FI93125C - Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa - Google Patents
Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa Download PDFInfo
- Publication number
- FI93125C FI93125C FI861217A FI861217A FI93125C FI 93125 C FI93125 C FI 93125C FI 861217 A FI861217 A FI 861217A FI 861217 A FI861217 A FI 861217A FI 93125 C FI93125 C FI 93125C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- grf
- trpe
- trp
- amino acid
- hybrid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 7
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 title description 23
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 title description 2
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 8
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000900690 Homo sapiens GRB2-related adapter protein 2 Proteins 0.000 claims description 8
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- -1 Tyr amino acid Chemical group 0.000 claims description 4
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 101100046504 Symbiobacterium thermophilum (strain T / IAM 14863) tnaA2 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N ortho-iodosylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I=O IFPHDUVGLXEIOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000009578 growth hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
93125
Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa Expression i E. coli av hybridpolypeptider som innehäller sekvensen för tiliväxthormon frigörande faktorn Äskettäin on eristetty akromegaalisen potilaan haimakasvaimes-ta ryhmä aineita, joita kutsutaan kasvuhormonia vapauttaviksi tekijöiksi (Growth hormone releasing factors, GRF). Guillemin et al, Science 218, 585, 1982; Esch et ai, J. Biol. Chem. 258, 1806, 1983.
Useita GRF-muotoja on puhdistettu ja niiden aminohappojärjestykset on määritetty. GRF-44 sisältää koko GRF-40: n aminohappojärjestyksen ja se jatkuu karboksyylipäästä neljällä aminohapolla.
GRF-40 puolestaan sisältää koko GRF-37: n aminohappojärjestyksen ja se jatkuu karboksyylipäästä kolmella aminohapolla. Myös GRF-29 peptidin on osoitettu olevan biologisesti aktiivinen (J. Riveir et ai, Nature 300, 276-8, 1982).
Vain GRF-44: n karboksyylipää (Leu) on amidoitu (GRF-NH2-44). Uskotaan, että GRF-NH2-44 on kypsä hormoni ja että GRF-40, 37 ja 29 ovat sen proteolyyttisiä johdannaisia, vaikkakin kaikki em. GRF: t ovat biologisesti aktiivisia.
On raportoitu, että GRF: t vaikuttavat sekä kasvuhormonin synteesiin että sen vapautumiseen aivolisäkkeestä. (Brazeau et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. , 79, 7909, 1982; Baringa et ai,
Nature, 306, 84, 1983. )
On esitetty, että hypothalamuksesta (alanäkökukkulasta) eristetty GRF-44 peptidi (hhGRF) olisi identtinen haimakasvaimesta saadun (hpGRF) kanssa, ja itse asiassa immunoreaktiivisuutta hhGRF: n ja hpGRF: a vastaan synnytettyjen vasta-aineiden välil- 2 93125 lä havaittiinkin. Lisäksi molempien peptidien profiilit HPLCsllä analysoituina olivat samat (Bohlen et ai, Biochem. Biophys. Res. Commun., 144, 930, 1983). Aivan äskettäin osoitettiin, että hpGRF:llä ja hhGRF:llä on sama aminohappojärjestys (Ling et ai, Proc. Natl. Acad. Sei., 81, 4302, 1984).
hpGRF:a tuottavasta haimakasvaimesta eristetyn lähetti-RNA;n komplementaarisen DNA:n synteesi ja karakterisointi on osoittanut, että GRF-44 tuotetaan pre-prohormonina, jossa on 107-108 aminohappoa ja että GRF ulottuu aminohappo-tähteestä 32 aminohappo-tähteeseen 75 (Gublere et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. £0, 4311, 1983; Mayo et ai, Nature, 306, 86, 1983).
GRF-44 sekvenssiä seuraava Gly-Arg muistuttaa tyypillistä amidointikohtaa (Boel et ai, The EMBO J. 3, 909, 1984; Bradbury et ai, Nature, 298, 686, 1982).
GRF:eja voidaan käyttää terapeuttisesti hyväksi useimmilla aloilla, joilla nykyisin ehdotetaan kasvuhormonikäsittelyn käyttämistä. Esimerkkeinä tällaisista terapeuttisistä käyttötarkoituksista ovat aivolisäkeperäinen kääpiökasvuisuus, diabetes, johon liittyy epänormaali kasvuhormonin tuotto, haavojen ja vakavien palovammojen hoito.
