KR970009082B1 - 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법

제1도는 Lys-C 엔도프로테이나아제(endoproteinase)에 의한 절단부위를 함유하며, 파아지 fr 외피(coat)단백질과 α-hANF로 구성된 융합 단백질의 161개 아미노산 서열 및 그에 상응하는 염기서열이다.

제2도는 파아지 fr 외피단백질 유전자의 해독 시작 부위(translation initiation region; TIR)의 염기서열이다.

제3도는 파아지 fr 외피단백질 및 α-hANF로 구성된 융합 단백질을 클로닝하고 발현시키기 위한 재조합 DNA 단편들 및 벡터들을 나타낸 것이다.

제4도는 융합 단백질의 발현을 분석하기 위해 실시한 SDS-폴리아크릴아미드 농도구배겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

제5도는 pFAN15 플라스미드에 의해 형질전환된 E. coli K803의 발효조에서의 성장곡선 및 융합 단백질의 생산량을 도시한 그래프이다.

제6도는 파아지 fr 외파단백질 및 α-hANF로 구성된 융합 단백질을 정제단계별로 SDS-폴리아크릴아미드 농도구배 겔 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

제7도는 재조합 α-hANF의 HPLC 용출 프로필이다.

제8도는 재조합 α-hANF의 농도 증가에 따른 토끼 동맥의 이완반응을 나타내는 그래프이다.

제9도는 재조합 α-hANF의 혈압 저하 작용을 나타내는 그래프이다.

제10도는 재조합 α-hANF의 이뇨작용을 나타내는 그래프들이다.

본 발명은 재조합 DNA 기술을 이용하는 α-hANF(인간 α-아트리알 나트리우레틱 인자)의 제조방법에 관한 것이다.

좀더 구체적으로 본 발명은, 재조합 DNA 기술 및 단백질 공학을 이용하여 일반적으로 박테리아에서 불안정하다고 알려진 α-hANF를 높은 발현율로 벡타리아 숙주내에서 생산하는 방법, 이 과정에서 발현율을 높이기 위해 요구되는 특정의 하이브리드 유전자를 함유하도록 구성된 발현 플라스미드 벡터와 이 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 세포즈, 또한 그 결과 생성되는 특정의 융합 단백질에 관한 것이다.

α-hANF는 채액양의 조절과 혈압의 항상성에 관계하는 심장 유래의 펩티드 호르몬이므로 고혈압 및 그에 따른 심장질환에 대하여 항 고혈압제 및 나트륨 뇨 배출제로서 임상적으로 유용하게 사용될 것으로 생각되는 단백질로서, 일반적으로 28개의 아미노산으로 구성되고, 아미노 말단으로부터 일곱 번째의 Cys과 23번째의 Cys이 디설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있는 환상의 단백질이다.

α-hANF 단백질을 포함하여 진핵생물중에 존재하는 많은 작은 크기의 단백질들(예 : 호르몬들)은 E. coli 등의 미생물에서 숙주에 의한 외래 단백질의 분해작용 때문에 단순한 유전공학적 방법으로는 원하는 외래단백질을 충분한 회수율로 발현시키기 어려운 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 이러한 선행기술상의 문제점을 극복하기 위해, 특이한 절단부위를 가지는 연결자에 의하여 α-hANF 활성을 가지는 단백질과 분해작용에 대한 방어역할을 하는 단백질을 연결하여 융합단백질을 만드는 방법을 개발하게 되었으며, 이때 사용되는 방어적 단백질로는 E. coli에서 과생산될 뿐아니라, 아결정을 형성하여 매우 안정한 박테리어 파아지의 fr 외피단백질을 선택하였다.

