JPS58201796A - 組換えｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なりＮＡおよびその用途に関する。さら
に詳しくは、本発明は、ａａｗｍＢ型肝炎　　、ウィル
スの表面抗原構造遺伝子を発現する新規な組換えＤＮＡ
　、当該ＤＮＡを含有する組換え体、ならびに当該組換
え体の培養によるａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィつス表面抗原の
製造法を提供するものである。

、Ｂ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極
東において多発するウィルス性疾患で１、慢性肝炎や肝
硬変、さらには原発性肝ガンの原因にもなることが疫学
的に示唆されている。病因は、ＤＮＡウイルヌの１種で
あるＢ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉ
ｒｕｓ　＋以下、ＨＢＶと略称する）で、それは直径４
２ｎｍの球状粒子で発見者の名を冠してデン（Ｄａｎｅ
　）粒子と呼ばれる。その外層には、ＨＢＶ表面抗原（
以下、ＨＢｓＡｇと略称する）があシ、その抗原性の違
いによってａｄｒ。

ａｄｗ、　ａｙｒ、　ａｙｗなどのサブタイプに分けら
れているが、日本で見いだされるのはａｄｗ型およびａ
ｄｒ型である。

Ｂ型肝炎患者の血中には、デン粒子のほかに小型粒子や
管状粒子が検出され、これらの粒子には３− デン粒子と同じ型のＨＢａＡｇが認められている。

ウイ／Ｌ’ヌの表在性抗原に対する抗体がそのウィルス
の感染を防御することは他のウィルスでも知られており
、ＨＢＶの場合にもＨＢｓＡｇをもとにＢ型肝炎に対す
るワクチンの製造が考えられる。ところが、ＨＢＶはヒ
トやチンパンジーなどにしか感染せず、培養細胞への感
染の試みは成功していない。そのためＨｌｊｓＡｇはヒ
ト感染者血中からの入手に限定されており、得られた小
型粒子などは診断用試薬の材料としての需要を満九すだ
けで、ワクチン製造にまわすことは不可能の状態である
。

分子生物学の最近の進歩によシ非細菌性の蛋白質をコー
ドするＤＭＡを細菌に導入し、形質転換させることが可
能になってきた。この遺伝子組換えの技術を応用し、Ｈ
ＢｓＡｇ構造遺伝子（以下、ＨＢａＡｇ遺伝子と略称す
る）を細菌内で発現させることができれば、ＨＢＶ感染
の危険性のないＦＩＢａＡｇを大量に調製することが可
能になシ、Ｂ型肝炎ワクチンの実用化への道が開かれる
。

現在知られている４種のサブタイプ、ａｄｗ。

４− ａｄｒ　、　ａｙｗ　、　ａｙｒ　　のうち、欧米に多
いａｙｗ型についてはＨＢｓムｇ遺伝子の存在部位およ
びその塩基配列が決定され（Ｇａ１ｉｂｅｒｔ、！”、
ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８１゜６４６　（１９７９）
　ＩＣｈａｒｎａｙ、Ｐ、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃムｏｉ
ｄＲａａ、、　７．３３５　（１９７９））　、雑種蛋
白質として大腸菌内での発現が報告されている（　Ｃｈ
ａｒｎａｙ、Ｐ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ　＊　２８６　＋　８９３　（１９８０）
　；　Ｉｉ！ｄｍａｎ　ｌ　Ｊ、αら。

Ｎａｔｕｒｅ、　２９１　、５０３　（１９８１））。

しかし、日本で多く見いだされているａｄｗ型について
は、ＨＢａＡｇ遺伝子のＤｌｉＡ塩基配列もゲノム上の
位置も知られておらず、またこれを含む組換えＤＮＡの
創製に成功し九との報告もなされていない。

かかる技術的背景の下に、本発明者らの一部らはａｃ１
ｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むＤＮＡの創製に成功し、当
該遺伝子のＤＩム塩基配列ならびにゲノム上の位置を決
定し、さらにこの組換えＤＮＡで形質転換させた組換え
体を培養してＨＢｓＡｇを大量生産する途を開いた（昭
和５６年特許出願第９３５４８号ｌ昭和５６年６月１６
日付出願）。

本発明者らはさらに研究を進めた結果、このＨＢ８ムｇ
遺伝子を、ベクター中に組み込まれた特定のオペロン中
の特定のポリペプチドをフードする遺伝子の中にまたは
特定のプロモーターの下流に挿入させ丸紐換えＤＮＡム
を創製して本発明を完成した。

ン中のアントフ二μ酸合成酵素コンボーネン）１もしく
はアントラ二μ酸合成酵素コンポーネントＩをフードす
る遺伝子、ｒａｃムオベロン中のｒｅｃム蛋白質をコー
ドする遺伝子もしくはアンピシリン耐性遺伝子オペロン
中のβ−フタタマーゼをコードする遺伝子の中にまたは
トリプトファンプロモーターもしくはｒｅｏＡプロモー
ターの下流に挿入してなる組換えＤｌｒム、 （２）上記組換えＤＭＡを含有する組換え体、ならびに （３）上記組換え体を培養し、培養物中にａｄｗ型ＨＢ
ｅムｇｆ友はそれと等価の免疫学約４しくけ生物学的活
性を有するポリペプチドを生成蓄積せしめることを特徴
とするａｄｗ型ＨＢａＡｇまたはそれと等価の免疫学的
もしくは生物学的活性を有するポリペプチドの製造法、 である。

本願明細書および図面で用いる記号の意義は第１表に示
すとおシである。

第１表 ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 Ａ　　　アデニン Ｔ　　　チミン Ｇ　　　グアニン ＣＶ）シン ｄｋＴＰ　　　デオキＶアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ　
　　デオキＶチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　デオキＶ
グアノシン三リン酸ｄＣＴＰ　　　デオキシンチジン三
すン酸ムＴＰ　　　アデノシン三リン酸 ＩＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸　　ＳＤ８　　
　ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ　　　グリシン ７− Ａｌａ　　　アフニン Ｍａｌ　　　バリン Ｉ、ｅｕ　　　ロイシン １１ｅ　　　イソロイシン Ｂａｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｃｙｓ　　　Ｓ／スティン Ｍｅｔ　　　メチオニン Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 ムｓｐ　　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　リジン ムｒｇ　　　アルギニン Ｈｌｓ　　　ヒスチＶン Ｐｈａ　　　フエ二μアフニン Ｔｙｒ　　　チロジン Ｔｒｐ　　　）リプトファン Ｐｒｏ　　　プロリン Ａ８ｎ　　　アスパラギン Ｇｉｎ　　　グルタミン　゛ ｂ　　　塩基 ８− ｂｐ　　　　塩基対 ｋｂｐ　　　キル塩基対 ｋｂ　　　　キロ塩基 本発明において用いられるＨＢａムｇ遺伝子は、昭和５
６年特許願第９３５４８号に記載されている方法もしく
はそれに準する方法によって製造することができる、九
とえば、下肥の方法により製造することができる。

ａｄｗ型ＨＢＶのデン粒子ＤＭＡを内在性ＤＮＡポリメ
ヲーゼ反応によシ完全な二重鎖Ｉ）ＮＡとし九のち、制
限酵素ＥｃｏＲ工によシ切断する。一方、プラスミドｐ
ＢＲ３２２ＤＮムも同じ酵素ＥｃｏＲＩで切断し、両者
をＴＡＤＭＡリガーゼの作用によりＩＱ　ｏＲＩ部位で
結合させる。この反応生成物を用いて大腸［（ｌ５ａｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ａｏｌｉ　）１１７７６株を形質転換
させたコロニーの中から、アンビンリン耐性、テトラサ
イクリン耐性でかつ３．２ｋｂＯ＆（ＩＷ型ＨＢＶ　　
ＤＮＡが組み込まれたプラスミドｐＢＲ３２２−１ｉ：
ｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３をもつ組換え体（χ１７７６／
ｐＢＲ３２２−１ｃｏＲ工／ａＢｖ９ａ３）を選択する
ことができる（第１図）。

この組換え体をＬグロスのような適当な培地で培養する
ことにより上記プラスミドｐＢＲ３２２−］ｉ：ｃｏＲ
Ｉ／ＨＢＶ９３３を大量に副製することができる。該プ
ラスミドを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩで消化すると３種のＤ
ＮＡ断片が生成するが、ＨＢｓＡｇ遺伝子は１３５５ｂ
　　ＤＮＡ断片上に存在する。この１３５５ｂ　　ＤＩ
ＪＡ断片の塩基配列は第２図に示すとお）である。塩基
配列順序１２７番目よりはじまるＡＴＧを開始コドンに
して、終止コドン（ＴＡＡ）が出現する゛までの６７８
　　ｂｐを対応するアミノ酸に翻訳（第２図）すると、
Ｐｅｔｅｒｓｏｎらによって報告されたａｄｗ型ＨＢａ
ｋｇＯＮ末端およびＣ末端アミノ酸配列（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｏａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７４、　１５３０　（１９７７））と一致することから
、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子は塩基配列順
序１２７〜８０７である。