GRF:n koko sen useissa muodoissa tekee sen valmistamisen tavanomaisin peptidisynteesin menetelmin mahdolliseksi. Useita GRF-johdannaisia onkin tuotettu näillä keinoin, ja niiden on havaittu olevan biologisesti aktiivisia (Murphy et ai, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 469, 1983; Thorner et ai, Lancet, January, 1/8, 24, 1983; Adams et ai, Lancet, May 14, .J-100, 1983; Rosenthal et ai, J. Clin. Endocr. Metab., 52, 677, ’1983). Lisäksi on mahdollista syntetisoida peptidejä, jotka sisältävät amidoidun karboksyylin pääteaminohapossa. GRF-44:n tuottaminen kemiallisesti on kuitenkin melko kallista ja peptidin tuottaminen yhdistelmä-DNA-tekniikoiden avulla vaikuttaa olevan tarkoituksenmukaisempaa.
93125 3
Eurooppalainen patenttijulkaisu EP 0108387 kuvaa synteettisten DNA-molekyylien valmistuksen, jotka molekyylit koodaavat useita GRF: n muotoja, joita edeltää metioniinikodoni, jotka siirrettyinä sopivaan ekspressiovektoriin ohjaavat metionyloidun GRF: n suoran synteesin sopivassa mikro-organismissa. Julkaisussa kuvataan menetelmä, joka käsittää kahden oliogodeoksi-ribonukleotidi-fragmenttisarjan valmistamisen, jotka sopivaan järjestykseen liitettyinä tuottavat kaksi kaksijuosteista DNA-molekyyliä, jotka koodaavat GRF-peptidin amino- ja karbok-syylipäi tä.
Nämä kaksi kaksijuosteista DNA-molekyyliä liitetään yhteen halutun GRF-rakennegeenin aikaansaamiseksi. Suositeltavat ekspressiovektorit ovat plasmidi pBR322: n johdannaisia, jotka sisältävät bakteriofaagi lambda DNA: sta eristetyn Pu-promoot-torin, joka on sijoitettu tetR- ja ampR-geenin väliin. Lisätyn metioniiniaminohapon läsnäolo GRF-molekyylin N-päässä saattaa tehdä mahdolliseksi epätoivottavat immunologiset reaktiot, erityisesti pitkäaikaishoidossa.
Tämä keksintö koskee GRF: n tuotantoa yhdistelmä-DNA-tekniikal-la saadun hybridipolypeptidin avulla sekä siihen käytettyä materi aalia.
Hybridipolypeptidi sisältää TrpE: n aminohapot 1. . . 323 liitettyinä järjestyksessä Trp-aminohappoon ja GRF: n aminohappo-jär-jestykseen. Amidoimaton GRF voidaan saada pelkistämällä ja karboksiamidometyloimalla, leikkaamalla Trp-tähde spesifisesti irti, sen jälkeen geelisuodattamalla ja puhdistamalla GRF HPLC: 11a.
Niinpä tämän keksinnön tarkoitus on tarjota menetelmä GRF: n valmistamiseksi hybridipolypeptidinä, jota koodaa plasmidi ja joka perustuu E. coli Trp promoottori/operaattorin käyttöön, jota seuraavat Trp-leader-alue ja attenuaattori, TrpE-geenin ribosomin sitoutumiskohta, ensimmäinen kaksi kolmannesta TrpE
4 >5 ι 25 polypeptidiä kohdaavasta DNA: sta, Trp-kodoni ja GRF-peptidiä koodaava geeni.
Tämän keksinnön toinen tarkoitus on esittää GRF: a koodaavan DNA-molekyylin synteesi, jota edeltää Trp: n TGG-kodoni ja nukleotidi j ärj estys, joka tekee mahdolliseksi tämän molekyylin liittämisen plasmidiin, jossa on TrpE rakennegeeni, samalla säilyttäen sen oikean lukuraamin.
Edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön menetelmä keksinnön mukaisen plasmidin sisältävän mikro-organismin kasvattamiseksi runsaan hybridi TrpE-GRF polypeptidin synteesin mahdollistamiseksi.
Lisäksi tämän keksinnön tarkoitus on tarjota menetelmä hybri-dipolypeptidin uuttamiseksi ja halutun GRF-peptidin eristämiseksi siitä eri vaiheiden kautta.