이에따라 진핵생물중에 존재하는 단백질인 α-hANF는 파아지 fr 외피단백질과 융합되어 박테리아에 의한 분해작용을 덜 받게될 것이고, 따라서 상업적으로 회수 가능한 수율로 박테리아에서 성공적으로 발현될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 목적은 하기와 같은 과정으로 구성되는 α-hANF 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명에 따라 미생물 숙주에서는 α-hANF 단백질 발현을 안정화시켜 원하는 α-hANF 단백질을 고수율로 제조하기 위해서는, 첫째, 통상의 박테리아 발현계에서는 충분히 회수되지 않는 α-hANF 단백질 호르몬에 상응하는 유전자 서열을 특정의 엔도프로테이나아제가 인식할 수 있는 절단부 염기서열을 통해 파아지의 fr 외피단백질 유전자와 융합시켜 박테이라 발현계에서도 회수 가능한 수율로 융합 단백질을 생산할 수 있도록 하이브리드 유전자를 구성하고, 둘째, 이렇게 하여 구성한 하이브리드 유전자를 발현시키기 위한 발현 벡터를 제조하며, 셋째, 이 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 원핵생물 숙주를 고밀도 세포배양하고, 넷째, 발현된 융합 단백질의 회수 및 융합 단백질의 절단, 분리, 정제과정을 거친 후, 다섯재, 제조된 재조합 α-hANF의 생리학적 시험을 통한 분석을 수행하는 단계를 거쳐야 한다.

본 발명은 상기 단계에 따라, α-hANF를 생산하는 과정에서 형성되는 특정의 발현 벡터를 제공함도 하나의 목적으로 한다.

여기서, 발현 벡터는 파아지 fr 외피단백질 유전자와 α-hANF 단백질 유전자를 특정의 절단부 염기서열에 의해 연결시킨 하이브리드 유전자를 함유하도록 구성됨으로써, 박테리아에서 불안정하게 생산되는 α-hANF 단백질의 발현율을 향상시킬 수 있는 재조합 플라스미드 벡터를 의미한다.

또한 통상의 유전공학적 방법을 이용하여, 상기 설명된 재조합 플라스미드에 의해 형질전환됨으로써 원하는 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 형질전환된 세포주 및 이 세포주내에서 발현되고 그후 정제단계를 거쳐 수득하게 되는 융합 단백질을 제공하는 것도 본 발명의 대상이 된다.

본 발명의 커다란 특징중의 하나는 하이브리드 유전자를 제조함에 있어서, 원핵생물의 α-hANF 단백질 분해작용에 대한 방어 역할을 함으로써 α-hANF 단백질 발현의 안정화를 꾀하는 방어용 단백질로서 130개의 아미노산 서열을 코드하는 파아지 fr 외피단백질을 선택하고, 이 외피단백질 유전자의 해독 시작 부위(translation initiation region)를 발현시 이용하였다는 점이다.

본 발명에 대한 명세서 전체의 설명에서, α-hANF 단백질 발현의 안정화란 형질전환된 숙주세포에 의해 외래 α-hANF 단백질의 분해작용으로부터 α-hANF 단백질을 방어하는 융합 단백질의 성질을 말하며, 단백질 발현의 향상이란 형질전환된 세포주의 전체 세포 단백질중 융합 단백질이 10 내지 20%를 차지 할 수 있는 발현 수준을 말한다.

본 발명의 구성을 상세히 설명하면 다음과 같다.

파아지 fr 외피단백질의 유전자는 130개 아미노산으로 구성된 성숙 단백질을 코드하는 유전자 및 그 3'-말단의 비번역부분 끝에 하이브리드 유전자를 구성하는데 편리한 몇개의 유용한 제한효소 절단부 염기서열을 함유하며, 번역 프레임(reading frame)은 파아지 fr 외피단백질의 아미노 말단에서 시작하여 연결자를 거쳐 단백질의 카르복시 말단에서 끝난다.

도한, 발현이 완료되고 융합 단백질을 분리해낸 다음에는 이융합 단백질로부터 목적 α-hANF 단백질을 절단하여 회수할 수 있도록 , 일단 단백질로 제조된 후 효소적 또는 화학적으로 절단될 수 있는 부위를 fr 외피단백질에 상응하는 유전자 서열 하단에 삽입시킨다.

