JP2001515720A - β−デフェンシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、β−デフェンシンのファミリーの１メンバーであるｚａｍｐ１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド分子に関する。ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドは抗微生物活性を示し、そして微生物の感染の研究または処置において使用することができる。本発明は、また、ｚａｍｐ１ポリペプチドに対する抗体を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 他の種による侵襲から生物を保護するために、生物学的防御戦略が発展した。
微生物の感染の応答系は、酸化的および非酸化的メカニズムを含み、細胞中で酵
素的に合成される化合物および単一の遺伝子産物であるペプチドを利用する。

【０００２】 抗微生物性ペプチドは、多数の分類学的ファミリーを包含する生物において見
出される、酸素独立の宿主防御系を構築する。抗微生物性ペプチドの１つの主要
なクラスは、保存されたシステイン残基のパターンにより定められる配列である
ことができ、そしてデフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）と命名される。哺乳動
物のデフェンシンは、皮膚、肺および腸から誘導され、グラム陽性細菌およびグ
ラム陰性細菌、菌類（例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種）およびウイルス
を包含する、広範な種類の病原体に対して抗生活性を示す。例えば、Ｐｏｔｅｒ
ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ． ６５（６）：２３９６−４０１、
１９９７、参照。

【０００３】 デフェンシンペプチドの両親媒特性は、微生物の攻撃、すなわち、細胞壁を通
る孔の形成、または「せん孔」による、の一般的メカニズムに対する手掛かりで
あるように思われる。さらに、Ｄａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６０（３） ：１０６８−７４、１９８６は、なかでも、単純ヘルペスウイルス１
型および２型、サイトメガロウイルスおよびインフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳ
Ｎ）を包含する、エンベロープドウイルスがヒト好中球ペプチド（ＨＮＰ−１）
とのインキュベーションにより不活性化されることを報告し、そしてウイルスに
対するデフェンシン分子の結合が細胞を感染するウイルスの能力を障害すると推
測した。

【０００４】 抗微生物性ペプチドのデフェンシンのファミリーは、２つの明確なコンセンサ
ス配列に基づいて２つの主要なサブクラスに分割することができる。例えば、Ｍ
ａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ ５８：１２８−３６、１９９５、参照。第１のデフェンシンのサブ
クラスは、古典的デフェンシンであり、ＨＮＰにより表され、好中球およびマク
ロファージのいわゆる大きいアズール顆粒の中に貯蔵され、そしてこれらの細胞
により食作用を受けた微生物を攻撃する。ＨＮＰのアミノ酸配列は、β−デフェ
ンシンのサブクラスのそれと区別される、予測されるジサルファイド架橋と一致
する。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）もまたデフェンシン源であ
ることができ、そしてこれらの細胞は外部の、余分の細胞の環境の中にこれらの
ペプチドを分泌するように思われる。例えば、マウスにおいて、小腸および近接
結腸のパネート細胞は、クリプチジンと呼ばれるデフェンシン様ペプチドをルー
メンの中に分泌する。例えば、ＯｕｅｌｌｅｔｔｅおよびＳｅｌｓｔｅｄ、Ｔｈ ｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １０：１２８０−９、１９９６、参照。

【０００５】 β−デフェンシン、第２の主要なデフェンシンのサブクラスは、ウシ肺の中に
見出されるペプチド（例えば、ＢＮＢＤ−ウシ好中球のβ−デフェンシン）なら
びに分泌された形態（ＴＡＰ−気管の抗微生物性ペプチド）を包含する。例えば
、Ｓｅｌｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８（９）：
６６４１−８、１９９３、参照。２つのβ−デフェンシンが報告された。ＳＡＰ
−１はヒト乾癬性皮膚から単離され、そしてｈＢＤ−１はヒト血液濾液の中に低
い濃度で見出された。例えば、Ｂｅｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ ｔ． ３６８（２）：３３１−５、１９９５、参照。これらのヒトβ−デフェン
シンのアミノ酸配列は、ウシＢＮＢＤおよびＴＡＰに最も類似する。例えば、Ｈ
ａｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８６１、１９９７、参照、
ここにはＳＡＰ−１がｈＢＤ−２と表示されている。

【０００６】 保存されたシステイン残基以外において、デフェンシンのファミリーは非常に
配列発散性である。変異型のアミノ酸配列の位置は活性の部位または条件に、ま
たは特定のデフェンシンにより攻撃される病原体のスペクトルに関係づけること
ができるであろう。 抗微生物活性に加えて、特定のデフェンシンは代謝的に感受性の細胞障害活性
を示し（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ６８：１４０７
−１０、１９８６およびＳｈｅｕ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２８：６２９−９、１９９３）、ＡＣＴＨに
対する副腎皮質細胞の応答を変更し（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８５（２）：５９２−６、１９８８）そし
てヒト単球に対して特異的な走化活性を有する（Ｔｅｒｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８４（６）：２０１７−２０、１９８９）。
好中球による単球の漸増は、一部分、好中球のデフェンシンにより仲介されるこ
とができ、そしてそれらの抗微生物作用に加えてこれらのペプチドについての前
炎症活性を示唆する。また、デフェンシンｍＲＮＡレベルの減少はＳＰＧ（特異
顆粒性疾患）において証明された。例えば、Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊａ ｐａｎ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ５９（２）：１３７−４２、１９９４
、参照。Ｈｉｇａｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１（３ ） ：１７６５０−５、１９９６は、デフェンシンの存在下にフィブリンに結合し
たプラスミノゲンがｔＰＡによる活性化に対する感受性が低いことを示唆してい
る。

