JP2001008697A - Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｒＩＧＦ−IIを生物学的活性型に再生するこ
と。 【解決手段】 宿主細胞からｒＩＧＦ−IIを単離し、そ
してジスルフィド結合を還元しそしてその還元されたポ
リペプチドを変性条件下で溶解することによってｒＩＧ
Ｆ−IIを生物学的活性形に再生し、前記変性したポリペ
プチドを天然に存在する形への折りたたみを可能にし、
そしてジスルフィド結合を形成するためにスルフヒドリ
ル基を再酸化するための方法を供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＤＮＡ技法
の分野に関し、そして共有結合された外来性タンパク質
成分及びＮ−末端結合メチオニン又はメチオニンの誘導
体を有さない組換えＩＧＦ−II（ｒＩＧＦ−II）又は前
記ｒＩＧＦ−IIの塩の調製方法、前記方法により産生さ
れたｒＩＧＦ−II、前記ｒＩＧＦ−IIをコードするＤＮ
Ａを含んで成るハリブリッドベクター、前記ベクターに
より形質転換された宿主及び宿主細胞からの前記ｒＩＧ
Ｆ−IIの単離方法並びに生物学的活性形へのその再生方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インシュリン様成長因子II（ＩＧＦ−I
I）は、インシュリン様活性を有するポリペプチド成長
因子のＩＧＦ群のメンバーである。ＩＧＦ群は、インシ
ュリン、リラキシン、ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−II及び７ｓ
神経成長因子のβ−サブユニットを含んで成る（Blunde
ll and Humbel, Nature 287: 781〜787, 1980; Froesch
and Zapt, Diabetologica 28: 485〜493, 1985; Froes
chなど．、Ann.Rev.Physiol.47:443〜467, 1985)。

【０００３】血清タンパク質ＩＧＦ−IIの生理学的機能
はまだ十分に理解されていない。しかしながら、ＩＧＦ
−IIは、活性化されたＴ細胞によるチミジン導入を刺激
し（Brown など．、J.Receptor Res.5:297, 1985) 、骨
髄細胞による赤芽細胞コロニー形成を増強し（Dainuiak
and Kreczuko, J.Clin.Invest.76:1237, 1985) 、そし
て正常なラット腎臓細胞の成長因子−β誘発軟寒天増殖
の転換に包含され得る（Massagueなど．、J.Biol.Chem.
260:455, 1985)。ＩＧＦ−IIは、胎児の成長の調節に包
含され、そして胎盤因子により調節されるように思われ
る（Scheonleなど．、 Nature 296, 252〜253, 1982; A
damsなど．、Nature 302:150〜153, 1986)。ヨーロッパ
特許出願ＥＰ−Ａ−０２８９３１４号は、ＩＧＦ−II
が、骨細胞のために分裂促進性である骨格増殖因子（Ｓ
ＧＦ）と同じであり（Farleyなど．、Biochemistry 21:
3509, 1982) 、そしてコラーゲン合成の刺激に包含され
ている（Linkhartなど．、J.Cell.Physiol.128:307, 19
86) ことを開示する。ＩＧＦ−IIは、骨の疾患の治療の
ために使用され得る。

【０００４】血清における成熟ＩＧＦ−IIは、細胞翻訳
生成物プレプロ−ＩＧＦ−IIに由来する。プレプロ−Ｉ
ＧＦ−IIは、次にさらに、成熟ＩＧＦ−IIに処理される
プロ−ＩＧＦ−IIに膜間輸送の間にタンパク質分解的に
切断される。ＩＧＦ−IIは、哺乳類及び鳥類を含む広範
囲の生物に見出され得る。異なった種の動物は、異なっ
たＩＧＦ−II分子を有し、そして特定の種又は特定の固
体においてさえ、ＩＧＦ−IIの変異体が合成され得る。
Rinderknecht及びHumbelは、FEBS Lett.89:283〜286, 1
986 においてヒトＩＧＦ−II（ｈｕＩＧＦ−II）のアミ
ノ酸配列を記載した。そのタンパク質は、６７個のアミ
ノ酸を有する一本鎖から成る。前記タンパク質の一次構
造は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として列挙する配列で与
えられる。

【０００５】ｈｕＩＧＦ−IIのラット同等物（ｒａｔ
ＩＧＦ−II）は、ラット細胞計ＢＲＬ−３Ａのならし培
地から単離され（Dulate and Shing, J.Cell.Physiol.9
0: 127〜138, 1976)、そして配列決定された（Marquard
t など．、J.Biol.Chem.256:6859〜6865, 1981) 。アメ
リカ特許第４，７８３，５４２号は、ウシＩＧＦ−II
（ｂｏＩＧＦ−II）のアミノ酸配列を開示する。鶏骨か
らのＩＧＦ−IIの調製は、ＥＰ０２８３９３１４号に開
示されている。

【０００６】Jansenなど．（FEBS Lett.179: 243〜264,
1985)は、位置２９でセリンの代わりにテトラペプチ
ド、アルギニン−ロイシン−プロリン−グリシンを有す
るｈｕＩＧＦ−IIの変異体を開示する。位置３３でセリ
ンの代わりにトリペプチド、システイン−グリシン−ア
スパラテートを有する、ｈｕＩＧＦ−IIのもう１つの変
異体がZumsteinなどによりProc.Natl.Acad.Sci.USA 82:
3169〜72(1985)に開示されている。ＩＧＦ−IIの追加の
変異体はＮ−末端のアラニンを欠き、その結果、そのア
ミノ酸配列はＮ−末端でチロシンにより始まる（ｄｅｓ
−Ａｌａ−ＩＧＦ−II）。ｄｅｓ−Ａｌａ−ＩＧＦ−II
はヒト及びラットの両者に同定された（Rinderknecht a
nd Humbel, FEBS Lett.89: 283〜286, 1978; Marquardt
など．、J.Biol.Chem.256:6859〜6863, 1981) 。

【０００７】ｈｕＩＧＦ−IIのプレプロ−形をコードす
るｈｕＩＧＦ−II遺伝子は、少なくとも５個のエキソン
及び４個のイントロンから成り、そして染色体１１上に
約１６kbp の領域を広げる（de Pagter-Holthuizenな
ど．、FEBS Lett.195: 179〜184, 1986)。Jansenなど
（FEBS Lett.179: 243〜264, 1985)により記載されたよ
うに、２個の異なったｍＲＮＡ転写体に対応する、２個
の密接に関係するが、しかし異なるタイプのｃＤＮＡが
同じヒト肝臓のｃＤＮＡライブラリーから単離された。
１つのｃＤＮＡタイプは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１を有
するアミノ酸配列を有するｈｕＩＧＦ−IIをコードす
る。第２のｃＤＮＡタイプは、位置２９でセリンの代わ
りにテトラペプチド、アルギニン−ロイシン−プロリン
−グリシンを有する上記のｈｕＩＧＦ−IIの変異体をコ
ードする。異なったｍＲＮＡ転写物は、特定の組織にお
いて優先的に発現されることが発見された。プレプロ−
又は成熟ＩＧＦ−IIをコードするｃＤＮＡは、たとえば
Jansenなど．（FEBS Lett.179: 283〜286,1985)、de Pa
gter-Holthuizenなど．（FEBS Lett.195: 179〜184, 19
86)、ＰＣＴ／ＷＯ８６００６１９、ＵＳＰ第４，７８
３，５２４号、Jansenなど．（Nature 306:609〜611, 1
983)及びＥＰ−Ａ−０１９３１１２号により開示され
る。

【０００８】ＩＧＦ−IIの変異形がわずかに変性された
コード配列を有するＩＧＦ−II対立遺伝子の生成物であ
るか、又は変異体が一本のＩＧＦ−II遺伝子の一次転写
体の交互のスプライシングにより形成されるかどうか
は、また明確でない（de Pagter-Holthuizenなど．、上
記）。多量のＩＧＦ−IIタンパク質を供給することが、
科学的及び臨床的な興味の対象である。ヒト血清（Rind
erknecht and Humbel, FEBS Lett.89: 283〜286, 197
8)、骨（ＰＣＴ／ＷＯ８６００６１９）又は細胞培養物
のならし栄養培地（Dulak and Sling, J.Cell.Physiol.
90:127〜138, 1976)からＩＧＦ−IIを生成する方法は既
知である。しかしながら、これらの方法によれば、限定
された量のＩＧＦ−IIのみが生成され得る。アミノ酸配
列及びｃＤＮＡの利用性は、組換え遺伝子技法により多
量のＩＧＦ−II又はその変異体、たとえば〔Ａｒｇ⁵⁴Ａ
ｒｇ⁵⁵〕−変異体（ＰＣＴ−ＷＯ８５／００８３１）の
生成を可能にした。この後、組換え遺伝子技法により生
成されたＩＧＦ−IIは、ｒＩＧＦ−IIとして言及され
る。

