９Ｋ
プライマー（図２１）を化学合成し使用した。得られた
増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したと
ころ、目的とするサイズ約２１０ｂｐのバンドが認めら
れた。この増幅産物をセンスプライマーとし、ｐＢＲＢ
ａｍＨＩプライマーをアンチセンスプライマーとし、プ
ラスミドｐＭ７４８を鋳型とする第二次ＰＣＲを行っ
た。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳
動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバン
ドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタ
ノール沈澱で精製した後、実施例３〔１〕の要領で、プ
ラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ
７２７を作製した。プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄII
I 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩
基配列、および対応するアミノ酸配列を図２２に示した
（配列表の配列番号２１参照）。

【００８０】〔３〕分泌発現量の測定実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形
質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を作成し、培養し
た。培養混合物を回収して遠心分離し、上清を回収し
た。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノ
ールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈
してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を
測定した。その結果、培養上清中のトリプシン阻害活性
は１１７Ｕ／ｍｌであり、比活性から算出したタンパク
質量を求めると約１４μｇ／ｍｌであった。本発明のベ
クターを使用しない場合と比較して、明らかに高い分泌
発現量が得られたことから、本発明のベクターを使用し
てポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６ＤをＸで示されるアミ
ノ酸配列との融合蛋白質として発現させることにより、
本来分泌発現しにくいＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの分泌発現量
が増加することが確認された。

【００８１】実施例５．プラスミドｐＭ７６５の作成〔１〕プラスミドｐＭ７６５を以下の方法で作成した。
プラスミドｐＭ７６５は、ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩
基配列を有する、ポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ
４６Ｄの発現ベクターであって、ｊ，ｘ，ｙ，ｚとして
それぞれ以下の塩基配列を有するものである。ｊ：前記式１８の大腸菌アルカリフォスファターゼのシ
グナル配列をコードする塩基配列、ｘ：前記式９なの塩基配列ｙ：Ｍｅｔをコードする塩基配列ｚ：ポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ

【００８２】プラスミドｐＭ７２７を鋳型として２度の
ＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３〔１〕に従
った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてはＨｉ
ｎｄIIIプライマーを、アンチセンスプライマーとして
は、化学合成して得たＲ１１Ｓプライマー（図２３）を
使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル
電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約１８０ｂ
ｐのバンドが認められた。この増幅産物をセンスプライ
マーとし、ｐＢＲＢａｍＨＩプライマーをアンチセンス
プライマーとして、プラスミドｐＭ７２７を鋳型とする
第二次ＰＣＲを行った。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、
１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的
とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが確認された。この
増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した
後、実施例３〔１〕の要領でプラスミドｐＭ４６３に組
み込み、発現用プラスミドｐＭ７６５を作製した。プラ
スミドｐＭ７６５のＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨ
Ｉ消化部位までの確認された塩基配列、および対応する
アミノ酸配列を図２４に示した（配列表の配列番号２２
参照）。

【００８３】〔２〕分泌発現量の測定実施例２の要領で大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、形
質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）を作成し、培養し
た。培養混合物を回収して遠心分離し、上清を回収し
た。培養上清を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノ
ールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で各濃度に希釈
してサンプルとし、後述の方法でトリプシン阻害活性を
測定した。その結果、培養上清中のトリプシン阻害活性
は４６０Ｕ／ｍｌであり、比活性から算出したタンパク
質量を求めると約７５μｇ／ｍｌであった。本発明のベ
クターを使用しない場合と比較して、明らかに高い分泌
発現量が得られ、Ｘで示されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドとの融合蛋白質として発現させることによ
り、分泌量が増加することが確認された。

【００８４】実施例６．プラスミドｐＭ７６５を利用し
たポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産〔１〕プラスミドｐＭ７６５を用い、実施例２の要領で
大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５
０５（ｐＭ７６５）を作製し、培養した。得られた培養
混合物をＢｅｎｃｈｍａｒｋＧＸ（メンブレックス（Ｍ
ｅｍｂｒｅｘ）社、孔径０．２μｍ）を使用して濃縮
後、４℃にて、約１００００×ｇ、２０分間遠心分離を
行い菌体を回収した。