Nämä ja muut keksinnön kohteet tulevat asiantuntijoille ilmi seuraavista yksityiskohtaisista kuvauksista, joissa
Kuva 1 osoittaa GRF-44 koodaavan geenin nukleotidijärjestyk-sen. DNA-molekyyli syntetisoitiin kemiallisesti kiinteän faasin fosfotriesterimenetelmällä käyttäen dinukleotidejä raken-nusyksikköinä ja polystyreeniä kiinteänä kantajana. Bgl II,
Xbal, BstXI, Narl ja BamHI osoittavat näiden restriktioendo-nukleaasien tunnuskohtia. "Stop" merkitsee proteiinisynteesin 1 opetus kodoni a.
Kuva 2 on pSP2 plasmidivektorin restriktiokartta, jossa ohut viiva esittää pBR322 DNA: ta, paksu viiva esittää E. colin • kromosomaalista DNA:ta, jossa sijaitsee Trp promoottori/operaattori, Trp-leader-sekvenssi (TrpL), koko TrpE rakennegeeni ja osa TrpD rakennegeenistä (A TrpD), ApR ja TcR merkitsevät ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssin geenejä ja "Ori" on tämän plasmidin replikaation aloituskohta.
93125 5
Kuva 3 on juoksukaavio, joka esittää plasmidin pSP2del rakentamisen plasmidista pSP2, jossa Δε merkitsee epätäydellistä TrpE rakennegeeniä.
Kuva 4 on juoksukaavio, joka esittää plasmidin pSP19 rakentamisen plasmidista pSP2del.
Kuva 5 on kaavamainen esitys hybridi TrpE-GRF polypeptidin aminohappojärjestyksestä, jossa esitetään TrpE osan koko aminohappojärjestys ja GRF:n ensimmäiset viisi aminohappoa. GRF-44 :n koko sekvenssi on esitetty kuvassa 1.
Koska GRF-44 DNA-molekyylissä on useita restriktioentsyymien pilkkomiskohtia, on mahdollista muodostaa 3 muuta molekyyliä, jotka myös kuuluvat tämän keksinnön piiriin, so. molekyylit, jotka koodaavat GRF-40, GRF-37 ja GRF-29 peptidejä.
Niinpä DNA-molekyyli voidaan pilkkoa Narl restriktioentsyymil-lä ja 3'-pään fragmentti voidaan korvata seuraavalla oligonuk-leotidillä: 40
Ala Stop C GCC TAG GG ATCCTAG Narl BamHI
• GRF-40 koodaavan DNA-molekyylin muodostamiseksi.
GRF-37 koodaava DNA-molekyyli voidaan saada seuraavalla tavalla: a) Kuvan 1 DNA pilkotaan BstXI restriktioentsyymillä, joka saa *· aikaan seuraavanlaisen 3'-pään: 35 36
Asn Gin
---AAC CAG GAGC
---TTG GTC
6 93125 b) Yksijuosteinen pää poistetaan SI eksonukleaasilla.
c) Seuraava oligonukleotidi 37
Glu Stop
GAG TAG
CTC ATCCTAG
BamHI
lisätään 3'-päähän kodonin 37 regeneroimiseksi.
Pilkkomalla kuvan 1 mukainen DNA-molekyyli Xbal restriktio-entsyymillä ja korvaamalla 3'-pään fragmentti seuraavalla oiigonukleotidillä: 29
Arg Stop
CTAGA TAG
_T ATCCTAG
Xbal BamHI
saadaan GRF-29 koodaava DNA-molekyyli pSP19 plasmidi rakennettiin ja plasmidista saatava TrpE-GRF-44 •hybridipolypeptidi valmistettiin seuraavalla tavalla: 1) pSP2 plasmidin rakentaminen pSP2 plasmidi rakennettiin lähtien pBR322:sta (Bolivar et. ai., Gene, 2, 95...113, 1977) sekä AEDlOf:sta (Armstrong et 'ai., Science, 196, 172, 1977 ja Helinski et ai.: Recombinant Molecules, Tenth Miles International Symposium, Raven Press, 1977, siv. 151...165), jota käytettiin E. coli promoottorista TrpD rakennegeeniin ulottuvan Trp-operonin DNA:n lähteenä. pBR322 ja AEDlOf hajotettiin EcoRI ja Hindlll restriktioent-syymeillä. AEDlOf:n EcoRI-Hindlll fragmentti, joka sisälsi 7 931 25
Trp-operonin säätelyjärjestelmän, täydellisen TrpE rakenne-geenin ja TRpD rakennegeenin 5'-pään, liitettiin yhteen pBR322:n suuremman Hindlll-EcoRi fragmentin kanssa T4 DNA ligaasilla. Ligaatioseoksella transformoitiin E. coli W3110 ATrp E5/tna2 solut (Nichols ja Yanofsky, Methods in Enzymo-logy, 101, 155, 1983). Transformoidut solut maljattiin mini-maalimaljoille, joilta puuttui tryptofaani. Yhtä Trp+-kloonia käytettiin pSP2 yhdistelmä-DNA-plasmidin lähteenä. Tämän kloonin soluja kasvatettiin ja säilytettiin rikkaalla kasvatus-alustalla (esim. NB, Difco), johon oli lisätty ampisilliinia (Ap) 50 pg/ml. pSP2:n restriktiokartta esitetään kuvassa 2, missä paksulla viivalla kuvattu EcoRI-Hindlll fragmentti sisältää E. colin Trp-toiminnot ja on peräisin lambda EDl0f:sta, muun DNA:n ollessa peräisin pBR322:sta.
