JP2601199B2 - ヒトインターロイキン−２蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ヒトインターロイキン−２蛋白
質に関する。

【０００２】インターロイキン−２〔以下ＩＬ−２と略
称することもある。なおＩＬ−２は、Ｔ細胞増殖因子
（ＴＣＧＦ）とも呼ばれる。〕は、レクチンやアロ抗原
等で刺激されたＴ細胞によって生産されるリンホカイン
である〔サイエンス，第１９３巻，１００７頁（１９７
６年）；イムノロジカル・レビュー，第５１巻，２５７
頁（１９８０年）〕。ＩＬ−２は、Ｔ細胞をインビトロ
でその機能を保持したまま増殖させ長期間の継代維持を
可能にするほかに、今までに胸腺細胞のマイトージエン
反応を促進したり（コステイミュレーター）、ヌードマ
ウス脾細胞のＴ細胞依存性抗原に対する抗体産生能を回
復させたり（Ｔ細胞リプレーシングファクター）、キラ
ー細胞の分化増殖を促進する（キラーヘルパーファクタ
ー）活性を有すると報告されている〔ザ・ジャーナル・
オブ・イムノロジー，第１２３巻，２９２８頁（１９７
９年），イムノロジカル・レビュー，第５１巻，２５７
頁（１９８０年）〕。

【０００３】ＩＬ−２を利用して、これまでにキラーＴ
細胞やヘルパーＴ細胞、さらにはナチュラルキラー細胞
などのクローンが多数得られている〔たとえば、ネイチ
ャー，第２６８巻，１５４頁（１９７７年）；ザ・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー，第１３０巻，９８１頁
（１９８３年）〕。このようなＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞のクローン化という直接的用途のほかに、ＩＬ−
２を用いてある特殊な抗原、たとえば腫瘍抗原を認識し
破壊する抗原特異的なキラーＴ細胞をインビトロで選択
的に増殖させることができる。このようにして増殖させ
た腫瘍特異的キラーＴ細胞を動物に移入して腫瘍の増殖
を抑制阻止することが可能である〔ザ・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー，第１２５巻，１９０４頁（１９８０
年）〕。また、ＩＬ−２がインターフェロンγの産生を
誘導すること〔（ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー，第１３０巻，１７８４頁（１９８３年）〕や、ナチ
ュラルキラー細胞を活性化すること〔ザ・ジャーナル・
オブ・イムノロジー，第１３０巻，１９７０頁（１９８
３年）〕が知られている。これらの実験事実はＩＬ−２
が抗腫瘍剤として用いられる可能性を示すものである。
ＩＬ−２はまた、胸腺機能を欠如しているヌードマウス
のヘルパーＴ細胞機能を回復させること〔ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・イムノロジー，第１０巻，７１９
頁（１９８０年）〕や、同種細胞に対するキラーＴ細胞
の誘導を回復させること〔ネイチャー，第２８４巻，２
７８頁（１９８０年）〕が知られており、免疫機能低下
疾患への応用も期待できる。しかしながら、ヒトＩＬ−
２は量産が困難であるために、現時点では臨床への応用
が不可能であり、純度の高いヒトＩＬ−２を容易により
安価に大量生産できる技術の開発が望まれている。Tani
guchi らは、ヒトＴ白血病細胞株 Jurkat のＩＬ−２ m
ＲＮＡを素材にヒトＩＬ−２遺伝子をクローニングし、
それから推定されるヒトＩＬ−２蛋白質のアミノ酸配列
を報告した〔ネイチャー，第３０２巻，３０５頁（１９
８３年）〕。その後、Devos らは、ヒト脾臓細胞由来の
ＩＬ−２遺伝子をクローニングして、大腸菌で発現した
ことを報告している〔ザ・ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ，第１１巻，４３０７頁（１９８３年）〕。しか
し、これまではＴＣＧＦ活性を有することによりＩＬ−
２様物質の存在が推定されていたのみで、現実にヒトＩ
Ｌ−２をコードするＤＮＡを含有する形質転換体の産生
するヒトＩＬ−２蛋白質を精製取得したとの報告はな
い。

【０００４】本発明者らは、遺伝子操作技術を利用して
ヒトＩＬ−２遺伝子をクローニングし、得られた組換え
ＤＮＡ分子を宿主に移入してヒトＩＬ−２遺伝子を発現
させ、目的とするＩＬ−２遺伝子を得ることのできる技
術の開発研究を行った結果、実質的に純粋な非グリコシ
ル化ヒトＩＬ−２蛋白質の製造法を確立し、本発明を完
成した。すなわち、本発明は、大腸菌形質転換体の培養
により得られ、ヒト末梢血リンパ球を５×１０^６個／ｍ
ｌとなるように１０％ＦＣＳ添加ＰＲＭＩ１６４０培地
に浮遊しコンカナバリン−Ａ４０μｇ／ｍｌおよび１２
−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート
１５ｎｇ／ｍｌを添加して３７℃で５％ＣＯ_２の存在下
に４８時間培養した培養液の上清を１Ｕ／ｍｌと定める
方法により測定される１０^４Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有
し、エンドトキシンおよび発熱性物質を実質的に含有し
ない、実質的に純粋な非グリコシル化ヒトインターロイ
キン−２蛋白質を提供するものである。本発明で用いら
れるヒトＩＬ−２をコードするＤＮＡは、例えば〔図
２〕中コドン１〜１３３で示される塩基配列のＤＮＡ
（Ｉ）があげられる。このＤＮＡ（Ｉ）は、その５’末
端にＡＴＧまたは〔図２〕中コドンＳ１〜Ｓ２０で示さ
れるシグナルコドンを有していてもよく、３’末端にＴ
ＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有することが好ましく、と
りわけＴＧＡが好ましい。ＤＮＡ（Ｉ）はプロモーター
の下流に連結されていることが好ましく、これらプロモ
ーターとしてトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター，
レックＡ（ｒｅｃＡ）プロモーター，λＰＬプロモータ
ーなどが挙げられ、とりわけｔｒｐプロモーターが好適
である。本発明においては、例えばコンカナバリンＡな
どで剌激されたヒト末梢白血球の培養液からヒトＩＬ−
２をコードするｍＲＮＡを分離し、逆転写酵素などを用
いて単鎖のｃＤＮＡを合成した後、二重鎖ＤＮＡを合成
する。ついで、プラスミドに導入して、例えば大腸菌や
枯草菌などを形質転換させ、これよりｃＤＮＡ含有プラ
スミドを単離することによりヒトＩＬ−２をコードする
二重鎖ＤＮＡを製造することができる。

【０００５】本発明で用いられるヒトＩＬ−２をコード
する mＲＮＡは Hinuma らの方法〔バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジィカル・リサーチ・コミュニケイシ
ョンズ，第１０９巻，３６３頁（１９８２年）〕によっ
て得ることができる。得られたヒトＩＬ−２ mＲＮＡを
鋳型として、逆転写酵素を用い自体公知の方法で、cＤ
ＮＡ鎖を合成し、cＤＮＡを二本鎖ＤＮＡへ変換する〔M
aniatis, T. ら、セル，第８巻，１６３頁（１９７６
年）；Land, H. ら、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ，第９巻，２２５１頁（１９８１年）〕。このＤＮＡ
を、例えばdＧ−dＣホモポリマー結合法〔Nelson, T.
S., メソッズ・イン・エンジモロジー，第６８巻，４１
頁（１９７９年）〕によりたとえばプラスミド pＢＲ３
２２のＰstＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位に組み込
ませる。さらに、例えばヒトＩＬ−２の一部のアミノ酸
配列に対応する塩基配列をもつオリゴヌクレオタイドを
化学合成した後、³²Ｐでラベルしてプローブとなし自体
公知の方法でコロニーハイブリダイゼイション法〔Grun
stein, M., Hogness, D. S., プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ＵＳ
Ａ，第７２巻，３９６１頁（１９７５年）〕；Alwine,
J. C. ら、メソッズ・イン・エンジモロジー，第６８
巻，２２０頁（１９７９年）〕により、テトラサイクリ
ン耐性あるいはアンピシリン感受性のトランスフォーマ
ントの中から求めるクローンを選出する。上記ハイブリ
ダイゼイション法で陽性を示したクローンのＤＮＡの塩
基配列をMaxam−Gilbert法〔Maxam, A. M. ら、プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・ＵＳＡ，第７４巻，５６０頁（１９７
７年）〕あるいはファージＭ１３を用いたジヌクレオチ
ド合成鎖停止の方法〔Messing, J. ら、ヌクレイック・
アシッド・リサーチ，第９巻，３０９頁（１９８１
年）〕により決定し、ヒトＩＬ−２遺伝子の存在を確認
する。次に、得られたクローンからヒトＩＬ−２遺伝子
の全部あるいは一部を切り出し、プラスミド中の適当な
プロモーター，ＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）
塩基配列の下流につないで適当な宿主に導入することが
できる。