적당한 절단 서열로는 Met 잔기, Trp 잔기, Lys 잔기, Glu 잔기 후위부 및 Asn과 Lys 사이 등이 제한 없이 이용될 수 있다.

여러 차례의 유전자 재조합 과정을 통하여 상기와 같은 성질을 지닌 하이브리드 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 벡터(pFAN15)를 제조한다.

본 발명의 실시예에 따른 발현 벡터는 플라스미드 p18-542 및 플라스미드 pFRC8-1-33으로부터 구성되었으며, 플라스미드 본체, trp 프로모터-오퍼레이터, TIR, 파아지 fr 외피단백질 및 파아지 단백질 유전자, α-hANF 단백질 유전자와 절단부 염기서열을 포함한다.

이때, 복제 오리진(replication origin), 제한효소 절단부위, 선별 마커, 발현 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터들은 사용될 숙주에 적합한 종으로부터 도출될 수 있는데, 예를들면 E. coli는 엠피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자와 ori를 가지는 pBR 322의 유도체를 사용하여 형질전환시킬 수 있다.

즉, 본 발명의 실시예에 따른 벡터에서는 E. coli의 trp 프로모터/오퍼레이터가 사용되었지만, lac, tac, P_L등 다른 원핵생물의 프로모터/오퍼레이터계의 조절 서열로 trp 조절부를 대체할 수도 있다.

발현 벡터를 제조한 다음에는 통상의 방법에 따라 이 발현 벡터를 이용하여 적당한 숙주를 형질전환시킨다.

이때 원핵생물 숙주는 파아지 fr 외피단백질의 발현에 사용할 수 있을 뿐아니라, 또한 클로닝시 가장 편리하므로, 일반적으로 가장 흔한 원핵생물 숙주로서 E. coli의 다양한 균주(strain)들이 사용될 수 있으나, 다른 미생물 균주들도 사용이 가능하다.

따라서 본 발명에 따른 방법에서는 미생물 숙주, 그중에서도 박테리아 숙주, 바람직하게는 엔테로박테리아 숙주를 사용하며, 가장 바람직하게는 E. coli 숙주를 사용한다.

본 발명에 따라 클로닝, 유전자 서열 분석 및 원핵생물에서의 발현에 사용될 수 있는 균주로는 박테리아나 박테리오파아지의 프로모터에 의해 조절되는 구조를 갖는 JM83, RR1, HB101, K802, MM294, VL902 등의 E. coli 균주등이 바람직하다.

여러 차례의 배양을 거치면서 형질전환주내에서 융합 단백질이 발현되도록 유도하고, 칼럼 크로마토그래피를 통해 융합 단백질을 순수하게 분리한다.

이 융합 단백질은 여러 종류의 엔도프로테이나아제에 의해 절단될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 파아지 fr 외파단백질 및 α-hANF 단백질 사이에 함유할 수 있는데, 바람직하게는 본 발명에 따른 융합 단백질은 Lys-C 엔도프로테이나아제 절단 부위를 갖는 161개의 아미노산으로 구성되어 있다.

이 융합 단백질중 아미노 말단에 위치한 130개의 아미노산으로 이루어진 부분은 파아지 fr 외피단백질에 상응하는 부분이고 카르복시 말단의 28개 아미노산으로 이루어진 부분은 α-hANF 단백질에 상응하는 부분이며, 그 사이에 3개의 아미노산으로 구성된 절단부 서열이 존재한다.

여기서 Lys-C 엔도프로테이나아제 절단부에 상응하는 3개의 아미노산 서열은 이소루이신-아스파르트산-리신의 서열로 이루어져 있다.

즉, 융합 단백질 전체중에서 α-hANF 단백질에 상응하는 부분은 17%를 차지한다.

분리된 융합 단백질로부터 목적 α-hANF을 회수하기 위하여 융합 단백질내에 존재하는 절단부 서열에 적합한 엔도프로테이나아제를 이용하여 절단한 후, 여러 칼럼을 사용하는 기지의 정제 방법으로 목적 단백질을 정제한다.