2) pSP2del plasmidin rakentaminen pSP2 plasmidin DNA hajotettiin Bgl II endonukleaasilla ja suurempi fragmentti puhdistettiin agaroosigeeli-elektroforeesilla . ja liitettiin yhteen itsensä kanssa T4 DNA ligaasilla. Ligaatioseoksella transformoitiin W3110 A TrpE5/tna 2 solut. ApR transformantit valikoitiin Nutrient Agarille (Difco), joka sisälsi 50 jug/ml Ap. Yhtä ApR kloonia käytettiin pSP2del DNA:n, jonka restriktiokartta esitetään kuvassa 3, lähteenä.
(Ks. kuvan 2 selostusta yksityiskohtien osalta.)
Bgl II fragmentin poistaminen TrpE rakennegeenistä aiheutti osittaisen TrpE polypeptidin, jonka entsymaattinen aktiivisuus on kadonnut, ilmentymisen. Tämän vuoksi pSP2del plasmidin sisältäviä W3110 A TrpE5/tna 2 soluja täytyy kasvattaa tryp-tofaanin läsnäollessa.
Bgl II kohtien liitoskohta pSP2del:ssa muodostaa uuden proteiinisynteesin lopetuskodonin. (Nichols et ai., J. Mol. Biol.
146, 45...54, 1981).
pSP2del:sta peräisin oleva osittainen TRpE ( A TrpE) sisältää 8 93125 siten 342 aminohappoa verrattuna pSP2 plasmidin koodaamaan kokonaisen proteiinin 520 aminohappoon (ks. jälleen kuva 3).
3) Trp-GRF-44 geenin kloonaaminen oSP2del DNA hajotettiin Bgl II ja BamHI restriktioentsyymeillä ja suurempi fragmentti puhdistettiin agaroosigeeli-elektrofo-reesilla. Tämä DNA sekoitettiin synteettisen Trp-GRF-44:ää koodaavan DNA-molekyylin (ks. kuva 1) kanssa ja käsiteltiin T4 DNA ligaasilla.
Kuva 4 osoittaa pSP19 plasmidin rakentamisen liittämällä synteettinen geeni pSP2del plasmidiin. Tc^ ilmaisee tetrasyklii-nisensitiivisyyttä
Ligaatioseos käytettiin W3110A. TrpE/tna2 solujen transformoi-miseen ja ApR kloonit valikoitiin maljoilla, jotka sisälsivät 50 ^ug/ml Ap. Yhtä tetrasykliinisensitiivistä (Tcs) ApR kloonia käytettiin pSPl9 DNA:n lähteenä.
Trp-GRF-44 geenin nukleotidijärjestys tekee mahdolliseksi syntetisoida osittaisen TrpE:n ja GRF-44:n välisen hybridi-polypeptidin, joita erottaa tryptofaanitähde. Trp voidaan hajottaa jodosobensoehapolla, kuten seuraavassa kuvataan. pSPl9 plasmidi DNA:n koodaaman hybridipolypeptidin aminohappo-järjestys osoitetaan kuvassa 5 ja sitä kutsutaan tavallisesti TrpE-GRF:ksi.
Ensimmäiset 323 aminohappoa edustavat TrpErn ensimmäistä kahta kolmannesta, joita seuraa Trp-tähde ja GRF-44:n aminohappo-järjestys. TrpE-GRF koostuu siis 368 aminohaposta.