上記１３５５　ｂのＢａｎ　ＨＩ　ＤＮＡ断片から、適
当な制限酵素を用いることによってＨＢ８Ａｇ遺伝子の
全塩基配列およびその一部を含む遺伝子断片を切シ出す
ことができる。例えば、第３図に示すように、該Ｂａｎ
　ＨＩ　　ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｐａＩで消化するこ
とによシ生じる９１８　ｂ　ＤＮＡ断片を、制限酵素８
ａｕ　　３Ａで部分分解することによ）、塩基配列順序
１２３〜９１８の７９２　ｂｐＤＮＡ断片（以下、Ａ断
片と略称する）および塩基配列順序１２３番目〜８８７
番目の７６１　　ｂｐＤＮＡ断片（以下、Ｂ断片と略称
する）を切シ出すことができる。また該Ｂａｍ　Ｈより
ＮＡ断片を、制限酵素Ｈ１ｎｃ　ｌで消化すると塩基配
列順序１９２〜９１８の７２７　ｂｐ　ＤＮＡ断片（以
下、Ｅ断片と略称する）を、制限酵素Ｈ１ｎｃ　ｌとＸ
ｂａ　　１で二重消化すると塩基配列順序２２０〜９１
８の６９５　’ｂｐ　ＤＮＡ断片（以下、Ｆ断片と略称
する）をそれぞれ切）出すことができる。

本発明においては、上記したａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子
の全ヌクレオチド配列もしくはその断片を前記した特定
のオペロン中の特定のポリペプチドをコードする遺伝子
の中にまえは特定のプロモーターの下流に挿入せしめる
ことによＦ）　ａｄｗ型ＨＢａＡｇ　１１− 遺伝子を発現する組換えＤＮＡが構築される。このうち
、ｔｒｐ　　プロモーターが組み込まれたベクターを利
用するものは、たとえば下記のようにして製造すること
ができる（第４図参照）。トリプトファン・オペロンが
組み込まれ九Ｃｏｌ　Ｅｌ　　プラスミドＰＭ’？’　
７７８　ＤＮＡを制限酵素）１１ｎｄ　ｌで消化するこ
とによＦ）、ｔｒｐ　プロモーター、オペレーター、　
ｔｒｐ　Ｅおよびｔｒｐ　Ｄの一部を含む５．５ｋｂの
ＤＮＡ断片を切シ出すことができる。

この断片をプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの制限酵素Ｈ
１ｎｄ　１部位に挿入し、プラスミドｐＴＲＰ２０２お
よびｐＴＲＰ　２３１　ＤｌｉＡを作製する。これらの
プラスミドでは、ｔｒｐ　Ｅにコードされたアミノ酸３
２２番目から３２４番目の】トン（ＧＡＧ　ＡＴＣＴＡ
Ｃ）上に制限酵素１１ｇ１　ｌ切断部位が１個所存在す
るため、全ＨＢａＡｇ遺伝子あるいはその断片をこの部
位に挿入することによ）トリ１）ファンオペロン中のア
ントフニル酸金成酵素コンポーネントＩをコードする遺
伝子（ｔｒｐｌ）との融合遺伝子が作製される。プラス
ミドｐＴＲＰ　２３１２− Ｉ　ＤＮＡを制限酵素Ｐｖｕ　ｌで消化したのち、再び
Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼで結合すると４．８ｋｂのプラ
スミドｐＴＲＰ　５０１　ＤＮＡが作製される。このプ
ラスミドでは、ｔｒｐ　ＤとプラスミドｐＢＲ３２２の
連結部（ＧＡＡＯＣＴＴム　）に制限酵素Ｈ１ｎｄ１部
位が１個所存在する丸め、全ＨＢａムｇ遺伝子あるいは
その断片をこの部位に挿入することによシトリブトファ
ンオペロン中のアントラ二〜酸合成酵素コンポーネント
ｌをコードする遺伝子（ｔｒｐ　Ｄ　）との融合遺伝子
が作製される。プラスミドｐＴＲＰ　５０１　ＤＮＡを
制限酵素Ｃ１ａ　ｌとＨｐａ　　Ｉで２重消化すると２
．６に’ｂｆ）Ｃ１ａ　Ｉ−ＨｐａｌＤＮム断片が得ら
れる。また、該プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｐａ　ｌ
とＴａｑ　■で２重消化すると３２　ｂｐ　ＤＮＡ断片
が得られる。この３２ｂｐ　ＤＮＡ断片と上記２．６ｋ
ｂＤＮＡ断片とをＴ４　Ｉ）ＮＡリガーゼで結合すると
プラスミドｐＴＲＰ６０１　ＤＮＡが作製される。該プ
フスミドＤＩムの制限酵素Ｐｖｕ　１部位に、プラスミ
ドｐＢＲ３２２ＤＮＡ　から制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｖ
ａ　ｌ　の２重消化によって得られる１−４ｋｂ　ＤＮ
Ａ断片をＤＮＡがリメラーゼＩ・ラージフラグメント（
クレノーのＤＮＡポリメラーゼＩともいう）で平滑末端
にしたものを挿入し、４．０ｋｂのプラスミドｐＴＲＰ
７０１を作製する。このプラスミドＩｌｌムを制限酵素
Ｃ１ａ　　Ｉで部分消化し、生じ九接着末端部をクレノ
ーのＤＮＡポリメフーゼＩで平滑末端にし九のち、Ｔ４
　ＤＮＡ　　リガーゼで結合することによシ制限酵素Ｃ
１ａ　ｌの切断部位が１個所になったプラスミドｐＴＲ
Ｐ　７７１　ＤＮＡを作製する。プラスミドｐ’ｒｎｐ
　６０１および７７１　ＤｔＪＡではｔｒｐ　プロモー
ター、５Ｉ）（シャイン　アンド　ダμガーノ）配列の
下流に制限酵素Ｃ１ａ　　［の部位があるため、ここに
全ＨＢａＡｇ遺伝子あるいはその断片の５′末端に読み
わくをずらすことなくムＴＧを結合させ九塩基配列を挿
入することができる。また、”プラスミドｐＴＲＰ　７
０１および７７１　ＤＮＡのアンピシリン耐性遺伝子オ
ペロン中のβ−ヲクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）中に１個
所存在する制限酵素Ｐａｔ　　■部位４全ＨＢａＡｇ遺
伝子あるいはその断片の挿入に利用できる。

ｒｅｃ　Ａプロモーターを利用する発現用ベクターは次
のように作製される（第５図参照）。ｒｅｃＡプロモー
ターが組み込まれたプラスミドｐＭＣＲ６１１ＤｉＡＣ
Ｍｔｈｔ、Ｔ、ら；　Ｍｏ１．　（）ｅｎ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、　、す３３゜２５　（１９８１）　）を制限酵素Ｒ
ａｍ　ＨＩとＰａｔ　ｌで２重消化すると、ｒｅａ　Ａ
プロモーターを含む１゜２５ｋｂのＤＮＡ断片を得るこ
とができる。該断片を制限酵素Ｔｉａｅ璽で部分分解す
ると、ｒａＣＡプロモーターとｒｅｃＡ蛋白質のＮ末端
側１５個のアミノ酸をコードしている１、　０６ｋｂ　
Ｄ　Ｎ　Ａ断片。

およびｒｅｃ人プロモーターとＮ末端９１５９個のアミ
ノ酸をコードしている１、１９ｋｂＤ）ｒＡ断片を得る
ことができる。これらの断片をそれぞれクレノーのＤＮ
Ａポリメツーゼｌで平滑末端にしたのちＪＴ４　ＤＮＡ
　リガーゼを作用させてＨ１ｎｄ璽リンカ−ｄ　（ＣＡ
ＡＧ（：ＴＴＧ）を該断片の両端に結合させる。このリ
ンカ−が結合したＤＮＡ断片を制限酵素Ｂａｎ　ＩＩと
Ｈ１ｎｄ璽で分解したのち、それぞれをプラスミドｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡを制限酵１５− 結合させ、プラスミドｐＲＩｃ　１０１とｐＲＥＣ２０
１ＤＩムを作製する。これらのプラスミドＤＮＡには制
限酵素Ｈ１ｎｃ！　ｌの切断部位が１個所存在するため
、全ＨＢｓムｇ遺伝子あるいはその断片をこの部位に挿
入するとｒｅＱムオベロン中のｒｅｃム蛋白質をコード
する遺伝子との融合遺伝子が作製される。

上記の如く作製された発現用ベクターに全ＨＢａＡｇ遺
伝子あるいはその断片を７４　ＤＮＡ　　９ガーゼの作
用によシ挿入させたのち、適当表宿主に導入することが
できる。宿主としては、大腸菌、枯草菌および酵５に表
どの微生物が挙げられるが、大腸菌（２９４株、Ｗ３１
１０株、ＲＲＩ株など）とりわけ２９４が好ましい。

かくして得られる組換えＤＮＡによる宿主の形質転換は
、公知の方法（Ｃ！ｏｈｓｎ、Ｓ、　Ｎ、ら、　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６９．
’２１１０（１９７２））もしくはそれに準する方法に
よシ行うことができる。

