JPS60115528A - ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン−２蛋白質および遺伝
子工学手法によるその製造法に関する。

インターロイキン−２（以丁工Ｌ−２と略称する。なお
工Ｌ−２は、Ｔｌ１ｔｌｌ胞増殖囚子（ＴＣＧＦ）とも
呼ばれる。〕は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたＴ
細胞によって産生されるリンホカインである〔サイエン
ス、第１９３巻、＋００７員（１９７６年）；イムノロ
ジカル・レビュー、第５１巻、２５７頁（１９８０年）
〕。工Ｉ、−２は、Ｔ細胞をインビトロでその機能を保
持したまま増殖させ長期間の継代維持を可能にするほか
に、今までに胸腺細胞のマイト−ジエン反応を促進した
り（コステイミュレーター）、ヌードマウス牌稚胞のＴ
細胞依存性抗原に対する抗体産生能を回復させた。り（
ＴＮＩ胞リプリブレーシングファクターフー細胞の分化
増殖を促進する（キフーへμバーファクター）粘性を有
すると報告されている〔ザ・ジャーナμ・オプ・イムノ
ロジー、第１２３巻。

２９２８頁（１９７９年）、イムノロシカＭ・レビュー
、第５１巻、２５７頁（１９８０′４））。

ＩＬ−２を利用して、これまでにキラーＴｌ１ｌＩ胞や
へμバーＴＩＶＩＩ胞、さらにはナチュラルキフー軸胞
などのクローンが多数得られている〔たとえば、ネイチ
ャー、第２６８巻、１５４頁＜　１９７７年）；ザ・ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー、第１３０巻、９８１頁
（１９８３年）〕。このよりなＴポ■胞やナチュフルキ
フー細胞のクローン化という直接的用途のほかに、■Ｌ
−２に用いである特殊な抗原、たとえば聰瘍抗原ｔ−認
識し破壊する抗原特異的へなキラーＴＭ胞をインビトロ
で選択的に増殖させることができる。このようにして増
殖させた腫瘍特異的キラーＴ細胞を動物に移入して腫瘍
の増殖を抑制阻止することが可能であるしザ・ジャーナ
ル・オグ・イムノロジー、第１２５巻。

１９０４頁（１９８０年）〕。また、■Ｌ−２がインタ
ーフェロンγの産生を誘導すること〔ザ・ジャーナル・
オブ・イムノロジー、第１３０巻。

１７８４頁（１９８３年）〕や、〕ナチュラルキラー細
を宿性化すること〔ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー、第１３０巻１９７０負（１９８３年）〕が知られて
いる。

これらの実験亭実は工Ｌ−２が抗腫瘍剤として用いられ
る可能性を示すものである。ＩＬ−２はまた、胸腺機能
を欠如しているヌードマウスのヘルパーＴ細胞機能を回
復させること（ヨーロピアン・ジャーナ〃・オプ・イム
ノロジー、Ｍ２Ｏ巻。

７１９負（１９８０年）〕や、同種細胞に対するキラー
Ｔ　ｆａｔ胞の誘導を回復させること〔ネイチャー、第
２８４巻、２７８頁（１９８０年）〕が知られておｐ１
免疫機能低下疾患への応用も期待できる。

しかしながら、ヒ）ＩＬ−２は量産が困難であるために
、現時点では臨床への応用が不可能であり、純度の商い
ヒトエＬ−２ｔ−容易により安ｆ＋ｌｌｉに大泣生産で
きる技俯の開発が望まれている。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　らは、ヒトＴ白血ＪＨｉｔ胞株Ｊ
ｕｒｋａｔの工Ｌ−２ｍＲＮＡ　全素材にヒトエＬ−２
ｉｋｔ仏子をクローニングし、それから推定されるヒト
エム−２蛋白質のアミノ酸配列を報告した〔ネイチャー
、第３０２巻、３０５頁（＋９８３４）、１）。その後
、Ｄｅｖｏｓ　らは、ヒトｎ臓則胞由来の工Ｌ−２遺伝
子をクローニングして、大腸菌で発現したことを報告し
ている〔ザ・ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１
１巻、４３０７頁（１９８３年）〕。しかし、これまで
はＴＣＧＦ活性を有することにより工Ｌ−２様物質の存
在が推定されていたのみで、現実にヒトエＬ−２’ｔコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体の産生ずるとトエ
Ｌ−２ｉ白質をＭ製取得したとの報告はない。

本発明者らは、遺伝子操作技南ヲ利用してヒトエＬ　−
２遺伝子をクローニングし、得られた組換えＤＮＡ分子
を宿主に移入してヒトエＬ−２遺伝子ｔ−発現はぜ、目
的とするｘｘ、−２蛋白′Ｒを出ることのできる技俯の
開発研究を行った結果、実質的に純粋な非グリコジル化
ヒトエＬ−１白質の製造法を確立し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明は、実質的に純粋な非グリコシル化ヒ
ト工Ｌ−２蛋白質、ならびにヒトＩＬ−２をコードする
塩蛾配列を有するＤＮＡを含有する形質転換体を培養し
、培養物から該ヒトエＬ−２ｆ、精製する当該蛋白質の
製造法を提供するものである。

本発明で用いられるヒトエＬ−２ｅコードするＤＮＡは
、例えば第２図中コドン１〜１３３で示される塩！＆自
己列のＤＮＡ（Ｉ　）があげられる。このＤＮＡ　（Ｉ
　）は、その５′末端にＡＴＧまたは第２図中コドン８
１〜８２０で示されるシグナルコドンを有していてもよ
く、３′末端にＴＡＡ　、ＴＧＡまたはＴＡＧ’ｉｉ：
有することが好ましく、とりわ゛けＴＧＡが好ましい。

ＤＮＡ　（ｉ　）はプロモーターのＦ流に連結されてい
ることが好ましく、これらプロモーターとしてトリプト
ファン（ｔｒｐ）グロモーター、レックＡ（ｒｅｃＡ）
プロモーター、λＰＬ　プロモーターなどが皐げられ、
と９わけｔｒｐ　プロモーターが好適である。

本究明においては、例えばコンカナバリンＡなどで刺激
されたヒト末梢白血球の培＊液からヒト■Ｌ−２にコー
ドするｍＲＮＡ　を分離し、逆転写酵素などを用いて単
鎖のｃＤＮＡ　を合成した後、二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａｉ合成
する。ついで、グラスミドに導入して、例えば大腸菌や
枯草菌などを形質転換させ、これよＦ）ｃＤＮＡ　含有
プラスミドを単離することによりヒトエＬ−２’ｒコー
ドする二ｍＷ４ＤＮＡを製造することができる。

