JPH0779701B2 - 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチドをコ−ドする遺伝子 - Google Patents

成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチドをコ−ドする遺伝子

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JPH0779701B2
JPH0779701B2 JP61058448A JP5844886A JPH0779701B2 JP H0779701 B2 JPH0779701 B2 JP H0779701B2 JP 61058448 A JP61058448 A JP 61058448A JP 5844886 A JP5844886 A JP 5844886A JP H0779701 B2 JPH0779701 B2 JP H0779701B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野及び従来の技術〕 成長ホルモン放出因子（GRF）と称される一群の物質が
最近先端肥大症患者のすい臓腫瘍から単離されている。
Guillemin等，Science，218,585,1982;及びEsch等，J.B
iol.Chem.258,1806,1983。
幾つかの形のGRFが精製され、そしてそれらのアミノ酸
配列が決定された。GRF−44はGRF-40の完全なアミノ酸
配列を含有し、そしてそのカルボキシ末端において４個
のアミノ酸により延長されている。今度はGRF-40はGRF-
37の完全なアミノ酸配列を含有し、そしてそのカルボキ
シル末端において３個のアミノ酸により延長されてい
る。ペプチドGRF29（J.River等，Nature，300,276-8,19
82）もまた生物学的に活性であることが示されている。
GRF-44のカルボキシ末端（Leu）のみがアミド化されて
いる（GRF-NH2‐44）。GRF-NH2‐44が成熟ホルモンであ
り、そしてGRF-40、GRF-37及びGRF-29はその蛋白質分解
誘導体であると信じられている。但し、上記のすべての
GRFは生物学的に活性である。
GRF類は脳下垂体による成長ホルモンの合成及び放出の
両者に対して作用すると報告されている。Sci.，79,790
9,1982;及びBaringa等，Nature，306,84,1983。視床下
部から単離されたGRF-44ペプチド（hhGRF）はすい臓腫
瘍に由来するそれ（hpGRF）と同一であることが示唆さ
れており、そして事実、hhGRFと、hpGRFに対する抗体と
の間に免疫反応性が検出された。さらに、両ペプチド
は、HPLCにより分析された場合同一のプロフィールをも
たらす（Bohlem等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,114,
930,1983）。さらに最近になって、hpGRF及びhhGRFが同
じアミノ酸配列を有することが証明された（Ling等，Pr
oc.Natl.Acad.Sci.，81,4302,1984）。
hpGRFを生産するすい臓腫瘍から単離されたメッセンジ
ャーRNAに対して相補的なDNAの合成及び特徴付けによ
り、GRF-44は107〜108個のアミノ酸を有するプレープロ
ホルモンとして生産され、そしてGRFはアミノ酸残基32
からアミノ酸残基75にわたることが証明された（Gubler
等，Proc.Natl.Acad.Sci.，80,4311,1983;及びMayo等，
Nature，306,86,1983）。
GRF-44配列に続くGly-Argは典型的なアミド化部位に類
似する（Boel等，The EMBO J., 3,909,1984;Bradbury
等，Nature，298,686,1982）。
GRFは、成長ホルモンによる治療について現在考えられ
ているほとんどの分野において医療的に使用することが
できる。このような医療的用途の例には脳下垂体性小人
症、異状な成長ホルモン生産による糖尿病、創傷、重症
の熱傷の治療が含まれる。
幾つかの形態のGRFの大きさは、常用のペプチド合成法
によってその製造が可能なものである。確かに、幾つか
のGRF誘導体がこれらの手段によって製造され、そして
生物学的に活性であることが見出された（Murphy等，Bi
ochem．Biophys. Res.Commun.,112,469,1983;Thorner
等，Lancet,1月1/8,24,1983;Adams等，Lancet,5月14110
0,1983;Rosenthal等，Clin.Endocr．Metab.，57,677,19