최종적으로 정제된 단백질의 여러 가지 생리 활성을 측정한 결과, 본 발명에 따라 제조된 재조합 α-hANF가 표준 α-hANF와 동일한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

재조합 DNA 조작방법들은 특별한 언급이 없는 한 샘부룩(Sambrook)등(A Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold spring harbor laboratory press, 1989)의 방법을 사용하였고, 단백질에 관련된 방법들은 브라드포드(Bradford)등(Anal. Bioc hem. 72-248-254, 1976) 및 토우빈(Towbin)등(Proc. Acad. Sci. USA, 76. 2350-2354, 1979)의 방법을 사용하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다.

그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

발현 벡터 pFAN15의 제조

클로닝 벡터 p18-542는 플라스미드 pUC8(Vieira and Messing(1982), Gene 19, 259-268)에 단백질 절단부위 및 합성된 α-hANF 유전자를 삽입하여 구성하였다.

여기서 α-hANF 유전자의 DNA 절편은 E. coli이 선호하는 유전암호를 사용하여 두 가닥의 62-머 길이의 단일가닥 DNA를 합쳐서 만들었으며, DNA 폴리머라아제 I 플레노우 단편을 사용하여 이중가닥 DNA로 만든 후 플라스미드 pUC8의 Sma I 부위에 클로닝하였다.

이렇게 해서 제조된 플라스미드 p18-542에 삽입되어 있는 107bp 길이의 α-hANF 염기 서열은 콜로니 혼성화 방법(colony hybridization), 제한 효소를 이용한 분석, 그리고 DNA 서열 결정 방법을 사용하여 확인하였다.

또한 필요량의 α-hANF 유전자를 얻기 위하여 p18-542 플라스미드 DNA를 Cla I 으로 절단한 후 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통해 정제하였다.

또한 플라스미드 벡터 pFRC8-1-33은 플라스미드 pFRC9(Kozlovskaya 등, 1986, Proc. Acad. Sco., USSR, 287, 452-455(in Russia))에 들어있는 파아지 fr 외피단백질 유전자의 3'-말단에 두개의 Cla I 부위를 갖는 합성 DNA 절편을 삽입시켜 만들었다.

결과적으로 플라스미드 pFRC8-1-33은 E. coli trp 프로모터로 인하여 효과적으로 전사되는 파아지 fr 외피단백질 유전자(Berzin et al., 1987, Nucleic Acids Research, 15, 6741) 및 여러개의 Cla I 부위를 갖게 된다.

본 발명에 따른 α-hANF 단백질 생산시의 발현 벡터 pFAN15는 위에서 플라스미드 p18-542로부터 정제한 α-hANF DNA 절편을 pFRC8-1-33에 삽입시켜 만들었다.

따라서, pFAN15는 파아지 fr 외피단백질 유전자와 α-hANF 단백질 유전자가 결합된 하이브리드 유전자를 함유한다(제1도).

[실시예 2]

융합 단백질의 발현

발현 플라스미드 벡터 pFAN15는 형질전환된 E. coli 세포주내에서 E. coli의 프로모터/오퍼레이터 조절하에 파아지 fr 외피단백질 및 α-hANF의 융합 단백질을 발현시키는데 이용할 수 있다.

먼저 발현 벡터 pFAN15을 이용하여 통상의 방법에 따라 E. coli RR1를 형질전환시킨 후, 엠피실린(ampicillin) 내성을 갖는 한 개의 콜로니를 선별하여 LB 배지(5ml, 40 ㎍/ml ampicillin), 37℃에서 밤새 배양한다. 카사미노산(casamino acid) 10mg/ml, 글루코오스 2mg/ml, 엠피실린 100㎍/ml를 포함하는 M9 최소 배지로 100배 희석시킨후 37℃에서 혼탕 배양하여, 540nm에서의 흡광도(OD₅₄₀)가 0.6에 도달하면 3-β-인돌아크릴산을 40㎍/ml 농도가 되게 가하고, 37℃에서 6시간 더 배양한 후 세포를 원심분리법으로 수거한다.