【００８５】〔２〕〔１〕で得られた菌体を破砕用溶液
（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭＥＤ
ＴＡ）に懸濁し、ミニラボ（ＲＡＮＮＩＥ社）を使用
し、８００ｂａｒで加圧破砕した。その後、４℃、２０
分間、約１００００×ｇで遠心分離し、ペレットを回収
した。回収したペレットに破砕用溶液を添加し、再び、
４℃、２０分間、約１００００×ｇで遠心分離した。こ
の操作を更に２回行い、ペレットを回収した。回収した
ペレットに可溶化バッファー（５Ｍグアニジン塩酸，
０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０，５０ｍＭＴｒｉｓ塩
酸ｐＨ８．０，５ｍＭＥＤＴＡ，２ｍＭ還元型グル
タチオン，０．０２ｍＭ酸化型グルタチオン）を加
え、更に、終濃度５０ｍＭとなるように２−メルカプト
エタノールを添加し、４℃にて終夜撹拌した。この溶液
を限外濾過膜（ＹＭ−５、グレースジャパン社）を使用
して濃縮した後、孔径０．４４μｍのフィルターを使用
して濾過した。ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００ＨＲ
（ファルマシア社製）を充填したカラム（５cmφ×９５
cm）を、前述の可溶化バッファーで平衡化し、これに濃
縮濾液を添加した。前述の可溶化バッファーを展開液と
し、波長２８０ｎｍにおける吸光度を指標として蛋白質
含量をモニターしながら、流速３．５ｍｌ／分でゲル濾
過を行った。３０ｍｌずつ分取し、各画分の一部を採取
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、
ＰＡＧＥＬ^R（ＳＰＵ−１５Ｓ、アトー社）を使用し、
その使用説明書に従って行った。クマシーブリリアント
ブルーで染色し、目的の分子量のポリペプチドを多く含
む画分を選択した。この画分の蛋白質含量がほぼ０．５
ｍｇ／ｍｌとなるように、可溶化バッファーを使用して
調整し、リフォールディング処理用サンプルとした。

【００８６】〔３〕〔２〕で得たリフォールディング処
理用サンプルを、〔２〕で使用した可溶化バッファーか
らグアニジン塩酸を除いた溶液、約１５倍量に対し、２
回透析した。次いで、約１５倍量の蒸留水に対して３回
透析を行った。透析終了後、塩酸を使用してサンプルを
ｐＨ２に調整した。このサンプルについて以下のように
精製を行った。

【００８７】〔４〕予め０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化し
たＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、ポリ
マーラボラトリーズ社製）に、〔３〕で得たリフォール
ディング処理後のサンプルを添加し、０．１％ＴＦＡ溶
液を用いて吸着させた。溶出は、０．１％ＴＦＡ／アセ
トニトリル溶液を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配
（０−７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３
０分、７０−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
溶液／３分）により、流速５ｍｌ／分で、波長２８０ｎ
ｍにおける吸光度をモニターしながら溶出を行い、５ｍ
ｌずつ分取した。各画分のトリプシン阻害活性を、後述
の方法で測定し、活性の認められた画分を凍結乾燥後、
７０％蟻酸におよそ１００μＭとなるように溶解した。
次いで、モル濃度比で２０００倍量となるように臭化シ
アンを加え、２５℃、２４時間暗所に静置した。これに
蒸留水を加えて２倍希釈した。

【００８８】〔５〕ＳＰ−トヨパール（３０ｍｍφ×１
５０ｍｍ、東ソー株式会社）を１０％蟻酸溶液で平衡化
した後、ＦＰＬＣシステム（既出）を用いて以下の方法
で陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。すなわ
ち、〔４〕で得られたサンプルをＳＰ−トヨパールに添
加し、１０％蟻酸溶液を用いて吸着させた。ＮａＣｌ／
１０％蟻酸を使用し、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０−
１．２ＭＮａＣｌ／１０％蟻酸溶液／１００分間）
により、流速８ｍｌ／分で、波長２８０ｎｍの吸光度を
モニターしながら溶出した。３２ｍｌずつ分取し、各画
分のトリプシン阻害活性を後述の方法で測定した。得ら
れた活性画分を〔３〕の逆相クロマトグラフィー用サン
プルとした。

【００８９】〔６〕ＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×
１５０ｍｍ、既出）を０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化した
後、〔５〕で得られた活性画分を添加し、０．１％ＴＦ
Ａ溶液を用いて吸着させた。溶出は０．１％ＴＦＡ／ア
セトニトリル溶液を用い、アセトアニリルの直線濃度勾
配（０−７０％／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／１
５分、７０−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
溶液／３分）により流速１０ｍｌ／分で行った。波長２
８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出を行い、ピー
クごとに分取し、各画分のトリプシン阻害活性を実施例
８の方法で測定した。得られた活性画分を凍結乾燥し
て、精製標品を得た。