83）。さらに端末アミノ酸にアミド化されたカルボキシ
を有するペプチドを合成することが可能である。しかし
ながら、化学的手段によるGRF-44の製造は非常に高価で
あり、そして組換DNA技法によるペプチドの製造が一層
便利であると考えられる。
ヨーロッパ特許出願公開No.・0108387は、メチオニンの
コドンにより先行される種々の形態のGRFをコードする
合成DNA分子の製造を記載しており、このメチオニンの
コドンは、該DNA分子が適当なベクターに挿入された後
の適当な微生物によるメチオニン化GRFの直接合成を可
能にする。適当な配列が連結された場合にGRFペプチド
のそれぞれアミノ端及びカルボキシ端をコードする２つ
の２本鎖DNA分子をもたらす２系列のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド断片の製造方法が記載されている。
２個の２本鎖DNA分子が一緒に連結されて目的とするGRF
構造遺伝子が得られる。好ましい発現ベクターは、バク
テリオファージλDNAから単離されてそしてtetR遺伝子
及びampR遺伝子の間に挿入されたPLプロモーターを含有
するプラスミドpBR322の誘導体である。GRF分子のＮ末
端における追加のアミノ酸メチオニンの存在が、特に長
い治療期間における不所望の免疫反応の可能性を生じさ
せる。
〔発明の目的〕
この発明は、組換DNA技法により得られるハイブリドポ
リペプチドによるGRFの製造、及びそのために使用され
る材料に関する。
このハイブリドポリペプチドは、アミノ酸Trpを介してG
RFのアミノ酸配列に連結されたTrpEのアミノ酸1-323を
含む。還元及びカルボキシアミドメチル化、Trp残基の
特異的開裂、並びにこれに続くゲル濾過及びHPLCによる
GRFの精製により非アミド化GRFが得られる。
従って、この発明は、E.コリTrpプロモーター／オペレ
ーター、Trpリーダー及びアテヌエーター、Trp遺伝子の
リボゾーム結合部位、TrpEポリペプチドの最初の３分の
２をコードするDNA、Trpコドン、並びにGRFペプチドを
コードする遺伝子の使用に基いて、プラスミドによりコ
ードされたハイブリドポリペプチドとしてGRFを製造す
るための方法を提供することを目的とする。
この発明の他の目的は、DNA分子の合成を提供すること
であり、このDNA分子は、GRFのコード配列、並びにこれ
に先行するTrpのためのTGGコドン、及び正しいリーディ
ングフレームを維持しながらTrpE構造遺伝子を担持する
プラスミド内に前記のDNA分子を挿入することを可能に
するヌクレオチド配列を含む。
この発明の他の目的は、高品質のハイブリドTrpE-GRFポ
リペプチドの合成を行うためにこの発明のプラスミドを
含有する微生物を増殖せしめる方法を提供することであ
る。
この発明の他の目的は、ハイブリドポリペプチドの抽出
のため及び一連の段階を通して目的とするGRFペプチド
を分離するための方法を提供することである。
この発明のこれらの及びその他の目的は、以下の詳細な
記載から明らかになるであろう。
GRF-44のDNA分子上には幾つかの制限酵素部位が存在す
るため、この発明の他の面を構成する他の３種類の分
子、すなわちGRF-40、GRF-37、及びGRF-29ペプチドをコ
ードするDNA分子を導くことができる。
事実、DNA分子をNarI制限酵素で分解し、そして次のオ
リゴヌクレオチド： により３′−末端断片を置き換えてGRF-40をコードする
DNAを生じさせることができる。
GRF-37をコードするDNA分子は次のようにして得ること
ができる。
ａ）第１図に示すDNAをBstXI制限酵素で分解して、次の
３′−末端： 35 36 Asn Gln −−−AAC CAG GAGC −−−TTG GTC を生じさせ； ｂ）単鎖テイルをS1エキソヌクレアーゼにより除去し；
そして、 ｃ）次のオリゴヌクレオチド： を３′−末端に付加して37番目のコドンを再生する。
第１図に示すDNA分子をXbaI制限酵素で分解し、そして
３′−末端末端を次のオリゴヌクレオチド： で置き換えることにより、GRF-29をコードするDNA分子
が得られる。
プラスミドpSP19の造成、及びプラスミド由来TrpE-GRF-
44ハイブリドポリペプチドの製造は、次のようにして達
成される。
（１）プラスミドpSP2の造成 pBR322（Boliver等，Science，2,95-113,1977）及びλE
D10f（Armstrong等，Science，196,172,1977;及びHelin
ski等,Recombinant Molecules,Tenth Miles Internatio
nal Symposium,Raven Press,1977,151-165）から出発し