【０００７】 デフェンシンの抗微生物、免疫刺激、前炎症および他の性質を有する部分が探
求された。本発明は、これらの用途および本明細書における教示から当業者にと
って明らかな他の用途のためのポリペプチドを提供する。 発明の要約 １つの面において、本発明は、下記のポリペプチドから成る群より選択される
ポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドからなる単離さ
れたタンパク質を提供する：ａ）配列番号：２のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基
６５の配列を有するポリペプチド；ｂ）配列番号：２のアミノ酸残基１９〜アミ
ノ酸残基６５の配列を有するポリペプチド；ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基２
１〜アミノ酸残基６５の配列を有するポリペプチド；ｄ）配列番号：１０のアミ
ノ酸残基１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；ｅ）配列番号：１
０のアミノ酸残基２１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；および
ｆ）配列番号：２のアミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペ
プチド；ここで前記ポリペプチドは配列番号：２または１０のアミノ酸残基３３
、４０、４５、５５、６２および６３に対応するシステイン残基を有する。１つ
の態様において、タンパク質は、ａ）配列番号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ
酸残基６７の配列を有するポリペプチド；ｅ）配列番号：１０のアミノ酸残基２
１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；およびｃ）配列番号：１０
のアミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；から成る
群より選択される配列を有するポリペプチドを含む。

【０００８】 他の面において、アミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列番号：１０の配
列を有する単離されたタンパク質が提供される。 なお他の面において、前述のタンパク質と、医薬として許容されるビヒクルと
を含んでなる医薬組成物が提供される。 なお他の面において、前述のタンパク質に特異的に結合する抗体が提供される
。

【０００９】 それ以上の面において、前述のタンパク質に特異的に結合する抗体の抗イディ
オタイプ抗体が提供される。 他の面において、タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド分子が
提供され、ポリヌクレオチド分子はコーディング鎖および相補的非コーディング
鎖から成り、ポリヌクレオチド分子は下記のポリペプチドから成る群より選択さ
れるポリペプチドに対してアミノ酸配列が少なくとも８０％同一であるポリペプ
チドをコードする：ａ）配列番号：２のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６５の配
列を有するポリペプチド；ｂ）配列番号：２のアミノ酸残基１９〜アミノ酸残基
６５の配列を有するポリペプチド；ｃ）配列番号：２のアミノ酸残基２１〜アミ
ノ酸残基６５の配列を有するポリペプチド；ｄ）配列番号：１０のアミノ酸残基
１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；ｅ）配列番号：１０のアミ
ノ酸残基２１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；およびｆ）配列
番号：２のアミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列を有するポリペプチド；
ここでポリペプチドは配列番号：２または１０のアミノ酸残基３３、４０、４５
、５５、６２および６３に対応するシステイン残基を有する。

【００１０】 他の面において、配列番号：１０のアミノ酸残基３３、４０、４５、５５、６
２および６３に対応するシステイン残基を有するタンパク質をコードする単離さ
れたポリヌクレオチド分子が提供され、ポリヌクレオチド分子はコーディング鎖
および相補的非コーディング鎖から成り、ポリヌクレオチドは下記のポリヌクレ
オチドから成る群より選択されるポリヌクレオチドの配列と少なくとも８０％同
一であるヌクレオチド配列を含む：ａ）ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド４２
０の配列番号：９に示すポリヌクレオチド；ｂ）ヌクレオチド２８０〜ヌクレオ
チド４２０の配列番号：９に示すポリヌクレオチド；およびｃ）ヌクレオチド２
８６〜ヌクレオチド４２０の配列番号：９に示すポリヌクレオチド。

【００１１】 なお他の面において、配列番号：１０のアミノ酸残基３３、４０、４５、５５
、６２および６３に対応するシステイン残基を有するタンパク質をコードする単
離されたポリヌクレオチド分子が提供され、ポリヌクレオチド分子はコーディン
グ鎖および相補的非コーディング鎖から成り、ポリヌクレオチドは配列番号：１
１に示すヌクレオチド配列を含む。

【００１２】 なお他の面において、下記の作用可能に連鎖された因子からなる発現ベクター
が提供される：転写プロモーター；前述のタンパク質をコードするＤＮＡセグメ
ント；および転写ターミネーター。１つの態様において、ＤＮＡセグメントはタ
ンパク質に作用可能に連結された分泌シグナル配列をさらにコードする。関係す
る態様において、分泌シグナル配列は、ａ）配列番号：２のアミノ酸残基１〜ア
ミノ酸残基１８の配列を有するポリペプチド；ｂ）配列番号：２のアミノ酸残基
１〜アミノ酸残基２０の配列を有するポリペプチド；ｃ）配列番号：１０のアミ
ノ酸残基１〜アミノ酸残基２０の配列を有するポリペプチド；およびｄ）配列番
号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基２２の配列を有するポリペプチド；か
ら成る群より選択される。

【００１３】 他の面において、本発明は、下記の作用可能に連結された因子からなる発現ベ
クターが導入された培養された細胞を提供する：転写プロモーター；前述のタン
パク質をコードするＤＮＡセグメント；および転写ターミネーター；ここで細胞
は前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記タンパク質を発現する。 それ以上の面において、下記の作用可能に連結された因子からなる発現ベクタ
ーが導入された細胞を培養し：転写プロモーター；前述のタンパク質をコードす
るＤＮＡセグメント；および転写ターミネーター；これにより細胞は前記ＤＮＡ
セグメントによりコードされる前記タンパク質を発現する；そして発現されたタ
ンパク質を回収する、ことからなる、タンパク質を製造する方法が提供される。