TrpE-GRF-44 hybridiproteiinin tuottaminen ft3110 A TrpE5tna2 (pSPl9) kannan soluja kasvatettiin yli yön 300 ml:ssa SMM:ää (Spizizer Minimal medium), joka sisältää litraa vesiliuosta kohti: 93125 9 (NH4)2S04 2 g KH2PO4 6 g K2HPO4 14 g
Na. sitraatti.2H2O 1 g
MgSC>4 0,2 g
Autoklaavilla steriloinnin jälkeen lisättiin: 10 ml 40% glukoosia 3,5 /ag/ml indolia.
Viljelmä (noin 4,3 x 10^ solua/ml) laimennettiin 10 litraan samaa kasvatusliuosta ja soluja kasvatettiin ravistellen ja ilmastaen 1 litralla ilmaa 1 atm paineessa/minuutti.
Kasvualustan koostumuksen ja kasvuolosuhteiden 10 litran fer-mentorissa on osoitettu olevan ihanteelliset pSPl9 sisältämän Trp-promoottorin derepressoituna pitämiseksi (mikä sallii siten TrpE-GRF polypeptidin ilmentymisen) sekä solujen kasvattamiseksi.
22...25 tunnin kasvatuksen jälkeen kasvatus saavutti OD-arvon noin 3,0 aallonpituudella 590 nm. Solut kerättiin sentrifugoi-malla ja ne säilytettiin -80 0c:ssa. Näytettä näistä soluista käytettiin proteiinipitoisuuden määrittämiseen polyasyyliami-digeeli-elektroforeesin avulla. Tulos osoitti halutun TrpE-GRF -• polypeptidin läsnäolon.
TrpE-GRF polypeptidin puhdistaminen
Jäädytetyt solut sulatettiin seuraavassa puskurissa: 0,2 M
Tris-HCl pH 7,6; 0,2 M NaCl; 0,01 M CH3COOMg; 0,01 M β-mer-*.kaptoetanoli ja 5 % glyseroli. Solut jauhettiin rikki alumiinioksidin läsnäollessa ja solujäte poistettiin sentrifugoi-. maila.
Vesifaasi laimennettiin neljä kertaa H20:lla ja hybridipro-teiini sakkautettiin lisäämällä 144 g (NH4)2SC>4 litraa lopul- 93125 10 lista liuosta kohti. Sakkautetut proteiinit pelletoitiin sent-ri fugoimalla, liuotettiin veteen ja dialysoitiin voimakkaasti 10 mM NH4HCO3 vastaan.
Dialysaatti analysoitiin sitten PAGE: 11a ja lyofilisoitiin.
GRF-44: n eristys TrpE-GRF hybridipolypeptidistä GRF-peptidiosan eristämiseksi TrpE-GRF polypeptidi käsiteltiin jäljempänä kuvatuin kemiallisin reaktioin.
1) Cys-tähteiden pelkistys ja karboksiamidometylaatio
Pelkistys- ja karboksiamidometylaatio-olosuhteet otettiin julkaisusta G. Allen: Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology, Vol. 9, siv. 28, T. S. Work ja R. H. Bur-don, Elsevier, 1981). Aikaisemmin valmistettu ja lyofilisoitu TrpE-GRF polypeptidi liuotettiin seuraavaan puskuriin: Tris- HC1 0,5 M; EDTA 01 %, guanidiini-HC1 6M pH 8,5.
Lopullinen proteiinipitoisuus oli 2 %. Sitten lisättiin DTT:tä pitoisuudeksi, joka oli 15 kertaa korkeampi kuin proteiinin Cys-pitoisuus. Seosta inkuboitiin sitten 2 tuntia 50 ' C: ssa ja jodoasetamidia lisättiin kaksi kertaa DTT-pitoisuuden. Pimeässä huoneenlämpötilassa 30 minuutin inkubaation jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä beta-merkaptoetanolia.
Reaktioseosta dialysoitiin 2 tunnin ajan vettä vastaan ja yön yli 10 mM NH4HCO3 vastaan. Tämä materiaali, joka sisälsi kar-boksiamidometyloidun TrpE-GRF polypeptidin, lyofilisoitiin tämän jälkeen.