【００９０】〔７〕〔６〕で得られた精製標品をＰＡＧ
ＥＬ^R（既出）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
銀染色の結果、単一のバンドが認められた。

【００９１】〔８〕アミノ酸配列の分析〔６〕で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し、
モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−
120A PTHアナライザー（アプライドバイオシステムズ
社）を用いてアミノ酸配列の分析を行なった。ＰＴＨア
ミノ酸を２７０ｎｍの紫外部吸収にて検出して、その保
持時間を測定し、予め同一の方法で分離した標準ＰＴＨ
アミノ酸（アプライドバイオシステムズ社）の保持時間
を基準にしてアミノ酸の同定を行なった。その結果、目
的とするタンパク質、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄが
精製されたことが確認された。

【００９２】実施例７．プラスミドｐＭ７２７を利用し
たポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産〔１〕プラスミドｐＭ７２７を用い、実施例２の要領で
大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５
０５（ｐＭ７２７）を作製し、培養した。培養上清を回
収して、６ＮのＨＣｌを加えてｐＨ２に調製した。孔径
１．０μｍのフィルター（日本ポール社製）を使用して
濾過した。濾液を、更に、ＣＮカートリッジ（孔径０．
２２μｍ、ミリポア社製）を使用して濾過した。

【００９３】〔２〕ＳＰ−トヨパール（５５０Ｃ、東ソ
ー株式会社）を５０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．
０）で平衡化した後、〔１〕で得られた濾液を添加し
た。５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ３．０）で洗
浄後、５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ５．０）を
使用し、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶
出した。各画分のトリプシン阻害活性を実施例８の方法
で測定した。得られた活性画分を、分画分子量３０００
の限外濾過膜（フィルトロン、富士フィルター社製）に
て濃縮後、孔径０．２２μｍのフィルターを使用して沈
澱を除去した。上清を回収して、以下のゲル濾過を行っ
た。

【００９４】〔３〕Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（２６ｍｍφ
×６００ｍｍ、ファルマシア社製）を５０ｍＭギ酸ア
ンモニウム（ｐＨ５．０）で平衡化し、〔２〕で得られ
た上清を添加した。５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ
５．０）で、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしなが
ら、流速２ｍｌ／分で溶出を行った。６ｍｌごとに分取
し、各画分のトリプシン阻害活性を後述の方法で測定し
た。得られた活性画分を凍結乾燥した。

【００９５】〔４〕〔３〕で得た凍結乾燥品を、実施例
６〔５〕、〔６〕、〔７〕の方法に準じて臭化シアン分
解および精製した。得られた精製標品を実施例６〔６〕
の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに共したところ単一のバンド
が確認された。実施例６〔７〕の方法でアミノ酸分析を
行った結果、目的とするタンパク質、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６
Ｄであることが確認された。トリプシン阻害活性の測定培養混合物を遠心分離して得た培養上清に０．１％ＢＳ
Ａ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）を加えて段階希釈し、ウシトリプシン阻害活性
測定用のサンプルとした。これらの活性測定用サンプル
のウシトリプシン阻害活性を、合成基質Ｓ−２４４４
（第一化学薬品株式会社製）を基質として、カッセル(K
assell) の方法（Kassell B.等、Methods in Enzymol.,
１９巻、８４４−８５２頁、１９７０年）に準じて以下
のように測定した。すなわち、まず、ウシトリプシン
（Type XIII 、シグマ社製）を、０．００１ＭＨＣｌに
溶解し、１３６００ＢＡＥＥＵ／ｍｌに調製し、それ
を、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）にて希釈し、０．６ＢＡＥＥ
Ｕ／ｍｌのトリプシン溶液を調製した。一方、合成基質
Ｓ−２４４４を蒸留水に溶解し、２ｍＭのＳ−２４４４
溶液を調製した。次に、上述のウシトリプシン阻害活性
測定用サンプル１００μｌもしくはコントロールを、ウ
シトリプシン溶液１００μｌと混合した。３７℃にて１
０分間静置した後、上記Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加
え、反応を開始させた。３７℃にて２０分間反応後、５
０％酢酸５０μｌを加えて反応を停止させ、分光光度計
にて、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。な
お、データ処理の際に、ここで用いた各種溶液の吸光度
への影響を差し引くための対照としては、上記ウシトリ
プシン溶液１００μｌに、予め、５０％酢酸５０μｌを
加え、ウシトリブシン阻害活性測定用サンプルもしくは
コントロール１００μｌ、Ｓ−２４４４溶液５０μｌを
加えたものを使用した。