【０００６】プロモーターとしては trp プロモーター
などが、宿主としては大腸菌（２９４株，ＤＨ １株な
ど）などが有利に用いられる。なお大腸菌２９４株〔Be
ckman ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ＵＳＡ，第７３巻，
４１７４頁（１９７６年）〕およびＤＨ １株〔Selson,
M. E. ら、ネイチャー，第２１７巻，１１１０頁（１
９６８年）〕はいずれも公知の菌株である。ＤＮＡによ
る宿主の形質転換は公知の方法〔Cohen, S. N. ら、プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・ＵＳＡ，第６９巻，２１１０頁
（１９７２年）〕により実施することができる。このよ
うにして得られた宿主はそれ自体公知の培地、例えばグ
ルコース，カザミノ酸を含むＭ９培地〔Miller, J., エ
クスペリメンツ・モレキュラー・ジェネテックス，４３
１頁−４３３頁（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー，ニューヨーク，１９７２年）〕中で培養さ
れる。trp プロモーターを使用する場合は、それを効率
よく働かせるために、例えば３−β−インドリルアクリ
ル酸のような薬剤を加えることができる。培養は通常１
５〜４３℃で３〜２４時間行ない必要に応じて通気ある
いは撹拌することもできる。かくして生成されるヒトＩ
Ｌ−２の測定にはＩＬ−２依存性細胞株を用いることが
できるが、ヒトＩＬ−２はヒト以外にラットおよびマウ
スなどのＩＬ−２依存性細胞の増殖をも促進することが
知られている〔イムノロジカル・レビュー，第５１巻，
２５７頁（１９８０年）〕ので、ＩＬ−２依存性ヒト細
胞株のみならずラットまたはマウスのＩＬ−２依存性細
胞株を用いることもできる〔ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー，第１３０巻，９８１頁および９８８頁（１９８
３年）〕。特にマウスのＩＬ−２依存性細胞株は、長期
間安定に継代維持され得るので再現性の高い測定結果が
得られる。

【０００７】本発明のヒトＩＬ−２を培養菌体から抽出
するに際しては、培養後、公知の方法で菌体を集め、菌
体を塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に
懸濁し、冷所で撹拌したのち、遠心分離によりＩＬ−２
を含む上澄液を得る方法、あるいは緩衝液に懸濁し、超
音波処理，リゾチームおよび（または）凍結融解によっ
て菌体を破壊したのち、遠心分離によりＩＬ−２を含む
上澄液を得る方法などが適宜用い得る。上記上澄液から
ＩＬ−２を分離，精製するには、自体公知の分離，精製
法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公
知の分離，精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶
解度を利用する方法，透析法，限外濾過法，ゲル濾過法
およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
の主として分子量の差を利用する方法，イオン交換クロ
マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法，アフィ
ニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用
する方法，逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水
性の差を利用する方法，等電点電気泳動法などの等電点
の差を利用する方法などが挙げられる。特に、ヒトＩＬ
−２蛋白質は高い疎水性を有しているので、疎水性カラ
ムクロマトグラフィーとりわけ逆相系カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーは該蛋白質の精製に極めて有
効である。したがって、本発明の精製工程においては、
逆相高速液体クロマトグラフィーを用いる工程が採用さ
れる。

【０００８】例えば、ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子
を含有する大腸菌を培養して得られる菌体を塩酸グアニ
ジン（好ましくは２Ｍ〜８Ｍの濃度で用いる）などの蛋
白質変性剤に懸濁させ、撹拌後遠心分離により上澄液を
集める。上澄液をそのままあるいは限外濾過装置などに
より濃縮して透析し、生じた沈澱を遠心分離により除
き、得られる上澄液を、たとえばジエチルアミノエチル
セルロース〔ＤＥ５２セルロース（ワットマン社製，ア
メリカ）カラムなど〕を用いて陰イオン交換クロマトグ
ラフィーを行い活性画分を集める。次いで、活性画分を
限外濾過装置を用いて濃縮したあと、たとえばＮ,Ｎ′
−メチレンビスアクリルアミド架橋アリルデキストラン
たとえばセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製，
スエーデン）カラム等を用いるゲル濾過を行う。活性画
分を集め、ついで前記した高速液体クロマトグラフィー
を行う。このような方法により、本発明の非グリコシル
化ヒトＩＬ−２を取得することができる。なお、ここで
高速液体クロマトグラフィーに用いる逆相系カラムとし
ては、例えばアルキル化（Ｃ_1-18程度）ケイ素のものが
挙げられる。溶出溶媒としては、Ｃ_1-6の低級アルカノ
ール（エタノール，プロパノールなど）やアセトニトリ
ルが有利に使用でき、pＨ１.５〜４のものが好ましい。
溶出速度は０.１〜１００ml／min が好ましい。ここで
得られるヒトＩＬ−２蛋白質溶液は必要によりこれを凍
結乾燥により粉末とすることができる。凍結乾燥に際し
ては、ソルビトール，マンニトール，デキストロース，
マルトース，グリセロール，ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）などの安定剤を加えることができる。

【０００９】本発明で得られるヒトＩＬ−２蛋白質はＩ
Ｌ−２依存性マウス細胞を用いて放射性チミジンの取込
みを指標とするＩＬ−２活性測定において、１×１０⁴
Ｕ／mg 以上の比活性を示すものである。本発明によれ
ば、２×１０⁴Ｕ／mg 以上、３×１０⁴Ｕ／mg にも達す
る比活性を示す高純度の非グリコシル化ヒトＩＬ−２蛋
白質を得ることができる。なお、ここでＩＬ−２の活性
としての単位(Ｕ)の算出方法は以下のようにして行っ
た。すなわち、ＩＬ−２濃度に依存して増殖するマウス
細胞株を浮遊した培地にＩＬ−２を含む検体を加えて培
養し、該細胞株の増殖をトリチウムチミジンの取込を指
標として求めた。目的とする検体中のユニット(Ｕ)算出
のためには、常に標準ＩＬ−２（１Ｕ／ml）を並べてア
ッセイを実施して、その比率からユニットを算出した。
具体的には、ヒトＩＬ−２を含有するコンディションド
メジウムを含む２０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ １６４０培地
中で、３７℃で５％ＣＯ₂の存在下に継代維持されたＩ
Ｌ−２依存性マウス細胞株（ＮＫＣ３），Hinuma ら、
バイオケミカル・バイオフイジカル・リサーチ・コミュ
ニケイションズ，第１０９巻，３６３頁（１９８２
年）〕を無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて２回洗
浄し、２０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ １６４０培地に６×１
０⁵個／mlになるように再浮遊する。ＩＬ−２を含む資
料５０μl を９６穴平底マイクロタイタープレート（ヌ
ンク社，デンマーク）の第１列目の穴に入れ、５０μl
ずつの２０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて
第１２列目まで順次２倍段階希釈系列を作成後、上記Ｎ
ＫＣ３細胞浮遊液を５０μｌ ずつ各穴に分注し、３７
℃で５％ＣＯ₂の存在下に２４時間培養する。培養２０
時間目に、各穴に１μＣi ずつトリチウムチミジン（ア
マルシャム社，イギリス）を添加してさらに４時間培養
を継続後、セルハーベスター（フロー社，アメリカ）を
使用して細胞をガラスフィルター上に回収し、液体シン
チレーションカウンターを用いてトリチウムチミジンの
取込を測定する。測定に際しては標準ＩＬ−２標品につ
いて資料と同一の操作を行い、トリチウムチミジンの取
込を測定する。