てpSP2を造成した。λED10fは、プロモーターからTrpD
構造遺伝子に延びるE.コリTrpオペロンDNA源として使用
した。pBR322及びλED10fをEcoRI及びHindIII制限酵素
により消化した。Trpオペロン制御機能部、完全TrpE構
造遺伝子及びTrpD構造遺伝子の５′‐端を担持するλED
10fからのEcoRI-HindIII断片を、T4DNAリガーゼによ
り、pBR322のHindIII-EcoRI大断片と連結した。この連
結混合物を用いてE.コリW3110ΔTrpE5/tna2細胞（Nicho
ls及びYanogsky,Methodsin Enzymology,101,155,1983）
を形質転換した。形質転換処理された細胞をトリプトフ
ァンを欠く最少培地プイート上にプレートした。１つの
Trp+クローンをpSP2組換体DNAプラスミド源として使用
した。このクローンの細胞を、50μg/mlのアンピシリン
（Ap）を添加した富培地中で増殖せしめ、そして貯蔵し
た。pSP2の制限地図を第２図に示す。ここで、太い線で
示されるEcoRI-HindIII断片はE.コリTrp機能部を担持
し、そしてλED10fに由来するものであり、他方、他のD
NAはpBR322に由来する。
（２）プラスミドpSP2delの造成 プラスミドpSP2のDNAをBglIIエンドヌクレアーゼにより
消化し、そして大断片をアガロースゲル電気泳動により
精製し、そしてT4DNAリガーゼにより自己連結した。こ
の連結混合物を用いてW3110ΔTrpE5/tna2細胞を形質転
換した。
ApR形質転換体を50μg/mlのアンピシンを含有するニュ
トリエント・アガー（ディフコ）上で選択した。１個の
ApRクローンをpSP2delのDNAの入手源として使用した。
この制限地図を第３図に示す（詳しくは第２図の説明を
参照のこと）。
TrpE構造遺伝子からのBglII断片の除去が、酵素活性を
喪失した部分的TrpEポリペプチドの発現をもたらす。従
って、pSP2delを担持するW3110ΔTrpE5tna2細胞はトリ
プトファンの存在下で増殖せしめなければならない。
pSP2del中のBglII部位の連結が蛋白質合成の新しい終止
コドンを形成する（Nichols等，J.Mol．Boil．146,45-5
4,1981）。
こうして、pSP2del由来部分TrpE（ΔTrpE）は342個のア
ミノ酸を含有し、これに対してプラスミドpSP2によりコ
ードされる全蛋白質は520個のアミノ酸を含有する（第
３図を参照のこと）。
（３）Trp-GRF-44遺伝子のクローニング pSP2delをBglII及びBamHI制限酵素で分解し、そして大
断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。このDN
Aを合成Trp-GRF-44コードDNA分子（第１図を参照のこ
と）と混合し、そしてT4DNAリガーゼと反応せしめた。
第４図は、プラスミドpSP2del中に合成遺伝子を挿入す
ることによるpSP19プラスミドの造成を示す。TcSはテト
ラサイクリンに対する感受性を示す。連結混合物を使用
してW3110ΔTrpE/tan2細胞を形質転換し、そして50μg/
mlのアンピシリンを含有するプレート上でApRクローン
を選択する。テトラサインリンに対して感受性（TcS）
である１つのApRクローンをpSP16DNA源として使用し
た。
TrpGRF44遺伝子のヌクレオチド配列は、部分的TrpEとGR
F44がトリプトファン残基により分離されているハイブ
リドポリペプチドの合成を可能にする。Trpは、後で記
載するようにヨードソ安息香酸により分解され得る。pS
P19プラスミドDNAによりコードされるハイブリドDNAは
第５図に示すアミノ酸配列を有し、そしてTrpE-GRFとし
て示される。
最初の323アミノ酸はTrpEの３分の２を示し、これにTrp
残基及びGRF44のアミノ酸配列が続く。従ってTrpE-GRF
は368個のアミノ酸から成る。
TrpE-GRF-44ハイブリド蛋白質の製造 W3110ΔTrpE5tna2（pSP19）株を、300mlのSMM（スピッ
ツアー最少培地）中で一夜増殖せしめた。この培地は１
当り次の成分： (NH4)2SO4 ２ ｇ KH2PO4 ６ ｇ K2HPO4 14 ｇ Na.シトレート．2H2O １ ｇ MgSO4 0.2g を含有する水溶液である。オートグレーブにより殺菌し
た後、10mlの40％クルコース、及び3.5μg/mlのインド
ールを加える。
培養物（約4.3×108細胞/ml）を10lの同じ培地中に希釈
し、そして細胞を攪拌、及び１分間当り１気圧の空気１
の吹込のもとで増殖せしめた。
10lの発酵槽中の培地の組成及び増殖条件は、Trpオペレ
ーターを担持するpSP19を抑制解除状態に維持し（従っ