【００１４】 本発明は、また、配列番号：１１のポリヌクレオチドまたは配列番号：１１に
対して相補的な配列の少なくとも１４の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオ
チドプローブまたはプライマーを提供する。 発明の詳細な記載 本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することはそれらの理解の助
けとなるであろう： 用語「親和標識（アフィニティータグ）」は、本明細書において、ポリペプチ
ドの精製または検出を提供するか、あるいは基質への第２ポリペプチドの結合部
位を提供するために、第２ポリペプチドに結合させることができるポリペプチド
のセグメントを表すために使用される。原理的には、抗体または他の特異的な結
合因子が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質を親和標識として使用する
ことができる。親和標識は下記のものを包含する：ポリヒスチジントラクト、プ
ロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ． ４：１０７５、
１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８：３、１９９１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈお
よびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１、１９８８）、サブスタンスＰ、Ｆ
ｌａｇ^TMペプチド（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６ ：１２０４−１２１０、１９８８）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、コネチカット州ニューヘブン、から入手可能である）、ストレプチアビジ
ン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメイン。一般に、Ｆ
ｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕ ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７、１９９１、参照。親和標識をコード
するＤＮＡは、商業的供給会社から入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）。

【００１５】 用語「アレレ変異型」は、本明細書において、同一染色体遺伝子座を占有する
遺伝子の２またはそれ以上のオールタネイト形態の任意のものを表すために使用
される。アレレの変動は突然変異により天然に起こり、そして集団内に表現型の
多形性を生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサイレント（コードされた
ポリペプチドの非変化）であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることができる。アレレ変異型という用語は、また、本明
細書において遺伝子のアレレ変異型によりコードされるタンパク質を表すために
使用される。

【００１６】 用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリ
ペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語
は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を
参照して使用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端
に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置
するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。

【００１７】 用語「相補／抗相補の対」は、適当な条件下に非共有結合的にアソシエートし
た安定な対を形成する、非同一部分を表す。例えば、ビオチンおよびアビジン（
またはストレプトアビジン）は、相補／抗相補の対のプロトタイプのメンバーで
ある。他の典型的な相補／抗相補の対は、レセプター／リガンドの対、抗体／抗
原（またはハプテンまたはエピトープ）の対、センス／アンチセンスポリヌクレ
オチドの対、およびその他を包含する。相補／抗相補の対の引き続く解離を望む
場合、相補／抗相補の対は好ましくは＜１０⁹ ／Ｍの結合アフィニティーを有す
る。

【００１８】 用語「ポリヌクレオチド分子の相補」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配列
に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列５’Ａ
ＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に対して相補的である。 用語「縮重ヌクレオチド配列」は、１またはそれ以上の縮重コドンを含むヌク
レオチド配列（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して
）を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一
アミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣのトリプレットの各
々はＡｓｐをコードする）。

【００１９】 用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または
円形のＤＮＡ分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、プ
ロモーターおよびターミネーターの配列を包含し、そして必要に応じて１または
それ以上の複製起点、１またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、
ポリアデニル化シグナル、およびその他を含むことができる。発現ベクターは、
一般に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導されるか、あるいは双方の因
子を含有するすることができる。

【００２０】 用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして、他の余分または望ましくな
いコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で
使用するために適当な形態であることを表す。このような単離された分子は、そ
れらの自然の環境から分離されたものであり、そしてｃＤＮＡおよびゲノムのク
ローンを包含する。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、それらが通常アソシエー
トされる他の遺伝子を含まないが、天然に存在する５’および３’の非翻訳領域
、例えば、プロモーターおよびターミネーター、およびその他を包含することが
できる。アソシエートされた領域の同定は、当業者にとって明らかであろう（例
えば、ＤｙｎａｎおよびＴｉｊａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７７４−７８、１
９８５、参照）。タンパク質に適用するとき、「単離された」は、その自然環境
、例えば、血液および動物の組織、以外の条件において、タンパク質が見出され
ることを示す。好ましい形態において、単離されたタンパク質は他のタンパク質
、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。高度に精製された形態、
すなわち、９５％より大きい純度、より好ましくは９９％より大きい純度のタン
パク質を提供することが好ましい。

【００２１】 用語「作用可能に連結された」は、ＤＮＡセグメントについて言及するとき、
セグメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、
転写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネ
ーターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。 用語「オーソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能
的対応物である、１つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。
オーソログの間の配列の差は種形成の結果である。

【００２２】 用語「オーソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能
的対応物である、１つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。
オーソログの間の配列の差は種形成の結果である。 用語「ポリヌクレオチド」は、５’→３’末端の方向に読んだ、デオキシリボ
ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーを意
味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを包含し、天然源から単離され
、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合
わせから製造することができる。ポリヌクレオチドは、塩基対（略号「ｂｐ」）
、ヌクレオチド（「ｎｔ」）、またはキロ塩基（「ｋｂ」）として表される。こ
の関係が許す場合、後者の２つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオ
チドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、それは
全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解される
であろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は長さ
が異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違うことがある；
こうして、二本鎖ポリヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドは対合していなこ
とがある。このような不対末端は、一般に、２０ｎｔを超えない長さであろう。

【００２３】 「ポリペプチド」は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により
結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基より小さいポリ
ペプチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。 用語「プロモーター」は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼを結合しか
つ転写を開始するＤＮＡ配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野において
認識されている意味において使用される。プロモーター配列は普通に、しかし常
にではないが、遺伝子の５’非コーディング領域の中に見出される。

【００２４】 「レセプター」は、生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞上の
リガンドの作用を伝達する、細胞関連タンパク質を表す。膜に結合したレセプタ
ーは、細胞外リガンド結合ドメインと、典型的にはシグナルトランスダクション
に関係する細胞内エフェクタードメインとからなる、多ドメイン構造物により特
徴づけられる。レセプターへのリガンドの結合は、エフェクタードメインと、細
胞中の１またはそれ以上の他の分子との間の相互作用を引き起こす、レセプター
におけるコンフォメーションの変化を生ずる。この相互作用は、引き続いて、細
胞の代謝の変更に導く。レセプター−リガンドの相互作用に関係する代謝の事象
は、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクル的ＡＭＰ産生の増加、細胞
のカルシウムの移動化、膜脂質の移動化、細胞の接着、イノシトール脂質の加水
分解、およびリン脂質の加水分解を包含する。大部分の核レセプターは、また、
多ドメインの構造を示し、この構造はアミノ末端、トランス作用性ドメイン、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。一般に、レセプターは
、膜結合、細胞質ゾルまたは核レセプター；モノマーのレセプター（例えば、甲
状腺刺激ホルモンのレセプター、ベータ−アドレナリン作動性レセプター）また
はマルチマーのレセプター（例えば、ＰＤＧＦレセプター、Ｇ−ＣＳＦレセプタ
ー、エリトロポイエチンレセプターおよびＩＬ−６レセプター）であることがで
きる。