【００９６】

【発明の効果】組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を
生産する際に、本発明のＤＮＡ断片を有する本発明のベ
クターを用いて、所望のタンパク質を特定のポリペプチ
ドの融合タンパク質として発現させると、所望のタンパ
ク質の発現量および／または宿主体内からの分泌量が増
加する。したがって、本発明は、組換えＤＮＡ技術で所
望のタンパク質を生産する際のタンパク質の生産量を増
加させ、また、本来分泌発現しにくいようなタンパク質
の分泌発現を可能にする。

【００９７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド

【００９８】配列番号：２配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gln Lys 1 5 10 15 Val Thr Glu Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Gly 20 25

【００９９】配列番号：３配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド

【０１００】配列番号：４配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド

【０１０１】配列番号：５配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asp 1 5 10

【０１０２】配列番号：６配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp 1 5 10

【０１０３】配列番号：７配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp Asp 1 5 10

【０１０４】配列番号：８配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド

【０１０５】配列番号：９配列の長さ：３３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）

【０１０６】配列番号：１０配列の長さ：７８配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７６）配列 GCT GTG CTA CCC CAA GAA GAG GAA GGA TCA GGG GGT GGG CAA CTG 45 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gln Lys 1 5 10 15 GTA ACT GAA GTC ACC AAG AAA GAA GAC TCG GGT 78 Val Thr Glu Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Gly 20 25

【０１０７】配列番号：１１配列の長さ：３３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７７）配列 GCT GTG CTA GAT CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT 33 Ala Val Leu Asp Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly 1 5 10

【０１０８】配列番号：１２配列の長さ：３３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７８）

【０１０９】配列番号：１３配列の長さ：３６配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７９）配列 GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT GAT 36 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asp 1 5 10

【０１１０】配列番号：１４配列の長さ：３９配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７８０）配列 GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT GAT GAT 39 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp 1 5 10

【０１１１】配列番号：１５配列の長さ：４２配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７８１）配列 GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT GAT GAT GAT 42 Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Asp Asp Asp 1 5 10

【０１１２】配列番号：１６配列の長さ：３３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７１１）配列 GCT GAC GAC CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT 33 Ala Asp Asp Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly 1 5 10

【０１１３】配列番号：１７配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala 16 20

【０１１４】配列番号：１８配列の長さ：６３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC Thr Pro Val Thr Lys Ala 16 20

【０１１５】配列番号：１９配列の長さ：２９２配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＧＣ４６７０（ｐＭ４７４）配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGA ATG GAC TCC CTA GGT CGC 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Asp Ser Leu Gly Arg 5 10 15 GAG GCC AAA TGT TAC AAT GAA CTT AAT GGA TGC ACC AAG ATA TAT 175 Glu Ala Lys Cys Tyr Asn Glu Leu Asn Gly Cys Thr Lys Ile Tyr 20 25 30 GAC CCT GTC TGT GGG ACT GAT GGA AAT ACT TAT CCC AAT GAA TGC 220 Asp Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Pro Asn Glu Cys 35 40 45 GTG TTA TGT TTT GAA AAT CGG AAA CGC CAG ACA TCG ATC CTC ATT 265 Val Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile 50 55 60 CAA AAA TCT GGG CCT TGC TGAGGATCC 292 Gln Lys Ser Gly Pro Cys 65

【０１１６】配列番号：２０配列の長さ：３４３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC TAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０１１７】配列番号：２１配列の長さ：３４３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０１１８】配列番号：２２配列の長さ：３４３配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC AGC GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Ser Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０１１９】配列番号：２３配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly

【０１２０】配列番号：２４配列の長さ：４７配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gln Lys Val Thr Glu Val Thr Lys Lys Glu Asp 35 40 45 Ser Gly

【０１２１】配列番号：２５配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Asp Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly

【０１２２】配列番号：２６配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Asp Gly

【０１２３】配列番号：２７配列の長さ：３３配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly Asp

【０１２４】配列番号：２８配列の長さ：３４配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly Asp Asp

【０１２５】配列番号：２９配列の長さ：３５配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly Asp Asp Asp 35

【０１２６】配列番号：３０配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Asp Asp Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ser Gly

【０１２７】配列番号：３１配列の長さ：９６配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCG GGT Ser Gly