て、TrpE-GRFポリペプチドの発現を可能にし）そしてさ
らに細胞の増殖を可能にするのに理想的であることが証
明された。22〜25時間の増殖の後、培養物は590nmにお
ける約3.0の0Dに達した。遠心分離により集菌し、そし
て−80℃にて貯蔵した。この細胞のサンプルを使用した
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により蛋白質の分析を
行い、目的とするTrpE-GRFポリペプチドの存在が証明さ
れた。
TrpE-GRFポリペプチドの精製 凍結した細胞を、0.2M Tris-HCl（pH7.6）,0.2M NaCl,
0.01M CH3COOMg,0.01M β‐メルカプトエタノール及び
５％グリセリンを含む緩衝液中で解凍した。アルミナの
存在下で細胞を破砕し、そして細胞破片を遠心除去し
た。水相を水で４倍に希釈し、そして最終溶液１当り
144gの(NH4)2SO4を添加することによりハイブリド蛋白
質を沈澱せしめた。沈澱した蛋白質を遠心分離によりペ
レット化し、水に溶解し、そして10mM NH4HCO3に対して
十分に透析した。次に透析物をPAGEで分析し、そして凍
結乾燥した。
TrpE-GRFハイブリドポリペプチドからのGRF-44の分離 TrpE-GRFポリペプチドを下記の一連の化学反応にかけGR
Fペプチド成分を分離した。
（１）Cys残基の還元及びカルボキシアミドメチル化 還元及びカルボキシアミドメチル化の条件はG.Allenの
報告、Laboratory Techniques in Bilchinistry and Mo
lecular Biology,Vo19,28頁,T.S.Work及びR.H.Burdon
編,Elsevier,1981から採用した。あらかじめ調製しそし
て凍結乾燥したTrpE-GRFポリペプチドを、0.5M Tris-HC
l,0.1％EDTA及び6Mグアニジン‐HCl（pH8.5）を含む緩
衝液中に溶解した。最終蛋白質濃度は２％であった。次
に、DTTを蛋白質中のCys含量より15倍高い濃度に加え
た。次に、混合物を50℃にて２時間インキュベートし、
そして次にヨードアセタミドをDTT濃度の２倍加えた。
暗中室温にて30分間インキュベートした後、β‐メルカ
プトエタノールを添加することにより反応を停止した。
次に反応混合物を水に対して２時間、そして10mM NH4HC
O3に対して一夜透析した。次に、カルボキシアミドメメ
チル化されたTrpE-GRFポリペプチドを含有するこの材料
を凍結乾燥した。
（２）ヨードソ安息香酸反応 使用した方法は、A.Fontana等，Biochemistry20,6997,1
981により記載されたものと実質上同一である。5mgのヨ
ードソ安息香酸を375μｌの4Mグアニジン‐HCl、80％酢
酸に溶解した。この溶液に7.5μｌのp-クレゾール及び
次に5mgのカルボキシアミドメチル化TrpE-GRFを溶解し
た。室温にて暗中20時間反応を行った。次に750μｌの
水を加え、そして10分間の後、混合物を12,000gにて５
分間遠心分離した。水相はペプチド、特にGRF-44を含有
する。
（３）GRF-44の精製 前に得られた水溶液を、５％酢酸に対して平衡化した１
×50cmセファデックスG-25カラムを通してゲル濾過する
ことにより脱塩した。流速は約3ml/時であった。排除さ
れた材料を回収し、そして蒸発によりその容積を減少せ
しめた。こうして得られた濃縮液をEt3NによりpH3.5に
した10mM H2PO4で平衡化したC18カラムを用いてHPCLに
より分析した。
ペプチドをアセトニトリルで溶出し、そして画分に集
め、次にこの画分をRIAにより分析した。この結果は主
ピーク中に免疫活性が存在することを示した。TrpE-GRF
40、TrpE-GRF37及びTrpE-GRF29ハイブリドポリペプチド
並びに対応するGRF40、GRF37及びGRF29ペプチドは、Trp
E-GRF44及びGRF44の製造について上に記載したのと同様
の方法により得ることができる。
記載されたプラスミドを含有するW3110ΔTrpE5tna2細胞
はATCCに、ブダペスト条約に基く国際寄託として寄託さ
れた。
W3110ΔTrp E5 tna2（pSP2）ATCC 53056W3110ΔTrp E5
tna2（pSP2-del）ATCC 53058W3110ΔTrp E5 tna2（pSP1
9）ATCC 53054。
【図面の簡単な説明】
第１図はGRF-44をコードする遺伝子のヌクレオチド配列
を示す。このDNA分子は構成ブロックとしてジヌクレオ
チドを使用しそして固体支持体としてポリスチレンを用
いる固相ホスホトリエステル法により化学的に合成され