【００２５】 用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードす
るＤＮＡ配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの１成分として、より大
きいポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向け
る。通常、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、
分泌ペプチドを除去する。

【００２６】 「可溶性レセプター」は、細胞膜に結合しないレセプターのポリペプチドであ
る。可溶性レセプターは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠如する、最
も普通にリガンド結合性のレセプターのポリペプチドである。可溶性レセプター
は、追加のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するか、あるいは
基質、または免疫グロブリンの定常部の配列へのポリペプチドの結合部位を提供
する、親和標識を含むことができる。多数の細胞表面のレセプターは、タンパク
質分解により産生されるか、あるいは交互にスプライスされたｍＲＮＡから翻訳
された、天然に存在する、可溶性対応物を有する。レセプターのポリペプチドが
、それぞれ、膜の定着またはシグナルのトランスダクションを提供するために十
分な、膜貫通および細胞内のポリペプチドのセグメントの部分を欠如するとき、
レセプターのポリペプチドはこれらのセグメントを実質的に含まないと言われる
。

【００２７】 不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Ｘま
たは「ほぼ」Ｘとして表すとき、Ｘの記載する値は±１０％の正確さであると理
解されるであろう。 本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。

【００２８】 本発明は、一部分、β−デフェンシンのファミリーのタンパク質に対する相同
性を有するポリペプチドをコードする、新規なＤＮＡ配列の発見に基づく。すな
わち、本発明のｚａｍｐ１ポリペプチドは配列番号：３および本明細書において
に示す保存されたモチーフを表す：Ｃ（Ｘ）₆ Ｃ（Ｘ）₄ Ｃ（Ｘ）₇ ＧＸＣ（Ｘ
）₆ ＣＣ、ここで「（Ｘ）」は特定のアミノ酸の間の好ましくは非システインの
アミノ酸残基のメンバーである。システインの位置および間隔はβ−デフェンシ
ンのファミリーの特徴を示す。さらに、配列番号：３に示す保存されたモチーフ
の中に埋め込まれたＱＩＧトリペプチドのモチーフは、β−デフェンシンのファ
ミリーのいくつかのメンバー（例えば、ＳＡＰ−１／ｈＢＤ−２、ＢＮＢＤ、Ｔ
ＡＰおよびその他）において起こる。このモチーフは、β−デフェンシン構造の
中の３つのジサルファイド結合の存在を示すと解釈される。それらのジサルファ
イド結合は第１図に示されている。さらに、ほぼ９００塩基対のイントロン配列
はｚａｍｐ１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列の中に見出される。こ
のイントロン配列は、配列番号：１０中のアミノ酸位置２０におけるグリシン残
基をコードするコドン中の２つのグアニン残基の間で挿入されている。シグナル
配列と成熟タンパク質の間の区域における、このようなイントロンの配置は、β
−デフェンシンのファミリーの他のメンバーにおいて起こる。

【００２９】 この新規なＤＮＡに対応するｍＲＮＡの標準的ノザンブロットの組織の分布は
発現を明らかにしなかった。こうして、ｚａｍｐ１ポリペプチドのｍＲＮＡの正
常の組織のレベルはノザンブロットの検出感度より低いように思われる。このよ
うな観測は、デフェンシンに関する分野における知識、すなわち、デフェンシン
が低いレベルにおける構成的に発現されるが、感染時に高度に誘導可能であると
いう知識、と一致する。配列が見出されるライブラリーに基づく、組織分布の電
子の分析は、ｚａｍｐ１ポリペプチドが気管支上皮において発現されることを示
す。

【００３０】 本発明の新規なｚａｍｐ１ポリペプチドは、ヒト乾癬性皮膚から単離されたＳ
ＡＰ−１ヒトデフェンシンに対して相同な配列についてＥＳＴデータベースを検
索することによって、最初に同定された。単一のＥＳＴ配列が気管支の上皮ｃＤ
ＮＡライブラリーの中に発見され、そしてβ−デフェンシンのファミリーに関係
すると予測された。また、β−デフェンシンのコンセンサスモチーフに基づく第
２の検索はＥＳＴを同定した。こうして、コンセンサスモチーフはｚａｍｐ１ポ
リペプチドならびにＳＡＰ−１タンパク質の中に見出される；しかしながら、２
つのタンパク質の残りの配列は発散し、アミノ酸レベルにおいてほぼ４３％の同
一性により特徴づけられる。例えば、第２図に示す多重アラインメントを参照の
こと。

【００３１】 ｚａｍｐ１ポリペプチドのヌクレオチド配列は配列番号：１および配列番号：
９に記載されており、そしてその推定されたアミノ酸配列は、それぞれ、配列番
号：２および配列番号：１０に記載されている。ｚａｍｐ１ポリペプチドは、配
列の分析により、２つのヒトβ−デフェンシン、ｈＢＤ−１およびｈＢＤ−２（
ＳＡＰ−１）でグループ化することができるが、それはｈＢＤ−２およびウシＢ
ＮＢＤに最も密接に配列が関係し、そしてｈＢＤ−１に対する類似性が低い。