【０１２８】配列番号：３２配列の長さ：１４１配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７６）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA CCC CAA GAA GAG GAA GGA 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCA GGG GGT GGG CAA CTG GTA ACT GAA GTC ACC AAG AAA GAA GAC 135 Ser Gly Gly Gly Gln Lys Val Thr Glu Val Thr Lys Lys Glu Asp 35 40 45 TCG GGT 141 Ser Gly 47

【０１２９】配列番号：３３配列の長さ：９６配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７７）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA GAT CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Asp Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCG GGT 96 Ser Gly

【０１３０】配列番号：３４配列の長さ：９６配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７８）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 GAT GGT Asp Gly

【０１３１】配列番号：３５配列の長さ：９９配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７７９）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCG GGT GAT 99 Ser Gly Asp

【０１３２】配列番号：３６配列の長さ：１０２配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７８０）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCG GGT GAT GAT 102 Ser Gly Asp Asp

【０１３３】配列番号：３７配列の長さ：１０５配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７８１）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCG GGT GAT GAT GAT 105 Ser Gly Asp Asp Asp

【０１３４】配列番号：３８配列の長さ：９６配列の型：核酸配列の種類：他の核酸起源生物名：大腸菌株名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７１１）配列 ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 45 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe 1 5 10 15 ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GAC GAC CCG CAA GAA GAA GAA GGC 90 Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Asp Asp Pro Gln Glu Glu Glu Gly 20 25 30 TCG GGT 96 Ser Gly

【図面の簡単な説明】

【図１】フラグメント１ａの塩基配列を示す図。

【図２】プラスミドｐＫＫ２２３Ｍを示す図。

【図３】プラスミドｐＭ４６３を示す図。

【図４】フラグメントＡの塩基配列を示す図。

【図５】プラスミドｐＭ４７４のＨｉｎｄIII 消化部
位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応す
るアミノ酸配列を示す図。

【図６】プラスミドｐＭ５５２を示す図。

【図７】ＨｉｎｄIII プライマーの塩基配列を示す
図。

【図８】ＡＮ６８プライマーの塩基配列を示す図。

【図９】ｐＢＲＢａｍＨＩプライマーの塩基配列を
示す図。

【図１０】フラグメント１ｂの塩基配列を示す図。

【図１１】プラスミドｐＭ７１０のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図１２】フラグメント２の塩基配列を示す図。

【図１３】フラグメント３の塩基配列を示す図。

【図１４】フラグメント４の塩基配列を示す図。

【図１５】フラグメント５の塩基配列を示す図。

【図１６】フラグメント６の塩基配列を示す図。

【図１７】フラグメント７の塩基配列を示す図。

【図１８】フラグメント８の塩基配列を示す図。

【図１９】形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７１０）の
菌体より得られた蛋白質のＳＤＳーＰＡＧＥの結果を示
す図。

【図２０】Ｙ４６Ｄプライマーの塩基配列を示す図。

【図２１】Ｑ１９Ｋプライマーの塩基配列を示す図。

【図２２】プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部までの塩基配列および対応す
るアミノ酸配列を示す図。