2) Jodosobentsoehapon reaktio Käytetty menetelmä on pääosin kuvattu julkaisussa A. Fontana et. ai.: Biochemistry, 20, 6997, 1981. 5 mg jodosobentsoehappoa . liuotettiin 375 μΐ: aan 4M guanidiini-HC1 80 % etikkahappoon.
93125 11 Tähän liuokseen lisättiin 7,5 (ui p-kresolia ja sitten siihen liuotettiin 5 mg karboksiamidometyloitua TrpE-GRF:ää. Reaktion annettiin edetä 20 tuntia pimeässä huoneenlämpötilassa. Sitten lisättiin 750 |ul vettä ja 10 minuutin kuluttua seos sentri-fugoitiin 5 minuuttia 12000 g:ssa. Vesifaasi sisältää peptidit, joiden joukossa on GRF-44.
3) GRF-44:n puhdistus
Edellä saadusta vesiliuoksesta poistettiin suolat geelisuodat-tamalla Sephadex G-25 1 x 50 cm pylvään läpi, joka oli tasapainotettu 5 % etikkahappoa vastaan. Virtausnopeus oli noin 3 ml/tunti. Läpivirrannut liuos kerättiin ja sen tilavuutta pienennettiin haihduttamalla. Näin saatu konsentroitu liuos analysoitiin HPLC:llä käyttäen C18 pylvästä, joka oli tasapainotettu 10 mM H3PC>4:llä, jonka pH oli säädetty 3,5:een ΕίβΝ:llä.
Peptidit eluoitiin asetonitriilillä ja kerättiin fraktioissa, . jotka analysoitiin myöhemmin RIArlla.
Tulokset osoittivat immunoreaktiivisuutta pääasiallisessa piikissä.
4i TrpE-GRF40, TrpE-GRF37 ja TrpE-GRF29 hybridipolypeptidit ja vastaavat GRF40, GRF37 ja GRF29 peptidit voidaan saada edellä kuvattujen TrpE-GRF44 ja GRF44 tuoton kanssa analogisin menetelmin.
W3110Δ TrpE5tna2 solut, jotka sisältävät tässä kuvatut plas-.midit, on talletettu ATCC:hen ja niiden talletusnumerot ovat: 'W 3110 A TrpE5 tna2 (pSP2) ATCC n. 53056 W 3110 A TrpE5 tna2 (pSP2-del) ATCC n. 53058 W 3110 A TrpE5 tna2 (pSP19) ATCC n. 53054
Claims (14)
1. Hybridi geeni, tunnettu siitä, että se käsittää DNA-sekvenssin, joka koodaa TrpE: lie homologista aminohappo-järjestystä fuusioituna lukuraamissa rakennegeeniin, joka koodaa Trp-GRF: a, jonka ensimmäistä N-päätteistä tyrosiini-kodonia edeltää välittömästi Trp: n kodoni.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridigeeni, tunnet-t u siitä, että TrpE: lie homologinen aminohappojärjestys käsittää TrpE: n aminohapot 1. . . 323.
3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1. . . 2 mukainen hybridigeeni, tunnettu siitä, että GRF on GRF-44, GRF-40, GRF-37 tai GRF-29.
4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1. . . 3 mukainen hybridigeeni, tunnettu siitä, että se on toiminnallisesti liitetty DNA sekvenssiin, joka kykenee aikaansaamaan mainitun rakennegeenin ilmentymiseen mikrobissa.
5. Replikoituva mikrobiaalinen ekspressiovektori, tunnet-t u siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4 mukaisen hybridi geeni n.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen replikoituva mikrobiaalinen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että vektori on pl as mi di.
7. Bakteeri-isäntä, tunnettu siitä, että se on trans-: formoitu patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukaisella ekspressio- vektorilla.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen bakteeri-isäntä, tunnettu siitä, että se on E. coli-kanta.
9. Menetelmä hybridipolypeptidin valmistamiseksi, joka hyb- 93125 ridipolypeptidi käsittää Trp-GRF: n, jossa ensimmäistä N-päät-teistä Tyr-aminohappoa edeltää välittömästi Trp-aminohappo, . tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaista bakteeri-isäntää kasvatetaan sopivassa ravintoliuoksessa.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressiovektori sisältää jonkin patenttivaatimuksen 2. . . 4 mukaisen hybridigeenin ja että mikro-organismia kasvatetaan sellaisen indolipitoisuuden läsnäollessa, joka riittää solujen kasvuun sekä Trp-operonin derepressoituna pitämiseen.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että solut kasvatetaan ilmastuksessa, joka riittää osittain inaktivoimaan indolin.