【００１０】ユニット(Ｕ)の計算はジャーナル・オブ・
イムノロジー，第１２０巻，２０２７頁（１９７８年）
に準じてプロビット変換法により行う。すなわち、標準
ＩＬ−２標品（ヒト末梢血リンパ球を５×１０⁶個／ml
となるように１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ １６４０培地に
浮遊し、コンカナバリン−Ａ４０μg および１２−Ｏ−
テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート１５ng
／mlを添加して、３７℃で５％ＣＯ₂の存在下に４８時
間培養した培養液の遠心上清を１Ｕ／mlと定める）の希
釈系列のうち最大値の取込を１００％として、各希釈段
階の取込値の割合(％)を計算する。得られた数値を正規
確率紙にプロットし、５０％の取込を示す希釈倍数を作
図から求める。同様にしてＩＬ−２を含む各資料につい
ても５０％の取込を示す希釈倍数を求める。資料のＩＬ
−２濃度（Ｕ／ml）は次式に従って計算される：

【数１】 なお、本定量法によって求めたヒト末梢血から得られた
天然のＩＬ−２比活性は、２０,０００〜７０,０００Ｕ
／mgであり、本発明の非グリコシル化ヒトＩＬ−２蛋白
質とほぼ同等の比活性を示した。

【００１１】本発明の非グリコシル化ヒトＩＬ−２蛋白
質は、好ましくは〔図３〕（配列表：配列番号２）に示
すアミノ酸配列〔該図中、ＸはＭet または水素を示
す〕からなるポリペプチド(II)を含有するものである。
本発明により製造されるヒトＩＬ−２蛋白質は下記の性
状を有する。 １) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一で
あり、本法による分子量測定値は１５,０００±１００
０ダルトンである。 ２) アミノ末端アミノ酸としてはアラニンまたはメチオ
ニンを有する。 ３) カルボキシ末端アミノ酸としてスレオニンを有す
る。 ４) 正常なＴ細胞やナチュラルキラー細胞をその機能を
保持させたまま増殖させる活性を有する。

【００１２】本発明により製造されるヒトＩＬ−２蛋白
質は、リムラス試験〔ヘモスターシス，第７巻，１８３
頁（１９７８年）〕陰性であり、夾雑蛋白質、発熱物質
がきわめて少ないので注射剤原体等として安全に使用さ
れる。本発明により得られる非グリコシル化ヒトＩＬ−
２蛋白質は、低毒性で、正常なＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞をその機能を保持させたまま増殖させる活性を有
する。したがって、本発明のＩＬ−２蛋白質は、Ｔ細胞
やナチュラルキラー細胞をインビトロで長期にわたり増
殖，継代したりクローン化するのに使用できる。なお、
この性質を利用してヒトＩＬ−２の活性を測定すること
ができる。さらに、本発明のヒトＩＬ−２蛋白質は、た
とえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラー
Ｔ細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す能
力をもつところのナチュラルキラー細胞をインビトロで
選択的に増殖させることができ、またこのキラーＴ細胞
を生体へ移入する際に、本発明のヒトＩＬ−２を同時に
接種することにより、その抗腫瘍効果を増大させること
から、温血動物（例、マウス，ラット，ウサギ，犬，ネ
コ，ブタ，ウマ，ヒツジ，ウシ，人など）の腫瘍の予
防，治療や免疫機能低下疾患の治療のために用いること
ができる。本発明のヒトＩＬ−２蛋白質は高純度に精製
されているので抗原性がなく低毒性である。本発明のヒ
トＩＬ−２蛋白質を腫瘍の予防，治療剤として用いるに
は、当該蛋白質を自体公知の担体と混合希釈して、たと
えば注射剤，カプセル剤などとして非経口的にまたは経
口的に投与することができる。さらに、前述したように
インビトロで増殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキラ
ー細胞と共にまたは単独で使用することができる。

【００１３】本発明のヒトＩＬ−２蛋白質は、公知の天
然から分離されたヒトＩＬ−２と実質的に同じ生物活性
を有するのでこれと同様に使用することができ、細胞の
ＩＬ−２受容体との解離定数がきわめて小さいことか
ら、極く小量の投与で良い。Ｔ細胞をインビトロで増殖
させる目的に使用するためには、本発明のヒトＩＬ−２
を約０.０１〜１ユニット／ml、好ましくは約０.１〜
０.５ユニット／mlの濃度で培地に添加して用いること
ができる。Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用
する具体例としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清を
含むＲＰＭＩ １６４０培地にヒト末梢血より分離した
Ｔ細胞（１×１０⁶個／ml）およびＸ線（１５００ラッ
ド）照射したＢ細胞トランスフォーマント（１×１０⁶
個／ml）を加えて３７℃，５％ＣＯ₂ 存在下で３日間リ
ンパ球混合培養を行なって得られるアロ抗原感作Ｔ細胞
を含む細胞浮遊液に本発明のＩＬ−２蛋白質を０.１〜
０.５ユニット／mlの濃度で約一週間ごとに培地交換し
ながら約１か月間培養を続ける方法などが挙げられる。
下記実施例に開示している形質転換体，大腸菌 E. coli
ＤＨ １／pＴＦ４は財団法人発酵研究所（Institute f
or Fermentation, Osaka）にＩＦＯ−１４２９９として
寄託されており、また本形質転換体は、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７５７８として寄託され、該寄託はブダペス
ト条約に基づく寄託に切換えられて、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２８として同研究所（ＦＲＩ）に保管されて
いる。なお、本願明細書および図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を〔表１〕に挙げる。また、アミノ酸に関し
光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−
体を示すものとする。

【表１】

【００１４】実施例１ (ｉ) ヒトＩＬ−２をコードする mＲＮＡの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を１２−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（１
５ng／ml）とコンカナバリンＡ（４０μg／ml)を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地（１０％の牛胎児血清を含む）
中、３７℃で培養し、ＩＬ−２を誘導させた。２４時間
後、この誘導した１×１０¹⁰個のヒトリンパ球を５Ｍグ
アニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、
５０mＭ Ｔris・ＨＣl pＨ７.６，１０mＭ ＥＤＴＡ溶
液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した後
Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４％になる
ように加え、均質化した混合物を５.７Ｍ塩化セシウム
溶液(５.７Ｍ塩化セシウム，０.１Ｍ ＥＤＴＡ）６ml上
に重層し、ベックマンＳＷ２８のローターを用いて１５
℃で２４０００rpm ４８時間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈
澱を得た。このＲＮＡ沈澱を０.２５％Ｎ−ラウロイル
ザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノール
で沈澱させ、１０mgのＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩
溶液〔０.５ＭＮaＣl，１０mＭ Ｔris・ＨＣl pＨ７.
６，１mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ ＳＤＳ〕中でオリゴ（d
Ｔ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ(Ａ)を含む mＲ
ＮＡを低塩溶液〔１０mＭ Ｔris−ＨＣl・pＨ７.６，１
mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ ＳＤＳ〕で溶出させることによ
り、ポリ(Ａ)を含む mＲＮＡ３００μgを分取した。こ
の mＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０.２mlの溶
液（１０mＭ Ｔris・ＨＣl pＨ７.６，２mＭ ＥＤＴ
Ａ，０.３％ ＳＤＳ）に溶かし、６５℃で２分間処理し
て１０〜３５％ショ糖密度勾配遠心処理（ベックマンＳ
Ｗ２８のローターを用いて２０℃，２５０００rpm で２
１時間遠心分離）することにより分画して２２分画を得
た。この各分画につきＲＮＡの一部ずつを、アフリカツ
メガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白質中のＩ
Ｌ−２活性を測定し、分画１１〜１５（沈降定数８Ｓ〜
１５Ｓ）にＩＬ−２の活性を検出した。この分画のＩＬ
−２mＲＮＡは約２５μg であった。