【０００９】遺伝子コードは退化物である。すなわち、
これは多くのアミノ酸が１つ以上のコドンにより特定さ
れることを意味する。たとえば、セリンは、デオキシリ
ボヌクレオチドトリプレット、ＴＣＴ，ＴＣＣ，ＴＣ
Ａ，ＴＣＧ，ＡＧＴ及びＡＧＣによりコードされる。従
って、同じアミノ酸配列をコードする異なったＤＮＡ配
列を有する遺伝子を合成することは可能である。ヒトＩ
ＧＦ−IIをコードする異なった合成遺伝子は、たとえば
Furmanなど．、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ５：１０
４７〜１０５１（１９８７），ＰＣＴ／ＷＯ８９０３４
２３号、ＰＣＴ／ＷＯ８５００８３１号、ＥＰ０１７６
３４１号及びＥＰ０１２３２２８号により開示される。

【００１０】ＩＧＦ−IIアミノ酸配列を含んで成るポリ
ペプチドのＥ．コリにおける発現は、たとえばヨーロッ
パ特許出願ＥＰ−０２３０８６９号、ＥＰ−０２２５８
６０号及びＥＰ−０１７６３４１号に開示される。現在
までに、ｒＩＧＦ−II−融合タンパク質のみが、Ｅ．コ
リで生成された。これらの融合タンパク質は、それらが
酵素的又は化学的に分解され、そして次に、ｒＩＧＦ−
IIが他の切断生成物から分離される欠点を有する。した
がって、ｒＩＧＦ−II−融合タンパク質の生成は、精製
されたｒＩＧＦ−IIを得るために行なわれるべき段階の
数及び化学的分解の間、タンパク質の変性の可能性に関
して欠点を有する。

【００１１】Ｅ．コリに発現されるタンパク質は、Ｅ．
コリ細胞において、タンパク質生合成におけるスタータ
ーアミノ酸であるＮ−末端メチオニンが、しばしばポリ
ペプチド鎖から分解されないので、Ｎ−末端に結合され
るメチオニン又はメチオニンの誘導体、たとえばＮ−ホ
ルミル−メチオニンを、しばしば含む。細菌又はバクテ
リオファージタンパク質成分に融合されない異質タンパ
ク質のＥ．コリにおける生成は、宿主細胞によるタンパ
ク質分解に対するその異質タンパク質の敏感性に関する
問題を有する。この理由のために、異質タンパク質を劣
化しないプロテアーゼを欠く宿主株が開発された。その
ような宿主株は、プロテアーゼ遺伝子ｌｏｎ及びｈｔｐ
Ｒ遺伝子を欠くＥ．コリＬＣ１３７であり、この生成
物は熱ショック誘発タンパク質合成を調節する。

【００１２】ジスルフィド結合を含む外来性タンパク質
は、正しいジスルフィド結合を欠く不溶性形でしばしば
微生物に生成され、還元され、そして非生来性コンホメ
ーションを有する。多くのＥ．コリ株、たとえばＥ．コ
リＬＣ１３７においては、そのような不溶性外来性タン
パク質は、細胞質に封入体として貯蔵される。誤って折
返されたタンパク質は本質的に不活性である（Smith な
ど．、Science 229:1219, 1985) 。

【００１３】分解緩衝液における還元剤の不在下での細
胞分解に基づいて、誤って折返されたタンパク質、空気
中の酸素による誤って折返されたタンパク質中のスルフ
ヒドリル基の酸化により誤ったジスルフィド対を有す
る。誤って折返されたタンパク質を天然に存在する成熟
形に再生することによってそれらの生物学的活性を回復
する試みが行なわれて来た。再生技法は主に、細胞から
封入体の単離、封入体の溶解及び誤って折返されたタン
パク質の変性を含んで成り、結局、誤って形成されたジ
スルフィド結合を還元し、そして再生された成熟タンパ
ク質を安定化する正しい分子内ジスルフィド架橋が形成
されるように、再生された成熟形の形成及びタンパク質
のスルフヒドリル基の酸化を可能にすることによって行
なわれる。

【００１４】還元、溶解及び再酸化を含んで成る再生方
法は、当業界において知られている(K.J.Doege and J.
H.Fessler, J.Biol.Chem. 261, 1986, 8924〜8935; J.
G.L.Petersen and K.J.Dorrington, J.Biol.Chem. 249
, 1974, 5633〜5641; V.P.Saxena and D.B.Wetlaufer,
Biochemistry, 9, 1970, 5015〜5022; EP 219874
号）。しかしながら、個々の特定のタンパク質のために
は、還元、溶解及び再酸化による再生のための正確な条
件が開発されるべきであり、そして予測できない。すべ
てのタンパク質に関してではないが、誤って折返された
タンパク質を生物学的に活性な天然に存在する形に再生
する試みは好結果をもたらして来た。Smith など．（J.
Biol.Chem.264:9314〜19321, 1989)においては、Ｅ．コ
リに発現される融合タンパク質を分解することによって
調製された組換えヒトＩＧＦ−IIの再生が記載されてい
る。しかしながら、その再生方法においては、重合ＩＧ
Ｆ−II及び２種の構造的同位体モノマーが形成された。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】共有結合された外来性
タンパク質成分及びＮ−末端結合メチオニン又はメチオ
ニン誘導体を有さない多量のｒＩＧＦ−IIをＥ．コリで
生成することが本発明の目的である。本発明のもう１つ
の目的は、Ｅ．コリに生成されるｒＩＧＦ−IIを生物学
的活性形に再生することによって生物学的活性ｒＩＧＦ
−IIを供給することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、共有結合され
た外来性タンパク質成分及びＮ−末端結合メチオニン又
はメチオニンの誘導体を有さないｒＩＧＦ−IIの調製方
法に関し、 １）リボソーム結合部位を含み、そしてＩＧＦ−II（イ
ンシュリン様成長因子II）をコードする第二ＤＮＡ配列
に読み枠を整合して結合されるアミノ酸のメチオニンを
コードする第一ＤＮＡ配列に作用可能的に結合されるプ
ロモーターから成る発現カセットを含んで成るハイブリ
ッドベクターにより適切な微生物宿主株を形質転換し、
そして ２）前記形質転換された宿主株を培養することを含んで
成る。

【００１７】ｒＩＧＦ−IIは、天然に存在する成熟ＩＧ
Ｆ−IIのアミノ酸配列から実質的に成り、そして１又は
複数の決定できる生物学的ＩＧＦ−II機能を有するポリ
ペプチドである。

【００１８】

【発明の実施の形態】ＩＧＦ−II活性を有するすべての
変異体及びそのフラグメントは、ｒＩＧＦ−IIの範囲内
に包含される。変異体は、異なった種、たとえば異なっ
た哺乳類、たとえばマウス、ラット、ヒト、ウシ又は鳥
類、たとえば鶏に見出され、又は特定の種内に見出され
る天然に存在する変異体、たとえば配列識別番号下で列
挙する配列（配列番号：１）で示されるヒトＩＧＦ−II
（ｈｕＩＧＦ−II）のアミノ酸配列の位置２９でセリン
の代わりにテトラペプチド、アルギニン−ロイシン−プ
ロリン−グリシンを有する変異体、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１を有するアミノ酸配列の位置３３でセリンの代わ
りにトリペプチド、システイン−グリシン−アスパルテ
ートを有する変異体又はＮ−末端アミノ酸を欠く変異体
を包含する。変異体はまた、コードされたタンパク質の
アミノ酸配列を変えるためにインビトロで突然変異誘発
されたＤＮＡから生成されるｒＩＧＦ−II形を包含す
る。そのような変異体は、１〜約１０個のアミノ酸が欠
失され又は１又は複数の他のアミノ酸により交換されて
いるアミノ酸配列を有する。