本発明で用いられるヒトＩＬ−２をコードするｍＲＮＡ
　ｌｄ　ｌｉｉｎｕｍａ　Ｃ）の方法しバイオケミカル
・アンド・バイオフィジイカル・リサーチ・コミュニケ
イションズ、第１０９巻、３６３負（１９８２年）〕に
よって得ることができる。得られたヒトＩＩ、−２ｍＲ
ＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用い自体公知の方法で
ｃＤＮＡ＋’ｉｌＡ’ｅ合成り、ｃＤＮＡに本、１ｄＤ
ＮＡへｆ−ＩＪする［　Ｍａｎｉａｔｉｓ＋　Ｔ、ら、
セル、第８券、１６３貝（１９７６年）　；　Ｌａｎｄ
　＋ハ、ら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第９
巻、２２５＋頁（１９８１年）〕。　このＤＮＡ１、例
えばｄＧ−ｄＣホモポリマー結合法〔Ｎｅ１ｓｏｎ＋　
Ｔ、Ｓ、　＋メソッズ・イン・エンジモロジー、第６８
巻、４１頁（１９７９年）〕によりたとえばフ゛フヌミ
ドｐＢＲ３２２のＰ日丸１制Ｊｉｌエンドヌクレアーゼ
切断部位に組み込ませる。式らに、例えばヒ）ＩＬ−２
の一部のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつオリコ
゛ヌクレオタイドを化学合成した後、　Ｐでフベｐして
プローブとなし自体公知の方法でコロニーノ１イプリダ
イゼイション法（Ｇｒｕｎｃｆｅｉｎ＋　Ｍ、　＋　Ｈ
ｏｇｎｅｅｅ＋　Ｄ、Ｓ、。

プロシーディングヌ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オプ・サイエンス・ＵＳＡ＋ＭＧ７２Ｓ＋３９６１
頁（１９７５年）Ｊ　；　Ａｌｗ　ｉｎｅ＋Ｊ、Ｃ。

ら、メソッズ・イン・エンジモロジ〜、第６８巻。

２２０頁（１９７９年）〕により、テトフサイクリン耐
性あるいはアンピシリン感受性のトヲンヌフォーマント
の中からめるクローンヲ選出する。

上記ハイブリダイゼインワン法で陽性金示したクローン
のＤＮＡの塩基配列ｆ　Ｍａｘａｍ　−Ｇ１１ｂｅｒｔ
法ＣＭａｘａｍ＋　Ａ、Ｍ、ら、プロシーディングヌ°
オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス
・ＵＳＡ　、第７４巻、５６０頁（１９７７年）〕ある
いはファージＭ１３　’ｅ用いたジヌクレオチド合成鎖
停止の方法（Ｍｅａｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、ヌクレイツク
・アシッド・リサーチ、第９巻、３０９貝（１９８１年
）〕により決定し、ヒトエＬ−２遺伝子の存在を確認す
る。次に、得られたクローンからヒトエＬ−２遺伝子の
全部あるいは一部を切り出し、プラスミド中の適当なプ
ロモーター、ＳＤ（シャイン・アンド・ダμガーノ）塩
基配列の下流につないで適当なｊ６王に導入することが
できる。

プロモーターとしてはｔｒｐプロモーターなどが、鉛工
としては大腸菌（２９４株、ｎｕ　１株など）などが有
利に用いられる。

なお大腸菌２９４株（Ｂｅｃｋ転＾へら、プロシーデイ
ンダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・ＵＳＡ　、８０３巻、４１７４７（（１９７
６年）〕およびＤＩ　１株Ｃ５ａｌｏｏｎ　＋　Ｍ　に
。

ら、ネイチャー、第２１７巻、１１１０頁（１９６Ｂ’
４＝））はいずれも公知の菌株である。

ＤＮＡによる鉛工の形質転換は公知の方法３　Ｃｏｈｅ
ｎ＋　Ｓ、Ｎ、ら、プロシーデインダス・オプ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ＵＳＡ、第
６９巻、２１１０頁（１９７２！ｊ□Ｉ−）〕により実
施することができる。このようにして得られた宿主はそ
れ自体公知の培地、例えばグルコース、カザミノ酸を含
むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ　ｒ　Ｊ、＋エクヌベリメン
ツ・モレキュツー・ジエネデツクヌ、４３１頁−４３３
員（コーμド・スゲリンク−ハーバ−・フポブトリー、
ニュー・ヨーク。

１９７２年）〕中で培養される。ｔｒｐ　プロモーター
を使用する場合は、それ全効率よくイ輪かせるために、
例えば３−β−インドリルアクリルような薬剤を加える
ことができる。ｉ８養は通常１５〜４３゛Ｃで３〜２４
時間行ない必要に応じて通気あるいは撹拌することもで
きる。

かくして生成されるヒトエＬ−２のｚｌｉｌｌ定には工
Ｌー２依存性細胞株を用いることができるが、ヒトエＬ
−２はヒト以外にラットおよびマウスなどのＩＬ−２依
存性ａｌｌ胞の増殖をも促進することが知られている〔
イムノロシカｌし・レビュー、第５１巻、２５７頁（１
９８０年）」ので、工り−２依存性ヒト細胞株のみなら
ずラットまたはマウスの工Ｌ−２依存性細胞株を用いる
こともできる〔ジャーナル・オグ・イムノロジー、Ｗｊ
１３０巻。

９８１負および９８８頁（１９８３年）〕。

特にマウスの工Ｌ−２依存性禰胞株は、長期間安定に継
代維持され得るので再現性の高い測定結果が得られる。

本発明のと）ＩＬ−２を培養菌体から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体を集め、菌体を塩酸グア
ニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衡液に懸濁し、冷所
で攪拌したのち、遠心分離により工Ｌ−２を含む上６′
を面を得る方法、あるいは籟使■液に懸濁し、超音波処
理、リゾチームおよび（または）油結融Ｗｆ−によって
菌体全破［鏝したのち、遠心分離により工Ｌ−２全含む
上澄液金得る方法などが適宜用い得る。

上記上Ｉσ液から工Ｌ−２を分離、積装するには、自体
公知の分離、精製法ｔ−適切に組み合わせて行うことが
できる。これらの公知の分離、精製法としては、塩４Ｊ
＋や浴謀沈鹸法などのＺ′＋５鮮度を利用する方法、透
析法、限外ｐ過法、ゲ／Ｉ／ｌＪ１過法訃よび５Ｄ８−
ポリアクリルアミトゲ１ｖｉｌ気泳動法などの王として
分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和８１：を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法。

等電点電気泳動法などの等電点の差金利用する方法など
が挙け°られる。特に、ヒトエＬ−１蛋白質は高い疎水
性を有しているので、疎水性カラムクロマトグラフィー
とりわけ逆相糸カラムを用いる高連取体クロマトグラフ
ィーは該蛋白質の精製に極めて有効である。