【図２３】Ｒ１１Ｓプライマーの塩基配列を示す図。

【図２４】プラスミドｐＭ７６５のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８４】実施例６．プラスミドｐＭ７６５を利用し
たポリペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの生産〔１〕プラスミドｐＭ７６５を用い、実施例２の要領で
大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５
０５（ｐＭ７６５）〔本願発明者によって、平成５年４
月２８日、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥ
ＲＭＢＰ−４２８５として寄託されている〕を作製
し、培養した。得られた培養混合物をＢｅｎｃｈｍａｒ
ｋＧＸ（メンブレックス（Ｍｅｍｂｒｅｘ）社、孔径
０．２μｍ）を使用して濃縮後、４℃にて、約１０００
０×ｇ、２０分間遠心分離を行い菌体を回収した。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９５】〔４〕〔３〕で得た凍結乾燥品を、実施例
６〔４〕、〔５〕、〔６〕の方法に準じて臭化シアン分
解および精製した。得られた精製標品を実施例６〔７〕
の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに共したところ単一のバンド
が確認された。実施例６〔８〕の方法でアミノ酸分析を
行った結果、目的とするタンパク質、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６
Ｄであることが確認された。トリプシン阻害活性の測定培養混合物を遠心分離して得た培養上清に０．１％ＢＳ
Ａ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）を加えて段階希釈し、ウシトリプシン阻害活性
測定用のサンプルとした。これらの活性測定用サンプル
のウシトリプシン阻害活性を、合成基質Ｓ−２４４４
（第一化学薬品株式会社製）を基質として、カッセル
（Ｋａｓｓｅｌｌ）の方法（ＫａｓｓｅｌｌＢ．等、
ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９巻、８
４４−８５２頁、１９７０年）に準じて以下のように測
定した。すなわち、まず、ウシトリプシン（Ｔｙｐｅ
ＸＩＩＩ、シグマ社製）を、０．００１ＭＨＣｌに溶解
し、１３６００ＢＡＥＥＵ／ｍｌに調製し、それを、
０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．８）にて希釈し、０．６ＢＡＥＥＵ／
ｍｌのトリプシン溶液を調製した。一方、合成基質Ｓ−
２４４４を蒸留水に溶解し、２ｍＭのＳ−２４４４溶液
を調製した。次に、上述のウシトリプシン阻害活性測定
用サンプル１００μｌもしくはコントロールを、ウシト
リプシン溶液１００μｌと混合した。３７℃にて１０分
間静置した後、上記Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加え、
反応を開始させた。３７℃にて２０分間反応後、５０％
酢酸５０μｌを加えて反応を停止させ、分光光度計に
て、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、
データ処理の際に、ここで用いた各種溶液の吸光度への
影響を差し引くための対照としては、上記ウシトリプシ
ン溶液１００μｌに、予め、５０％酢酸５０μｌを加
え、ウシトリブシン阻害活性測定用サンプルもしくはコ
ントロール１００μｌ、Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加
えたものを使用した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｘで示される塩基配列を有することを特徴
とするＤＮＡ断片。（ただし、ｘは、下記式１ないし８
のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を表わす。）式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
【請求項２】ｘで示される塩基配列を少なくとも１つ有
することを特徴とするベクター。（ただし、ｘは下記式
１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配列をコード
する塩基配列を表わす。）式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
【請求項３】ｊ−ｘで示される塩基配列を有することを
特徴とするベクター。（ただし、ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、ｘは下記式１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を表わす。）式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧ
【請求項４】ｊ−ｘ−ｙで示される塩基配列を有するこ
とを特徴とするベクター。（ただし、ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、ｘは下記式１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列であり、式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧｙは酵素および／または化学薬品によって切断されうる
アミノ酸もしくはアミノ酸配列をコードする塩基配列、
を表わす。）
【請求項５】ｊ−ｘ−ｙ−ｚで示される塩基配列を有す
ることを特徴とするベクター。（ただし、ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、ｘは下記式１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列であり、式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧｙは酵素および／または化学薬品によって切断されうる
アミノ酸もしくはアミノ酸配列をコードする塩基配列、ｚは所望の蛋白質をコードする塩基配列、を表わす。）
【請求項６】少なくともｊ−ｘ−ｚで示される塩基配列
を有することを特徴とするベクター。（ただし、ｊはシグナルペプチドをコードする塩基配列、ｘは下記式１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列であり、式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧｚは所望の蛋白質をコードする塩基配列、を表わす。）
【請求項７】以下の群より選択されるプロモーターを、
さらに有する請求項１ないし６いずれかに記載のベクタ
ー。〔１〕ｔｒｐプロモーター〔２〕ｔａｃプロモーターおよび〔３〕ｌａｃプロモーター
【請求項８】請求項２ないし７いずれかに記載のベクタ
ーを用いて形質転換されたことを特徴とする形質転換
体。
【請求項９】前記形質転換体の宿主が大腸菌、枯草菌お
よび酵母よりなる群より選択される請求項８に記載の形
質転換体。
【請求項１０】請求項８または９に記載の形質転換体を
培養して、Ｊ−Ｘ−ＺもしくはＪ−Ｘ−Ｙ−Ｚのアミノ
酸配列で表される融合タンパク質を発現させる工程を含
むことを特徴とするＺの産生方法。（ただし、Ｊはシグナルペプチド、Ｘは下記式１ないし８のいずれかで示されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド、式１：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧ式２：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＧＧＱＬＶＴＥＶＴＫＫ
ＥＤＳＧ式３：ＡＶＬＤＱＥＥＥＧＳＧ式４：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＤＧ式５：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤ式６：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤ式７：ＡＶＬＰＱＥＥＥＧＳＧＤＤＤ式８：ＡＤＤＰＱＥＥＥＧＳＧＹは酵素および／または化学薬品によって切断されうる
アミノ酸またはアミノ酸配列、Ｚは所望の蛋白質のアミノ酸配列、を表わす。）