OD₅₄₀이 1.0 되도록 세포를 현탁시키고 라믈리 완충액(Laemmli buffer)을 가하여 5분 동안 끓인 후, 폴리아크릴아미드 농도 구배(12 내지 23%)-SDS 전기 영동으로 원하는 융합 단백질이 발현되었는지의 여부를 분석한다.

발현된 fr 외피단백질 및 α-hANF의 융합 단백질은 표준(Standard)으로 사용한 파아지 fr 외피단백질(14,400 D)보다 더디게 내려간다.

조우스-뢰블 크로모스칸(Jouce-Loebl chromoscan)을 사용하여 겔을 분석한 결과, 총 세포 단백질의 15 내지 20%가 융합 단백질임을 알 수 있었다.

이 융합 단백질을 니트로셀룰로오스로 옮긴 후 토끼의 항 파아지 fr 외피단백질 혈청과 말의 레디쉬 과산화효소(horse redish peroxidase)가 접합된 단백질 A로 처리함으로써 이 융합 단백질이 파아지 fr 외피단백질을 함유함을 확인할 수 있었다.

[실시예 3]

발현 벡터에 의해 형질전환된 E. coli의 배양

발현 벡터 pFAN15에 의해 형질전환된 E. coli K802(한국종균협회에 1994년 1월 18일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁 완료함; 기탁 번호는 KCCM-10046)를 복합배지(Sciloach and Bauer, Biotechnol. Bioeng. 17, 227-239, 1975) 1L가 들어있는 바이오리엑터(bioreactor)에 넣고 37℃에서 밤새 배양한다.

주기적으로 영양소를 공급하고 용존 산소량을 25 내지 30% 포화되게 조건을 맞추어 주면 1L당 40g의 건조 무게 세포를 수득할 수 있다.

이와 같은 고밀도의 세포 배양은 최종 목적물인 α-hANF 단백질을 대량으로 희수하는데 유용하다.

[실시예 4]

파아지 fr 외피단백질 및 α-hANF의 융합 단백질의 정제

형질전환된 E. coli K802/pFAN15 10g을 60mM 트리스-아세테이트(pH 8.0) 완충액 100ml에 현탁시키고 고체 우레아 60.7g을 가한 후, 0℃에서 세포 분쇄기로 세포를 파쇄시킨다.

15,000g에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 셀룰로오스 MN 300층을 통과시키고, 다시 350ml DE 32 SH 셀룰로오스를 통과시킨다.

흡착 되지 않은 분획을 pH 5.0이 되도록 초산으로 조정한 후 60mM 트리스-아세테이트, pH 5.0(7M 우레아)으로 평형화된 CM 32 셀룰로오스 칼럼(2.5×14cm)을 통과시킨다.

동일한 완충용액으로 세척한 후, pH 5.0의 조건에서 암모늄아세테이트 농도구배(60 내지 100mM)로 용출시킨다.

80mM 농도근방의 분획을 모아서 1mM 아세트산, pH 3.2에서 투석시킨다.

최정 정제를 위하여, 60mM 트리스-아세테이트(pH 9.0, 7M 우레아)로 평형화시킨 QAE 세파덱스 A25 칼럼, 또는 20mM 암모늄아세테이트(pH 5.3 7M)로 평형화시킨 CM 32 셀룰로오스 칼럼에 융합 단백질을 통과시킨다.

융합 단백질은 암모늄아세테이트 농도 구배(20 내지 60mM)를 사용하여 용출시킨다.

융합 단백질을 함유하는 분획을 모아서 1mM 아세트산, pH 3.2의 조건에서 밤새 투석시킨 후 트리스-염기를 첨가하여 pH 9.0으로 조정함으로써 선별적으로 침전시킨다.

10,000g에서 30분간 원심분리하여 모은 침전을 66% 아세트산에 용해시킨 후 다시 1mM 아세트산, pH 3.2 용액에 용해시켜 4℃에서 보관한다.