例えば、ヒト１Ｌ−２をコードする迩伝子を含有する大
腸菌全培養して得られる菌体を塩酸グアニジン（好まし
くは２Ｍ〜８Ｍ（７）Ｚ度で用いる）などの蛋白質変性
剤に懸濁させ、撹拌後遠、Ｕ分離によシ上澄液を集める
。上澄液をそのままあるいは限外沖過装置などによシ濃
縮して透析し、生じた沈澱を遠心分離により除き、得ら
れる上澄液を、たとえばジエチμアミノエチμセルロー
ス　［Ｄ　Ｅ５２セμロース（ワットマン社製、アメリ
カ）カラムなと］ヲ用いて陰イオン交換クロ叫グヲフィ
ーを行い活性画分を集める。

次いで、活性画分を限外か過装置を用いて濃縮したあと
、たとえばＮ　、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド
架橋アリμデキストフンたとえばセファクリ／’Ｓ−２
００（ファルマシア社製、スエーデン）カフム等葡用い
るゲｙｖｐ過を行う。活性画分を集め、ついで前記した
高速液体クロマトグラフィーを行う。このような方法に
より、本発明の非グリコＶμ化ヒトＩＬ−２を収得する
ことができる。

なお、ここで品速ｉｔｌクロマトグフフィーに用いる逆
相糸カラムとしては、例えばアルキル化（Ｃ，〜、８程
度）ケイ素のものが挙げられる。浴出溶媒としては、Ｃ
□〜６の低級ブルカノール（エタノール、グロバノーμ
など）やア七ト二トリルが有利に使用でき、ｐＨ１，５
〜４のものが好ましい。

溶出速度は０　、１−１００　ｇ？／ｍ１ｎｌｌ好Ｉし
い。

ここで得られるヒトエＩ、−２蛋白′Ｒ溶液は必要によ
りこれｔＳ結乾燥により粉末とすることができる。凍結
乾燥に際しては、ツルピトーμ、マンニトール、デキス
トロース、マμドース、グリセロ−μ、ヒト血清１ルプ
ミン（ＨＳ　Ａ　）　ｉ＞どの安定剤を加えることがで
きる。

本発明で得られると）ＩＬ−２蛋白質は工Ｌ−２依存性
マウス輔胞を用いて放射性チミジンの取込みを指標とす
る工Ｌ−２活性測定において、ｌＸ１Ｏ’ｕ／＃ｙ以上
の比活性を示すものである。

本発明によれば、２×１０’Ｕ／ｑ以上、３Ｘ１０’Ｕ
／りにも達する比活性を示す高純度の非グリコジル化ヒ
トＩＬ−２蛋白質を得ることができる。

なお、ここで工Ｌ−２の活性としての単位（Ｕ）の非出
方法は以下のようにして行った。

すなわち、■Ｌ−２濃度に依存して増殖するマウス細胞
株を浮遊した培地に工Ｌ−２ｔ−含む検体を加えて培養
し、該細胞株の増殖をトリチウムチミジンの継送を指標
としてめた。目的とする倹体中のユニット＜Ｕ）Ｊ４−
出のためには、常に標準ＩＬ−２（１ｔＪ／解ｔ）ｔｌ
−並べてアッセイ會実施して、その比率からユニットヲ
算出した。

具体的には、とトエＬ−２１に含有するコンディション
ドメジウム？：含む２０％ＦＣ８加ＲＰＭ工１６４０培
地中で、３１″Ｃで５％ＣＯの存在下に継代維持された
工Ｌ−２依存性マウス細胞株（ＨＫ　Ｃ３）　＋　Ｈｌ
ｎｕｍａら、バイオケミ力〃・バイオフイジカμ・リサ
ーチ・コミュニケイシ目ンズ。

第１ｏ　？巻、３６３貝（１９８２年）〕を無血清ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地を用いて２回洗浄し、２０％ＦＣ８
加ＲＰＭ工　１６４０培地に６×１０　個／　Ｍｅにな
るように杏浮遊する。

ＩＬ−２を含む資料５０μｅを９６穴平底マイクロタイ
タープレート（ヌンク社、デンマーク）の第１列目の穴
に入れ、５０μｅずつの２０％Ｆｃｓ　／ＪＩＲｐ［１
６４０培地金用いて第１２列目まで順次２倍段階希釈系
列を作成後、上記ＮＫＣ３細胞浮遊液を５０μｅずっ各
穴に分注し、３７”Ｃで５％Ｃ０２の存在ｒに２４時間
培養する。培養２０時間目に、各穴に１μＣ１ずつトリ
チウムチミジン（アマｐジャム社、イギリス）を添加し
てさらに４時間培養を継続後、セルハーベスタ−（フロ
ー社、アメリカ）を使用して細胞をガラスフィルター上
に回収し、液体シンチン−ジョンカウンターを用いてト
リチウムチミジンの取込全測定する。測定に際しては標
準工Ｌ−２標品について惰弱と同一の操作全行い、トリ
チウムチミジンの取込ｔ：３１１１定する。

ユニッ）（Ｕ）の計算はジャーナル・オプ・イムノロジ
ー、第１２０巻、２０２７頁（１９７８年）に準じてプ
ロビット変換法により行う。すなわち、標準ＩＬ−２標
品（ヒト末梢血リンパ３よｔ−５Ｘ１０６１１＆　／　
ｔｘｔとなるように１０％ＦＣ８加ＲＰＭ工　１６４０
培地に浮遊し、コンカナバリン−Ａ４０Ｉｔｇ　オよび
１２−０−テトフデカノイルホルポーｔｖ−１３−アセ
テート１５　ｎｇ　／ｇｌｋ＆加して、３７’Ｃで５％
ＣＯ２の存仕下に４８時間培養した培養液の遠Ｈｕ上清
ｆ、ｌｔｒ／ｇ？と定める）の希釈系列のうち最大値の
取込を１００％として、各希釈段階の取込値の割合（％
）をＪ１μする。得られた数値を正規確率紙にプロット
し、５０％の取込を示す希釈倍数全作図からめる。同様
にして工Ｉ、−２ｔ−含む各唯倉についても５０％の取
込を示す希釈倍数をめる。

１材の工Ｌ−２濃度（Ｕ／ｙ／）は次式に従って計算さ
れる： なお、本ＭＭ法によってめたヒト末梢血から得られた天
然の工Ｌ−２の比活性は、２９．０００〜７０．０００
Ｕ／ｌであり、本発明の非グリコジル化とトエＬ−２蛋
白質とほぼ同等の比活性を示した。

本発明の非グリコジル化ヒトエＬ−２＊白′Ｒは、好ま
しくは第３図に示すアミノ酸第列し該図中、ＸはＭｅｔ
または水素金示す〕からなるポリペプチド（…）を含有
するものである。

本発明により製造されるヒ）ＩＬ−２蛋白質はＦ記の性
状を有する。

１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミトゲμ電気泳動で均一で
あり、水沫による分子ｍ測定値は１５．０００±１００
０ダμトンである。