12. Hybridipolypeptidi, joka sisältää TrpE-GRF: n, tunnettu siitä, että ensimmäistä N-terminaalista Tyr-amino- ·. happoa edeltää välittömästi Trp-aminohappo ja Trp-GRF-j ärj es-tystä edeltää välittömästi TrpE: lie homologinen aminohappo-j ärj estys.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen hybridipolypeptidi, tunnettu siitä, että TrpE:lie homologisena aminohappo-järjestyksenä on TrpE: n 1...323.
14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen hybridipolypeptidi, tunnettu siitä, että GRF on GRF-44, GRF-40, GRF-37 tai GRF-29. 93125
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8547856A IT1234977B (it) | 1985-03-22 | 1985-03-22 | Espressione in e. coli polipeptidi ibridi contenenti la sequenza del fattore di rilascio dell'ormone della crescita |
| IT4785685 | 1985-03-22 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI861217A0 FI861217A0 (fi) | 1986-03-21 |
| FI861217A FI861217A (fi) | 1986-09-23 |
| FI93125B FI93125B (fi) | 1994-11-15 |
| FI93125C true FI93125C (fi) | 1995-02-27 |
Family
ID=11262958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI861217A FI93125C (fi) | 1985-03-22 | 1986-03-21 | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0199018B1 (fi) |
| JP (3) | JPH0779701B2 (fi) |
| AR (1) | AR242056A1 (fi) |
| AT (1) | ATE84548T1 (fi) |
| AU (1) | AU600891B2 (fi) |
| DE (1) | DE3687470T2 (fi) |
| DK (1) | DK122486A (fi) |
| ES (1) | ES8800722A1 (fi) |
| FI (1) | FI93125C (fi) |
| IL (1) | IL78044A (fi) |
| IT (1) | IT1234977B (fi) |
| NO (1) | NO175318C (fi) |
| ZA (1) | ZA861644B (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1200162B (it) * | 1985-12-18 | 1989-01-05 | Serono Ist Farm | Protezione della metionina in una catena polipeptidica dalla ossidazione irreversibile |
| US4828988A (en) * | 1986-05-15 | 1989-05-09 | Smith Kline - Rit | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine |
| US5565606A (en) * | 1986-10-21 | 1996-10-15 | Hoechst Aktiengesellschaft | Synthesis of peptide aminoalkylamides and peptide hydrazides by the solid-phase method |
| CA2040649A1 (en) | 1990-04-24 | 1991-10-25 | Gerald S. Brooke | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5512459A (en) * | 1993-07-20 | 1996-04-30 | Bionebraska, Inc. | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides |
| DE4435960C2 (de) * | 1994-10-07 | 1998-05-20 | Goodwell Int Ltd | Snowboardbindung |
| BR0001606A (pt) * | 1999-04-12 | 2001-04-24 | Pfizer Prod Inc | Composições de hormÈnio de crescimento e de hormÈnio de liberação de hormÈnio de crescimento |
| US6759393B1 (en) | 1999-04-12 | 2004-07-06 | Pfizer Inc. | Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions |
| EP1205551A1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-05-15 | Pfizer Products Inc. | Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| EP0068719A3 (en) * | 1981-06-16 | 1984-03-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Deoxyribonucleic acids, their production and use |
| JPS58201796A (ja) * | 1982-05-19 | 1983-11-24 | Takeda Chem Ind Ltd | 組換えｄｎａおよびその用途 |
| US4499188A (en) * | 1982-05-05 | 1985-02-12 | Cetus Corporation | Bacterial production of heterologous polypeptides under the control of a repressible promoter-operator |
| DE3381567D1 (de) * | 1982-11-04 | 1990-06-21 | Hoffmann La Roche | Hestellung von rekombinanten wachstumsausloesenden faktoren. |
| JPS59154989A (ja) * | 1983-02-23 | 1984-09-04 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | プラスミド |
| JPS59227899A (ja) * | 1983-05-25 | 1984-12-21 | チロン・コ−ポレイシヨン | 成長ホルモン放出因子の製造方法 |
| DE3327007A1 (de) * | 1983-07-27 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus |
| IT1198443B (it) * | 1984-03-30 | 1988-12-21 | Serono Ist Farm | Espressione genetica di polipeptidi ibridi contenenti la sequenza della somatostatina |
| FR2587359B1 (fr) * | 1985-05-28 | 1987-12-24 | Sanofi Sa | Derives non amides de la somatocrinine et procede de preparation par genie genetique |