【００１５】(ii) 単鎖ＤＮＡの合成 上記で得た mＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００μ
l の反応液（５μgのmＲＮＡ，５０μgオリゴ（dＴ），
１００ユニットの逆転写酵素，１mＭずつの dATP.dＣＴ
Ｐ，dＧＴＰおよび dＴＴＰ，８mＭ ＭgＣl₂，５０mＭ
ＫＣl，１０mＭジチオスレイトール，５０mＭ Ｔris−
ＨＣl pＨ８.３）中で４２℃，１時間インキュベートし
た後に、フェノールで除蛋白し、０.１ＮのＮaＯＨで７
０℃，２０分処理してＲＮＡを分解除去した。 (iii) 二重鎖ＤＮＡの合成 ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μl の反応液
（mＲＮＡとオリゴdＴを含まない以外は上記と同じ反応
液）中で４２℃２時間反応させることにより二重鎖ＤＮ
Ａを合成した。 (iv) dＣテイルの付加 この二重鎖ＤＮＡにヌクレアーゼＳ１を５０μl の反応
液（二重鎖ＤＮＡ ０.１Ｍ酢酸ナトリウム pＨ４.５，
０.２５Ｍ ＮaＣl，１.５mＭ ＺnＳＯ₄，６０ユニット
のＳ１ヌクレアーゼ）中で室温３０分間作用させ、フェ
ノールで除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた
後、これにターミナルトランスフェラーゼを５０μl の
反応液（二重鎖ＤＮＡ，０.１４Ｍカコジル酸カリ，０.
３Ｍ Ｔris（塩基）pＨ７.６，２mＭジチオスレイトー
ル，１mＭ ＣoＣl₂，０.１５mＭ dＣＴＰ，３０ユニッ
トターミナルトランスフェラーゼ）中で３分間３７℃で
作用させ二重鎖ＤＮＡの３′両端に約１５個のデオキシ
シチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反応で約３０
０ngのデオキシシチジン鎖をもった二重鎖ＤＮＡを得
た。 (ｖ) 大腸菌プラスミドの開裂ならびにdＧテイルの付
加 一方、１０μg の大腸菌プラスミド pＢＲ３２２ＤＮＡ
に制限酵素ＰstＩを５０μl の反応液（１０μg ＤＮ
Ａ，５０mＭ ＮaＣl，６mＭ Ｔris・ＨＣl・pＨ７.４，
６mＭ ＭgＣl₂，６mＭ ２−メルカプトエタノール，１
００μg／ml 牛血清アルブミン，２０ユニットのＰst
Ｉ）中で３時間３７℃で作用させて pＢＲ３２２ＤＮＡ
中に１ケ所存在するＰstＩ認識部位を切断し、フェノー
ルで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラーゼを５
０μl の反応液(ＤＮＡ １０μg，０.１４Ｍカコジル酸
カリ，０.３Ｍ Ｔris・塩基 pＨ７.６，２mＭジチオス
レイトール，１mＭ ＣoＣl₂，０.１５mＭ ＧＴＰ，３０
ユニットターミナルトランスフェラーゼ）中で３分間３
７℃で作用させ上記プラスミド pＢＲ３２２ＤＮＡの
３′両端に約１７個のデオキシグアニン鎖を延長させ
た。

【００１６】(vi) cＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形
質変換 このようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ ０.１μg と
上記プラスミド pＢＲ３２２，０.５μg を０.１Ｍ Ｎa
Ｃl，５０mＭ Ｔris・ＨＣl pＨ７.６，１mＭＥＤＴＡ
よりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間加熱しそ
の後除冷して会合させ Enaa らの方法〔J. Mol. Biol.,
９６，４９５（１９７５）〕に従って大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換させた。 (vii) cＤＮＡ含有プラスミドの単離 このようにして約２０,０００個のテトラサイクリン耐
性株が単離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロー
スフィルターの上に固定した。次いで Taniguchiらの報
告〔Nature, ３０２，３０５（１９８３年）〕したＩＬ
−２のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸 No. ７４〜
７８（Ｌys⁷⁴−Ｈis−Ｌeu−Ｇln−Ｃys)およびアミノ
酸 No. １２２〜１２６（Ｔhr¹²²−Ｐhe−Ｍet−Ｃys−
Ｇlu）に対応する塩基配列（５’ＡＡＡ ＣＡＴ ＣＴ
Ｔ ＣＡＧ ＴＧＴ３’および５’ＡＣＡ ＴＴＣ Ａ
ＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ３’にそれぞれ相補するオリゴヌ
クレオチド）をトリエステル法〔Crsa, R. ら Proc, Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７ ５，５７６５（１９７
８）〕により化学合成した。このオリゴヌクレオチドに
対してＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用いて５０μ
l の反応液(オリゴヌクレオチド０.２０μg，５０mＭ
Ｔris・ＨＣl pＨ８.０，１０mＭ ＭgＣl₂, １０mＭメ
ルカプトエタノール，５０μＣiγ−³²ＰＡＴＰ，３ユ
ニットＴ４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間３
７℃で反応させ、５′末端を³²Ｐで標識した。この標識
されたオリゴヌクレオチドをプローブとして Lawn らの
方法〔Nucleic Acids Res., ９，６１０３（１９８
１）〕に従って上記のニトロセルロースフィルター上に
固定したＤＮＡに会合させ、オートラジオグラフィーに
よって上記二種類のオリゴヌクレオチドプローブに反応
する菌株を４個単離した。これらの菌株の各々の菌体か
らプラスミドＤＮＡをアルカリ法〔Birncoim H. C. ＆
Doly, J. Nucleic Acids Res., ７，１５１３(１９７
９）〕によって単離した。次にプラスミドＤＮＡの挿入
部を制限酵素ＰstＩにより切り出し、分離したプラスミ
ドのうちでその挿入部の長さの最も長い断片を含むもの
をえらび、このプラスミドをpＩＬＯＴ １３５−８と名
づけた。このプラスミドの制限酵素地図を〔図１〕に示
す。次にこのpＩＬＯＴ−１３５−８プラスミドに挿入
されたcＤＮＡの配列の一次構造（塩基配列）をジデオ
キシヌクレオチド法と Maxma−Gilbert 法によって決定
した。その一次構造は〔図２〕（配列表：配列番号１）
に示した。この塩基配列により規定されるペプチドはそ
の合成開始信号（No. ６４〜６６のＡＴＧ）から始まっ
て１５３個のアミノ酸から成る。この中Ｎ末端から２０
個のアミノ酸はシグナルペプチドと考えられる。上記の
一次構造から、このプラスミドはヒトＩＬ−２蛋白質を
コードする塩基配列を全部持っていることが判明した。
この事実によってプラスミドに組み込まれた遺伝子を他
の発現用プラスミドに組み込むことによりＩＬ−２蛋白
質の任意のポリペプチドを生産することができる。