たものである。BglII、XbaI、BstXI、及びBamHIはこれ
らの制限エンドヌクレアーゼにより認識される部位を示
す。Stopは蛋白質合成の終止のためのコドンを示す。 第２図は、pSP2プラスミドベクターの制限地図であり、
ここで細線はpBR322のDNAを示し；太線はTrpプロモータ
ー／オペレーター、Trpリーダー配列（TrpL）、完全Trp
E構造遺伝子及び部分的TrpD構造遺伝子（ΔTrpD）を担
持するE.コリ染色体DNAを示し；ApR及びTcRはそれぞれ
アンピシン及びテトラサイクリンに対する耐性を付与す
る遺伝子を示し；そして“Ori"はこのプラスミドの複製
開始点である。 第３図は、プラスミドpSP2からのプラスミドpSP2delの
造成を示すフローチャートであり、ΔＥは不完全なTrpE
構造遺伝子を示す。 第４図は、プラスミドpSP2delからのプラスミドpSP19の
造成を示すフローチャートである。 第５図は、TrpE部位の全アミノ酸配列及びGRFの最初の
５個のアミノ酸を示すTrpE-GRFハイブリドポリペプチド
のアミノ酸配列の模式的構造を示す。 GRF-44の全配列は第１図に示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シルビア ドニニ イタリー国 ローマ，エル．ゴ デクリ オルシ 22 (56)参考文献 特開 昭60−49798（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−162887（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−227899（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−145221（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 20，（1981），Ｐ．6997−7004

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】成長ホルモン放出因子（GRF）のＮ−末端
    にトリプトファン（Trp）を介してTrpEペプチドのＣ−
    末端が結合して成るポリペプチドをコードする構造遺伝
    子。
  2. 【請求項２】前記GRFがGRF-44である特許請求の範囲第
    １項に記載の構造遺伝子。
  3. 【請求項３】前記GRFがGRF-40である特許請求の範囲第
    １項に記載の構造遺伝子。
  4. 【請求項４】前記GRFがGRF-37である特許請求の範囲第
    １項に記載の構造遺伝子。
  5. 【請求項５】前記GRFがGRF-29である特許請求の範囲第
    １項に記載の構造遺伝子。
  6. 【請求項６】GRFのＮ−末端にTrpを介してTrpEペプチド
    のＣ−末端が結合して成るポリペプチドをコードする構
    造遺伝子と、該構造遺伝子の微生物的発現を行うことが
    できるDNAとが使用可能に連結されているDNA。
  7. 【請求項７】GRFのＮ−末端にTrpを介してTrpEペプチド
    のＣ−末端が結合して成るポリペプチドをコードする構
    造遺伝子を、形質転換された微生物中で発現することが
    できる複製可能な微生物性発現ベクター。
  8. 【請求項８】次の構造： （構造式中、Trp p/oはトリプトファン遺伝子（Trp）プ
    ロモーター／オペレーターを表わし;LはTrpのリーダー
    配列遺伝子を表わし；ΔＥはTrp E遺伝子の部分を表わ
    し、そしてGRFは成長ホルモン放出因子の構造遺伝子を
    表わす） により表わされるプラスミドpSP19である、特許請求の
    範囲第７項に記載の発現ベクター。
  9. 【請求項９】GRFのＮ−末端にTrpを介してTrpEペプチド
    のＣ−末端が結合して成るポリペプチドをコードしてい
    る構造遺伝子を発現することができる複製可能な発現ベ
    クターにより形質転換された細菌。
  10. 【請求項１０】前記発現ベクターが、次の構造： （構造式中、Trp p/oはトリプトファン遺伝子（Trp）プ
    ロモーター／オペレーターを表わし;LはTrpのリーダー
    配列遺伝子を表わし；ΔＥはTrp E遺伝子の部分を表わ
    し、そしてGRFは成長ホルモン放出因子の構造遺伝子を
    表わす） により表わされるプラスミドpSP19である、特許請求の
    範囲第９項に記載の細菌。
  11. 【請求項１１】大腸菌である、特許請求の範囲第９項又
    は第10項に記載の細菌。
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