【００１９】好ましいｒＩＧＦ−IIは、配列番号：１を
有するアミノ酸配列を有するｈｕＩＧＦ−IIである。Ｉ
ＧＦ−IIをコードするＤＮＡは、当業界において知られ
ている方法から製造され、そしてヒト、マウス、ラット
又はウシから哺乳類ｃＤＮＡライブラリー、又は鳥類か
らの鳥類ｃＤＮＡライブラリーから単離されるｃＤＮＡ
から成る。ｃＤＮＡライブラリーは、種々の組織からの
細胞、たとえば肝細胞又は骨細胞に由来する。ＩＧＦ−
IIをコードするＤＮＡはまた、たとえば哺乳類ゲノムＤ
ＮＡライブラリー、たとえばヒト、マウス、ラット又は
ウシ細胞から、又は鳥類ゲノムＤＮＡライブラリー、た
とえば鶏組織から単離されるゲノムＤＮＡから成る。Ｉ
ＧＦ−IIをコードするＤＮＡはさらに、天然に存在する
ＩＧＦ−IIコードＤＮＡ又はその突然変異体のいづれか
のＤＮＡ配列を有する化学的に合成されたＤＮＡから成
る。天然に存在するＤＮＡの突然変異体は、天然に存在
するＩＧＦ−II又はＩＧＦ−II活性を有し、そして／又
はたとえば１〜約１０個のアミノ酸が欠失され又は１又
は複数の他のアミノ酸により置換されているアミノ酸配
列を有するその変異体形をコードする。天然に存在する
ＩＧＦ−IIをコードする突然変異体ＤＮＡはまた、１又
は複数のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換さ
れ、それによって新しいコドンが同じアミノ酸をコード
する非活性性突然変異体も包含する。そのような突然変
異体ＤＮＡ配列はまた、分解されたＤＮＡ配列でもあ
る。分解されたＤＮＡ配列は、無制限数のヌクレオチド
が、それらがコードするアミノ酸配列を変えないで他の
ヌクレオチドにより置換される遺伝子コードの意味内で
分解される。そのような分解されたＤＮＡ配列は、それ
らの異なった制限部位、及び／又はｒＩＧＦ−IIの最適
発現を得るために特定の宿主により好まれるそれらの特
定頻度のコドンのために有用であることができる。その
ようなＤＮＡ配列の好ましい例は、それぞれＥ．コリに
好ましいコドンの使用及び酵母に好ましいコドンの使用
を包含し、そしてそれぞれ配列番号：２及び３として列
挙される配列に示される。

【００２０】適切な微生物宿主株は、たとえばＥ．コリ
株である。好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、たとえば
ｌｏｎプロテアーゼ遺伝子、及び熱ショック誘発タンパ
ク質合成の調節に包含される遺伝子、たとえばｈｔｐ
Ｒ遺伝子を欠くＥ．コリ株が使用される（アメリカ特許
第４，７５８，５１２号；Buell, G. など．、Nucleic
Acids Res.13: 1923〜1938, 1985) 。

【００２１】本発明のハイブリッドベクターの生成のた
めの適切なベクターは、微生物宿主細胞において使用す
るベクターである。適切なハイブリッドベクターは、完
全なレプリコン及びマーカー遺伝子を含み、そのマーカ
ー遺伝子は表現型特徴による、発現プラスミドにより形
質転換された微生物の選択及び同定を可能にする。適切
なマーカー遺伝子は、微生物に、たとえば耐重金属性、
抗生物質、たとえばアンピシリン又はテトラサイクリン
に対する耐性を付与する。

【００２２】Ｅ．コリ株におけるＩＧＦ−II遺伝子の発
現のために適切であるベクターの例は、バクテリオファ
ージ、たとえばバクテリオファージλの誘導体、又はプ
ラスミド、たとえばｐＭＢ９，ｐＳＦ２１２４，ｐＢＲ
３１７，ｐＢＲ３２２又はｐＰＬＭｕである。好ましく
は、ｐＰＬＭｕであり、これはBuell など．、Nucl.Aci
ds Res.13:1923〜1938(1985)に開示される。ＩＧＦ−II
をコードするＤＮＡ配列を含んで成る好ましいハイブリ
ッドベクターは、ｐＰＬＭｕ／ＢＢ及びｐＰＬＭｕ／Ｉ
ＧＦ−IIである。

【００２３】いくつかのプロモーターが、Ｅ．コリにお
けるＩＧＦ−II遺伝子の発現を調節するために使用され
得る。しっかりと調節され得る強く発現された遺伝子の
プロモーターが特に有用である。適切なプロモーター
は、たとえばｌａｃ，ｔａｃｔｒｐ及びｌｐｐプロモー
ター、さらにファージλＮ又はファージλＰ_L プロモー
ターである。Ｅ．コリに使用するための好ましいプロモ
ーターは、しっかりと調節されたプロモーター、たとえ
ばλＰ_L ，λＰ_R ，ｌａｃ又はｔｒｐプロモーターであ
る。λＰ_L プロモーターが最っとも好ましい。それは、
たとえばベクターｐＰＬＭｕに含まれる。

【００２４】リボソーム結合部位（シャイン−ダルガル
ノの配列）は、使用されるプロモーターに自然に結合さ
れ又はＩＧＦ−IIのコード領域に５′で共有結合され得
る短いヌクレオチド配列上に位置する。好ましくは、配
列番号：４として示されるＤＮＡ配列に含まれるファー
ジＭｕ ｎｅｒ遺伝子リボソーム結合部位である。形質
転換された微生物宿主株は、炭素、窒素及び無機塩の同
化可能源を含む液体培地に培養される。

【００２５】本発明の好ましい態様において、ハイブリ
ッドベクターの発現カセットに含まれるプロモーターは
調節タンパク質により調節され、そして形質転換された
宿主細胞におけるｒＩＧＦ−IIの生成が誘発され得る。
ハイブリッドベクターの発現カセットに含まれるプロモ
ーターを調節するタンパク質をコードするＤＮＡ配列
は、宿主株のゲノム又は宿主株が本発明のハイブリッド
ベクターにより形質転換され得る追加のプラスミドベク
ターに含まれる。ハイブリッドベクターの発現カセット
に含まれるプロモーターを調節するタンパク質をコード
する適切なＤＮＡ配列の選択は、そのプロモーターに依
存する。プロモーターを調節するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列は、リプレッサータンパク質、たとえばｔ
ｒｐ Ｒ，ｌａｃ Ｉ，λｃｒｏ、又はλｃＩをコード
する遺伝子、又はその温度感受性突然変異体である。

【００２６】ｒＩＧＦ−IIの生成の誘導のための条件
は、プロモーター及び前記プロモーターを調節するタン
パク質をコードするＤＮＡ配列に依存する。熱不安定性
λＣＩ ₈₅₇ リプレッサーが使用される場合、熱誘導が約
４２℃で約１〜約１０時間行なわれる。宿主細胞におけ
るｒＩＧＦ−IIの量が満足するレベルに達する場合、培
養は止められる、そしてポリペプチドが単離される。ｒ
ＩＧＦ−IIは、細胞中の封入体に付着される。

【００２７】ｒＩＧＦ−IIの生成のための好ましい方法
は、熱不安定λＣＩ₈₅₇ リプレッサーをコードするプラ
スミドｐｃＩ₈₅₇ により及びファージＭｕ ｎｅｒ遺伝
子リボソーム結合部位（この配列は配列番号：４として
与えられる）を含み、そしてｈｕＩＧＦ−IIをコードす
る配列番号：２又は３を有するＤＮＡに読み枠を整合し
て結合されるアミノ酸メチオニンをコードする第一ＤＮ
Ａ配列に作用可能的に結合されるλＰ_L プロモーターか
ら成る発現カセットを含んで成るｐＰＬＭｕから成るハ
イブリッドベクターにより形質転換されたＥ．コリＬＣ
１３７を培養し、そして約４２℃で熱誘導により、ＩＧ
Ｆ−IIの発現を誘発することを含んで成る。特に好まし
くは、プラスミドｐｃＩ₈₅₇ 及びプラスミドｐＰＬＭｕ
／ＩＧＦ−II又はｐＰＬＭｕ／ＢＢにより形質転換され
たＥ．コリＬＣ１３７の使用である。