１６− たとえば、上記のようにして得られるＨＢａムｇ遺伝子
を含む新規な組換えプラスミドＤＭＡを大腸菌２−９４
株に導入して形質転換させ、アンビンリン耐性、テトラ
サイクリン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表繞型とし
て組換え体（ト→ンスフオーマント）を選ぶことかで色
る。なお、２９４株は公知の菌（Ｂａａｋｍａｎ　、　
Ｋ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７３．４１７４（１９７６
）：）であり、財ｉ法人「発酵研究所（工ｎａｔｉｔｕ
ｔｅ　ｆｏｒ　Ｆａｒｍｅｎ−ｔａｔｉｏｎ、　０ｓａ
ｋａ）　Ｊに１９８２年３月２３日付で工ＦＯ二１４１
７１として寄託もされている。これらの耐性株の中から
ＨＢａＡｇ遺伝子をもつ新規な組換えプラスミドＤＮＡ
を゛保持する菌株を探し出すには、たと□えば次の手法
が用いられる。ＨＢａムｇ遺伝子の全塩基配列を含む７
９２’ｂｐのＡ′断片をニツタ・トランスレージジン法
（Ｒｌｇｂｙ、Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、ら。

Ｊ、　Ｍｏ１．　ＢｉｏＬ、　’１１３　、２３’７（
１９７７）−）によって、ｉ２ｐなどの放射性同位元素
で標識し、これを探針（プローブ）とじて、それ°自体
公知のコロニーハイプリダイ゛ゼーション法（Ｇｒｕ晶
ｔｅｉｎ、Ｍ、　ａｎｄＨｏｇｎｅａａ、Ｄ、　ａ　、
　ＰｒｏαＭａｔＬＡｃａｄ、　８ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ
　。

７２．３９６１（１９７５））によって、すでに得た薬
剤耐性の組換え体の中から陽性を示すクローンを確実に
探し出すことができる。

このようにして選択され丸紐換え体をそれ自体公知の培
地で培養する。培地としては、例えばＬグロス、ベナセ
イ（Ｐｅｎａａａａｙ　）プロスおよびグルコース、カ
ザミノ酸を含むＭ−９培地（Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｊ、、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｇｅｎ＠ｔｉｃｓ、４３１−４３３　（Ｃｏ１
ｄ　８ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９７２　））が挙げられる
。ここに、必要によジブロモ−ターを効率よく働かせる
丸めに、たとえば３β−インドリルアクリル酸、ナリジ
キシン酸、マイトマイジンＣのような薬剤を加えること
ができる。

培養は通常１５〜４３℃、好ましくは２８℃〜４０℃で
２〜２４時間、好ましくは４〜１６時間行い、必要によ
り通気や攪拌を加えることもできる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば、緩衝液に懸
濁させた後、例えばリゾチームあるいは超音波処理によ
って菌体を破壊し、遠心分離によシ上澄液を得る。該上
澄液からの１（Ｂｓムｇの単離は、通常知られている蛋
白質の精製方法にしたがえばよい。

生成物のＨＢａＡｇ活性は、九とえはオースリア１−１
２５（グイナボット社製）あるいはオーヌザイムｌ（ア
ボット社ｉｆ’）を用いる免疫学的方法によシ測定する
ことができる。

本発明によ１製造されるａｄｗ型ＨＢａＡｇ　ｔたはそ
れと等価の免疫学的または生物学的活性を有するポリペ
プチドは、従来の方法で製造されたＪＬ（ＩＷ型ＨＢｓ
Ａｇと同等の免疫学的ならびに生物学的活性を有し、こ
れと同様の目的たとえばＢ型肝炎のワクチンもしくは診
断剤として同様の用法によシ使用することができる。

以下に、参考例および実施例を示して本発明を更に具体
的に説明するが、これによシ木発明は限定されるもので
はない。

参考例／：　　ａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡの単離１９− 昭和５６年特許願第９３５４８号の実施例λによって得
られるａｄｗ型１１１ＢＶ　　ＤＮＡが組み込まれたプ
ラスミドｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３を持
つ組換え体χ１７７６／ｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ／Ｈ
ＢＶ９３３　の１白金耳を、２００ｇＪフラスコに分注
されたジアミノピメリン酸１００μか−、チミジン２０
μｆ／１ｄおよびテトラサイクリン１２．５μす／−ｌ
を含むＬプロス３０ｓｊに接種し、３７℃で一夜、２０
０ｒｐｉｓで振盪培養した。この培養液２５ｄを、１１
フラスコに分注されたジアミノピメリン酸１００μｆ／
−およびチミジン２０μす／−を含むＬグロス５００ｄ
に移植し、３７℃、４時間。

２００ｒｐ鳳で振盪培養し九のち、クロフムフエニコー
μを１７０μｆｅｄになるように添加し、さらに６〜８
時間培養をつづけ、プラスミドＤＮＡの増幅をはかった
。このような同一条件下で培養され九培養液３Ｉｌを８
０００ｒｐｉａ、４℃、５分間遠心分離し、得られ死菌
体を生理食塩水で２回洗浄し、３゛Ｏｄの緩衝液（５０
ｍＭ　　Ｔｒｉｍ−ＥＩＣＩ（ｐＨ８，０）、２５％（
ｗ／Ｖ）ｓ／ニーｐロー：ｘ）−加一 に懸濁した。これに６ｄの５Ｗ／ｄリゾチーム溶液を加
え、５分間水中におき、１２−の０．２ＭＮａ２ＥＤＴ
ム（ｐＨ８，０）を添加し先後、１５ぎｌの５　Ｍ　１
ｉａｃ１および６ｄの１０％８ＤＳを加えて１時間以上
４℃におき、１８．０００ｒｐｍで４ｔｉ、３０分間遠
心分離し丸。得られた上澄液にエチジウムプａ−ｔｒイ
ド（ＥｔＢｒ　）を１００〜２００μｆ／ｍｌ。

塩化セシウム（ＣａＣ１）を密度１．５７〜１．５８９
／ｃＩｎ３　になるように加え、ベックマン５０Ｔ１０
−ターで４０．０００ｒｐｍで２０℃、４８時間ＣＢＣ
１−１ｔＢｒ平衝密度勾配遠心分離にかけた。プラスミ
ドＤＭＡのバンドを集め、これをさらに同一条件下でＣ
ｓＣ１−１ｔＢｒ平衝密度勾配遠心分離にかけて精製し
たー遠心後、プラスミドＤＮＡ圃分を集め、等量のイソ
アミルアルコ−μを加えてＥｔＢｒを除去した後、緩衝
液（１０ｍＭ　Ｔｒｉａ　−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ｍ
Ｍ）ＥＤＴム）中で透析し７１のをブ？ＸｔドｐＢＲ３
２２−ＥｏｏＲ工／ＨＢＶ’９３３　　ＤＮムの標品と
して使用し九。

参考例、２．　　ａｄｗ型１１１ａＡｇ遺伝子の単離ブ
ヲスミドｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３　Ｄ
ＮＡからａｄｗ型ＨＢａＡｇ遺伝子を次のように調製し
た。

４００μｆのプフスミドｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ／Ｈ
ＢＶ９３３　　ＤＮＡに制限酵素Ｂａｎ　ＨＩ　〔全酒
造■製〕を８００μｅの反応液（ｉ　０１１Ｍ　Ｔｒｉ
ａ−ＨＣＩ　。

ｐＨ８，０，７ｍＭＭｇＧ１２，１００ｍＭＮａＣ１，
２ｍＭ２−メルカプトエタノ−！、０．０１９６ウシ血
清アμプミン、１００ユニツトのＢａｎ　ＨＩ）中で３
０℃、６時間作用させた後、１．０％アガロース（Ｓｅ
ａｋｓｉｍ社製）スフプゲμを用いて緩衝液〔１００ｍ
Ｍ　Ｔｒｉａ−ＨＣＩ、１００ｍＭホウ酸、　２ｍＭ　
ＥＤＴＡ（ＰＨ８，３））中、１６０Ｍ２時間電気泳動
にかけた。泳動後、ｌ、４ｋｂＤｌｆム断片を含むグμ
片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内に沈め、
該ＤＮＡ断片をゲμから電気的に溶出した（　ＤｃＤｏ
ｎｅｌｌ　、　Ｌ　Ｗ、ら、　、Ｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏＬ　、す、０．１１９（１９７７）　）。透析チュー
ブ内液をフェノール抽出さらにエーテル抽出し死後、’
ＮａＣ１を０．２Ｍになるように加え、つづいて２倍量
の冷エタノールを加えて一２０℃でＤＮＡを沈殿させた
。

５０ｐｆｌの１．４ｋｂ　Ｄｌｆム断片に制限酵素Ｈｐ
ａＩ〔全酒造■製〕を２００μｌの反応液（ｉｏｍＭ　
Ｔｒｉａ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．１００　ｍＭ　ＫＣＩ　、　７ｍＭ　２−メμカプト
エタノー＊、０．０１％ウシ血清アルブミン、５ユニツ
トのＨｐａ　Ｉ　）中で３７℃、−夜作用させた後、制
限酵素８ａｕ　３Ａの希釈液を加えて３７℃、１５分間
部分分解した。

反応生成物を１．２％アガロース・スラグゲルを用いて
上記条件下で電気泳動にかけ丸。泳動後、ＨＢｓ’Ａｇ
遺伝子の全塩基配列を含む７９２ｂｐ　のＡ断片と７６
１ｂｐ　　の３断片とをそれぞれ上記と同様な条件下で
ゲルから溶出した。溶出液をフェノ−μおよびエーテル
抽出した後、ＮａＣ１を０゜２Ｍになるように加え、２
倍量の冷エタノールを加えて各ＤＮＡを沈殿させた。