【００３２】 ｚａｍｐ１ポリペプチドについての三次元のモデルの構造を構築する、コンピ
ューターによりモデルを予備的に構成する努力は、鋳型としてＢＮＢＤ＿１２（
Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４（４１ ） ：１３６６３−１３６７１、１９９５）を使用して物理的に合理的なモデルの
構造を発生できることを示す。これらのペプチドの間に比較的低い配列の同一性
が存在するが、それらの全体の二次構造は非常に類似する。ループ領域に大部分
の変動性が観察される。ループのセグメントは各ループについて多数の可能なコ
ンフォメーションの１つを表すので、これは驚くべきことではない。双方の構造
は抗平行ベータシートのコア、ＢＮＢＤ＿１２モデルの４本の鎖およびｚａｍｐ
１ポリペプチドにおける３本の鎖から主として構成されている。ＢＮＢＤ＿１２
鎖におけるベータ鎖の２本の間で形成された回転は、また、２つのベータ鎖を接
続するｚａｍｐ１ポリペプチドのモデルにおいて見出される。ＢＮＢＤ＿１２の
全体のフォルディングは、ベータ鎖／短いベータ鎖／短いベータ鎖／ターン／ベ
ータ鎖のパターンに従う。ｚａｍｐ１ポリペプチドのフォルディングは、ベータ
鎖／ベータ鎖／ターン／ベータ鎖から成る。これらの普通の構造因子は高度に重
ねることができる。こうして、２つのポリペプチドは同一のまたは類似する生物
学的プロセスに十分に関係することができる。

【００３３】 本発明の他の面は、ｚａｍｐ１ポリペプチドのフラグメントを含む。好ましい
フラグメントは、配列番号：２のアミノ酸１（Ｉｌｅ）からアミノ酸１８（Ｇｌ
ｙ）または２０（Ｇｌｙ）までの範囲および配列番号：１０のアミノ酸１（Ｍｅ
ｔ）からアミノ酸（Ｇｌｙ）または２２（Ｇｌｙ）までの範囲の、リーダー配列
を含む。このようなリーダー配列を使用して、他のポリペプチドの分泌を指令す
ることができる。このような本発明のフラグメントは、次のようにして使用する
ことができる：分泌のために選択的したオールタネイト（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）
タンパク質との融合物として、オールタネイト分泌リーダー配列を形成する；融
合タンパク質の発現を指令することができる調節領域を有するプラスミドを被験
細胞の中に導入する；そしてタンパク質の分泌をモニターする。

【００３４】 本発明は、また、下記のポリペプチドから成る群より選択されるｚａｍｐ１ポ
リペプチドを組込んだ融合構築物を提供する：（ａ）アミノ酸残基１（Ｉｌｅ）
、１９（Ｈｉｓ）または２１（Ｇｌｙ）からアミノ酸残基６５（Ｌｙｓ）までの
配列番号：２に示すアミノ酸残基の配列、またはアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）、２
１（Ｈｉｓ）または２３（Ｇｌｙ）からアミノ酸残基６７（Ｌｙｓ）までの配列
番号：１０に示すアミノ酸残基の配列；あるいは（ｂ）（ａ）の哺乳動物種の相
同体またはヒトパラログ；他のデフェンシン分子の少なくとも成熟ポリペプチド
領域；および、必要に応じて、それらの間のポリペプチドのリンカー。デフェン
シン分子が病原体の異なるスペクトルを有するとき、それらを含有する融合構築
物はより広い範囲の抗微生物作用を示すことが期待される。必要に応じてポリペ
プチドのリンカーを使用して、融合物の成分のポリペプチドを分離するか、ある
いは融合タンパク質の柔軟性を可能とし、これにより融合タンパク質の各デフェ
ンシン成分の抗微生物活性を保存する。当業者はこのようなリンカーを設計する
ことができる。

【００３５】 ｚａｍｐ１ポリペプチドのコンセンサスデフェンシン分子において高度に保存
されたアミノ酸は、新しいファミリーのメンバーを同定する道具として使用する
ことができる。例えば、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用
して、種々の組織源から得られたＲＮＡから保存されたモチーフをコードする配
列を増幅することができる。さらに詳しくは、下記のプローブを使用して他のヒ
トまたはｚａｍｐ１様β−デフェンシンを同定することができる。本発明のこの
面の好ましい態様は、配列番号：２のアミノ酸残基３１および６１の間の範囲で
ある（配列番号：１のヌクレオチド９１〜１８３に対応する）。特に、前述の配
列から設計された、高度にデジェネレイトのプライマーはこの目的に適当である
。

【００３６】 配列番号：４は、配列番号：２のｚａｍｐ１ポリペプチド（アミノ酸１〜６５
）をコードする、すべてのポリヌクレオチドを包含するデジェネレイトポリヌク
レオチド配列である。配列番号：１１は、配列番号：１０のｚａｍｐ１ポリペプ
チドをコードする、すべてのポリヌクレオチドを包含する縮重ポリヌクレオチド
配列である。こうして、配列番号：４のヌクレオチド１、６１または６７からヌ
クレオチド１９５または２１３までの範囲および配列番号：１１のヌクレオチド
１、６１または６７からヌクレオチド２０１または２１９までの範囲のｚａｍｐ
１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明に包含される。また、
配列番号：４および配列番号：１１の類似領域から形成される、配列番号：１お
よび配列番号：１０に関して前述した、フラグメントおよび融合物は本発明に包
含される。配列番号：４中の記号を下記表１に要約する。

【００３７】

【表１】

【００３８】 所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号：４およ
び配列番号：１１において使用するデジェネレイトコドンを、下記表２に記載す
る。

【００３９】

【表２】

【００４０】 当業者は理解するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代
表する、縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セ
リン（ＷＳＮ）の縮重コドンは、ある環境において、アルギニン（ＡＧＲ）をコ
ードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）の縮重コドンは、ある環境に
おいて、セリン（ＡＧＹ）をコードするすることができる。同様な関係はフェニ
ルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在する。したがって、縮
重配列に包含される、いくつかのポリヌクレオチドは変異型アミノ酸配列をコー
ドすることができるが、当業者は、配列番号：２および配列番号：１０のアミノ
酸配列を参照することによって、このような変異型配列を容易に同定することが
できる。変異型配列は、本明細書において記載するように、機能性について容易
に試験することができる。