【００２８】本発明はまた、宿主細胞からｒＩＧＦ−II
を単離し、そしてジスルフィド結合を還元し、そしてそ
の還元されたポリペプチドを変性条件下で溶解すること
によってｒＩＧＦ−IIを生物学的活性形に再生し、前記
変性されたポリペプチドを天然に存在する形への折返し
を可能にし、そしてジスルフィド結合を形成するために
スルフヒドリル基を再酸化するための方法にも関する。
前記方法は、 ａ）宿主細胞により産生されたｒＩＧＦ−IIを単離し、 ｂ）ｒＩＧＦ−IIを適切な溶液に溶解し、 ｃ）段落ｂ）で得られたｒＩＧＦ−II溶液を折返し緩衝
液に対して透析し、そしてｒＩＧＦ−IIが、生物学的活
性形に折返されるように還元されたスルフヒドリル基の
分子内ジスルフィド結合へのゆっくりした酸化を可能に
するために酸化物質の存在において酸素を含まない条件
下で前記ｒＩＧＦ−IIを折返し緩衝液中でインキュベー
トすることによってｒＩＧＦ−IIを生物学的活性形に再
生し、そして ｄ）所望により、遊離カルボキシ及び／又はアミノ基を
有する得られたポリペプチドを塩に転換し、又は得られ
た塩をその遊離化合物に転換する段階を含んで成る。

【００２９】本発明の好ましい態様においては、前記方
法に従ってＥ．コリに生成されるｒＩＧＦ−IIが宿主細
胞から単離され、そして再生される。ｒＩＧＦ−IIは、
従来の方法で細胞から単離される。宿主細胞を分解し、
そして封入体を単離するための方法は当業界において良
く知られている。細胞は、たとえば超音波による音波処
理、たとえば液体窒素における凍結及び融解により、又
は機械液な力、たとえばフレンチ−プレスによる剪断力
により破壊され得る。封入体は、破壊された細胞の懸濁
液中、たとえば４０００ｇ〜約１５０００ｇで約１０〜
３０分間遠心分離することによって沈殿化され得る。

【００３０】ｒＩＧＦ−IIを溶解するための適切な溶液
は、ｒＩＧＦ−IIを再生するために十分な濃度で還元剤
及びカオトロープ並びに必要ならプロテイナーゼインヒ
ビターを含んで成る。本発明において有用な還元剤は、
ジスルフィド基をスルフヒドリル基に還元する物質、た
とえばメルカプト基を含む試薬、たとえばジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、
メルカプトメタノール、メルカプトエタノール、システ
イン又は還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）である。

【００３１】前記変性のために有用なカオトロープは、
たとえば尿素、グアニジン−ＨＣｌ、アルギニン又は
塩、たとえばカリウムチオシアネート又は水溶性カルシ
ウム、塩、たとえばＣａＣｌ₂ である。好ましくは尿素
であり、特に好ましくはグアニジン−ＨＣｌである。ｒ
ＩＧＦ−IIを再生するために十分な尿素又はグアニジン
−ＨＣｌの濃度は、約７Ｍ〜約９Ｍである。

【００３２】本発明において有用なプロテイナーゼイン
ヒビターは、たとえばベンズアミジン、エチレンジアミ
ン四酢酸、フェニルメチルスルホニルフルホリド（ＰＭ
ＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＩＦ
Ｐ）、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（Ｔ
ＰＣＫ）、トシルロイシルクロロメチルケトン（ＴＬＣ
Ｋ）、ｏ−フェナントロリン、微生物のプロテアーゼイ
ンヒビター、たとえばペプスタチン、ロイペプチン又は
アンチパイン又はダイズトリプシンインヒビター（ＳＢ
ＴＩ）及び同様のものである。

【００３３】ｒＩＧＦ−IIを溶解するためのもう１つの
適切な溶液は、カルボン酸、たとえばＣ₂ −Ｃ₄ のカル
ボン酸を含んで成る水溶液である。好ましいカルボン酸
は酢酸である。前記溶液中のカルボン酸の濃度は、約
０．１％（ｖ／ｖ）〜約７０％（ｖ／ｖ）のＣ₂ −Ｃ₄
のカルボン酸である。好ましい酢酸濃度は約５０％（ｖ
／ｖ）〜約７０％（ｖ／ｖ）である。カルボン酸濃度、
たとえば酢酸濃度が約０．１％（ｖ／ｖ）である場合、
pHは約pH２〜４、好ましくはpH３に調節されるべきであ
る。pHは、たとえばハロゲン化水素酸、たとえばＨＣｌ
により調節される。

【００３４】段階ｂ）で得られたｒＩＧＦ−IIの溶液の
折返し緩衝液に対する透析は、約０℃〜約１０℃、好ま
しくは約４℃で行なわれる。透析の後、ｒＩＧＦ−II
は、約１０μｇ／ml〜約４００μｇ／ml、好ましくは約
１００μｇ／mlの濃度で、約１８〜約９６時間、約４℃
〜約３５℃の温度で折返し緩衝液中においてインキュベ
ートされ得る。

【００３５】本発明に有用な折返し緩衝液は、約１Ｍ〜
約２．５Ｍ、好ましくは２Ｍの濃度でカオトロープ、た
とえばグアニジン−ＨＣｌ又は尿素を含んで成る。ｒＩ
ＧＦ−II溶液がプロテアーゼにより汚染される場合、折
返し緩衝液はさらに、前記プロテイナーゼインヒビター
を含むことができる。酸素を含まない条件は、不活性ガ
ス、たとえば窒素又は貴ガス、たとえばヘリウム又はア
ルゴンにより脱気することによって得られる。

【００３６】本発明において有用な折返し緩衝液はま
た、酸化物質を含んで成る。本発明の酸化物質は、タン
パク質のスルフヒドリル基がジスルフィド基に酸化され
るようにスルフヒドリル／ジスルフィドレドックス対よ
りも低いレドックスのポテンシャルを有する溶液を供給
する物質又は物質のレドックス対である。酸化物質又は
レドックス対は、たとえば（酸化されたグルタチオン
（ＧＳＳＧ）又は還元され、そして酸化されたグルタチ
オンの混合物、システイン又はシステイン及びシスチン
の混合物及び同様のものである。物質の濃度はレドック
ス対のメンバーの割合は、折返し緩衝液のレドックスポ
テンシャルがｒＩＧＦ−IIのスルフヒドリル基を酸化す
るのに十分に低いように選択される。

【００３７】ｒＩＧＦ−IIはさらに精製され得る。精製
段階は、ｒＩＧＦ−IIの再生の前又は後で行なわれ得
る。再生の前又は後でｒＩＧＦ−IIの追加の精製のため
に適切な方法、たとえば標準のクロマトグラフィー法、
たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、Ｄ
ＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー、イムノア
フィニティー又はＨＰＬＣは良く知られている。再生の
前、ｒＩＧＦ−IIの追加の精製のための方法は、たとえ
ばゲル濾過カラム、たとえばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
２００カラム上でのゲル濾過であり、これは上記ｒＩＧ
Ｆ−IIを溶解するために適切な溶液により平衡化され、
そして溶出される。

【００３８】再生されたｒＩＧＦ−IIは、従来の方法、
たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナ
トリウムによる塩析により、又はタンパク質溶液を濃縮
することにより、そして蒸発又は凍結乾燥により折返し
緩衝液から得られる。使用される方法に依存して、再生
されたｒＩＧＦ−IIは、遊離形で又はその塩として既知
の方法で得られる。それはいくつかのアミノ酸残基に遊
離アミノ基を含むので、本発明の化合物は、酸付加塩の
形で得られる。適切な酸付加塩は、従来の治療上許容で
きる酸との特に薬理学的に許容できる塩である。代表的
な無機塩は、ハロゲン化水素酸（たとえば塩酸）及びま
た、硫酸、リン酸及びピロリン酸である。代表的な有機
酸は、特にアレーン−スルホン酸（たとえばベンゼン−
スルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸）、又は低級ア
ルカンスルホン酸（たとえばメタンスルホン酸）、並び
にカルボン酸、たとえば酢酸、乳酸、パルミチン酸、ス
テアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸及びク
エン酸である。しかしながら、本発明の化合物はまた、
いくつかのアミノ酸残基に遊離カルボキシル基（このカ
ルボキシル基は、全ペプチドに酸性特徴を付与する）を
含むので、それはまた、無機又は有機塩基との塩、たと
えばナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウ
ム塩、又はアンモニア又は薬理学的に許容できる有機窒
素含有塩基に由来するアンモニウム塩の形でも得られ
る。しかしながら、それは同時に、遊離カルボキシル基
及び遊離アミノ基を含むので、それはまた、内部塩の形
でも得られる。薬理学的に許容される塩の生成が好まし
い。