５μすの１．４ｋｂ　ＤＮＡ断片に制″限酵素Ｈ１ｎｃ
Ｉ〔全酒造■製〕を３０μｌの反応液（ＩＯＩＩＭＴｒ
ｉａ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，０、７ｍＭ　Ｍｇ０１ｇ、６
０　ｍＭ）ｉａｃｌ、　７ｍＭ　　２−メμカプトエタ
ノー７ｔｚ、５ユニットのＨｌｎｃ　ｌ　）中で３７℃
、２時間作用させ２３− た後、１．０％アガロース・スラグゲルを用いて前記条
件下で泳動にかけ九。泳動後、ＨＢａムｇ遺伝子の断片
を含む７２７ｂｐのＥ断片を前記と同様な条件下でゲμ
から溶出した。溶出液をフェノ−μおよびエーテル抽出
した後、ＮａＣ１を０．２Ｍになるように加え、２倍量
の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。

５ｕｆの１．４ｋｂＤＮＡ断片に制限酵素ＸｂａＩ（Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂａ社製）とＨｐａ
　Ｉとを３０／ｌの反応液（６ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣＩ
、　ｐＨ７，９、６ｍＭＭｇｃ１２．１５０　ｍＭ　Ｎ
ａ’Ｃ１、０，０１％ウシ血清アルブミン、　５　躬）
のＸｂａｌ、５ユニツトのＨＰＪＬＩ）中で３７℃、２
時間作用させた後、１．０％アガー−ス・メフプゲμを
用いて前記条件下で泳動にかけた。泳動後、ＨＢｓムｇ
遺伝子の断片を含む６９５　ｂｐのＴ断片を前記と同様
な条件下でゲμから溶出した。溶出液をフェノールおよ
びエーテル処理し死後、ＮａＣ１を０．２Ｍになるよう
に加え、冷エタノ−μでＤＩｒムを沈殿させた。

参考例、ｉ　　ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子発現用ベクタ
一スー の構築 （１）　　ｔｒｐプロモーターを含有する発現用ベクタ
ーの構築 ■　２μｆのトリプトファン　オペロンが組み込まれた
Ｃｏ１１ｅｌプフスミドｐＭＴ　７７８　Ｉ）ＮＡに制
限酵素Ｈｌｎｄｌ〔全酒造■製〕を２０μｌの反応液（
１０ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５、７ｍＭＭ
ｇＣ１２，６０ｍＭＩＪａｃｌ、　２ユ＝ツトのｕｔｎ
ａｌ）中で３７℃、２時間作用させた後、０．７％アガ
ロース・スラプグμを用いて参考例コの条件下で電気泳
動を行つ九、泳動後、ｔｒｐプロモーター。

オペレーター、　ｔｒｐｌおよびｔｒｐＤの一部を含む
５、５ｋｂのＤＮＡ断片を参考例２の方法によシゲμか
ら分取した。

１μｆのプフスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡに制限酵素Ｈ１
ｎｄ　ｌを２０μｊの反応液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｍ−Ｍ
ＣＩ、　ｐＨ’ｙ、　５　、７！ＩＩＭ　ＭｇＣｌ２．
６０１１１ＭＮ＆ＣＬ　２ユニツトのＨｌｎｄｌ）中で
３７℃、２時間作用させて直鎖状ＤＭＡとした後、０．
１ユニツトのアルカリ性ホスファターゼ（Ｗｏｒｔｈｉ
ｎｇｔｏｎ社−）を添加して６５℃、３０分間反応させ
て５′末端のリン酸基を除去した。反応液をフェノール
で除蛋白し、冷エタノールでＤ　Ｎ　Ａ　（Ｈｌｎｄ　
ｌ消化ｐＢＲ３２２）を沈殿させた。

とのＨｌｎｄ　ｌ消化ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　（４００ｎ
ｌ）と前記５．５ｋｂＤＮ人断片（２００ｎｇ）とを混
合し、１０μｌの反応液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
、ｐＨ７、６，６，６ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭムＴＰ、２ユニットのＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造■　製）〕中、１４℃で一夜作用さ
せてＤＮＡを結合させた。この反応液を用いて大腸菌２
９４株を前記のＣｏｈｅｎらの方法に従って形質転換し
た。アンピシリン耐性を指標として選択され丸紐換え体
の中には、アンビンリン耐性だけを示す菌株とアンピシ
リン、テトラサイクリン両耐性を示す菌株が見いだされ
た。これらの菌株の菌体からプラスミドＤＮＡをアルカ
リ抽出法〔Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏ
ｌｙ、Ｊ、　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄａＲｅａ、
、　７．１５ｉ３　（１９７３））によって単離し、分
子量と制限酵素による分解パターンを調べると、前者の
菌株には５．５ｋｂのＤＮＡ断片がβ−ツクタマーゼ遺
伝子と順方向に挿入されたプラスミドｐＴＲＰ　２３１
　ＤＮＡが、後者の菌株には該ＤＮＡ断片がテトラサイ
クリン耐性遺伝子と順方向に挿入されたプラスミドｐＴ
ＲＰ　２０２が検出された（第４図参照）。

■　１μｆのプラスミドｐＴＲＰ　２３１　Ｄ！ｊＡに
制限酵素Ｐｖｕ　Ｉ　（全酒造■製〕を２０μｅの反応
液（ｌ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５、
７ｍＭ　ＭｇＣｌ２、６　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ
　２−メルカプトエタノール、２ユニツトのＰｖｕ　ｌ
　）中で３７℃、２時間作用させ死後、フエノーーで除
蛋白し、冷エタ〉−μでＤＮＡを沈殿させた。このＤＮ
Ａを、参考例３の（１）の■に記載の条件下で、Ｔ４Ｄ
ｌｆＡＩＪガーゼの作用によ如再結合させた後、その反
応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換させた。アンピ
シリン耐性の組換え体、の中に、プラスミドｐＴＲＰ２
３１の約５．１ｋｂのＰｖｕ　ｌ　Ｄ、Ｎム断片が除去
されたプラスミドｐＴＲＰ　５０１が得られｆＣ（第４
図参照）。

一釘一 ■　５μすのプラスミドｐＴＲＰ　５０１　ＤＮＡ　に
制御［酵素ｃ１ａ　　Ｉ　　（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）とをＨｐａ　　ｌを５０μｌの反応液（ｌＯｍ
ＭＴｒｉａ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，７ｍＭＭｇＣ１２，
１００ｍＭＫＣｌ、７ｍＭ、２−メルカプトエタノ−／
Ｌ’、０−０１％ウシ血清アルブミン、５ユニツトのＣ
１ａ　Ｉ　＋　５ユニツトのＨｐａＩ）中で３’ｌ、２
時間作用させ、つづいて０．５ユニツトのアルカリ性ホ
スファターゼを添加して６５℃、３０９間反応させた。

反応液を参考例２に記載の条件下で０．７％アガロース
・スラプゲμ電気泳動（かけ、　２．６　ｋｂ（ＤＤＮ
ＤＮＡを参考例コの方法によシゲμよシ分取し九。一方
、５０μｔのプブスミ、ドｐτＲＰ　５０１　ＤＮＡに
制限酵素Ｈｐａ　　Ｉを２００μｌの反応液（１０ｍＭ
　Ｔｒｌｍ　ＨＣＩ、　ｐＨ’ｙ、　５−７ＴＩＭＭｇ
Ｃ１２，１００ｍＭＭＣｌ、７ｍＭ　　２−メルカプト
エタノール、５ユニツトのＨｐａＩ）中で３７℃、−楔
作用させた後、５０ユニツトの制限酵素Ｔａｑ　Ｉ　を
添加し、６５℃、２時間反応させた。との反応液を１０
％ポリアクリルアミド・スフグゲルを用いて２８− 緩衝液（ｓ　９　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　８９ｍＭ
ホウ酸、２゜５ｍＭＥＤＴム、ｐＨ８，３）中で１６０
ｖ、１．５時間泳動にかけた。泳動後、３２　ｂｐのＤ
ＮＡ断片を参考例コに記載の方法によりゲμより分取し
た。

２００ＩＩＪの２．６ｋｂ　Ｃ１ａ　Ｉ−Ｈｐａ　（Ｄ
ＮＡ断片と１，５ｎｆのＣ１ａ　１−Ｔａｑ　ＩＤＮＤ
ＮＡを混合し、参考例３の（１）の■に記載の条件下で
Ｔ４ＤＮムリガーゼの作用によ、ｊｆｉ　Ｄ　Ｎ　、Ａ
を結合させた。