【００４１】 本発明の他の面において、精製したｚａｍｐ１ポリペプチドと、薬学上許容さ
れるビヒクルとを含んでなる医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は
、病理学微生物、例えば、細菌、真菌およびウイルスの感染に関連する症状の治
療において使用することができる。ｚａｍｐ１ポリペプチドの抗菌的応用は、病
原体が標準的治療に対する耐性となった状況を包含する。例えば、病院の敗血症
は増加する問題である。なぜなら、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓ ）株は普通に使用される抗生物質に対して耐性となるからである。

【００４２】 一般に、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合物、抗体、アゴニスト
およびアンタゴニストをこの分野において知られている技術により評価すること
ができる。さらに詳しくは、被験因子に対する微生物細胞培養物の感受性を評価
し、そして感染したマウスに対する被験因子の保護作用を評価することによって
、抗微生物活性を評価することができる。例えば、Ｍｕｓｉｅｋ ｅｔ ａｌ．
、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｒ． ３：４０、１９
７３、参照。抗微生物活性を評価する既知の技術は、例えば、Ｂａｒｓｕｍ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ． ８（５）：７０９−１４、１９９５
；Ｓａｎｄｏｖｓｋｙ−Ｌｏｓｉｃａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．Ｍ ｙｃｏｌ．（Ｅｎｇｌａｎｄ） ２８（４）：２７９−８７、１９９０；Ｍｅｈ
ｅｎｔｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｅｎｇｌａｎ ｄ） １３５（Ｐｔ．８）：２１８１−８、１９８９；ＳｅｇａｌおよびＳａｖ
ａｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ２４：４７７−４７９、１９８６およびその他を包含する
。抗ウイルス活性に対して特異的な既知のアッセイは、例えば、Ｄａｈｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６０（３）：１０６８−７４、１９８６、に記
載されている。

【００４３】 さらに、契約研究所は抗微生物性質を評価するサービスを提供する。例えば、
パンラブス・インコーポレーテッド（Ｐａｎｌａｂｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｂａｔｈ
ｅｌｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）は、下記の微生物のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉ
ｎ ｖｉｖｏの試験を提供する：細菌、グラム陰性細菌（エンテロバクター・ク
ロア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇ ａｒｉｓ ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒ ｕｇｉｎｏｓａ ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍ ）およびセラチア・マルセカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｓｅｃａ ｎｓ ））、グラム陽性細菌（バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ ｉｌｉｓ ）、ブレベバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｅｂａｃｔｅｉ ｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ）、コリネバクテリウム・ミヌチシムム（Ｃｏ ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ ）、ミクロコッカス・
ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、マイコバクテリウム・ラ
ネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｎａｅ）、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）株およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ ）株）および嫌気性生物（アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏ ｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒ ｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓ ｔｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ）、コリネバクテリウム・アクネス（Ｃｏ ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌ ｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ）およびポルフィロモナス・ジンジバリス（ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ）、ならびに原生動物（ト
リコモナズ・フェツス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｆｏｅｔｕｓ））および真菌
（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エ
ピデルモフィトン・フロッコーサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃ ｃｏｓｕｍ ）、エキソフィアラ・ジェンセルメイ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａ ｎｓｅｌｍｅｉ ）、ミクロウポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）株、トリコフィ
トン（Ｔｒｃｈｏｐｈｔｏｎ）株およびその他）。モレキュラー・プローブス・
オブ・オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ）は
、細菌学において使用するための商業的に入手可能な蛍光技術を有する。

【００４４】 所望ならば、これに関するｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合タン
パク質、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体の性能をこれに関して機能的で
あることが知られているタンパク質、例えば、プロリンに富んだタンパク質、リ
ゾチーム、ヒスタチン、ラクトペルオキシダーゼおよびその他と比較することが
できる。さらに、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗
体、アゴニストまたはアンタゴニストを１またはそれ以上の抗微生物因子と組合
わせて評価して、相乗作用を同定することができる。

【００４５】 本発明の医薬組成物は、また、前炎症活性を望むとき、使用することができる
。このような前炎症活性のための応用は、特に制限されたまたは損傷された血管
系を有する区域における、慢性の組織の損傷、例えば、糖尿病に関連する四肢に
おける損傷における損傷、の治療を包含する。対照的に、ｚａｍｐ１ポリペプチ
ドは抗炎症剤として役立ち得る。

【００４６】 本発明のｚａｍｐ１ポリペプチドの医薬組成物は、また、免疫応答の刺激を望
む症状の治療において使用することができる。このような症状は、機能不全の免
疫系を有する患者、特に後天性免疫不全症候群の患者または化学療法、放射線治
療またはその他を受けている個体の治療を包含する。 気管支上皮のライブラリーおよび膵嚢胞性繊維症の中に見出されたｚａｍｐ１
ポリペプチドは頻繁な微生物の感染により特徴づけられるので、ｚａｍｐ１ポリ
ペプチドを含有する医薬組成物は、また、膵嚢胞性繊維症に関連する肺の感染の
処理において使用することができる。また、塩濃度に対する感受性の減少により
特徴づけられる、操作されたｚａｍｐ１ポリペプチドは本発明に包含される。高
い塩濃度に対する感受性の減少は、高い塩濃度の環境、例えば、膵嚢胞性繊維症
を患う患者の肺の気道において、操作されたｚａｍｐ１ポリペプチドの抗微生物
活性を保存するであろう。このようにして、肺への送出のために配合された、操
作されたｚａｍｐ１ポリペプチドを含有する医薬組成物は、膵嚢胞性繊維症に関
連する肺の感染を処理するために使用することができる。