２）アミノ末３゛萄アミノ酸としてアフニンまたはメチ
オニンを有する。

３）カルボキン末端アミノ酸としてスレオニンを有する
。

４）正常なＴ細胞やナチュラルキラー細胞をその機能を
保持させたまま増殖させる活性を有する。

本発明により製造されるヒＬ工Ｌ−２蛋白賀は、突鹸す
ムフス試験しヘモスターシス、第７巻。

１８３頁（１９７８年）〕陰性であシ、夾イ”１蛋白質
、発熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として安
全に使用される。

本発明により得られる非グリコシμ化ヒトエＬ−２蛋白
質は、低毒性で、正常なＴ　Ｊｉｆｆ胞やナチュラルキ
ラー細胞をその機能全保持させたまま増ＩＡ口させる活
性を有する。したがって、本発明の工Ｌ−２蛋白質は、
ＴｉＩ胞やナチュヲμキフー細胞をインビトロで長期に
わたり増殖、継代したシフローン化するのに使用できる
。なお、この性質を利用してヒトエＬ−２の活性を測定
することができる。

さらに、本発明のヒトエＬ−２＆白質は、たとえばｌｆ
ｆ１瘍抗原ｆｆ：認識し、破壊する抗原特異的なキラー
Ｔａ胞や抗原ｇ作の経験の有無と無門係に和賜を殺す能
力をもつところのナチュヲ〃キフー細胞全インビトロで
選択的に増殖させることができ、またこのキブーＴ細胞
葡生体へ移入する際に、本究明のヒトエＬ−２＊同時に
接種することにより、その抗ルｈ瘍効果を増大させるこ
とから、温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、犬、
ネコ、ブタ。

ウマ、ヒツジ、ウシ、人なと）の嘘瘍の予防、治療や免
疫機能低「疾患の治療のために用いることができる。

本発明のヒトエＬ−２蛋白質は高純度に積製さ鎮 れているの乃原性がなく低毒性である。

本発明のヒトエＬ−２蛋白質を腫瘍の予防、治療剤とし
て用いるには、当該蛋白質を自体公知の担体と混合柿釈
して、たとえは注射剤、カプセル剤などとして非経口的
に−）たは妊口的に投与することができる。式らに、前
述したようにインビトロで増殖させたキラー１゛細胞や
ナチュラルギフー州胞と共にまたは単独で使用すること
ができる。

本発明のヒトエＬ−ｚ蛋白質は、公知の天然から分離さ
れ念とトエＬ−２と実質的に同じ生物活性を有するので
これと同様に使用することができ、和服の工Ｌ−’ｌ受
答体との解離尾畝がきわめて小さいこと２７）ら、価く
小屋の投与で良い。

Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用するために
は、本発明のヒトエＬ−２を約０．０１〜１ユニツト／
ｌｘｌ、好ましくは約０．１〜０．５ユニツト／＃ｌの
Δ度で培地に添加して用いることができる。

Ｔ　＋１４１１胞をインビトロで増殖させる目的に使用
する具体例としでは、たとえば、２０％ウシ胎児血清を
含むＲＰＭ工　ｊ６４０培地にヒト末梢血よｐ分離した
Ｔ細胞（ＩＸ１０６個／Ｎｌ）およびＸ線（１５００ラ
ンド）　ｌｉ（＋射したＢ＋１４１１胞トランスフオー
マント（ＩＸＩＯ個／ゴ）を加えて３７″０゜５％ＧＯ
）存在下で３日間リンパ球混合培養を行なって得られる
アロ抗原感作Ｔｉ１ｌ胞を含む細胞浮遊液に本発明の工
Ｉ、−２蛋白質を０．１〜０．５ユニツ）／Ｉｌの頭皮
で約−週間ごとに培地交換しながら約１か月間培養を続
ける方法などが挙けられる。

下記実施例に開示している形質・伝換体、大腸―Ｅ、　
ｃｏｌｉ、　ＤＨＩ／ｐＴＦ４は財団法人究酵研死Ｉ３
１「（工ｎｅｔｉｔｕｔｅ　Ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉａｎ、０ｓａｋａ）に工ｒｏ−１４２９９として１
６託されている。

なお、本願明細みおよび図面において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、工ＵＰＡＣ−工　Ｕ　Ｂ　
Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を第１
表に挙ける。また、アミノ酸に関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする
。

第　１　表 Ｄ　Ｎ　Ａ　：　デオキシリボ核酸 ＣＤＮＡ：　４Ｎ補的デオキシリポ杉龍Ａ　：　アデニ
ン Ｔ　：　チミン Ｇ　：　グアニン Ｃ；　シトシン ＲＮＡ　：　リボ核酸 ｍＲＮＡ：　伝々リボ核酸 ｄＡＴＰ：　デオキシアデノンン三リン酸ｄ’ｌ’ＴＰ
　：　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ、デオキシグ
アノシン三リン酸ｄＣＴＰ：　デ゛オキシシチジ７三リ
ン酸ＡＴＰ　：　アデノシン玉リン酸 ＥＤＴＡ：　エチレンジアミン四耐−酸ＳＤＳ　：　ド
デシ／１／硫酸ナトリウム０１４　：　グリシン Ａｌａ：　アフニン Ｖａｌ：　バリン Ｌｅｕ：　ロイシン １１ｅ：　インロイシン Ｂｅｒ：　セリン Ｔｈｒ　：　スレオニン Ｃｙｓ：　シヌテイン ’／２Ｃｙ８：　ン＼：−フシスチン Ｍｅｔ　：　メチオニン Ｇｌｕ　：　グルタミン〔俊 Ａ８ｐ：　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　：　リジン Ａｒｇ　：　アルギニン Ｈｉｓ：　ヒスチジン ＰｈｅＨフェニールアラニン Ｔｙｒ：　チロシン Ｔｒｐ：　）リグトラ１ン Ｐｒｏ　：　プロリン Ａ８ｎ　：　アスパラギン Ｇｌｎ　：　グルタミン 実施例１ （１）　ヒトエＬ−２ｔ？コードするｍＲＮＡの分離ヒ
ト末梢血より調製したリンパ球を１２−０−テトヲデカ
ノイルホルボー／ｌ’−１３−アセテート（ＴＰＡ　）
（１５ｎｇ／ｇｔ）とコンカナバリンＡ（４０μｇ／ｇ
？）を含むＲＰＭ工　１６４０培地（１０％の牛脂治児
血清衛含む）中、３７°Ｃで培養し、■Ｌ−２を藺導さ
せた。２４時間後、この誘尋したＩ　Ｘ　１０１０．（
固のヒトリンパ球を５Ｍグアニジンチオンアネート、５
％メルカプトエタノール、５　Ｑ　ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ
ｌ　ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｍＭ中でテフロ
ンホモゲナイザーによって破壊変性した後Ｎ−フウロイ
リ〜ザμコシン酸ナトリウムを４％になるように加え、
均質化した混合物を５．７Ｍ塩化セシウム溶液（５，７
Ｍ塩化セシウム、　Ｑ　、　ｌ　Ｍ　ＥＤＴＡ）　６Ｍ
ｔ上に重層し、ベックマン５Ｗ２８のローターを用いて
１５°Ｃで２４００Ｏｒｐｍ４８時間遠心処理を行い、
ＲＮＡ沈誠を得た。