この反応液を用いて大腸菌２９４株を形質転換し、アン
ピシリン耐性の組換え体からプラスミドｐＴＲＰ６０１
　Ｍムが得られｆｃ（第４図参照）。、■　１μｆのプ
ラスミドｐＴＲＰ　６０１　ＤＮＡに制限酵素Ｐｖｕ　
ｌを２０μｊの反応液（１０ｍＭＴｒｉｍ−ＨＣＩ、　
ｐＨ７，５、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６０　ｍＭＮａＣｌ
、７ｍＭ　　２−メμカプトエタノー〜、２ユニットの
Ｐｖｕ　ｌ　）中で苧７℃、２時間作用させた後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノ−／＆でＤＮＡｔ−沈殿さ
せた。一方、２μｆのプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡに
制限酵素ＥｃｏＲＩ　〔全酒造■製〕とＡｖａ　　ｌ　
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂａ社製）とを
２０μＩの反応液（１００ｍＭＴｒｌａ−ＨＣＩ、ｐＨ
７，５、７ｍＭＭｇｃ１２．５０　ｍＭＮａｃｌ、　７
　ｍＭ　２−メμカブＹエタノーＡ’、２ユニットのＥ
ｃｏＲＩ、２ユニツトのＡｖａ　　ｌ　）中で３７℃、
２時間作用させた。

反応液を参考例コに記載の条件下で０．７％アガロース
・スラプゲμ電気泳動にかけ、泳動後、１゜４　ｋｂ　
０ＥｃｏＲニ−ＡｖａｌＤＮＡ断片を参考例λに記載の
方法によシゲμから分取し丸。

５００ｎｌＦの１．４ｋｂ　ＥｃｏＲニームｖａｌＤＩ
Ｎム断片にＤＭＡポリメヲーゼ・ラージフラグメント（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）を３０
ｐｌの反応液（４ｏ　ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７゜５　、６．６ｍＭＭｇＣ１２，１ｍＭ　２−メμカ
プトエタ／−Ａ／、　３３　μＭｄＡＴＰ、　３３μＭ
ｄＧＴＰ、　３３μＭｄＴＴＰ、　３３μＭ（ＩｃＴＰ
、　２：ＬニットのクレノーのＤ）ＩＡポリメラーゼＩ
）中で室温、３０分間作用させて、接着末端を平滑末端
にした。２００　ｎｆの該１．４ｋｂＤＮム断片と２０
０ｎｇのＰｖｕ　１消化ｐＴＲＰ　６０１　ＤＭＡとを
混合し、参考例３の（１）の■に記載の条件下で’１’
４Ｄ１ｊＡ９ガーゼの作用によシ結合した。該反応液で
大腸菌２９４株を形質転換させ、アンピシリン耐性かつ
テＦラサイクリン耐性を示す組換え体からプラスミドｐ
ＴＲＰ７０１ＤＮムが得られた（第４図参照）。

■　２μｆのプラスミドｐＴＲＰ　７０１　ＤＮＡに希
釈し九制限酵素Ｃ１ａ　　ｌを２０μＩの反応液（１０
ｍＭＴｒｉａ−ＨＣＩ、　ｐＨ！　８．０　、１０　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２．。

希釈し九Ｃ１！ＬＩ）中で３７℃、１５分間作用させ死
後、フェノールで除蛋白し、エタノールでＩＮＮＡを沈
殿させた。この部分分解ｐＴＲＰ　７０１ＤＮＡの接着
末端を、実施例３の（１）の■に記載の条件下でクレノ
ーのＤＩムポリメラーゼ■を作用させて平滑末端にした
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノ−〜でＤＭＡを沈
殿させた。該Ｉ）Ｎムを、実施例３の（１）の■に記載
の条件下でＴ４ＤＭＡ！ｊガーゼを作用させて再結合さ
せ九。この反応液で大腸菌２９４株を形質転換させ、得
られたトランスフォーマントの中からプラスミドｐＴＲ
Ｐ　７０１　ＤＮＡ中に２個所存在した制限酵素Ｃ１ａ
　ｌ　サイトが１３１− 個所になったプラスミドｐＴＲＰ　７７１が得られた。

該プラスミドＤＮＡに卦ける制限酵素Ｃ１ａ　　Ｉの切
断部位は、ｔｒｐ　　プロセーターにつづ（ＳＤ配列の
直後に存在した（第４図参照）。

（１）　　ｒｅｃＡプロモーターを含有する発現用ベク
ターの構築。

２００μｆのプラスミドｐＭＣＲ６１１ＤＮＡ　に制限
酵素Ｂａｎ　ＨＩとＰａｔ　Ｉ’（全酒造■製〕とを４
ｏｏμｇｏｆｆ応液（１ｏ　ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣｌ、
ｐＨ８、０，７ｍＭＭｇＣＩ２．１’００ｍＭＮａＣ１
，２ｍＭ　２−メルカプトエタノ−／Ｌ／、０．０１％
つＶ血清アμプミン、２０ユニツトのＢａｎ　　ＨＩ、
２０ユニツＦのＰｓｔ　Ｉ　　）中で３７℃で一夜作用
させ死後、反応液を１．ＯＳアガロース・スフプグμを
用いて参考例λに記載の条件下で電気泳動にかけた。

泳動後、１．２５ｋｂのＤＭＡ断片を参考例２に記載の
方法でゲμから分取し九。３０ｐｆの該１．２５ｋｂＤ
Ｎ’Ａ断片に、希釈した制限酵素Ｈａｓ　１〔全酒造■
製〕を１００ｐｅの反応液（ｌＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
、　ｐＨ７，５、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．７　ｍＭ　２３
２− 一メμカプトエタノール、希釈したＨａｓ　璽）中で３
７℃、１５分間作用させた後、１．２＊アガロース・ヌ
ラプゲμを用いて参考例λに記載の条件下で電気泳動に
かけた。泳動後、１．０６ｋｂおよび１．１９ｋｂＩ）
ＮＡ断片を参考例ユに記載の方法によってゲルからそれ
ぞれ分取した。２μすの１．０６ｋｂ　ＤＭＡ断片およ
び５００　ｎｇの１゜１９ｋｂＤｌｉム断片をそれぞれ
実施例３の（１）の■に記載の条件下でクレノーのＤＮ
ＡポリメラーゼＩと反応させて平滑末端にかえた後、フ
ェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿さ寝
た（第５図参照）。

２００　ｎｇのＨｌｎｄ　ｌ　　リンカ−（！　（ＣＡ
ＡＧＣＴＴＧ）　Ｃ全酒造■製〕にＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ〔全酒造■製〕を５０μｌの反応液（５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉ８−ＨＣＩ、　ｐＨ７，６、１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．１９ｍＭ２−メルカプトエタノ−＊、１＜）Ｏ
ｌ［Ａ７’ｐ、３ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ）中で３７ｂ、を時間作用させて、５′末端をリン
酸化した。

４ｎｇの５′末端がリン酸化され九Ｈ１ｎｄ　ｌ　　リ
ンカ−（５’−ｐ−ａ（ｃムムＧＣＴＴＧ））と４０゜
ｎｌＦの平滑末端１．　Ｑ５ｋｂ　Ｄ　Ｎム断片とを混
合し、参考例３の（＋）の■に記載の条件下でＴ４Ｄ１
１Ａ！Ｊガーゼの作用で結合させた。次に、この反応液
にｌＯユニットの制限酵素ＢａｍＩＩとＨｌｎｄ璽とを
それぞれ含む２０μｌの緩衝液（１０ｍＭＴｒｉａ−Ｈ
ＣＩ、ｐＨ８，０，７ｍＭＭｇＧ］４．１００ｍＭＮａ
Ｃ１，２履Ｍ２−メルカプトエタノーμ、０゜０１ｇ６
ウシ血清アμプミン）を加え、３７して一夜反応させて
、両末端を接着末端にかえ丸。

２ｎＨの上記５′末端リン酸化Ｈ１ｎｄ璽リンカ−と２
００ｎｆの平滑末端１．１９ｋｂＤＮム　とを混合し、
前記と同様な条件下で結合させた後、両末端を接着末端
にかえ丸。

一方、２μｆの１ラスミドｐＢＲ３２２ＤｌｉＡに制限
酵素Ｂａｎ　ＨＩとＨｌｎｄ　ｌとを２０μｌの反応液
（１０２１１Ｍ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＩ、　ｐ）１ｇ、　０
　、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．．１００　ｍＭ　）ｉａｃｌ
、　２　ｍＭ　２−メμカプトエタノーμ、０．０１％
ウシ血清アルブミン、３ユニツトのＢＪＬＩＩ　ＨＩ　
、　３　ユニットのＨｌｎｄ璽）中で３７℃、２時間作
用させた後、０．２ユニツトのアルカリ性ホスファター
ゼをｍ加Ｌ、６５℃、３０分間反応を続けた。反応液を
、１．０％アガロース・スツプゲルを用いて参考例λの
条件下で電気泳動にかけ、４．Ｏｋｂ　ＤＮＡ断片を実
施例λの方法でゲμから分取した。

次に、５００　ｎＨの４．Ｑｋｂ　ＤＮＡと２００ｎｆ
の平滑末端１．０６ｋｂＤＮＡ　を混合し、参考例３の
（１）の■に記載の条件下でＴ４　ＤＮＡ　リガーゼの
作用で結合させた。該反応液で大腸菌２９４株を形質転
換し、アンビＶりン耐性を示すトランスフォーマントか
らｒｏｅムプロモーターを含有するプラスミドＩ）ＲＥ
Ｃ１０１が得られた。また、５００ｎｆの４．ＱｋｂＤ
Ｎムと１００ｎｆの平滑末端１゜１９ｋｂＤＮム　とを
混合し、上記と同様の反応を行い、ｒｅａムプロモータ
ーを含有するプラスミドｐＲＥＣ２０１を得九。