【００１７】実施例２ 実施例１で得たプラスミドpＩＬＯＴ １３５−８を制限
酵素ＨgiＡ１で切断し、１２９４bpのＩＬ−２遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ４ポリメラ
ーゼで処理した後、アラニンのコドンＧＣＡとメチオニ
ンのコドンＡＴＧを有するＣlaＩのリンカー，ＣＧＡＴ
Ａ ＡＴＧＧＣＡを結合させＣlaＩ，ＰstＩ処理した
後、ptrp ７７１のＣlaＩ，ＰstＩ siteに組み込み、得
られた発現用プラスミドをpＴＦ４と命名した（〔図
４〕）。

【００１８】実施例３ 実施例２で得たプラスミド pＴＦ４を用いて Cohen ら
の方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６９，２１
１０（１９７２）〕に準じて大腸菌ＤＨ １を形質転換
させ、当該プラスミドを含む形質転換体（Escherichia
coli ＤＨ １／pＴＦ４）を得た。

【００１９】実施例４ 実施例３で得た E. coli ＤＨ １／pＴＦ４を２５０ml
容三角フラスコ内のバクト・トリプトン（ディフコ・ラ
ボラトリーズ，アメリカ）１％，バクト・イーストエキ
ス（ディフコ・ラボラトリーズ，アメリカ）０.５％，
食塩０.５％およびテトラサイクリン７μg／mlを含む液
体培地（pＨ７.０）５０mlに接種して３７℃で１晩回転
振盪培養した。この培養液をカザミノ酸０.５％，グル
コース０.５％およびテトラサイクリン７μg／mlを含む
Ｍ９培地２.５リットルの入った５リットル容ジャーフ
ァーメンターに移し３７℃で４時間、ついで３−β−イ
ンドリルアクリル酸（２５μg／ml）を添加して、さら
に４時間通気撹拌培養して培養液２.５リットルを得
た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃で
凍結して保存した。

【００２０】実施例５ 実施例４で得た凍結保存菌体１２.１ｇを７Ｍ塩酸グア
ニジン，０.１Ｍ Ｔris・ＨＣl を含む抽出液（pＨ７.
０）１００mlに均一に懸濁し、４℃で１時間撹拌した。
この溶菌液を２８,０００×ｇで２０分間遠心分離して
上清９３mlを得た。

【００２１】実施例６ 実施例５で得た上清を０.０１Ｍ Ｔris／ＨＣl 緩衝液
（pＨ８.５）に対して透析後１９,０００×ｇで１０分
間遠心分離して透析上清９４mlを得た。この透析上清を
０.０１Ｍ Ｔris−ＨＣl緩衝液（pＨ８.５）で平衡化し
たＤＥ ５２（ＤＥＡＥ−セルロース，ワットマン社
製，イギリス）カラム（５０ml容）に通して蛋白を吸着
させ、ＮaＣl 濃度直線勾配（０〜０.１５Ｍ ＮaＣl，
１リットル） を作成してＩＬ−２を溶出させた。活性
画分５３mlをＹＭ−５メンブラン（アミコン社製，アメ
リカ）を用いて４.８mlに濃縮し、０.１Ｍ Ｔris・ＨＣ
l（pＨ８.０）−１Ｍ ＮaＣl 緩衝液で平衡化したセフ
ァクリルＳ−２００（ファルマシ ア社製，スエーデ
ン）カラム（５００ml容）を用いてゲル濾過を行った。
活性画分２８mlをＹＭ−５メンブランで２.５mlに濃縮
した。得られた濃縮液をウルト ラポアＲＰＳＣ（アル
テックス社製，アメリカ）カラムに吸着させ、トリフル
オロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高速液体
クロマトグラフィーを行った。カラム，ウルトラポアＲ
ＰＳＣ（４.６×７５mm）；カラム温度，３０℃；溶出
溶媒Ａ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水；溶出
溶媒Ｂ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニ
トリル；溶出プログラム，０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）
−２５分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋
５５％Ｂ）−４５分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分
（１００％Ｂ）；溶出速度，０.８ml／min；検出波長，
２３０nm。本条件下で保持時間約３９分の活性画分を集
め、非グリコシル化ヒトＩＬ−２蛋白質０.５３mg〔比
活性，３０,０００Ｕ／mg，出発材料からの活性回収
率，３０.６％；蛋白質の純度，９９％（デンシトメト
リーによる）〕を含む溶液１０mlを得た。上記溶液を凍
結乾燥に付し、白色粉末を得た。本粉末の比活性は２
６,０００Ｕ／mgであった。

【００２２】実施例７ 実施例６で得たヒトＩＬ−２蛋白質について以下の諸性
質を調べた。 (１) 単一性：ラエムリの方法〔Nature, ２２７，６８
０（１９７０）〕に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミド
スラブゲル電気泳動を行ったあとクマジーブリリアント
ブルーで染色した結果、該ヒトＩＬ−２蛋白質は単一の
バンドを示した（〔図５〕参照）。バンドの位置は還元
条件下でも非還元条件下でも変わらなかった。 (２) 分子量：該ヒトＩＬ−２蛋白質の分子量は、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動から約１
５,０００ダルトンと算出された（〔図５〕参照）。上
記(１)項および(２)項の結果から、実施例６で得たヒト
ＩＬ−２蛋白質はオリゴマーを実質的に含んでいないこ
とが明らかである。

【００２３】(３) アミノ酸組成：該ヒトＩＬ−２蛋白
質２０μg をガラス製加水分解用試験管にとり、４％チ
オグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて、減圧下に封
管したのち、１１０℃で２４，４８，７２時間加水分解
した。加水分解後、開管し、減圧下に塩酸を除去し、残
渣を０.０２Ｎ塩酸に溶解して日立製８３５型アミノ酸
分析計によりアミノ酸分析を実施した。シスチンおよび
システインはハーフの方法〔Methods in Enzymol., １
１，１９７（１９６７）〕に従い、該ヒトＩＬ−２蛋白
質を過ギ酸酸化したのち、減圧下、定沸点塩酸中で２４
時間加水分解して、アミノ酸分析計によりシスティン酸
として定量した。アミノ酸分析値は、２４，４８および
７２時間の加水分解で得られた値を平均して求めた。但
し、セリンおよびスレオニンの値は加水分解時間を０時
間に外挿して求めた。その結果を〔表２〕に示す。

【表２】

【００２４】(４) Ｎ末端アミノ酸配列：該ヒトＩＬ−
２蛋白質３４μg に気相プロテインシークエネーター
（アプライド・バイオシステムズ社製４７０Ａ型、アメ
リカ）を用いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端
アミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダントインア
ミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）はミクロパックＳＰ−ＯＤ
Ｓカラム（バリアン社製，アメリカ）を用いる高速液体
クロマトグラフィーにより同定した。各ステップで検出
されたＰＴＨ−アミノ酸を〔表３〕に示す。

【表３】 表中Ｙについては未決定である。

【００２５】(５) Ｃ末端アミノ酸：該ヒトＩＬ−２蛋
白質３０μg をガラス製ヒドラジン分解用試験管にと
り、無水ヒドラジン０.０５mlを加えて減圧下に封管し
たのち、１００℃で６時間加熱した。得られたヒドラジ
ン分解物を凍結乾燥したのち、蒸留水に溶解した。この
溶液にベンズアルデヒドを添加し、室温で１時間撹拌
し、遠心分離を行なったのち、上清を得た。この上清を
凍結乾燥し、日立製８３５型アミノ酸分析計によりアミ
ノ酸分析を実施した。その結果、スレオニンのみが検出
された。 (６) トリプシン消化のペプチドマップ：該ＩＬ−２標
品１５μg をＴＰＣＫ（Ｌ−１−トシルアミド−２−フ
ェニルエチルクロルメチルケトン）トリプシン（ワシン
トン社製，アメリカ）０.４μgと０.０２Ｍ炭酸水素ナ
トリウム１２０μl 中、３７℃，１８時間反応させた。
反応液に２−メルカプトエタノール５μl を添加してさ
らに３７℃で２時間反応したのち、反応液に１％トリフ
ルオロ酢酸７５μl を加え反応を停止させた。得られた
反応液を下記の条件下での高速液体クロマトグラフィー
により分析して、〔図６〕に示すマップを得た。 カラム：ウルトラスフェアーオクチル（５μm，４.６×
２５０mm；アルテックス社製，アメリカ）。 カラム温度：３０℃ 移動相：Ａ液，０.０２％トリフルオロ酢酸−９９.９８
％水 Ｂ液，０.０２％トリフルオロ酢酸−９９.９８％アセト
ニトリル ０分（９５％Ａ液＋５％Ｂ液）−４０分（３０％Ａ液＋
７０％Ｂ液）。 溶出速度：１.０ml／分。 検出法：フロレスカミン（ロッシュ社製，アメリカ）を
用いる螢光法〔Analytical Biochem., ６７，４３８
（１９７５）〕。