【００４７】 放射性ハイブリッドマッピングは、哺乳動物の染色体の高い分解能の、隣接す
る地図を構築するために開発された、幹細胞の遺伝的技術である（Ｃｏｘ ｅｔ
ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：２４５−５０、１９９０）。遺伝子の配列
の部分的または完全な知識は、染色体の放射性ハイブリッドマッピングパネルと
ともに使用するために適当なＰＣＲプライマーの設計を可能とする。全体のヒト
ゲノムをカバーする、放射性ハイブリッドマッピングパネル、例えば、Ｓｔａｎ
ｆｏｒｄ Ｇ３ ＰａｎｅｌおよびＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨ Ｐａｎｅ
ｌは商業的に入手可能である（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
、アラバマ州ハンツヴィレ）。これらのパネルは、急速な、ＰＣＲをベースとす
る染色体の局在化および遺伝子、配列標識化部位（ＳＴＳｓ）、および問題の領
域内の他の非多形性および多形性マーカーの順序決定を可能とする。これは、問
題の新しく発見された遺伝子と前にマッピングされたマーカーとの間の、直接的
に比例する物理的距離の確立を包含する。遺伝子の位置の正確な知識は、下記の
目的を包含する、多数の目的に有用である：１）配列が存在するｃｏｎｔｉｇの
一部分であるかどうかを決定し、そして追加の取り囲む遺伝的配列を種々の形態
、例えば、ＹＡＣｓ、ＢＡＣｓまたはｃＤＮＡクローンで得ること；２）同一染
色体領域に対する連鎖を示す、遺伝性疾患の可能な候補の遺伝子を準備すること
；および３）特定の遺伝子がどんな機能を有することができるかの決定を促進す
ることができる、交差参照モデルの生物、例えば、マウス。

【００４８】 結果が示すように、ｚａｍｐ１遺伝子はＷＩＣＧＲ放射線ハイブリッド地図上
のヒト染色体８連鎖基の上部から３３．５ｃＲ＿３０００マッピングされた。近
接および遠位のフレームワークのマーカーは、それぞれ、ＣＨＬＣ．ＧＡＴＡ６
２Ｄ１０およびＷＩ−３８２３（Ｄ８Ｓ１５１１）であった。取り囲むマーカー
を使用すると、８ｐ２３．３−ｐ２３．２領域中のｚａｍｐ１遺伝子は統合され
たＬＤＢ染色体８地図上に位置決定される（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｏｃａ
ｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｈａｍｐ
ｔｏｎ、ＷＷＷ ｓｅｒｖｅｒ：ｈｔｔｐ：／／ｃｅｄａｒ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ
．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂｌｉｃ＿ｈｔｍｌ／）。

【００４９】 以前において、双方の造血由来（例えば、ＨＤ−１、Ｓｐａｒｋｅｓ ｅｔ
ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５（２）：２４０−４、１９８９、に記載されてい
る）および上皮由来（例えば、ＨＤ−５およびＨＤ−６、Ｂｅｖｉｎｓ ｅｔ
ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３１（１）：９５−１０６、１９９６、に記載され
ている）のヒトデフェンシン遺伝子は、ヒト染色体８（８ｐ２３）の短いアーム
上に局在化される。いくつかのデフェンシン遺伝子、すなわち、クリプイジン、
は、マウスゲノム中にマッピングされ、そしてマウス染色体８上のヒトとともに
保存されたシンテニーの領域の中に見出される。例えば、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ
ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５（２）：２３３−９、１９８９、参照。最
近、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４３（３）：３１６−２０、１
９９７は、染色体８上のデフェンシンの同一クラスターへのｈＢＤ＿１遺伝子の
マッピングを報告した。α−およびβ−デフェンシン遺伝子は哺乳動物のダイバ
ージェンス前に共通の祖先の遺伝子から発生することを、これらの著者らは提案
している。こうして、染色体８のこの領域へのｚａｍｐ１ポリペプチドをコード
する遺伝子の局在化は、ヒトの古典的デフェンシンと同一染色体の位置に第２ヒ
トβ−デフェンシンを付加し、そしてデフェンシンの進化についての仮説を支持
する。

【００５０】 本発明は、また、診断用途において使用する試薬を提供する。例えば、ｚａｍ
ｐ１遺伝子、ｚａｍｐ１ ＤＮＡまたはＲＮＡからなるプローブ、またはそれら
のサブ配列を使用して、ｚａｍｐ１遺伝子が染色体１９上に存在するかどうか、
あるいは突然変異が起こったかどうかを決定することができる。ｚａｍｐ１遺伝
子座における検出可能な染色体の異常は、異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入
、欠失、制限部位の変化および再配列を包含するが、これらに限定されない。こ
のような異常は、分子遺伝的技術、例えば、制限フラグメントの長さの多形性（
ＲＦＬＰ）分析、ＰＣＲ技術を用いる短い直列反復（ＳＴＲ）分析、およびこの
分野において知られている他の遺伝的連鎖分析技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．、ｉｂｉｄ．；Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．、ｉｂｉｄ．；Ｍａｒｉａ
ｎ、Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５−２６５、１９９５）を使用することによって
、検出することができる。