-
1985
- 1985-03-22 IT IT8547856A patent/IT1234977B/it active
-
1986
- 1986-02-25 DE DE8686102447T patent/DE3687470T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-25 EP EP86102447A patent/EP0199018B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-25 AT AT86102447T patent/ATE84548T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-03-05 ZA ZA861644A patent/ZA861644B/xx unknown
- 1986-03-05 IL IL78044A patent/IL78044A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-03-17 DK DK122486A patent/DK122486A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-03-18 AU AU54843/86A patent/AU600891B2/en not_active Ceased
- 1986-03-18 JP JP61058448A patent/JPH0779701B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-19 AR AR86303426A patent/AR242056A1/es active
- 1986-03-21 FI FI861217A patent/FI93125C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-03-21 ES ES553274A patent/ES8800722A1/es not_active Expired
- 1986-03-21 NO NO861142A patent/NO175318C/no unknown
-
1994
- 1994-02-28 JP JP6029632A patent/JPH0816120B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-09 JP JP7143597A patent/JP2537029B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07316197A (ja) | 1995-12-05 |
| DE3687470D1 (de) | 1993-02-25 |
| JPH0710900A (ja) | 1995-01-13 |
| EP0199018A3 (en) | 1987-07-22 |
| DK122486D0 (da) | 1986-03-17 |
| IL78044A (en) | 1991-07-18 |
| JPS61274686A (ja) | 1986-12-04 |
| EP0199018B1 (en) | 1993-01-13 |
| JPH0816120B2 (ja) | 1996-02-21 |
| FI93125B (fi) | 1994-11-15 |
| AR242056A1 (es) | 1993-02-26 |
| ZA861644B (en) | 1986-10-29 |
| JP2537029B2 (ja) | 1996-09-25 |
| NO175318C (no) | 1994-09-28 |
| AU5484386A (en) | 1986-09-25 |
| DK122486A (da) | 1986-09-23 |
| ES553274A0 (es) | 1987-12-01 |
| FI861217A (fi) | 1986-09-23 |
| IL78044A0 (en) | 1986-07-31 |
| NO175318B (no) | 1994-06-20 |
| NO861142L (no) | 1986-09-23 |
| ES8800722A1 (es) | 1987-12-01 |
| ATE84548T1 (de) | 1993-01-15 |
| AU600891B2 (en) | 1990-08-30 |
| FI861217A0 (fi) | 1986-03-21 |
| IT8547856A0 (it) | 1985-03-22 |
| DE3687470T2 (de) | 1993-05-19 |
| JPH0779701B2 (ja) | 1995-08-30 |
| IT1234977B (it) | 1992-06-09 |
| EP0199018A2 (en) | 1986-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU648670B2 (en) | A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| CA1338642C (en) | Bacterial methionine n-terminal peptidase | |
| IE881597L (en) | Expression of Human Proapolipoprotein A-I | |
| KR100566136B1 (ko) | 효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 b의 생산 | |
| JPH0657154B2 (ja) | 所望のポリペプチドを発現させるためのクローニングビーイクル | |
| EP0281418B1 (en) | Process for production of physiologically active peptide containing cysteine residue | |
| AU6587594A (en) | Expression of heterologous polypeptides in halobacteria | |
| FI93125C (fi) | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa | |
| IE904294A1 (en) | Novel process for the production of unfused protein in E. coli | |
| US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
| CA1339464C (en) | ¬leu13| motilin, dnas coding for same and methods for producing same | |
| US4894362A (en) | Eel growth hormone | |
| US5268278A (en) | Genetic expression of somatostatin as hybrid polypeptide | |
| US5420113A (en) | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| CA1301676C (en) | Genetic expression of somatostatin as hybrid polypeptide | |
| US4851512A (en) | Novel human interleukin-2 polypeptide derivative | |
| KR970009082B1 (ko) | 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법 | |
| Honda et al. | DNAs coding for LCU 13! motilin | |
| JPS62259595A (ja) | 生理活性ペプチドの製造方法 | |
| Honda et al. | Method for producing Leu 13! motilin | |
| JPH0695938B2 (ja) | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド | |
| JPS61257999A (ja) | 魚類のプロラクチンポリペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: ISTITUTO DI RICERCA CESARE SERONO SPA |