このＲＮＡ沈鐙ｔ０．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈敵させ
、１０ｑのＲＮＡ’（ｙ−得た。このＲＮＡを高塩溶液
ＣＯ、５Ｍ　ＮａＣ１，ｉＱｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ
７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３％　５ＤＳＪ中でオ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）
を含むｍｆ（ＮＡ　ｆ低塩溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
−１１０１・ｐＨ７，６，１ｍＭＥＤＴＡ、ｏ、ａ％８
ＤＳ、）で溶用させることにより、ポリ（Ａ）？含むｍ
ＲＮＡ’１ｔＪＯμｇを分取した。

このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０．２ｄの
溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７，６，２ｍ
ＭＥＤＴＡ、Ｑ、３％５ＤＳ）に溶かし、６５℃で２分
間処理して１０〜３５％シｇ糖密度勾配遠む処理（ベッ
クマン５ｗ２Ｂのローターを用いて２０°Ｃ９２５００
０ｒｐｍで２１時間遠心分離）することにより分画して
２２分画を得た。この各分画につきＲＮＡの一部スつを
、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される
蛋白質中の工Ｌ−２活性を測足し、分画１１〜１５（沈
降定数８Ｓ〜１５Ｓ）に工Ｌ−２の活性を検出した。こ
の分画の工Ｌ−２ｍＲＮＡは約２５μｇであった。

＋ｉｉ）　単鎖ＤＮＡの合成 上記で得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００μ
ｅの反応液（５μｇのｍＲＮＡ　、　５０μｇオｌＪゴ
（ｄＴ）ｉ００ユニットの逆転写酵素。

ｌ　ｍＭずつのｄＡｌｏＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ、８ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ　ＫＣＩ、　
１０１１１Ｍジチオヌレイトール、　５ＱｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−）１ｃＩ　ｐＨ８，３）中で４２℃、１１祐１用イ
ンキユベートした後に、フ２．４ ｘ　／　−ｌＬＡ＋ｍ　ｋ白し、０　、　Ｉ　ＮノＮｅ
、（ＪＨＴγＯ’Ｃ。

２０分処理してＲＲＡ’；（分解除去した。

（１１リ　二重鎖ＤＮＡの合成 ここで合成された単鎖の相補Ｄ　ＲＡを５０ｔｔｌｌの
反応ｒ［（（＋ｎＲＮＡとオリゴｄ’ｌ’？］ｌ−含ま
ない以外は上記と同じ反応ζ代）中で４・２°Ｃ２１１
６間反応させることにより二重鎖ＤＮＡ１ｙ−合成した
。

０Ｖ）ｄＣティルのイｊ加 この二重鎖ＤＮｈにヌクレアーゼＳ　１ｔ５０μｅノ反
応１ｒｉ　（二Ｎ＃Ａ　Ｄ　Ｎ　ＡＯ、Ｉ　Ｍ　ｌｔｍ
＋トリウムｐＨ４，５，０，２５Ｍ　ＮａＣ１，１，５
ｍＭ　ＺｎＳＯ４，６Ｑユニットの８１ヌクレアーゼ）
中で室温３０分間作用させ、フェノールで隙蛋白し、エ
タノールでＤＮＡ１沈Ｉｆ３．させた後、これにターミ
ナルトフンヌフェフーゼｆ？：５０μｅの反応液（二重
鎖ＤＮＡ　。

０．１４Ｍカコジｌｖ酸カリ、０．３ＭＴｒｉｓ（塩基
）ＰＨＣ６，２ｍＭジチオヌレイト−／’　ｒ　１ｍＭ
　Ｃ。

Ｃ１２，０−１５ｍＭ　ｄｃＴＰ、３０ユニツトターミ
ナルトヲンスフエラーゼ）中で３分間３７°Ｃで作用さ
せ二重ＭＤＮＡの３）両端に約１５個のデオキシンチジ
ンｉｔ伸長させた。これらの一連の反応で約３００ｎｇ
のデオキシシチジン鎖をもった二重鎖ＤＮＡを得た。

ＩＶ）　大腸菌グラスミドの開裂ならびにｄＧティμの
付加 一万、１０μｇの大腸菌グラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制限酵素Ｐｓｔ工を５０μｌの反応液（１０ｔｔｇ　
ＤＮＡ、５０ｍＭ　Ｎａ、Ｃ１，６ｍＭ　Ｔｒｉｅ４Ｃ
１・ｐＨ７、４，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノ−／Ｌ／、１００μｇ／Ｍｌ牛血清アμ
プミン、２０ユニツトのＰｓｔ工）中で３時間３７°Ｃ
で作用させてｐＢＲ３２２ＤＮＡ中に１ケ所存仕するＰ
８ｔＩ認誠部位を切断し、フェノールで除蛋白した後、
ターミナμトフンスフェフーゼを５０μｌの反応液（Ｄ
ＮＡ　１０μｇ、０．１４Ｍカコジｌｖ酸カリ、０．３
ＭＴｒｉｓ　−塩＆　Ｉ）”　７”　２ｍＭ　ジチオス
レイトール。

１ｍＭ　Ｃ６Ｃ１２，０，１５ｍＭ　ＧＴＰ、３０ユニ
ツトターミナルトフンスフエヲーゼ）中で３分間３Ｔ”
Ｃで作用させ上記グラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの３′
両端に約１７個のデオキシグアニン鎖ヲ延長させた。

６ＩＩＪ　ｃＤＮＡの会合ならびに大腸山の形質変換こ
のようにして得られた合成二重１ＤＮＡ　０．１μｇと
上記グラスミドＩ）ＢＲ３２２，０，５μｇを０　、　
ＩＭ　Ｎａ１１．　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ４Ｃ１ｐＨ７，
６，１ｍＭεＤＴＡ　よりなる溶液中で６５℃２分間、
４５°Ｃ２時間加熱しその後除冷して会合させＥｎａａ
らの方法〔Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９６　、４
９５　（１９７５））に従って大腸菌ＭＭ２９４を形′
Ｒ転換させた。

υ１ｌｃＤＮＡ＠有プフヌミドの単離 このようにして約２０，０００個のテトフサイクリン耐
性株が単離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロー
スフィルターの上に固定した。次いで’ｌ’ａｎｉｇｕ
ｃｈｉ　らの報告ＣＮａｔｕｒｅ、　３０２　、３０５
（＋９８３）：）Ｉ、た工Ｌ−２のアミノ酸配列をもと
にしてアミノ酸ＮＱ　７４〜７８　（Ｌｙｓ　−Ｈｌｓ
−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ−Ｃｙｅ　）およびアミノ酸Ｐ＆Ｌ
＋２２−１２６（ＴｈｅｌＰｂ、ｅ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｕ）に対応する％ｊ’＋Ｉｓ配列（”ＡＡＡ　ＣＡ
Ｔ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　’１Ｙ７ｒぎおよび”’ＡＣＡ　
ＴＴＣＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＡＡ３’）をトリエステル法
ＣＣｒＢａ＋　Ｒ１らＰｒｏｃ＋　Ｎａｔｉ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７５　＋５７６５　（１９
７８））によシ化学合成し念。

このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチド
カイネースを用いて５０μｅの反応液（オリゴヌクレオ
チド０．２０棺　、５０ｍＭＴｒｉｓ・■（１ｐｍ　８
．０．　１０ｍＭ　ＭｇＧ１２　、１０ｍＭメルカグト
エクノーμ、５０μＣｉγ−ＰＡＴＰ、３ユニツトＴ４
ポリヌクＶオチドカイネース）中で１時間３７゛Ｃで反
応さぜ、５′末端を　Ｐで標識した。

この標識されたオリゴヌクレオチドをグローブ゛として
　Ｌａｗｎ　らの方法Ｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ８
Ｒｅｓ、＋９．６１０３（１９８１））に従って上記の
ニトロセルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会合
させ、オートヲジオグフフイ−によって上記二種類のオ
リゴヌクレオチドノロープに反応する白株を４個単離し
た。これらの菌株の各々の菌体からグラスミドＤＮＡを
アルカリ法Ｌ　ＢｉｒｎｃｏｉｍＬＣ，＆　Ｄｏｌｙ＋
　Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、―工１１
５１３　（＋９７９））によって単離した。次にグラス
ミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔ工により切り出し
、分離したグラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長い断片を含むものをえらび、このプフスミドｔ−ｐ工
ＬＯＴ　１３５−８と名づけた。このグラスミドの制限
酵素地図を第１図に示す。

次にこのｐ工Ｉ、０Ｔ−１３５−８プフスミドに挿入さ
れたｃＤＮＡの配列の一次構造（塩基配列）をジデオキ
シヌクレオチド法とＭａｘａｍ　−Ｇ１１ｂｅｒｔ　法
によって決冗した。その−次構造は第２図に示した。

この塩基配列により規定されるペプチドはその合成開始
信号（Ｎａ６４〜６６のＡＴＧ）から始まって１５３個
のアミノ酸から成る。この中Ｎ末端から２０個のアミノ
ｉ稜はシグナルペプチドと考えられる。上記の一次構造
から、このグラスミドはヒトエＬ−２蛋白質をコードす
る塩基配列を全部持っていることが判明した。この事実
によってグラスミドに組み込まれた遺伝子を他の発現用
プラスミドに組み込むことにより工Ｌ−２蛋白質の任意
のポリペプチドを生産することができる。

実施例２ 実施例１で得たプラスミドル工ＬＯＴ　１３５−８を制
限酵素Ｈｇ１Ａｌで切断し、１２９４　ｂｐの工Ｌ−２
遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片＠Ｔ４
ＤＮＡポリメヲーゼで処理した後、アラニンのコドンＧ
ＣＡとメチオニンのコドンＡＴＧｆ有するＣ１ａ工のリ
ンカ−、ＣＧＡＴＡ　ＡＴＧＧＣＡ　を結合させＣ１ａ
工、Ｐｓｔ工処理した後、ｒｔｒＨ７７１のＣ１ａ工＋
　Ｐ５ｔ　工５ｉｔｅ　に組み込み、得られた発現用デ
ヲスミド１ｐＴＦ４と命名した（第４図）。

実施例３ 実施例２で得たプヲスミドｐＴＦ４’ｉ用いてＣｏｈｅ
ｎらの方法しＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ。

ＵＳＡ、６９．２１１０（１９７２））に準じて大腸菌
ＤＩＩ１１′に形質転換させ、当該デフスミドを含む形
質転換体Ｃ１５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄ■１
／ｐＴＦ４）を得た。

実施例４ 実施例３で得たＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＩ　１　／ｐＴＦ　
４　”ｃ２５０ｇ？容三角フラスコ内のバクト・トリプ
トン（ディフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）１％。

パクト・イーストエキヌ（ディフコ・フポフトリーズ、
アメリカ）０．５％１食塩０．５％およびテトフサイク
リン７μｇ／　ｚｌ　ｆ含む液体培地（ｐＨ７，０）５
０ｒｘｔＫ接種して３７’Ｃで１晩回４云振盪培養した
。この培養ａにをカザミノ酸０．５％、グルコース０．
５％およびテトフサイクリンＴμ（＜／ｒｔｌを含むＭ
９培地２．５ｇの入った５ｇ容ジャーファーメンターに
移し３７℃で４時間、ついで３−β−インドリμアクリ
μ酸（２５μｇ／ｇｔ）？添加して、ざらに４時間通気
攪拌培養して培養ｆ＆２．５４を得た。この培養液を遠
、む分離し、６１体を集め、−８０℃で凍結して保存し
た。

実施例５ 実施例４で得た速結保存菌体１２．１ｆを７Ｍ塩酸グア
ニジン、　０　、　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ４Ｃ１ｋｓむ抽出
液（ｐＨ７，０）１００ｇ／に均一に懸濁し、４℃で１
時間攪拌した。この溶菌液ｔ−２８，０００）１で２０
分間遠心分離して上ｉ？１９３　ｍｌを得た。

実施例６ 実施例５で得た上清ｔｌ−０、０１１［Ｔｒｉ９・■Ｃ
１緩衝液（ｐＨ８，５）に対して透析後＋９，０ＯＯＸ
ｆで１０分間遠心分離して透析上清９４ｓｒ？を得た。

この透析土浦ｔ−０、０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ＩＩ
ｌ衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したＤＢ　５２（ＤＥＡ
Ｅ−セルロース、ワットマン社製、イギリス）カラム（
５０Ｍ１容）に通して蛋白を吸着させ、ＮａＣ１濃度直
線勾配（０〜０　、１５Ｍ　ＮａＣ１，Ｉｎ）ｔ−作成
しテＩＬ−２を溶出させた。活性画分５３屑？をＹＭ−
５メンブフン（アミコン社製、アメリカ）ｔ−用いて４
．８ｙｄＶＣ９ｌ縮し、０　、　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８，０）−１ｉｉ　ＮａＣ１緩向液で平衡化
したセフ１クリ／ｖ８−２００（７アμマシア社製、ス
エーデン）カラム（５００ｍ／容）を用いてゲ／ｌ／沖
過を行った。活性画分２８ｍ＋？ｔ−ＹＭ−５メンズフ
ンで２．５ａ工に濃縮した。得られた濃縮液をウルトフ
ボアＲＰ８Ｃ（ア〃テックス社製、アメリカ）カラムに
吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系ｋｉ容
出溶媒とする高速液体クロマトグツフィーを行った。