【００２６】(７) ＩＬ−２依存性細胞株に対する活
性：Biochem. Biophys. Res. Commun., １０９，３６３
（１９８２）に記載の方法に準じて、本発明の非グリコ
シル化ヒトＩＬ−２蛋白質の活性を測定した結果、該Ｉ
Ｌ−２蛋白質はＩＬ−２依存性マウス細胞株（ＮＫＣ
３，〔図７〕参照）およびヒト細胞株（〔図８〕参照）
のいずれに対してもトリチウムチミジンの取込を促進さ
せる活性を有していた。また、該ＩＬ−２蛋白質を０.
５Ｕ／mlになるように２０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４
０培地中に溶解したものに、ＮＫＣ３株を２×１０⁵個
／mlになるように浮遊してリンブロマルチディッシュ
（フロー社，アメリカ）内で３７℃，５％ＣＯ₂ 存在下
に継代培養した。培養２〜３日毎に生細胞数を計測し
て、新たに新鮮な上記培養液に再浮遊することを繰り返
した結果、〔図９〕に示すように該ＩＬ−２蛋白質はＮ
ＫＣ３株の増殖を長期にわたって維持し得る活性を有し
ていた。

【００２７】実施例８ 注射用製剤：実施例６で得られ
た非グリコシル化ヒトＩＬ−２蛋白質含有溶液を、０.
０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ５.０）で平衡化
したＣＭトヨパール（東洋曹達社）カラムに無菌条件下
で吸着させ、０.１５ＭのＮaＣl を含む上記緩衝液で溶
出させる。溶出液に０.１５Ｍ ＮaＣl を適宜加えて希
釈し、ＨＳＡを０.５％になるように添加してメンブラ
ンフィルター（口径０.２２μm）を用いて濾過後、得ら
れた濾液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に分注して凍結
乾燥し、注射用ヒトＩＬ−２を調製する。本注射用製剤
は、用時注射用蒸留水１mlに溶解する。

【００２８】実験例１ 実施例６で得たヒトＩＬ−２蛋白質につき、そのチオー
ル基の定量とチオール基の位置決定を行った。 (１)まず、チオール基の定量については、ＤＴＮＢ法に
よる Ellman の方法〔アルカイブズ・オブ・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオフィジクス（Archivesof Bio
chemistry and Biophysics）第３２巻７０頁（１９５９
年）〕に従って行なった。すなわち、実施例６で得たヒ
トＩＬ−２蛋白質０.４mg(２６.７n mol）を含む６Ｍ塩
酸グアニジン−１０mＭエチレンジアミンテトラ酢酸・
２ナトリウム-75mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ８.３）１.９
８mlに１０mＭ ＤＴＮＢ［５,５′−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）］メタノール溶液０.０２mlを添加
し、室温で３０分間反応を行わせた。定量は反応液の黄
色の呈色を４１２nmの吸光度で測定し、標準物質として
既知濃度のシステイン塩酸塩を用いることにより行っ
た。その結果、ヒトＩＬ−２蛋白質１モルあたり０.８
５モルのチオール基が検出され、従って、ヒトＩＬ−２
蛋白質が有するシステイン３残基のうち、遊離のチオー
ル基を有するのは１残基のみで、他の２残基は互いにジ
スルフィド結合を形成していることが判明した。 (２)次にチオール基の位置決定を Egorov らによって報
告された方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ＵＳＡ，第７
２巻第３０２９−３０３３頁（１９７５年）］に基づい
て行った。すなわち、実施例６で得たヒトＩＬ−２蛋白
質６.３mgを含む６Ｍ塩酸グアニジン−０.１Ｍ塩化ナト
リウム−２５mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ５.０）
３mlを同緩衝液で平衡化されたチオプロピルセファロー
ス６Ｂ（ファルマシア社，スウェーデン）カラム（１.
０cmφ×５.１cm，４ml）に流速５ml／h で負荷したの
ち、上記緩衝液１０ml，０.１Ｍ塩化ナトリウム−２５m
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.０）１０mlおよび０.
２Ｍ酢酸（pＨ３.０）１０mlを用いてカラムの洗浄を行
った。

【００２９】次にこのチオプロピルセファロース６Ｂゲ
ル４mlをカラムから取り出し、０.２Ｍ酢酸（pＨ３.
０）６mlを添加し、ペプシン（シグマ社，ＵＳＡ）０.
１mgを用いて３７℃，１５時間撹拌しながら、加水分解
反応を行わせた。反応後、再びこのゲルをカラムに詰
め、０.２Ｍ酢酸（pＨ３.０）１０mlおよび２５mＭ酢酸
アンモニウム緩衝液（pＨ４.５）１０mlで洗浄したの
ち、２０mＭ ２−メルカプトメタノール−２５mＭ酢酸
アンモニウム（pＨ４.５）３０mlを用いてゲル中の未反
応基を２−チオピリドンとして溶出した。ひき続いて、
２５mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ４.５）１０mlお
よび２５mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ８.０）１０m
lでカラムを洗浄したのち、２０mＭ ２−メルカプトエ
タノール−２５mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ８.
０）を用いて流速５ml／h で溶出を行い、遊離のチオー
ル基を有するヒトＩＬ−２蛋白質由来のペプチドフラグ
メントを含む画分１０ｍｌを取得した。さらに、この画
分をサーバンドを用いて濃縮乾固したのち、０.１％ト
リフルオロ酢酸溶液０.５mlに溶解させ、下記の条件で
逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。 カラム：ヌクレオシル５Ｃ１８（０.８cmφ×３０cm，
ナーゲル社，西ドイツ） カラム温度：３０℃ 溶出溶媒Ａ ：０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水 溶出溶媒Ｂ ：０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％ア
セトニトリル 溶出プログラム ：０分（９５％Ａ＋５％Ｂ）−６０分
（７０％Ａ＋３０％Ｂ）−７５分（５０％Ａ＋５０％
Ｂ）−８５分（４０％Ａ＋６０％Ｂ）−９５分（２５％
Ａ＋７５％Ｂ）−９８分（１５％Ａ＋８５％Ｂ） 溶出速度 ：３ml／min 検出波長 ：２３０nm その結果、〔図１０〕に示すように４つのピークが検出
されたので、これらを、分取後、サーバントで濃縮乾固
し、それぞれについてアミノ酸組成分析を行った。結果
を〔表４〕に示す。

【表４】 上記の結果からピーク１はＣys１２５−Ｓer１３０, ピ
ーク２はＣys１２５−Ｔhr１３１, ピーク３はＣys１２
５−Ｉle１２９, ピーク４はＣys１２５−Ｔhr１３１と
容易に同定され、４つのピークすべてがＣys１２５を含
むフラグメントであることがわかった。また、チオプロ
ピルセファロースカラムクロマトグラフィー，プロテア
ーゼ反応，逆相高速液体クロマトグラフィーの全過程を
通じての回収率は３２.６％であった。従って、実施例
６で得た精製ヒトＩＬ−２蛋白質は、ヒトＩＬ−２蛋白
質が有するシステイン３残基のうち、遊離のチオール基
を有するのはＣys１２５であり、Ｃys５８とＣys１０５
とがジスルフィド結合を形成しており、チオール基の結
合様式の異なるアイソマーは含まれていないことが判明
した。