実施例ｉ　　ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を発現する組換
えＤＮＡ分子の構築ｈ′よド言＃ｐＮＡ分）ＩＳＪｉ人
鳴丙の勧ｖＬ転換 （１）　　ｔｒｐ　ＥとＨＢａムｇ遺伝子との融合遺伝
子の構築。

■　ｌμｆのプラスミドｐＴＲＰ　２０２　ＤＮＡに制
限酵素Ｂｇｌ　ｌを２０μｌの反応液（１０ｍＭＴｒｉ
ａ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５、７ＥＩＩＭ　ＭｇＣｌ２．
６０　ｍＭＮａＣｌ、７　ｍＭ　　２−メルカプトエタ
ノ−１Ｌ／１２ユニツトのＢｇｌｌ）中で３７℃、２時
間作用させ＊後、ｏ、１ユニツトのアルカリ性ホスファ
ターゼを添加して６５℃、３０分間反応を続は友。反応
後、フェノ−μで除蛋白し、ＤＮＡを冷エタノ−！で沈
殿させた（Ｂｇｌｌ消化ＰＴＲＰ　２０２）。

５　Ｑ　ＯｎｇのＢｇｌ　ｌ消化ｐＴＲＰ　２０２と５
００ｎｆのＨＢａムｇ遺伝遺伝子片断片混合し、参考例
３の（１）の■に記載の条件下でＴ４　ＤＩムリガーゼ
を作用させてＤＮＡを結合させた。との反応液を用いて
大腸菌２９４株を形質転換させ、アンピシリン耐性を示
す組換え体から１フスミドＤＮＡをアルカリ抽出法で抽
出し、その制限酵素による分解パターンを分析し九。そ
の結果、Ｂ断片がトリプトファンオペロン中のアントラ
ニル酸合成酵素コンポーネントＩをコードする遺伝子（
ｔｒｐ　Ｅ）と順方向に挿入されたプラスミドｐＴＲＰ
Ｅ８−３を保持する菌株（２９４／ｐＴＲＰ　Ｅ８−３
　）を分離した。

■　２μｆのＨＢａムｇ遺伝遺伝子片断片考例３の（１
）の■で記載の条件下でクレノーのＤＮＡポリメツーゼ
ｌを反応させて接着末端を平滑末端にした。１μすの平
滑末端Ｅ断片と、参考例３の（ＩＩ）に記載の方法でき
末端がリン酸化されたＢｇＩＭ　リンカ−〔ターＰ−ｄ
（ＣＡＧＡＴＣＴＧ））（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ
ｏＬａｂａ社製）、ｓｏｎｇを参考例３の（１）の■で
記載の条件下でＴ４　ＤＨムリガーゼの作用によシ結合
させた。該反応液に過剰の制限酵素Ｂｇｌ　ｌを添加し
て接着末端を生成させ、かつ残存しているＢｇｌ　ｌ　
リンカ−を分解した後、フェノ−μで除蛋白し、冷エタ
ノ−μでＤＮＡを沈殿させ丸。

次に、１μｔの該リンカ−が結合したＥ断片と２μｔの
Ｂｇｌ　Ｉ消化ｐＴＲＰ　２０２　ＤＮＡを、参考例３
の（１）の■に記載の条件下で’１’４　ＤＮＡ　！Ｊ
ガーゼの作用によ多結合させた。該反応液を用いて大腸
菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実施例／の（１
）の■に記載の方法によって調べ、鵞断片がトリプトフ
ァンオペロン中のアントフニμ酸合成酵素コンポーネン
トｌをコードする遺伝子（ｔｒｐΣ）と順方向に挿入さ
れ九プツスミドｐＴＲＰ　１８−１１　を保持する菌株
（２９４／ｐＴＲＰ　ｌ５−１１　）を分離した。

■　２μすのＨＢｓムｇ遺伝遺伝子片断片び２μｆのＢ
ｇｌｌ消化ｐＴＲＰ　２０２　ＤＩＩＡにそれぞれ参考
例３の（１）の■に記載の条件下でクレノーのＤＮＡポ
リメラーゼＩを反応させて接着末端を平滑末端にした。

両者を混合し、参考例３の（１）の■に記載の条件下で
Ｔ４　ＤＮムリガーゼの作用によ多結合させ丸。反応液
を用いて大腸菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実
施例／の（１）の■に記載の方法によって調べ、ｙ断片
がトリプトファンオペロン中のアントラニル酸谷成酵素
コン／−１ントＩをコードする遺伝子（ｔｒｐΣ）と順
方向に挿入されたプラスミドｐＴＲＰ　ｌ５−２１を保
持する菌株（２９４／ｐＴＲＰ　［８−２１）を分離し
た。

（１）ｔｒｐＤとＨＢｓムｇ遺伝子との融合遺伝子の構
築。

■　１μ９のプラスミドｐＴＲＰ　５０１　ＤＩＩＡに
制限酵素Ｈ１ｎｄ　ｌを２０μｌの反応液（１０ｍＭＮ
５ＬＣ１、２ユ＝ツトの１ｌｉｎｃｌ　ｌ　）中で３７
℃１２時間作用させ、次に０．１ユニツトのアルカリ性
ホスファターゼを添加して６５℃、３０分間反応を続け
た。反応後、フェノ−μで除蛋白し、冷エタン−μを加
えてＤｌｒＡを沈殿させた（　Ｈｌｎｄ　１消化ｐＴＲ
Ｐ　５０１）。　　　　　　　　　。

２μｆＯＨＢａムｇ遺伝子ム断片に参考例３の（＋）の
■に記載の条件下でクレノーのＤｌｒムポリメヲーゼＩ
を作用さ□せ、接着末端を平滑末端にかえた。

１μすの平滑末端Ａ断片と、参考例３の（１）で記載し
た方法で５′末端がリン酸化され九Ｈ１ｎｄｌｌＪンと
を混合し、参考例３の（１）の■に記載の条件下で’Ｉ
’４　ＤＩ人リす□−讐を作用させてＤＭＡを結合さ３
９− せた。該反応液に過剰の制限酵素Ｈ１ｎｄ　ｌを添加し
て接着末端を生成させ、かつ残存しているＨ１ｎｄ璽リ
ンカ−を分解した後、フェノ−μで除蛋白し、冷エタノ
−μでＩ）ＭＡを沈殿させ丸。

次に、１μすの該リンカ−が結合したム断片と１μ９の
Ｈｌｎｌ　ｌ消化ｐ’ｌ’ＲＰ　５０１１１１ｉＡを、
参考例３の（１）の■に記載された条件下で’１’４Ｄ
Ｎムリガーゼの作用によって結合させた。該反応液を用
いて大腸菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実施例
／の（１）の■に記載された方法によつヤ調べ、ム断片
が（リデトファンオベロン中のアントフ二！酸合成酵素
コンポーネントＩをコーＦ−１遺伝子（ｔｒｐＤ）と順
方向に挿入されたプラスミドｐＴＲＰ　Ｄ’８　１を保
持する菌株（２９４／ｐＴＲＰ　ＤＳ−１）を分離した
。

■　１μＶのＨ１１ｍＡｇ遺伝子Ｅ断片と、参考例３の
（１）で記載の方□法によシ５′末端がリン酸化された
Ｈ１ｎｄ璽リンカ−（５’−Ｐ　−ｄ　（ＣＡＡＧＣ’
ｌ’ＴＧ））、５９ｎｆとを参考例３の（１）の■に記
載の条件下でＴ４ＤＮ１　リガーゼの作用によ多結合さ
せた。

４０− 反応液に過−の制限酵素Ｈ１ｎｄ　ｌを添加して接着末
端を生成させ、かつ残存するＨ’ｉｎｄ　１リンカ−を
分解させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールで
ＤＮＡを沈殿させた。

次に、２００ｎｆの該リンカ−が結合したＥ断片とｚｏ
ｏｎｔのＨｌｎｄ　ｌ消化ｐＴＲＰ　５０１　ＤＭＡを
、参考例３の（１）め■に記載の条件下でＴ４　ＭＡリ
ガー讐の作用によ多結合させた。この門゛応液を用いて
大腸菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実施例／の
（１）の■に記載された方法によって調べ、Ｉ断片がト
リプトファンオペロン中のアントヲニμ酸合成酵素コン
ｌ−ネン）Ｉをコードする遺伝子（ｔｒｐ　Ｄ）と順方
向に挿入されたプラスミドｐＴＲＰ　’Ｄ８−’３３を
保持する菌株（２９４／ｐＴＲＰＤ＄−３３）を分離し
た。　　　　　　　■　２μｑのＨＢｓムｇ遺伝遺伝子
片断片参考例３の（＋）の■に記載の条件下でクレノー
のＤＮＡポリメラーゼＩを作用させて平滑末端にした。

１μ９の該平滑東端Ｆ断片と、参考例３の（Ｉ）に記載
の方法によって５′末端がリン酸化されたＨ１ｎｄｌリ
ンカー（ｓ’　−ｐ−ａ（ｃムＡＧＣＴ、ＴＧ））、５
０ｎｆとを、参考例３の（，１）の■に記載の、条件下
でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合させた。反応
液に過剰の制限酵素Ｈｌｎｄ璽を添加して接着末端を生
、成させ、かつ残存しているＨ１ｎｄ璽リンカ−を分解
し死後、フェノ−μで除蛋白し、冷エタノールでＤＨ−
を沈殿させ丸。