カラム、つμトフボアＲＰ８Ｃ（４，６Ｘ７５ｍ）；カ
フム温度、３０℃；溶出溶μＡ、０．１％トリフ〃オロ
＃酸−９９，９％水；溶出溶媒Ｂ。

０．１％トリフρオロ酢酸−９９．９％アセトニトリ／
Ｉ／；溶出グログツム９口分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−
２５分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５
５％Ｂ）−４５分（３０％Ａ＋１０％Ｂ）−４８分（１
００％ｇ）；８出迎度、０．８ｇ／／ｗｉｎ　；検出波
長、２３０　ｎｕｌｏ　本条件丁で保持時間約３９分の
活性画分を集め、非グリコシμ化ヒトエＬ−２蛋白質０
．５３＊［−比活性。

３０．０ＯＯＵ／ｗｆ、出発材料からの活性回収率。

３０．６％＋　蛋白質の純度、９９％（デンシトメトリ
ーによる）〕を含む溶液１０ｖｔｌｋ得た。

上記溶液を棟結乾燥に付し、白色粉末を得た。

本粉末の比活性は２６，０ＱＯｕ／Ｉｍｇであった。

実施例７ 冥流側６で得たヒトエＬ−２蛋白質について以■の請性
質をム１−べた。

（１）単−注： フエムリの方法〔Ｎａｔｕｒｅ　、　２２７　、６８０
（１９７０））に準じて５ＤＳ−ポリアクリルアミドス
ラブゲル電気泳動を行ったあとクマジープリリアントプ
ルーで染色した結果、該ヒトエＬ−２蛋白質は単一のバ
ンドを示した（第５図参照）。バンドの位置は還元条件
下でも非運九条件下でも変らなかった。

（２）分子量： 該ヒトエＬ−２蛋白質の分子ｙλは、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドスヲブゲ／Ｌ／’４気泳動から約１５．００
０ダμトンと赫出された（第５図参Ｉｆ（）。

（３）アミノ酸組成二 該ヒトエＬ−２蛋白′Ｒ２０μｇｔ−ガラス製加水分解
用試験管にとシ、４％チオグリコ−／Ｌ’酸をもむ定沸
点塩酸を加えて、減圧Ｆに封管したのち、１１０°Ｃで
２４．４８．７２時間加水分解した。

加水分解後、開管し、減圧下に塩酸を除去し、賎渣ｔ−
０，０２Ｎ塩酸に溶解して日立ＥＡ８３５型アミノ酸分
析計によりアミノ酸分析を実施した。ジメチンおよびシ
スティンはハースの方法い［ｅ　ｔ　ｌ＊ｃｘｉｓｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌ　、　ＩＩ　、　１９７（１９６γ）
〕に従い、該ヒトエＩ、−２蛋白質を過ギ酸酸化したの
ち、減圧下、定班点塩酸中で２４時間加水分解して、ア
ミノ酸分析計によりシスティン酸として定量した。

アミノ酸分析値は、２４．４８および７２１１Ｑ間の加
水分解で得られた値を平均してめた。但し、セリンおよ
びスレオニンの値は加水分解時間を口詩間に外挿してめ
た。その結果を第２表に示す。

（以下余ｆｆＪ’） 第　２　衣 アミノ酸　モｐ％ Ａｓｐ／Ａｓｎ　８．８ ’ｌ’ｈｒ　９　、３ Ｓｅｒ　５．７ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　１３．７ Ｐｒｏ　３．４ Ｇ１７　１．７ Ａｌａ　３　、８ ％Ｃｙｓ　２．３ Ｖａｌ　３．Ｉ Ｍｅｔ　３．７ エｌｅ　６・３ Ｌｅｕ　１６　、３ Ｔｙｒ　２　、３ Ｐｈｅ　４．５ Ｌｙｓ　８　、３ Ｈ１ｓ　２．５ Ａｒｇ３．１ Ｔｒｐ　ｌ　、　１ （４）Ｎ末端アミノ酸配列： 該ヒトＩＬ−２蛋白質３４μｇＫ気相プロテインシーク
エネーター（アブフィト・バイオシステムズ社Ｎ４７０
Ａ型、アメリカ）を用いる自・助エドマン分解法を適用
して、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒ
ダントインアミノ酸（ＰＴＨ−アミノＩＩ’）はミクロ
パック５Ｐ−ＯＤ８カラム（パリアノ社製、アメリカ）
を用いる高速液体クロマトグラフィーにより国定した。

各ステップで検出されたＰＴＩｉ−アミノ酸を第３衣に
４くす。

（ＪＸ千余白） 第３衣 ヌテップ　検出されたＰＴＨ−アミノ酸ｌ　Ａｌａ ｅｔ ２　Ｐｒ。

ｌａ ３　Ｔｈｒ Ｐｒ。

４　Ｓｅｒ ｈｒ ５　５ｅｒ ６　５ｅｒ ７　Ｔｈｒ ８　Ｌｙｓ ９　Ｌｙｓ ｌｏ　Ｔｈｒ ｌｌ　Ｇ１ｎ １２　Ｌｅ　ｕ １３　Ｇｉｎ ４Ｌｅｕ １５　Ｇｌｕ １６　ｙ １７　Ｌｅｕ １８　Ｌｅｕ １９　Ｌｅｕ 衣中Ｙについては未決定である。

（５）Ｃ末端アミノ１□Ｉ々： 該ヒトエＬ−２１白質３０１１ｇ　全ガフヌ製ヒドフジ
ン分解用試Ｉφ２管にとり、無水ヒドラジノ０．０５Ｉ
Ｉｔを加えて減圧下に封管したのち、１００°Ｃで６時
間加熱した。得られたヒドフジン分解物全凍結乾燥した
のち、蒸留水にｍｍした。この溶液にベンズアルデヒド
ｆｃ添加し、室温で１時間４’：ｉ　拌Ｌ、遠心分離を
行なったのち、上清全書た。この上清を凍結乾燥し、日
立製８３５型アミノ酸分０１計によジアミノ酸分析を実
施した。その結果、スレオニンのみが検出された。

（６）トリプシン消化ペプチドマツプ：該工Ｌ−２係品
１５μｇをトリプシン（ワシントン社製、アメリカ）０
．４μｇと０．０２Ｍ炭酸水素ナトリウム１２０り中、
３７　”Ｃ、１８１ｈｌｌｌ１反応させた。反応液に２
−メルカプトエタノール５μｅを添加してさらに３Ｔ“
°Ｃで２時間反応したのち、反応液に１％トリフμオロ
Ｑｌｉｌｖ７５μｅｔ加え反応を停止させた。得られた
反応液ｆｒ、’Ｆ記の条件下での高速液体クロマトグラ
フィーによシ分析して、第６図に示すマツプを得た。