【００３０】実験例２ 実施例６で得たヒトＩＬ−２蛋白質につき、そのエンド
トキシンの定量を行った。定量法は、岩永らの方法［ヘ
モスターシス（Haemostasis）第７巻１８３−１８８頁
（１９７８年）］に従って行った。 (１)まず、エヒェリヒア・コリ０１１１−Ｂ４から得ら
れた標準エンドトキシン（エンドトキシン検出試薬プレ
ゲル（帝国臓器製薬製）に添付したもの）の１０^-2ng／
ml，１０^-1ng／ml，３×１０^-1ng／ml，１ng／mlおよび
３ng／mlの濃度の水溶液を調製した。ＬＡＬ（Limulus
Amebocyte Lysate, カブトガニ血球抽出成分，帝国臓器
製薬製）２５μl，合成基質 Ｂoc−Ｌeu−Ｇly−Ａrg
−pＮＡ（生化学工業製，Ｂoc：ブトキシカルボニル，p
ＮＡ：パラニトロアニド）（１.６mg／ml）２５μlおよ
び上記標準エンドトキシンの水溶液５０μl を混合し、
３７℃６０分反応させた後、１２.５％酢酸を添加し、
４０５nmの吸光度をそれぞれ２回測定し、次の結果を得
た。

【表５】 上記の結果をプロットし、〔図１１〕を作成した。

【００３１】(２)次に、実施例６で得たヒトＩＬ−２蛋
白質を、１.１０mg／ml，１.１６mg／mlとなるようにそ
れぞれ水に溶解し、水溶液とした。これらを、上記(１)
項と同様の反応に付し、４０５nmの吸光度を測定した。
得られた吸光度から、〔図１１〕に基づいて、該水溶液
のエンドトキシン濃度を計算し、これより、実施例６で
得たヒトＩＬ−２蛋白質の１mgタンパクあたりのエンド
トキシン量を算出した。結果を次の〔表６〕に示す。

【表６】

【００３２】実験例３ (１)粗抽出液の製造 (ｉ)発現用プラスミドの構築 上述の実施例１(vii)で得られたヒトＩＬ−２遺伝子を
有するプラスミドpＩＬＯＴ １３５−８を制限酵素Ｈgi
ＡＩで切断した。得られた１２９４bpＤＮＡ断片をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて、ＥcoＲＩリンカーdTGCCATGAATTCATGGCA を
結合させた。得られたＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、翻訳
開始コドンＡＴＧおよびヒトＩＬ−２遺伝子を有するＤ
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、あらかじめＥcoＲ
Ｉ−ＰstＩ部位を消化したptrp７８１［ヌクレイック・
アシズ・リサーチ，第１１巻，３０７７頁(１９８３)］
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。かくして得ら
れた発現用プラスミドpＴＦ１はtrpプロモーターの下流
に翻訳開始コドンとヒトＩＬ−２遺伝子を有する。プラ
スミドpＴＦ１を制限酵素ＳtuＩで切断し、ＢamＨＩリ
ンカーと結合させた。このプラスミドＤＮＡを制限酵素
ＢamＨＩおよびＥcoＲＩで処理し、ついでＥcoＲＩ−Ｂ
amＨＩ部位にλＰＬプロモーターを有するプラスミドp
ＴＢ２８１に挿入した。かくして得た発現用プラスミド
をpＴＢ２８５と命名した。 (ii)形質転換体の製造 上記で得たプラスミドpＴＢ２８５でエシェリヒアコリ
Ｎ４８３０をコーエンらの方法［プロシージングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ)，第
６９巻，２１１０頁(１９７２)］に従い形質転換し、上
記プラスミドを含有する形質転換体エシェリヒアコリＮ
４８３０／pＴＢ２８５を得た。 (iii)形質転換体の培養，抽出 前記で得た形質転換体エシェリヒアコリＮ４８３０／p
ＴＢ２８５を、実施例４と同様の方法で培養した。この
ようにして得られた大腸菌形質転換体(８g)を、２０mＭ
トリス−塩酸(pＨ７.５，３０mＭ ＮaＣｌを含む。)で
洗浄し、同じ組成の緩衝液(４０ml)に懸濁し、これをソ
ニック処理(０℃，２分間)に付した。さらに、分解物を
リゾチーム(１μg／ml)消化(０℃，２０分)し、ついで
凍結融解を ３回行ない、全体を遠心分離(２８０００×
ｇ，３０分)した。このようにして得られた２つの粗抽
出液をロット０１およびロット０２と称する。

【００３３】(２)、形質転換体の培養，抽出および精製 上記で得られた形質転換体エシェリヒアコリＮ４８３０
／pＴＢ２８５を、実施例４と同様の方法で培養し、実
施例５および６の方法と同様の方法で抽出および精製を
行なった。このようにして得られたリコンビナントヒト
インターロイキン−２（以下、ｒＩＬ−２と略称するこ
ともある。）の２つの精製品を、ロット５１およびロッ
ト５２と称する。 (３)、ＩＬ−２活性 前記(iii)および(iv)で得られた粗抽出液および精製品
の蛋白濃度およびＩＬ−２活性を測定した。ユニット
は、前記方法と同様の方法で測定した。結果を〔表７〕
に示す。

【表７】

【００３４】実験例４ (１)rＩＬ−２製剤中のエンドトキシン含量の測定 (イ)材料：rＩＬ−２製品(粗抽出液ロット０１および０
２ならびに精製品ロット５１および５２)を使用した。 (ロ)方法および結果：上記製品中のエンドトキシンの定
量を、T. サカタらの方法〔Journal of Parenteral Sci
ence and Technology, ３９，１９７(１９８５)〕に従
って実施した。まずエシェリヒア・コリ０５５：Ｂ５由
来の標準エンドトキシンControl ７Ｄ─４０８９〔ディ
フコ・ラボラトリーズ〕を水に溶解し、エンドトキシン
濃度３. １×１０^-3ng/ml、６.３×１０^-3ng/ml、１.２
５×１０^-2ng/ml、２.５×１０^-2ng/mlおよび５.０×１
０^-2ng/mlの水溶液を調製した。トキシノメーターＥＴ
− ２０１を用いてのアッセイを、１０mm径ガラス管中
の１００μｌ のＬＡＬ〔Limulus amebocytelysate(カ
ブトガニアメーバ様細胞溶解産物)、カブトガニ(Limulu
s polyphemus)血液細胞抽出物；アソシエーツ・オブ・
ケイプコッド、インコーポレイテッド〕溶液１００μｌ
に試験液１００μｌ を加えることによって、行った。
ヴォルテックスミキサーで数秒間反応液を混合したの
ち、試験管をトキシノメーターＥＴ−２０１の光学ユニ
ットに挿入し、濁度測定を開始した。各試料の反応時間
を個々に、ゲル化が確認されるまで計測した。結果を次
の〔表８〕に示す。

【表８】 上記の結果をプロットして、エンドトキシンの用量依存
性標準曲線としてグラフＡを得た。 ｌogＣ＝−３.０７×ｌog Ｔ(Ｇ)＋２.３８９ γ＝−０.９９７ ＊トキシノメーターＥＴ−２０１は、ＬＡＬ／エンドト
キシン溶液のゲル化時の濁度変化を波長 ６６０nmで測
定し、試料のゲル化時間を自動的に記録する。この装置
は、連続的に変化する光量の初期光量に対する比Ｒ(ｔ)
を同時に６４サンプルまで１２秒ごとに測定する。試料
を３７±０.５℃の一定温度で静置状態でインキュベー
トするとき、試料の振動からくる妨害なしに、ゲル化を
客観的に検出できる。Ｒ(ｔ)の５％低下を得るのに必要
な反応時間として定義されるゲル化時間Ｔ(Ｇ)は、表示
装置に表示され、印字されるか、外部コンピューターに
送られて、エンドトキシン濃度の計算に使われる。