모든 정제과정은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인한다(12 내지 23%의 농도구배).

[실시예 5]

Lyc-C 엔도프로테이나아제를 사용하여 융합 단백질로부터 파아지 fr 외피단백질을 제거함에 의한 α-hANF 단백질의 분리

pH 3.2의 1mM 아세트산에 용해되어 있는 융합 단백질 1.2ml(1mg/ml)에 0.48ml의 아세토니트릴과 0.45ml의 물을 가하고, 5㎍(in 30㎕ water)의 Lys-C 엔도프로테이나아제를 가한 후 20℃에서 10분간 방치시킨다.

이 샘플을 250mM Tris-HCl(pH 8.5, 10mM EDTA) 0.24ml로 희석시킨 후 다시 20℃에서 120분간 방치시킨다.

최종농도가 0.2%로 되도록 TFA를 가함으로써 반응을 정지시킨다.

반응이 정지된 용액을 10mM 소듐아세테이트 완충액(pH 5.0, 20% 아세토니트릴)으로 평형화시킨 Sp-세파덱스 C-50 칼럼에 통과시킨다.

동일한 완충용액 2ml로 세척한 후, pH 5.0, 10mM 소듐아세테이트 2.8ml, pH 8.0, 10mM 소듐포스페이트 3ml로 차례로 세척한다.

10mM 소듐포스페이트(pH 8.0, 500mM NaCl) 2ml로 용출시킴으로써 α-hANF 단백질(0.28mg)을 수득한다.

[실시예 6]

HPLC에 의한 α-hANF 단백질의 정제

SP-세파덱스 칼럼을 통과한 277㎍의 부분 정제된 α-hANF 단백질용액에 0.1볼륨의 10% TFA를 가한다.

HPLC에 의하여 이 단백질용액으로부터 α-hANF 단백질을 순수하게 정제하기 위한 HPLC 사용조건은 하기에 열거하는 바와 같다 : 칼럼; LKB 울트 라팩(Ultrapack) TSK ODS-120T 세미 프레파라티브(Semi preparative)(7.8×300mm), 유속; 1ml/분, 용출용매; 0 내지 60%의 아세토니트릴(0.1% TFA) 농도구배, 모니터 흡광파장; 220nm, 이와 같은 조건에서 정제된 α-hANF 단백질 피크는 베링거 만하임(Boeringer Mannheim)으로부터 구입한 표준 α-hANF과 일치하였으므로 26.4분의 보유시간에서 용출된 분획을 모은 후 냉동 건조시켰다.

제조된 α-hANF 단백질을 분석하기 위한 또 다른 방법으로 사용된 TLC 조건은 다음과 같다.

단백질 1 내지 10㎍을 키셀 겔(kiesel gel) 60F 254, 20×105cm 플레이트(Merck)에 적하시킨 후, 20℃의 n:부탄올:피리딘:아세트산:물(20:10:3:1) 시스템에서 전개시켰다.

전개시킨 결과, 본 발명에 따라 제조된 후 정제된 α-hANF 단백질과 표준 α-hANF 단백질의 Rf 값은 0.25였다.

[실시예 7]

생리활성의 측정

시험관내에서 α-hANF의 혈관 확장, 혈압 강하 능력을 측정하였다.

토끼(2.5-3.3kg)의 경동맥으로부터 얻은 대동맥 스트립(Aortic strips)을 크렙스(Krebs) 용액이 담긴 10ml 챔버에 넣고 37℃에서 95% O₂/5% CO₂로 통기시킨다.

스트립을 노어에피네프린(norepinephrine)(1×10^-6M)으로 수축시킨 후 0.5g의 하중을 걸고, 수축작용이 안정화되면 α-hANF를 가한다.