【００３９】薬理学的に許容できる塩は、酸、たとえば
上記塩を形成する酸との反応により、及び蒸発又は凍結
乾燥により、又はpHを適切な中和点に調整することによ
り、そして蒸発又は凍結乾燥により遊離化合物から得ら
れる。本発明のもう１つの態様は、リボソーム結合部位
を含み、そしてＩＧＦ−IIをコードする第二ＤＮＡ配列
に読み枠を整合して結合されるアミノ酸のメチオニンを
コードする第一ＤＮＡ配列に作用可能的に結合されるプ
ロモーターから成る発現カセットを含んで成るハイブリ
ッドベクターである。好ましくは、配列番号：２又は３
を有するＤＮＡ配列を含んで成るハイブリッドベクター
である。最っとも好ましくは、ｐＰＬＭｕ／ＢＢ及びｐ
ＰＬＭｕ／ＩＧＦ−IIである。

【００４０】本発明のハイブリッドベクターは、当業界
において知られている方法により、任意にリボソーム結
合部位を含み、そしてＩＧＦ−IIをコードする第二ＤＮ
Ａ配列に読み枠を整合して結合されるアミノ酸のメチオ
ニンをコードする第一ＤＮＡ配列に作用可能的に結合さ
れるプロモーターから成る発現カセット、又はその発現
カセットの成分を選択的な遺伝子マーカー及び予定され
た順序で選択された微生物宿主のための複製の起点を含
むＤＮＡフラグメントに結合することによって調製され
得る。前記ハイブリッドベクターの調製はまた、本発明
の対象でもある。

【００４１】本発明はさらに、リボソーム結合部位を含
み、そしてＩＧＦ−IIをコードする第二ＤＮＡ配列に読
み枠を整合して結合されるアミノ酸のメチオニンをコー
ドする第一ＤＮＡ配列に作用可能的に結合されるプロモ
ーターから成る発現カセットを含んで成るハイブリッド
ベクターにより形質転換された微生物宿主、及び前記ハ
イブリッドベクターによる前記微生物宿主の形質転換を
含んで成るその生成方法にも関する。

【００４２】本発明の形質転換された微生物宿主細胞
は、下記段階を含んで成る組換えＤＮＡ技法により調製
され得る：前記ハイブリッドベクターによる微生物宿主
株の形質転換、及び形質転換されていない宿主細胞から
形質転換された宿主細胞の選択。本発明のハイブリッド
ベクターによる形質転換は、たとえばＥ．コリについて
の文献に記載される方法で行なわれる〔W.Mandelな
ど．、J.Mol.Biol.53, 159(1970)〕。形質転換された宿
主細胞の単離は、発現プラスミドに含まれるマーカー遺
伝子が耐性を付与する殺生物剤が添加されている選択栄
養培地から都合良くもたらされる。たとえば、ハイブリ
ッドベクターがａｍｐ^R 遺伝子を含む場合、アンピシリ
ンが栄養培地に添加される。ハイブリッドベクターを含
まない細胞は、そのような培地において破壊される。

【００４３】微生物宿主株は上記で特定された株であ
る。最っとも好ましい形質転換宿主株は、ｐＰＬＭｕ／
ＩＧＦII及びｐｃＩ₈₅₇ により形質転換されたＥ．コリ
ＬＣ１３７及びｐＰＬＭｕ／ＢＢ及びｐｃＩ₈₅₇ により
形質転換されたＥ．コリＬＣ１３７である。本発明の方
法により生成されたＩＧＦ−IIはまた、本発明の対象で
もある。

【００４４】本発明はさらに、本発明の方法により生成
されたＩＧＦ−II又はその誘導体又は塩を含んで成る医
薬組成物にも関する。医薬組成物は、従来の方法で調製
される。これまで及びこの後のアミノ酸又はアミノ酸配
列の記載のためには、３文字のコード又は１文字のコー
ドが下記のように使用される： Ａ Ala アラニン Ｒ Arg アルギニン Ｎ Asn アスパラギン Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｃ Cys システイン Ｑ Gln グルタミン Ｅ Glu グルタミン酸 Ｇ Gly グリシン Ｈ His ヒスチジン Ｉ Ile イソロイシン Ｌ Leu ロイシン Ｋ Lys リシン Ｍ Met メチオニン Ｆ Phe フェニルアラニン Ｐ Pro プロリン Ｓ Ser セリン Ｔ Thr トレオニン Ｗ Trp トリプトファン Ｔ Tyr チロシン Ｖ Val バリン Ｂ Asx (Asn＋Asp) Ｚ Glx (Gln＋Glu) 〔材料及び方法〕 〔細菌株（Ｅ．コリＫ１２）〕 ＬＣ１３７：ハーバード大学から得られたｈｔｐ
Ｒ_am，ｌｏｎ_R9，ｌａｃ_am，ｍａｌ_am，ｔｒｐ_am，ｐｈ
ｐ_am，ｒｐｓＬ，ｔｓｘ：：Ｔｎ１０，ｓｕｐＣｔｓ
株；Goff, S.A.など．、PNAS（1984）81, 6647〜6651。

【００４５】Ｗ３１１０：λｌｙｓｏｇｅｎ，ｈｓｄ
Ｒ 〔プラスミド〕 ｎＰＬＭｕ：ＢＩＯＧＥＮ（Buell, G. など．、Nucl.A
cids Res. (1985)13,1923〜1938）から得られた。この
プラスミドは、ファージＭｕｎｅｒ遺伝子リボソーム結
合部位を有するバクテリオファージλＰ_L プロモーター
を担持する（Van Leerdam, E. など．、Virology（198
2) 123 , 19〜28；またＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を参照
のこと）。

【００４６】ｐｃＩ₈₅₇ ：熱不安定性λＣＩ₈₅₇ リプレ
ッサーをコードするプラスミド（Remaut, E.など．Gene
（1983）22, 103 〜113 ）。それは耐カナマイシン性を
付与する。 ｐＩＧＦII／３：単一のＥｃｏＲＩ部位中にクローンさ
れる、ヨーロッパ特許出願０１２３２２８号に開示され
る合成ｈｕＩＧＦ−II遺伝子を有するｐＢＲ３２５（ま
たＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３も参照のこと）。