カフム：ウルトラスフェアーオクチＡ’（５μｍ。

４．６×２５０ｍＩ；アμテックス社製、アメリカ）。

カラム温度：３０°Ｃ 移動相；Ａ液、０．０２％トリフルオロｉｔ＋酸−９９
，９８％水 Ｂ液、０．０２％トリフルオロ酢酸− ９９，９８％８％アセトニト リル（９５％ＡＫ＋５％Ｂｒ＆）−４０分（３０％ｂｉ
ｔ乏＋７０％Ｂｉ良）。

溶出迎ＩＸ　：　１　、ＯｔｌＩｌ１分。

検出法ニア０レスカミ７（ロッシュ社硬、アメリカ）ｔ
−用いる螢光法ＣＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、＋６７．４３８（＋９７５））。

（７）　ＩＬ−２依存性細胞株に対する粘性：Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｅ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、＋…
、３６３　（１９８２）　に記載の方法に準じて、本発
明の非グリコシμ化ヒトエＬ−２ｆｆｉ白質の活性を測
定した結果、該工Ｌ−２６白質は工Ｌ−２依存注マウス
則胞株（Ｎ　Ｋ　Ｃ３９，ｔｓ　７　ｌ”ｊ参ｊ１（イ
）およびヒトミｔ胞株（第８図＃１Ｋ（）のいずれに対
してもトリチウムチミジンの取込を促進させる粘性を有
していた。

また、該工Ｌ−２蛋白″ＲをＱ、５Ｕ／ゴになるように
２０％ＦＣ８加ＲＰＭニー１６４０培地中に溶解したも
のに、ＮＨＯ２株を２×１０５個／ｍｅになるように浮
遊してリングロマルチディッシュ（フロー社、アメリカ
）内で３７℃、５％ＣＯＬ。

在任ＦＫ継代培養した。培養２〜３日毎に生細胞数を計
測して、新たに新鮮な上記培養液に再浮遊することを繰
り返した結果、第９図に示すように該ＩＬ−２蛋白質は
ＮＨＯ２株の増殖全長期にわたって維持し得る活性を有
していた。

実施例８　注射用ｄ剤： 実施例〆で得られた非グリコシρ化ヒ）ＩＬ−２蛋白質
含有溶液を、０．０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩爾液（ｐ
Ｈ５，０）で平衡化したＣＭ）ヨパ−Ａ／（東詳ａ痒社
）カラムに無菌条件Ｆで吸着させ、０．１５ＭのＮａＣ
１を含む上記坂爾液で溶出させる。溶出液に０　、１５
　Ｍ　１ｌａｃ１　ｆ適宜加えて希釈し、Ｈ８Ａｆ娃％
になるように添加してメングフンフィμター（口径０．
２２μｍ）を用いて濾過後、得られた炉液な無菌的に１
胃Ｃずつバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用ヒ）
ＩＬ−２を調製する。本注射用製剤は、用時注射用蒸留
水１震ｔに溶解する。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は実施例１６／Ｉｌｌで得たプフス
ミドｐ工ＬＯＴ　１３５−８の制限酵素地図（咽はシグ
ナμペプチドｔコードする部分金、　ω　はＩＬ−２’
ｅコードする部分ｔ−表わす）および−次描造（塩基配
列）をそれぞれ示し、第３図は本発明の非グリコジル化
ヒトエＬ−２蛋白質のアミノ酸配列（１頒中又は、Ｍｅ
ｔまたは水素ｔ−表わす）を示す。第４図は実施例２に
おける発現用プフスミドｐＴＥ’４構築図金示す。第５
図は実施例７（υ。 （２）の８ＤＳ−ポリアクリルアミドスヲプゲ／Ｉ／電
気泳動の結果を、第６図は実施例７（６）のトリ１シン
消化ペプチドマツプを、第７図および第８図は実施例７
（７）のＮ　Ｋ　Ｃ３ｄｉｌｌ胞抹およびヒト削胞林の
トリチウムチミジンの取込に及ぼす本究明のヒトエＬ−
２蛋白質の影響を示す。第９図は実施例７（ＩＪのＮ　
Ｋ　ｃ　３　Ｎ＜ｕ胞株に対する長期４１本代培養の結
果を示す。 第２図 ”’ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＴ
Ｃ’ｒＣＴ’ｌ’ＴＡＡＴＣＡＣ’Ｉ’ＡＣＴＣＡＣＡ
ＧＴＡＡＣＣＩ ＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＧ
Ｇ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＧＣ２
０１ ＡＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　Ｃ
ＴＴ　ＧＴＣＡＣＡ　ＡＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＴＡ
ＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡ
Ａ　八ＣＡ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＧＡＧ
０ ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　Ｃ
ＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＴ
ＴＭＴ　へへＴ　ＴＡＣＡＡＧ　ＭＴ　ＣＣＣＡＡＡ　
ＣＴＣＡＣＣＡＧＧ　ＡＴＧ　ＣＴＣＡＣ八へＴ’Ｉ’
　ＭＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣＡＴＧ　ＣＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ
　ＧＣＣＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＡＭ０ ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　Ｇ
ＡＡ　ＧＡＡ　Ｃ’ｒＣへへへ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡ
Ｇ０ ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　ＭＴ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＣＭ
　ＡＧＣＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＴ　ＣＡＣＴＴＡＡＧＡ　
ＣＣＣＡＧＧ　ＧＡＣＴＴＡ　ＡＴＣＡＧＣＡＡＴ　Ａ
ＴＣＡＡＣＧＴＡ　ＡＴＡ　ＧＴＴ００ ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＴＣＴ　Ｇ
ＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＣＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＡ八
へＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　Ａ
ＣＣＡＴＴ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣ
ＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３゜捺４図 竿５　図 １　２　３ １　井り５ノコシ）ｖＡＬし１ｉＬ−２蛋冶’ｌ（→ト
刊１元、茶罷牛下）２升ダ）ノコン）レカｉＪＩし一２
４冶＊（ンツに５ンＬ、劣←〃十千ン３秦１重背−カ−

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　１０　ｕ／ダ以上の比活性を有する実質的に純
   粋な非グリコジル化ヒトインターロイキン−２蛋白質。
2. （２）　ヒトインターロイキン−２をコードする塩基配
   列を有するＤＮＡを含有する形質転換体を培養し、培養
   物中にヒトインターロイキン−２を生成蓄積せしめ、得
   られるヒトインターロイキン−２含・ｈ液を、疎水性カ
   フムクロマトグヲフィー処坤全含む精製工程で精製する
   ことを特徴とする１０４Ｕ／ｑ以上の比油性全有する実
   質的に純粋な非グリコジル化ヒトインターロイキン−２
   蛋１［の製造法。
3. （３）１０　Ｕ／ｑ以上の比活性を有する実質的に純粋
   な非グリコジル化ヒトインターロイキン−２蛋白質と製
   剤学的に許容される担体、賦形剤または（および）布釈
   剤と全含有する製剤学的組成物。