용량 응답곡선(Dose respose curve)을 그린 후, 이 곡선으로부터 IC₅₀값을 계산한다(참고 : J. M. Van Roussum, Arch. Int, Pharm acodyn., V. 143, 299-330, 1963). 제8도 및 9도로부터 알 수 있는 바와 같이 α-hANF는 괄목할만한 혈관확장, 혈압강하 작용을 보여준다.

더구나 제9도로부터는 120nmol/kg의 용량으로 α-hANF를 쥐에 투여할 경우 동맥압이 30분동안 10 내지 20mmHg 정도 점차적으로 강하되는 것을 할 수 있었다.

이뇨 효과는 알비노 쥐(al bino rat; 200 내지 205g)에서의 사구체 여과율(glomerular filtration rate)을 결정함으로써 측정하여(Shik, O., The functional studies of kidneys, Praha, Avicennum, 1981, 544p(in Russian)), 그 결과를 표준품인 푸로세미드(furosemide)를 투여했을 경우와 비교함으로써 확인하였으며, 나트륨 뇨 배출제로서의 활성(Natriuretic activity)은 쥐에서 나트륨과 칼륨의 배출속도를 측정함으로써 결정하였다(제10도).

Claims (16)

1. 파아지 fr 외피단백질 및 α-hANF로 구성된 융합 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 하이브리드 유전자를 삽입시킨 발현 벡터를 사용하여 E. coli를 형질전환시킨 후, 형질전환된 E. coli를 고밀도 배양하고, 발현된 융합 단백질을 분리, 정제하여 파아지 fr 외피단백질을 제거함으로써 α-hANF를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 파아지 fr 외피단백질 유전자가 130개의 아미노산을 코드하는 유전자로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 하이브리드 유전자가 파아지 fr 외피단백질 유전자와 α-hANF 유전자 사이에 특정의 화학적 혹은 효소적 절단부위를 암호화하는 염기서열을 함유함을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 효소적 절단부위가 폴리펩타이드로 발현된 후 Lyc-C 엔도프로테이나아제에 의해 절단되는 서열임을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, Lys-C 엔도프로테이나아제 의해 인지되는 선택적 절단 부위가 이소루이신-아스파르트산-리신의 아미노산서열로 구성된 부위임을 특징으로 하는 방법.
6. 파아지 fr 외피단백질 유전자 및 α-hANF 유전자가 연결된 하이브리드 유전자가 삽입되어 있음을 특징으로 하여, 미생물내에서 α-hANF을 고수율로 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터.
7. 제6항에 있어서, 파아지 fr 외피단백질의 TIR(translation initiation region) 및 유도가능한 박테리아나 박테리아파아지의 프로모터에 의해 조절됨을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
8. 제6항에 있어서, 파아지 fr 외피단백질 유전자가 130개의 아미노산을 코드하는 유전자로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
9. 제6항에 있어서, 하이브리드 유전자가 파아지 fr 외피단백질의 유전자와 α-hANF 유전자 사이에 화학적 또는 효소적 절단부위를 암호화하는 DNA 서열을 함유함을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
10. 제9항에 있어서, 효소적 절단부위가 폴리펩타이드로 발현된 후 Lys-C 엔도프로테이나아제에 의해 절단됨을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
11. 제10항에 있어서, Lys-C 엔도프로테이나아제에 의해 인지되는 선택적 절단 부위가 이소루이신-아스파르트산-리신의 서열로 구성된 부위임을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
12. 제6항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 E. coli.
13. 파아지 fr 외피단백질 및 α-hANF 단백질로 구성되며, 엔도프로테이나아제에 의해 절단가능한 서열을 함유함을 특징으로 하는 융합 단백질.
14. 제13항에 있어서, 파아지 fr 외피단백질이 130개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
15. 제13항에 있어서, Lys-C 엔도프로테이나아제에 의해 절단되어지는 부위를 함유함을 특징으로 하는 융합 단백질.
16. 제15항에 있어서, Lys-C 엔도프로테이나아제에 의해 인지되는 선택적 절단부위가 이소루이신-아스파르트산-리신의 서열로 구성된 부위임을 특징으로 하는 융합 단백질.