【００４７】ｐＢＢＧ８／ＩＧＦII：ＳｐｈＩとＢａｍ
ＨＩ部位との間にクローンされる、ＰＣＴ特許出願ＷＯ
８９／０３４２３に開示される合成ｈｕＩＧＦ−II遺伝
子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２；Ｎ−末端メチオニンのた
めの配列を含む）を有するプラスミドｐＵＣ１８。 〔ＳＤＳゲル−電気泳動〕ＳＤＳゲル−電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）は、ＢＩＯＲＡＤからのＭｉｎｉｐｒｏ
ｔｅａｎII細胞及び１mmの厚さの１８％ポリアクリルア
ミドゲルを用いて、前記のようにして（Laemmli, U.K.N
ature (1970)227 ,680〜685)行なわれる。 〔熱誘導〕４０μｇのアンピシリン及びカナマイシン
（ＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ）を含む培養管中の７mlのＬＢ
を単一のコロニーにより接種し、そして３０℃で一晩、
振盪しながらインキュベートする。この一晩の培養物５
mlを、１００mlの三角フラスコ中の１５mlのＬＢ／ａｍ
ｐ／ｋａｎに添加し、そしてそのフラスコを４２℃の水
槽振盪機に移す。サンプル２mlを、移す前に取り、そし
て次にサンプル１mlを１時間の間隔で５時間まで取る。
細胞を遠心分離によりペレット化し（Eppendorf （登録
商標）管及びEppendorf （登録商標）遠心分離機モデル
５４１５を用いて、１００００rpm で５分間）、上清液
を捨て、次にそのペレットをＳＤＳ−ゲルのためのサン
プル緩衝液１００μｌに再懸濁し、そして９５℃で１０
分間加熱する。アリコート１０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅのために負荷する。 〔ウェスターン分析〕タンパク質を、室温で移動用緩衝
液（２５mMのトリス−塩基／１９２mMのグリシン、１５
％のメタノール）中において０．７Ａで３０分間、電気
泳動的に膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥからの“Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｏｎ”）に移動せしめる。２０％の不活性化されたヤ
ギ血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号０６３−６２１０、
血清は５７℃で１時間、水浴中でインキュベートするこ
とにより熱不活性化される）を含むＴＢＳ（１０mMのト
リス−ＨＣｌ、室温でpH７．２，０．１５ＭのＮａＣ
ｌ）中で振盪しながら、室温で１時間、阻止を行なう。
次に膜をＴＢＳ５０mlにより３度洗浄し、そしてウサギ
抗−ｈｕＩＧＦ−II抗血清とＴＢＳとの１：２０００希
釈溶液と共に４℃で一晩インキュベートする。次の操作
を室温で行なう。次に膜をＴＢＳ５０mlにより１５分間
洗浄する（２回以上のくり返しての洗浄）。免疫反応性
タンパク質を、ＢＩＯＲＡＤキット（カタログ番号１７
０−６５０９，１９８７）を用いて可視化する。膜を、
アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−ウサギＩｇＧの
１：２０００希釈溶液と共にＴＢＳ２０ml中で１時間イ
ンキュベートし、次に上記のようにして３度洗浄する。
次の反応のために、膜を、６６μｌのＮＢＴ（ＢＩＯＲ
ＡＤカタログ番号１７０−６５３９，７０％のジメチル
ホルムアミド１ml当り７５mg）及び５０μｌのＢＣＩＰ
（ＢＩＯＲＡＤカタログ番号１７０−６５３２、蒸留水
１ml当り５０mg）を含む溶液１５ml中でインキュベート
する。眼に見えるバンドを進行せしめ、そしてその反応
を、５０mMのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液
５０ml中でその膜をインキュベートすることによって停
止する（２度くり返す）。 〔ＤＮＡフラグメント及びベクターＤＮＡの精製〕プラ
スミドＤＮＡ５μｇを、供給者の推薦に従って、緩衝液
５０μｌ中、制限酵素により切断を完結する。次に、そ
のＤＮＡを、３Ｍの酢酸ナトリウム５μｌ，１００mMの
ＭｇＣｌ₂ ，５mMのＥＤＴＡ及びエタノール１５０μｌ
の添加により沈殿せしめる。−７０℃で１５分間のイン
キュベーションの後、ＤＮＡを、１３０００ｇで１５分
間の遠心分離によりペレット化する。上清液を捨て、そ
してＤＮＡペレットを、０．２５％のブロモフェノール
ブルー及び０．２５％のキシレンシアノールを含む、
０．０８９Ｍのトリス−ボレート、０．０８９Ｍの硼酸
及び０．００２ＭのＥＤＴＡ（ＴＢＥ緩衝液）の溶液８
０μｌ中に再懸する。ブロモフェノールブルーマーカー
が１０cm×０．８cm（長さ×厚さ）のゲルの底に達する
まで、０．５μｇ／mlのエチジウムブロミドを含むＴＢ
Ｓ中において１％アガロースゲルを通して５０Ｖで、サ
ンプル４×２０μｌを電気泳動せしめる。ＤＮＡバンド
を短波ＵＶ光下で可視化し、レーザー刃により切断し、
そしてＳＣＨＬＥＩＣＨＥＲ ＆ ＳＣＨＵＥＬＬの
“ＢＩＯＴＲＡＰ”装置を用いて、２００Ａで１．５時
間の適用により、ゲル片から電気溶離する。溶離された
ＤＮＡを沈殿せしめ（上記参照のこと）、ＴＥ（１０mM
のトリス−ＨＣｌ、室温でpH７．４，１mMのＥＤＴＡ）
２０μｌに再懸濁し、そして追加の実験のために使用す
る。 〔ＤＮＡフラグメントの連結〕線状化され、そして精製
されたベクターＤＮＡ１０ng及び精製されたＤＮＡフラ
グメント３×モル当量を、１単位のＤＮＡ−リガーゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む連結緩衝液（７０mMの
トリス−ＨＣｌ，２４℃でpH７．５，１０mMのＭｇＣｌ
₂ ，５mMのジチオトレイトール、０．１mMのアデノシン
−トリホスフェート）２０μｌ中において４℃で１５時
間インキュベートする。 〔形質転換〕ＤＮＡプラスミド（上記を参照のこと）の
連結で得られた連結混合物１０μｌを、冷たい（４℃）
コンピテントＥ．コリ細胞（上記を参照のこと）２００
μｌに添加する。３０分間のインキュベーションの後、
細胞を、４２℃の水浴中で１．５分間インキュベーショ
ンすることによって熱ショックせしめる。ＬＢ２mlを添
加し、そしてその培養物を培養管中で３７℃の振盪機に
より４０分間振盪する。次にアリコート２００μｌを、
選択のための適切な４０μｇ／mlの抗生物質を含むＬＢ
プレート上に置く。 〔プラスミドの調製〕プラスミドＤＮＡ，Birnboim, H.
C.及び Doly, J(1979)Nucleic Acids Res.,７, 1513の
方法に従って調製する。 〔コンピテント細胞の調製〕コンピテントＥ．コリ細胞
を、Maniatis, T., Fritsch, E.F. 及びSambrook,J.198
2, Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laborator
y, New York), 250〜251 ページに記載されているよう
に塩化カルシウム法により調製する。

【００４８】

【実施例】１．プラスミドＰＬＭｕ／ＩＧＦIIの調製及
びｈｕＩＧＦ−II遺伝子のＥ．コリにおける発現 ｐＩＧＦII／３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）に含まれる
ｈｕＩＧＦ−II遺伝子を、第１図に示されるようにｐＰ
ＬＭｕ中にクローン化する。ｐＰＬＭｕ／３中のＩＧＦ
−II遺伝子は停止コドンを欠いている。これを、ｐＰＬ
Ｍｕ／３中のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ（“フィルイン”さ
れている）フラグメントをｐＩＧＦII／３からのＳａｌ
Ｉ−ＰｖｕIIフラグメントにより置換することによって
ｐＰＬＭｕ／ＩＧＦIIに再構成する。