次に、２００ｎｆの該リンカ−が結合し九Ｆ断片と２０
０ｎｇＯＨ１ｎｄｌｆｉ化ｐＴＲＰ　５０１　ＤＮＡを
、参考例３の（１）の■に記載の条件下でＴ４　ＤＮム
リガーゼの作用によ多結合させ丸。この反応液を用いて
大腸菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実施例１の
（１）の■に記載率れ先方法によって調べ、Ｆ断片がト
リプトファンオペロン中のアントヲ＝！酸合成竺素・ン
ボーネ、ント１を・−ドする遺伝子（ｔｒｐ　Ｄ　；　
）と順方向に挿入褌れたプラスミドｐＴＲＰ　ＤＳ−４
，２を保持する菌株（２９４／ｐＴＲＰ　ＤＳ−４２）
を分離した。

（−）、β−フクタマーゼをコードする遺伝子１．（ｂ
ｌａ）とＨＢａＡｇ遺伝子との融合遺伝子の構築。

■　１μ９のブラスミ）’ＰＴＲＰ　７０１　ＤＮＡに
制限酵素Ｐｓｔ　　ｌを２０　ｐｌｊの反応液（２ｏ　
ｍＭＴｒｉａ、−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５、１０ｍＭ　ｇ
ｇｃ１２　、５０ｍＭ　（ＮＨ４）２８０４　、０　、
０１　％ウシ血清アルブミン。

２子ニツトの：Ｐａｔ　（）中で３７℃、２時間作用さ
せ、次に、０．１ユニツトのアμカリ性ホスファタニゼ
を添加して６５℃、３０分間反応を続けた。

反応後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールを加えて
ＤＮＡを沈殿させた（ｐａｔｌ消化ｐＴＲＰ７０１）。

２μｆｆ）ＨＢａムｇ遺伝遺伝子片断片参考例３の（Ｉ
）の■≦紀記載条件下でクレノーのＤｌｒムポリメラー
ゼＩを作用させ、接着末端を平滑末端にかえた。１μ炉
の平滑末端ム、断片と、参考例３の（ＩＩ）で記載し先
方法で５′末端が、リン酸化されたＰａｔ、ｌリンカ−
（５’７Ｆ−（！（ＧＣ，ＧＴＣムＧＣ＞）　（、Ｎ１
５ＷＥＮ１５ＷＥｎ　ＢｉｏＬａｂｓ、社製）、５０ｎ
ｆとを、参考例３の（１）の■に記載の条件下でＴ４Ｄ
Ｉムリガーゼの作用によって結合させ丸。該反応液に過
剰の制限酵素Ｐａｔ　　ｌを添加して接着末端を生成さ
せ、−〇− かつ残存している。Ｐｓｔ　ｌ　　リンカ−を分解し死
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールテＤ、Ｎムを
沈殿させた。

次に、２００ｎｆの該リンカ−が結合し九Ａ断片と２０
０　ｎｇ　０Ｐａｔ　Ｉ消化ｐＴＲＰ　７０１とを、参
考例３の（：）の■に記載の条件下でＴ４ＤＮムリガー
ゼの作用によ多結合させ丸。この反応液を用いて大腸菌
２９４株を形質可換させ、組換え体を実施例１の（１）
の■に！載され先方法によって調べ、ム断片がアンピシ
リン耐性遺伝子オペロン中のβ−フタタアーゼをコード
する遺伝子（ｂｌｍ）と順方向に挿入さ、れたプラスミ
ドｐ、ＴＲＰ　ＬＳ−２を保持する菌株（２９４／ｐＴ
Ｒｐ　ＬＳ−２）を分離した。

■　１μｆのＨＢａムｇ遺伝遺伝子片断片参考例３０値
）に記載の方法によって５′末轡をリン酸化し九ＰＢｔ
、ｌ　　９ンカ−（５′、−Ｐ−ｄ（ＧＣＴＧＣＡＧＣ
））、５０ｎｇとを、参考例３の（：）の■に記載の条
件下でＴ４Ｔ）Ｎムリガーゼの作用によって結合させた
。反応液に過剰の制限酵素Ｐａｔ　　ｌを添加して接着
末端を生成させ、かつ残存しているＰａｔ　１−材一 リンカ−を分解した後、フェノールで除蛋白し、冷エタ
ノールでＤＮＡを沈殿させた。、　　。

次に、２００ｎｆのＰａｔ　　ｌ　リンカ−が結合した
Ｅ断片と２００　ｎｊのＰａｔ　　ｌ消化ｐＴＲＰ　７
０１を、参考例３の（１）の■に記載の条件下でＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼの作用によ）結合させ九。この反応液を用
いて大腸菌２，９４株を形質転換させ、組換え体を実施
例／の（１，、）の■に記載された方法によって調べ、
Ｅ断片がアンビイリン耐性遺伝子オペロン中９β−ラク
タマー、ゼなコードする遺伝子（ｂｔａ）と順方向に挿
入されたプラスミドｐＴＲＰ　ＬＳ−３１を保持する菌
株（２９４／ｐＴＲＰ　ＬＳ、３１　）を分離した。

（ｌｖ）　　ｒｅｏＡ蛋白質遺伝子とＨＢａＡｇ遺伝子
との融合遺伝子の構築。

■　１μすのプラ、スミドｐＲＫｃ、１０１．Ｉ）ＨＡ
に制限酵素Ｈ１ｎｄ　ｌをｚ、ｏｐｌの反応液（１０ｍ
ＭＴｒｉａ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５、７ｎ＋１　ＭｇＣ
ｌ２．６０　ｍＭＮａＣｌ　、　２：ｘ、＝ットのＨｌ
ｎｄ　Ｉ　）中で３７℃、２時間作用させ、次に０．１
ユニツトのアμカリ性ホスファターゼを添加して６５℃
、３０分間反応を続けた。反応後、フェノ−μで除蛋白
し、冷エタノールを加えてＤｌｉＡ′を沈殿させた（　
Ｈ１ｎｄ璽消化ｐＲＥＣ１０１）。

２μＶのＨＢａＡｇ遺伝子Ａ断片に参考例３の（１）の
■に記載の条件下でクレノーのＤＮＡポリメヲーゼＩを
作用させ、接着末端を平滑末端にかえた。

１μＶの平滑末端ム断片と、参考例３の（■）で記載し
た方法で５′末端をリン酸化したＨｌｎｄ　’ｌ　！ｊ
ンカー（５’−Ｐ−ｄ（ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣ））　（
ＢＲＬ社製）、５０ｎｆとを参考４Ａ３の（１）の■に
記載の条件下でＴ’４ＤＮムリガー讐の作用によって結
合させた。該反応液に過剰の制限酵素’Ｈ１ｎｄ　ｌを
添加しそ接着末端を生成させ、かつ残存している阻ｎｄ
璽リンカ−を分解した後、フェノ−〜で除蛋白し、冷エ
タノールでＤＮＡを沈殿させた。

次に、２００ｎｆの該りンカーが結合したム断片と２０
０ｎｆのＨｌｎｄ　Ｉ消化ｐＲＥｃ　１０１　ＤＩＡを
、参考例３の（１）の■に記載の条件下でＴ４ＤＮムリ
ガーゼの作用によシ結合させた。この反応液を用いて大
腸菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実施例／の（
１）必■に記載された方法によらて調ベム断片がｒｅｏ
；、オペロン中のｒｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子と
順方向に挿入されたプラスミドｐＲＥＣＲ８−３番保持
する一株（２９４／ｐＲＥｃＲ８’−３）を分離した。

■゛１μ９のＨＢａＡｇ遺伝子Ｅ断片と、参考ｉ１３の
（Ｉｔ）で記載の方法により５′末端がリン酸化され九
Ｈ１ｎｄ　ｌりンカー（５′−ｐ’−’ａ　（’ＧＣ４
ＡＧＣＴＴＧ’Ｃ））　、　５０μ゛替とを参考例、１
ｎ（ｏの■に記載の条件下で７４’ＤＩムリガーゼの作
用によシ結合させ九。該反応液−過一の制限酵素Ｈ１ｎ
ｄ　’ｌを添加して接着末端を生成させ、かつ残存する
Ｈｌｎｄ　１リン力ニ番分解させ先後、ツーノー；で除
−白１、冷エタノ−μでＤＮＡを沈殿させた。　　′茨
に、２００ｎｇの該リンカ−が結合″したＥ′断片と２
００ｎｆのＨｌｎｃＳ　璽消化ｐ’ＲＥＣ”　１０１　
Ｄ’ＮＡとを、参考例３の（１）の■に記載６条犀下で
ＴＡ　ＤＮＡリガーゼの作用により結合させ是。この反
応液を昂いて大腸”繭２９４株を形質転換させ、組換−
４７二 え体を実施例／の（１）の■に記載され先方法によって
調べ、Ｅ断片がｒ６Ｑムオベ゛門ン中のｒｅｏ　Ａ蛋白
質をコードする遺伝子ｉ順方高に挿入されたプラスミド
ｐＲＢｃ　Ｒ８−’１１を保持する菌株（２９４／ｐＲ
ＥＣＲ８−１１）を分離し九。　　　□゛（ｙ）　　Ｈ
Ｂａムｇ遺伝子およびその断片の直接発現用プラスミド
の構築。　　□ ■　１μｔのプラスミドｐＴＲＰ　７７１　ＤＮＡに制
限酵素Ｃ１ａ　　ｌを２０　ｉｌｌの反応液（１ａｍＭ
Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＩ　、　ｐ　Ｈ８−０＊　１０　Ｉｌ
ｌ　Ｍ　Ｍｇ　Ｃ１２，２ユ”　７トのＣ１ａ　ｌ　）
中で３７℃、２時間作用させ、次に０．１ユニツトのア
ルカリ性ホスファターセヲ添加して６１．３０分間反応
を続けた。反応後、フェノ−μで除蛋白し、冷エタノ−
μを加えてＤＮＡを沈殿させた（Ｃ１ａ）消化ｐＴＲＰ
　７７１）。