【００３５】

【表９】 つぎに、rＩＬ−２製品を水に溶解し、水溶液とした。
これらの溶液を上記と同じ操作に付し、ゲル化時間を測
定した。こうして得られたゲル化時間を〔表９〕に示し
た曲線と比較して、該水溶液中のエンドトキシン濃度を
算出し、rＩＬ−２蛋白質１mg当りのエンドトキシン量
に換算した。こうして得られた結果を下記の〔表１０〕
に示す。

【表１０】

【００３６】(ハ)エンドトキシン含量 上記(ロ)の〔表１０〕から明らかなように、精製品のエ
ンドトキシン含量は極めて少量で０.０１７および０.０
１４ng／mg蛋白である。これに対し、粗抽出液のエンド
トキシン含量は、２×１０³および２.９×１０³ng／mg蛋
白で、精製品のそれの約１.６×１０⁵倍である。粗抽出
液は、試料中に大量のエンドトキシンを有するので、粗
抽出物は臨床用に使用することができない。一方、精製
品のエンドトキシン含量は極めて少量であるので、精製
品はそのままで臨床に用いることができる。 (２)rＩＬ−２製品中の発熱物質の測定 (イ)材料：rＩＬ−２製品(粗抽出物ロット０１および０
２ならびに精製品ロット５１および５２)を使用した。
ウサギは市川屋(東京)から購入した。 (ロ)方法および結果：発熱物質試験は「生物学的製剤基
準、厚生省薬務局監修、社団法人細菌製剤協会発行、１
９８５年」２２３〜２２４ページに記載の方法に従って
実施した。結果を次の〔表１１〕に示す。

【表１１】 緩衝液は、発熱物質を含まないものを使用した。 (ハ)結 論 生物学的製剤基準の発熱試験法の判定基準に従えば、精
製品は、発熱物質を含んでいない。しかし、粗抽出物
は、ヒトへの臨床量投与条件下で発熱性であることが明
らかである。さらに詳しくは、本実験は、予定臨床用量
１×１０³Ｕ／人(２０Ｕ／kg体重；ヒトの平均体重を５
０kgとした)に基き、粗抽出液および精製品とも、その
１０倍量の２００Ｕ／kgを投与して発熱性試験を行っ
た。しかし、用量決定実験で、粗抽出液を投与したウサ
ギは、体温上昇のため死に至った。それゆえ、粗抽出液
群では、用量を２０Ｕ／kgに低減した。上記〔表１１〕
に示されているように、精製品の発熱性は検出されなか
ったが、粗抽出液では、精製品よりも少量のrＩＬ−２
の投与によっても、発熱性が検出された。それゆえ、粗
抽出液は、その発熱性のため、臨床に用いることはでき
ない。一方、精製品は、発熱性を有しないために、臨床
に用いることができる。

【００３７】

【発明の効果】本発明のヒトインターロイキンー2蛋白
質は、高度に精製されており、夾雑蛋白質，発熱物質が
きわめて少ないので、注射剤原体として安全に使用する
ことができる。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：組織 配列： GGGGGGGGGG GGGGGGGATC ACTCTCTTTA ATCACTACTC ACAGTAACCT CAACTCCTGC 60 CACAATGTAC AGGATGCAAC TCCTGTCTTG CATTGCACTA AGTCTTGCAC TTGTCACAAA 120 CAGTGCACCT ACTTCAAGTT CTACAAAGAA AACACAGCTA CAACTGGAGC ATTTACTGCT 180 GGATTTACAG ATGATTTTGA ATGGAATTAA TAATTACAAG AATCCCAAAC TCACCAGGAT 240 GCTCACATTT AAGTTTTACA TGCCCAAGAA GGCCACAGAA CTGAAACATC TTCAGTGTCT 300 AGAAGAAGAA CTCAAACCTC TGGAGGAAGT GCTAAATTTA GCTCAAAGCA AAAACTTTCA 360 CTTAAGACCC AGGGACTTAA TCAGCAATAT CAACGTAATA GTTCTGGAAC TAAAGGGATC 420 TGAAACAACA TTCATGTGTG AATATGCTGA TGAGACAGCA ACCATTGTAG AATTTCTGAA 480 CAGATGGATT ACCTTTTGTC AAAGCATCAT CTCAACACTG ACTTGATAAT TAAGTGCTTC 540 CCACTTAAAA CATATCAGGC CTTCTATTTA TTTAAATATT TAAATTTTAC CCCCCCCCCC 600 CCCC 604

【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：１３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 80 85 90 95 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 115 120 125 Ile Ile Ser Thr Leu Thr １３０

【図面の簡単な説明】

【図１】は実施例１（ｖｉｉ）で得たプラスミドpＩＬ
ＯＴ １３５−８の制

【数２】 をコードする部分を表わす）および一次構造（塩基配
列）をそれぞれ示す。

【図２】は実施例１(vii)で得たプラスミドpＩＬＯＴ
１３５−８の制

【数３】 をコードする部分を表わす）および一次構造（塩基配
列）をそれぞれ示す。

【図３】は本発明の非グリコシル化ヒトＩＬ−２蛋白質
のアミノ酸配列（図中Ｘは、Ｍetまたは水素を表わす）
を示す。

【図４】は実施例２における発現用プラスミドpＴＦ４
構築図を示す。

【図５】は実施例７(１)，(２)のＳＤＳ−ポリアクリル
アミドスラブゲル電気泳動の結果を示す。

【図６】は実施例７(６)のトリプシン消化ペプチドマッ
プを示す。

【図７】は実施例７(７)のＮＫＣ３細胞株およびヒト細
胞株のトリチウムチミジンの取込に及ぼす本発明のヒト
ＩＬ−２蛋白質の影響を示す。

【図８】は実施例７(７)のＮＫＣ３細胞株およびヒト細
胞株のトリチウムチミジンの取込に及ぼす本発明のヒト
ＩＬ−２蛋白質の影響を示す。

【図９】は実施例７(７)のＮＫＣ３細胞株に対する長期
継代培養の結果を示す。

【図１０】は、実験例１で得られた逆相高速液体クロマ
トグラフィーの結果を示す。

【図１１】は、実験例２における標準エンドトキシンの
濃度と４０５nmの吸光度の関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 欧州特許91539（ＥＰ，Ｂ) ＰＲＯＧＲＡＭＭＥ ＡＮＤ ＡＢＳ ＴＲＡＣＴＳ ３ＲＤ ＩＮＴＥＲＮＡ ＴＩＯＮＡＬ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ Ｏ Ｎ ＨＰＬＣ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｓ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＯＬ ＹＮＵＬＥＯＴＩＤＥＳ，ＮＯＶＥＭＢ ＥＲ 14−19，1983 ＭＯＮＡＫＯ，Ｐ ＯＳＴＥＲ ＳＥＳＳＩＯＮＳ ＰＲＥ ＰＡＲＡＴＩＶＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＢＩＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ207

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大腸菌形質転換体の培養により得られ、ヒ
   ト末梢血リンパ球を５×１０^６個／ｍｌとなるように１
   ０％ＦＣＳ添加ＰＲＭＩ１６４０培地に浮遊しコンカナ
   バリン−Ａ４０μｇ／ｍｌおよび１２−Ｏ−テトラデカ
   ノイルホルボール−１３−アセテート１５ｎｇ／ｍｌを
   添加して３７℃で５％ＣＯ_２の存在下に４８時間培養し
   た培養液の上清を１Ｕ／ｍｌと定める方法により測定さ
   れる１０^４Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、エンドトキシ
   ンおよび発熱性物質を実質的に含有しない、実質的に純
   粋な非グリコシル化ヒトインターロイキン−２蛋白質。