【００４９】発現研究のために、プラスミドＰＬＭｕ／
ＩＧＦIIを用いて、適合するプラスミドｐｃＩ₈₅₇ を担
持するＥ．コリ株ＬＣ１３７を形質転換し、そして４０
μｇ／mlのアンピシリン及びカナマイシンを含むＬＢ−
プレート上にプレートする。新しい形質転換体の単一コ
ロニーを熱誘導のために使用する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びクーマシーブリリアントブルー染色による分析を第２
図に示す。組換えｈｕＩＧＦ−IIは、熱誘導の間、Ｅ．
コリ細胞に封入体として全細胞タンパク質の約５〜８％
蓄積する。ｒＩＧＦ−IIの同定は、第３図に示されるよ
うにウサギ抗−ｈｕＩＧＦ−II抗体を用いて“ウェスタ
ーン”分析により示される。さらに、７５００ｄの見掛
の分子量を有する熱誘導されたタンパク質バンドをゲル
から切断し、そしてＮ−末端アミノ酸分析にゆだねる。
このようにして得られた配列は、Ａ−Ｙ−Ｒ−Ｐ−Ｓ−
Ｅ−Ｔ−Ｌ−？−Ｇ−Ｇ−Ｅ−Ｌ−Ｖ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｑ
（位置“？”においては、アミノ酸は決定されない）を
示し、そして天然のｈｕＩＧＦ−IIの１つに相当する。
アミノ酸のための単一文字の意味は上記に与えられてい
る。２．プラスミドＰＬＭｕ／ＢＢの調製及びｈｕＩＧＦ−
II遺伝子のＥ．コリにおける発現 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２を有するＤＮＡ配列を有するｈ
ｕＩＧＦ−II遺伝子を、第４図に示されるようにして発
現ベクターｐＰＬＭｕ／Ｎｄｅ中にクローン化した。プ
ラスミドｐＰＬＭｕ／Ｎｄｅは次のようにして調製され
た：プラスミドｐＰＬＭｕを制限エンドヌクレアーゼＮ
ｄｅＩにより単一部位で切断した。５′−オーバーハン
ギング端を、T.Maniatis, E.F.Fritsch and J.Sambrook
(1982) ,“Molecular Cloning ”,Cold Spring Harbor
Laboratoryにより記載されているようにして、“クレノ
ウ”−ＤＮＡポリマラーゼ、２′−デオキシアデノシン
−５′−トリホスフェート及びチミジン−５′−トリホ
スフェートを用いてブラント末端化し、そして連結し、
プラスミドｐＰＬＭｕ／Ｎｏｎｄｅをもたらした。ｐＰ
ＬＭｕ／Ｎｏｎｄｅ中のＮｃｏＩ部位を、オリゴヌクレ
オチド指図のインビトロ突然変異誘発（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ、コードＲＰＮ．２３２２）のために市販のキットを
用いてＮｄｅＩ部位に転換し、そしてプライマー５′−
CGTAACCATATGAAAAACCCをプラスミドｐＰＬＭｕ／Ｎｄｅ
にもたらした。Ｅ．コリＬＣ１３７／ｐｃＩ₈₅₇ におけ
るプラスミドｐＰＬＭｕ／ＢＢによる発現研究は、ｐＰ
ＬＭｕ／ＩＧＦIIに関するのと類似する組換えｈｕＩＧ
Ｆ−IIの発現レベルを示した。３．プラスミドＰＬＭｕ／ＩＧＦIIにより形質転換され
たＥ．コリＬＣ１３７から組換えｈｕＩＧＦ−IIを含ん
で成る封入体の単離 例１に従って誘発された細胞を分離し、そして分解緩衝
液（５０mMのトリス−ＨＣｌ，１０mMのＥＤＴＡ，pH
７．０）中で２度洗浄し、そして１０分間音波処理し、
そして遠心分離する（３０分、１３０００ｇ，４℃）。
ペレットは封入体を含む。４．尿素を含む緩衝液による封入体の安定化 例３で得られた封入体を、溶解緩衝液（８Ｍの尿素、１
００mMのトリス−ＨＣｌ，８mMのＥＤＴＡ，５mMのベン
ズアミジン、５mMのＤＴＴ，pH６．５）に再懸濁し、２
〜５分間音波処理し、そして遠心分離する（３０分、１
３０００ｇ，４℃）。上清液は再生された組換えｈｕＩ
ＧＦ−IIを含む。５．酢酸による封入体の溶解 例３で得られた封入体を、７０％（ｖ／ｖ）の水性酢酸
に溶解する。６．再生の前、組換えｈｕＩＧＦ−IIの精製 例４で得られた上清液を、折返しの前、ゲル濾過カラム
（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００）上に適用する。平衡
化及び溶離緩衝液は、８Ｍの尿素、１００mMのトリス−
ＨＣｌ，１０mMのＤＴＴ（pH６．５）を含む。

【００５０】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムか
ら溶離する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、そして
組換えｈｕＩＧＦ−IIを含む画分を追加の処理のために
プールする。７．組換えｈｕＩＧＦ−IIの再生 再生された組換えｈｕＩＧＦ−IIを、例６に従って得ら
れたプール又は例４に従って得られた上清液から、尿素
濃度が２Ｍになるまでアルゴンによりガス抜きすること
によって得られた酸素フリー条件下で前記プール又は上
清液を４℃で折返し緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ，
４mMのＤＴＴ，１．５mMのＬ−シスチン、４．５mMのＬ
−システイン、pH８．５）に対して透析し、そして続い
てこの反応混合物を３０℃で２４時間インキュベートす
ることによって得た。この再生は、３０℃でのインキュ
ベーションの開始で（第５Ａ図）及び１８時間後（第５
Ｂ図）に取られる反応混合物のサンプルの逆相ＨＰＬＣ
によりモニターされる。８．組換えｈｕＩＧＦ−IIの逆相ＨＰＬＣ 折返しされていない（還元された）、準安定性の及び再
生された（酸化された）組換えｈｕＩＧＦ−IIの分離
を、ｐＨ３で酢酸による処理により及び逆相ＨＰＬＣ上
での上清液の付随するクロマトグラフィー処理により達
成する。その結果は第８表に示される。実験条件：装
置：Ｋｏｎｔｒｏｎ．カラム：ＶｙｄａｃＣ１８ ５μ
ｍ。定常相：２１８ ＴＰ５４１５。アリコート部分：
６００μｌ。流速：１２ml／分。溶離剤Ａ：０．１％の
トリフルオロ酢酸。溶離剤Ｂ：アセトニトリル／水８：
２＋０．０８％のトリフルオロ酢酸。圧力：約１００バ
ール。２１６nmでの吸光度。９．組換えｈｕＩＧＦ−IIの特徴化 例８に従ってＨＰＬＣにより単離された２０．６６（第
５Ａ図）又は２０．５１（第５Ｂ図）での画分１（ピー
クは、“酸化された再生”として示される第４図に存在
する）を、次のようにして特徴づける：ａ）組換えｈｕＩＧＦ−IIのアミノ酸組成の決定 ＨＰＬＣ溶離液の画分１から単離された組換えｈｕＩＧ
Ｆ−IIをＨＣｌにより加水分解し、そして次に、Chang
など．、Method in Enzymology 91:41(1983)に記載され
るようにして分析する。その加水分解物は、第１表に与
えられるアミノ酸組成を有する。第１表：Ｅ．コリからの組換えｈｕＩＧＦ−IIのアミノ
酸組成 括弧の中の値は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として示され
るアミノ酸配列におけるアミノ酸の数を示す。

【００５１】 アミノ酸 加水分解物 アミノ酸 加水分解物 Asx 3.3(3) Ile 0.5(1) Thr 3.8(4) Leu 5.5(6) Ser 7.6(7) Tyr 1.2(3) Glx 6.3(7) Phe 4.3(4) Pro 3.6(3) His − (-) Gly 6.3(5) Lys 1.2(1) Val 4.0(4) Arg 8.3(8) Ala 4.8(5) Met − (-) Cys 5.0(6) 合計 67 ｂ）部分配列の分析 ＨＰＬＣ溶離液の画分１から単離された組換えｈｕＩＧ
Ｆ−II約３５μｇをＥｄｍａｎの従来の配列分析にゆだ
ね、そしてＮ−末端フェニルチオヒダントインアミノ酸
を逆相ＨＰＬＣにより決定する。３５サイクルの結果は
次の通りである： サイクル 1 10 20 アミノ酸 ＡＹＲＰＳＥＴＬ−ＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶ サイクル 21 30 35 アミノ酸 −ＧＤＲＧＦＹＦ−ＲＰＡＳＲＶｃ）組換えｈｕＩＧＦ−IIの見掛の分子量 組換えｈｕＩＧＦ−IIを、還元及び非還元条件下で、La
emmli など．、Nature227:680〜685(1970) に従ってＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析する。両条件下
で、約７５００Ｄの見掛の分子量が組換えｈｕＩＧＦ−
IIのために測定される。ｄ）²⁵² Ｃｆ−ＰＤ−質量分析法により分子量の測定 ５μｇのｒＩＧＦ−IIを、水及び酢酸の１：１（ｖ／
ｖ）混合物１０μｌに溶解する。タンパク質を、ニトロ
セルロース被覆のサンプルホルダーに吸着し、そして質
量スペクトルを、１３cmのフライト管の長さを有するフ
ライト質量分析器モデルＢｉｏｉｏｎ ２０（BIOION N
urdic AB, Uppsala, Sweden)の²⁵² Ｃｆプラズマ脱着時
間に基づいて記録する。

【００５２】スペクトルを＋１９KVの加速電位で集め
る。測定されたｍ＋Ｈ⁺ イオンの質量は７４６９であ
る。その計算された分子量は７４６９．５である。 〔微生物の寄託〕下記の微生物は、Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen, Mascheroder Weglb, D-3300 Bra
unschweigにブダペスト条約に基づいて１９８９年１１
月１４日に寄託された：ｐｃＩ₈₅₇ 及びｐＰＬＭｕ／Ｂ
Ｂにより形質転換されたＥ．コリＬＣ１３７は、Ｎｏ．
ＤＳＭ５６４１の番号でＬＣ１３７／ＢＢとして寄託さ
れた。