２μＶのＦＩＢａＡｇ遺伝子Ａ断片に参考例３の（１）
の■に記載の条件下でクレノーのＤＮＡポリメヲーゼ■
を作用させて、接着末端を平滑末端にかえた。１μすの
平滑末端Ａ断片と、参考例３の（１）で記載した方法で
５′末端をリン酸化し九Ｂａａ　ＨＩ！Ｊ４８− ンカー（５’−Ｐ−ｄ’（ＣＣＧＧムＴＣＣＧＧ））（
宝酒造■製）、’５０’ｎｌＦとを、実施例３の（１）
の■に記載の条件乍でＴ４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼの作用
によって結合させた。該反応液に過剰め制限酵素Ｈｐａ
　ｌ（Ｎｅｗ　’Ｉｎｇ’１ａｎｄ　ＢｉｏＬａｂａ社
製′）を添加して接着末端門星晟させ、かつ残存してい
る該Ｂａｎ　ＨＩリンカ一番分解した後、フェノールで
除蛋白し、冷エタノ−゛μでＤＮＡを沈殿させた。

次に、”２００ｎｆの該゛リン↓−′が結合し九Ａ断片
と２００ｎｇのＣ１ｍ　　ｌ消゛化ｐ’ＴＲＰ　７７１
　ＤＮＡとを、゛参考−３の（＋）（Ｄ■に記載の条件
下で’ｒＪＤＮムリガーゼの作用によ）結容させた。こ
の反応液を用いて大腸菌２９４株を形ｉ転換させ、組換
え体を実−′例／の（１）の■に記載さ五九方法によっ
（２９’ｊ／ｐＴＲｐ’　８−５　　）を分離した。

■　１μ７のＷＢａＡｇ遺伝子Ｅ断片と参考例）とを参
考例３の（１）の■に記載の条件下でＴ４ＤＭムリガー
ゼの作用によって結合させ丸。反応液に過剰の制限酵素
Ｃ１＆Ｌ　Ｉを添加してアダプターを分解した後、フェ
ノ−μで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させ丸
。なお、上記アダプターはトリエステル法（Ｃｒｅａ、
Ｒ，ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．５７６５　（
１９７ｇ））を用いて化学合成した。

次に、２００ｎｆの該アダプターが結合し九Σ断片と２
００ｎｆのＣ１ｍ　ｌ消化ｐＴＲＰ　７７１　ＤＮＡと
を、参考例３の（１）の■に記載の条件下でＴ４　ＤＩ
ムリガーゼの作用により結合させた。この反応液を用い
て大腸菌２９４株を形質転換させ、組換え体を実施例／
の（１）の■に記載された方法によって調べ、Ｉ断片が
ｔｒｐプロモーターと順方向に挿入され九プラスミドｐ
ＴＲＰ　８−１２を保持する菌株（２９ｔ／ｐＴＲＰ　
８−１そ２）を分離した。

実施例、２５Ｌｄｗ型ＨＢａムｇ遺伝子の大腸菌におけ
る発現 実施例／で得られ九ＨＢａＡｇ遺伝子発現デフスミドを
含む各組換え体を、０．５％グμコース。

０．５％カザミノ酸を含むＭ−９培地で、３７℃、６時
間培養した後、菌体を集め、緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｏ−ＨＣＩ、　ｐＨ１ｇ、　０　、５０　ｍＭ　Ｎａ１
ｌ。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ　　）で洗浄し丸。菌体を、ｌＱｍＭ
Ｔｒｉａ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，０、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　
、　１ｎ＋Ｍフエニ〜メチルスルホニルフμオフイド。

０．５Ｗ／Ｍｌリゾチームからなる溶菌液に懸濁し、凍
結、融解を３回繰り返すことにより溶菌した。

溶菌液を４℃で１５．００Ｏｒｐｍ　、３０分間遠心分
離にかけて上澄液を得た。この上澄液のＨＢａムｇ活性
をオースリアｌ−１２５キツトを用いて測定した。その
結果を第２表に示すが、ＨＢａＡｇ抗原性を示すペプチ
ドの生成量は菌体１個あ九）およそ２０００〜４０００
ＨＢｓＡｇ分子と計算された。

（以下金白） ５１− 第２表

【図面の簡単な説明】

第１図はａｄｗ′ｆＩＩＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｍムが組み込
まれたｆ’ｌ　スミＹｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ／ＨＩ
ＩＶ９３３　を、第２図はＨＢＶ　　ＢａｎＨＩ　　１
３５５　ｂ　ＤＩム断片の塩基配列とＨＢａムｇのアミ
ノ酸配列を、第３図＝５２− は当該１３５５　ｂ　ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図と
それから得られる断片を、第４図はｔｒｐプロモーター
を利用する発現用プラスミドの構築例を、第５図はｒｅ
ｏＡプロモーターを利用する発現用プラスミドの構築例
を示す。 代理人　　弁理士　松　居　祥　ニ ｐ８Ｒ，３２２７［：、ｃｏＲＩ　、／Ｈ８ｖ９３３ ｐＲＥｃｌｏｌ　　＋５．０８ｋｂｌ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原構造遺
   伝子ｔ−１）リプトファンオベロン中のアントラニル酸
   合成酵素コンポーネント！もしくはアントラニル酸合成
   酵素コンポーネントｌをコードする遺伝子、ｒｅｃＡオ
   ペロン中のｒｏｅム蛋白質をコードする遺伝子もしくは
   アンピシリン耐性遺伝子オペロン中のβ−ラクタマーゼ
   をスートする遺伝子の中にまたはトリプトファンプロモ
   ーターもシクハ’　ｒｏｅムデロ毫−ターの下流に挿入
   してなる組換えＤＩ′ム。
2. （２）表面抗原構造遺伝子が第２図において塩基配列順
   序１２７〜８０７として示される塩基配列またはその断
   片である特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡｏ　
   　　　　　　’
3. （３）表面抗原構造遺伝子が第２図に示されるポリペプ
   チドまたはそれと等価の免疫学的もしくは生物学的活性
   を有するポリペプチドを特徴とする特許請求の範囲第１
   項を九は第２項記載の組換えＤＮＡ０
4. （４）トリプトファンプロモーターもしくはｒｅｃ　Ａ
   プロモーターの下流に、第２図において塩基配列順序１
   ２７〜８０７として示される塩基配列またはそれの断片
   の５′末端に読みわくをずらすことな（ＡＴＧを結合さ
   せた塩基配列を挿入してなる特許請求の範囲第１項〜第
   ３項記載の組換えｎｍ＊。
5. （５）　　ａｄｗｍＢ型肝炎ウイμスつ表面抗原構造遺
   伝子ヲ、トリプトファンオペロン中のア”ントラニμｍ
   酸合成酵素コンポーネントｌもしくはアントヲニμ酸合
   成酵素コンポーネント１をコードする遺伝子、　ｒｅｏ
   ムオベーン中のｌ”ｅＱム蛋白質をコードする遺伝子も
   □しくはアンピシリン耐性遺伝子オペロン中め□β−ツ
   タタマーゼをコードする遺伝子の中にまたはトリプトフ
   ァンプロ毛−ターモシくハｒｅｃＡプロモーターの下流
   に挿入してなる組換えＤＮＡを含有する組換え体゛。
6. （６）大腸菌である特許請求の範囲第５項記載の組換え
   体。
7. （７）　　ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原構造遺
   伝子を、トリプトファンオペロン中のアントラ二μ酸合
   成酵素コンポーネントＩもしく社アントラニル酸合成酵
   素コンポーネント■をコードする遺伝子、ｒｅｃＡオペ
   ｐン中０ｒｅｃム蛋白質をコードする遺伝子もしくはア
   ンピシリン耐性遺伝子オペロン中のβ−ラクタマーゼを
   コードする遺伝子の中　　　□に゛またはトリプトファ
   ンプロモーターもしくはｒｅｃＡプロモーターの下流に
   挿入してなる組換えＤＮＡを含有する組換え体を培養し
   、培養物中にａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原また
   はそれと等価の免疫学的覗しくけ生物学的活性を有する
   ポリペプチドを生成蓄積せしめることを特徴とするａｄ
   ｗ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原またはそれと等価の免
   疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプチドの製
   造法。