【００５３】ｐｃＩ₈₅₇ 及びｐＰＬＭｕ／ＩＧＦIIによ
り形質転換されたＥ．コリＬＣ１３７は、Ｎｏ．ＤＳＭ
５６４２の番号でＬＣ１３７／ＩＧＦIIとして寄託され
た。

【００５４】

【配列表】 <110> Novartis AG <120> Novel process for the production of unfused protein in E.coli <130> B006129 <150> GB8927008.6 <160> 4 <210> 1 <211> 67 <212> PRT <213> human <400> 1 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 2 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> <222> <223> DNA sequence of the synthetic huIGF-II gene with E.coli preferred codon usage. from 1 to 6 NdeI cleavage site from 7 to 207 coding region from 211 to 216 BamHI cleavage site <400> 2 catatggcat accgcccgag cgagaccctg tgcggtggcg agctcgtaga cactctgcag 60 ttcgtttgtg gtgaccgtgg cttctacttc tctcgtcctg ctagccgtgt atctcgccgt 120 tctagaggca tcgttgaaga gtgctgtttc cgcagctgtg atctggcact gctcgaaact 180 tactgcgcaa ctccagcaaa atccgaataa ggatcc 216 <210> 3 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> <222> <223> huIGF-II gene with preferred yeast codon usage. from 1 to 6 EcoRI cleavege site from 7 to 11 HgaI cleavege site from 17 to 217 coding region from 223 to 227 HgaI cleavage site <400> 3 gaattcgacg cttatggctt acagaccatc cgaaaccttg tgtggtggtg aattggtcga 60 caccttgcaa ttcgtttgtg gtgacagagg tttctacttc tccagaccag cttccagagt 120 ttctagaaga tccagaggta tcgttgaaga atgttgtttc agatcttgtg acttggcttt 180 gttggaaacc tactgtgcta ccccagctaa gtctgaatga atgcgtcgaa ttc 233 <210> 4 <211> 150 <212> DNA <213> Bacteriophage Mu <220> <221> <222> <223> DNA sequence of the DNA fragment downstream of theλPL promoter in plasm id pPLMu comprising the ner gene ribosomal binding site of phage Mu from 1 to 61 ner gene ribosomal binding site from 62 to 110 polylinker with recognition sites for the restrictio n enzymes NcoI, EcoRI, SmaI, BamHI, SalI, PsrI, and HindIII. <400> 4 gaattcttac acttagttaa attgctaact ttatagatta caaaacttag gagggttttt 60 accatggtta cgaattcccg gggatccgtc gacctgcagc caagcttggc tgcctcgcgc 120 gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 150

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、プラスミドＰＬＭｕ／ＩＧＦIIの構
成のためのクローニング手段の略図である。

【図２】第２図は、Ｅ．コリＬＣ１３７における組換え
ｈｕＩＧＦ−IIの発現を示すクーマシーブリリアントブ
ルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真であ
り、図面に代わる写真である。レーン１：１０μｌの粗
抽出物、細胞は誘導されていない。レーン２：１０μｌ
の粗抽出物、細胞は１時間熱誘導されている。レーン
３：１０μｌの粗抽出物、細胞は２時間熱誘導されてい
る。レーン４：分子量サイズマーカー。レーン５：２０
μｌの粗抽出物、細胞は誘導されていない。レーン６：
２０μｌの粗抽出物、細胞は１時間熱誘導されている。
レーン７：２０μｌの粗抽出物、細胞は２時間熱誘導さ
れている。

【図３】第３図は、プラスミドｐＰＬＭｕ／ＩＧＦII及
びｐｃＩ₈₅₇ を担持するＥ．コリ株ＬＣ１３７の熱誘導
の後、全細胞タンパク質の“ウェスターン分析”を示す
写真であり、図面に代わる写真である。ウサギ抗−ｈｕ
ＩＧＦ−II抗体が使用された。レーン１：１０μｌの全
細胞タンパク質、細胞は誘導されていない。レーン２：
１０μｌの全細胞タンパク質、細胞は１時間熱誘導され
ている。レーン３：１０μｌの全細胞タンパク質、細胞
は２時間熱誘導されている。レーン４：１０μｌの全細
胞タンパク質、細胞は３時間熱誘導されている。レーン
５：精製された組換えｈｕＩＧＦ−Ｉ標準。

【図４】第４図は、プラスミドＰＬＭｕ／ＢＢの構成の
ためのクローニング手段の略図である。

【図５】第５図は、再生の前（Ａ）及び後（Ｂ）での組
換えｈｕＩＧＦ−IIのＨＰＬＣ分析の溶離プロフィール
である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主細胞からｒＩＧＦ−IIを単離し、そ
   してジスルフィド結合を還元しそしてその還元されたポ
   リペプチドを変性条件下で溶解することによってｒＩＧ
   Ｆ−IIを生物学的活性形に再生し、前記変性したポリペ
   プチドを天然に存在する形への折りたたみを可能にし、
   そしてジスルフィド結合を形成するためにスルフヒドリ
   ル基を再酸化するための方法であって、 ａ）宿主細胞により産生されたｒＩＧＦ−IIを単離し、 ｂ）ｒＩＧＦ−IIを適切な溶液に溶解し、 ｃ）段階ｂ）で得られたｒＩＧＦ−II溶液を折りたたみ
   緩衝液に対して透析し 、そしてｒＩＧＦ−IIが任意にプロテイナーゼインヒビ
   ターの存在下で生物学的活性形に折りたたまれるよう
   に、還元されたスルフヒドリル基の分子内ジスルフィド
   結合へのゆっくりした酸化を可能にするように、酸化物
   質の存在において酸素を含まない条件下で前記ｒＩＧＦ
   −IIを折りたたみ緩衝液中でインキュベートすることに
   よってｒＩＧＦ−IIを生物学的活性形に再生し、そして ｄ）所望により、遊離カルボキシ及び／又はアミノ基を
   有する得られたポリペプチドを塩に転換し、又は得られ
   た塩をその遊離化合物に転換する段階を含んで成る方
   法。
2. 【請求項２】 前記ｒＩＧＦ−IIを溶解するために適切
   な溶液が、ｒＩＧＦ−IIの折りたたみを解くために十分
   な濃度で還元剤及びカオトロープ並びに必要なら、プロ
   テイナーゼインヒビターを含んで成る請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 前記カオトロープが尿素又はグアニジン
   −ＨＣｌである請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記カオトロープの濃度が約７〜約９Ｍ
   である請求項２記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ｒＩＧＦ−IIを溶解するために適切
   な溶液がカルボン酸を含む水溶液である請求項１記載の
   方法。
6. 【請求項６】 前記カルボン酸が、約０．１％（ｖ／
   ｖ）〜約７０％（ｖ／ｖ）の濃度でのＣ₂ −Ｃ₄ カルボ
   ン酸である請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 前記カルボン酸が酢酸である請求項６記
   載の方法。
8. 【請求項８】 前記酢酸の濃度が約５０％（ｖ／ｖ）〜
   約７０％（ｖ／ｖ）である請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 前記酢酸の濃度が約１％であり、そして
   pHをＨＣｌで２〜４に調整する請求項７記載の方法。
10. 【請求項１０】 折りたたまれていないｒＩＧＦ−IIを
    含んで成る溶液を約０℃〜約１０℃の温度で折りたたみ
    緩衝液に対して透析し、そして続いて、ｒＩＧＦ−IIを
    約１０μｇ／ml〜約４００μｇ／mlの濃度で約４℃〜約
    ３５℃の温度で約１８〜約９６時間、折りたたみ緩衝液
    中においてインキュベートする請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記透析温度が４℃である請求項２記
    載の方法。
12. 【請求項１２】 前記折りたたみ緩衝液がカオトロープ
    として、グアニジン−ＨＣｌ又は尿素を約２Ｍの濃度で
    含んで成る請求項１０記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ｒＩＧＦ−II濃度が約１００μｇ
    ／mlである請求項１０記載の方法。