【００５１】 本発明の他の面は、細胞培養物中の、あるいはＳＰＧ、チェディアック−東症
候群またはデフェンシン濃度の変更により特徴づけられる他の症状について評価
を行っている患者の血清試料または組織のバイオプシー中の、ｚａｍｐ１ポリペ
プチドの検出を包含する。ｚａｍｐ１ポリペプチドは、イムノアッセイ技術およ
びｚａｍｐ１ポリペプチドのエピトープを認識することができる抗体を使用して
検出することができる。さらに詳しくは、本発明は、下記の工程からなるｚａｍ
ｐ１ポリペプチドを検出する方法を包含する： ｚａｍｐ１ポリペプチドを含有する可能性がある溶液または試料または細胞培
養物のライゼイトまたは上清を、固体の支持体に結合させた抗体に暴露し、ここ
で前記抗体はｚａｍｐ１ポリペプチドの第１エピトープに結合し； 前記固定化された抗体−ポリペプチドを洗浄して、非結合汚染物質を除去し； 固定化された抗体−ポリペプチドをｚａｍｐ１ポリペプチドの第２エピトープ
に対して向けられた第２抗体に暴露し；ここで第２抗体は検出可能な標識とアソ
シエートしており；そして 検出可能な標識を検出する。対照のそれと異なるｚａｍｐ１ポリペプチド濃度
は、ＳＰＧ、チェディアック−東症候群またはデフェンシン濃度の変更により特
徴づけられる他の症状を指示することができる。さらに、ｚａｍｐ１の発現は、
感染の危機の開示の予測として、膵嚢胞性繊維症の患者においてモニターするこ
とができる。また、高いデフェンシン、例えば、ｚａｍｐ１ポリペプチド、のレ
ベルは細胞障害性作用に関係づけられ、このような細胞障害性を防ぎまたは処理
する治療を方向づけるためにｚａｍｐ１ポリペプチドのレベルを使用できること
を示す。例えば、治療の理学療法において、ｚａｍｐ１ポリペプチドに対して向
けられた抗体を投与して、ｚａｍｐ１ポリペプチドを不活性化することができる
。

【００５２】 本発明の追加の面において、前述のｚａｍｐ１ポリペプチドに特異的に結合す
る抗体または合成された結合性タンパク質（例えば、ファージディスプレイによ
り発生されたもの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｆａｂ、およびその他）が提供され
る。このような抗体は、本明細書に記載する他の使用のなかで、抗イディオタイ
プ抗体の製造に有用である。合成された結合性タンパク質は、商業的に入手可能
なキット、例えば、Ｐｈ．Ｄ^TMファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリ
ー・キット（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋ
ｉｔｓ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチュセッ
ツ州ベバーリイ）、から入手可能である）を使用して、ファージディスプレイに
より製造することができる。ファージディスプレイ技術は、例えば、米国特許第
５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号および米国特許第５，
５７１，６９８号に記載されている。

【００５３】 本発明の追加の面は、前述のｚａｍｐ１ポリペプチドのアゴニストまたはアン
タゴニストを同定する方法を提供する。このようなアゴニストまたはアンタゴニ
ストは、本明細書においてさらに議論するように、価値ある性質を有することが
ある。１つの態様において、ｚａｍｐ１ポリペプチドのアゴニストに対して応答
性の細胞を準備し、被検化合物の存在において細胞を培養し、細胞の応答をｚａ
ｍｐ１ポリペプチドの存在において培養した細胞と比較し、そして細胞の応答が
同一の型である被検化合物を選択することからなる、ｚａｍｐ１ポリペプチドの
アゴニストを同定する方法が提供される。

【００５４】 他の態様において、ｚａｍｐ１ポリペプチドに対して応答性の細胞を準備し、
ｚａｍｐ１ポリペプチドの存在において細胞の第１部分を培養し、ｚａｍｐ１ポ
リペプチドおよび被検化合物の存在において細胞の第２部分を培養し、そして細
胞の第１部分に比較して、細胞の第２部分の細胞の応答の減少を検出することか
らなる、ｚａｍｐ１ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法が提供される
。

【００５５】 本発明のそれ以上の面は、細胞培養において単球の化学誘引を研究する方法を
提供し、この方法は、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質
、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストからなる培地中で単球をインキュベー
トして、単球の化学誘引を研究または評価することからなる。このような評価は
、この分野において知られている方法、例えば、上に言及したＴｅｒｒｉｔｏ
ｅｔ ａｌ．が記載する方法を使用して、実施することができる。

【００５６】 メラノコルチンのレセプターは、アデニレートシクラーゼを活性化し、カルシ
ウムのフラックスを引き起こす、Ｇ結合タンパク質のレセプターである。アゴウ
チ（ａｇｏｕｔｉ）タンパク質（これはトキシン様である３６アミノ酸のドメイ
ンを含有する）は、ＭＣ１およびＭＣ４へのＭＳＨ−アルファの結合を阻害する
と考えられる。さらに、アゴウチタンパク質はカルシウムチャンネルのアンタゴ
ニストであると考えられ、そしてある種のトキシンはイオンフラックスをモジュ
レートすると考えられる。デフェンシンがカルシウムチャンネルをブロックでき
ることを示唆する、実験の証拠が発生された。

【００５７】 本発明のそれ以上の面は、細胞培養においてレセプターのメラノコルチンのフ
ァミリーの活性を研究する方法を提供する。この方法は、このようなレセプター
（例えば、ＡＣＴＨレセプターまたはその他）を内因的に有する細胞またはこの
ようなレセプターを有するように操作された細胞を、リガンドまたは推定上のリ
ガンドおよびｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、
アゴニストまたはアンタゴニストからなる培地中でインキュベートして、リガン
ドまたは推定上のリガンドの結合および／またはイオンフラックスの調節または
モジュレーションを研究または評価することからなる。このような評価は、この
分野において知られている方法、例えば、上に言及したＺｈｕ ｅｔ ａｌ．が
記載する方法を使用して、実施することができる。

【００５８】 本発明のそれ以上の面は、細胞培養においてイオンフラックスを研究する方法
を提供する。この方法は、イオンフラックス、例えば、カルシウムフラックス、
ナトリウムフラックス、カリウムフラックスまたはその他を調節またはモジュレ
ートできる細胞を、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、
抗体、アゴニストまたはアンタゴニストからなる培地中でインキュベートして、
イオンフラックスの調節またはモジュレートを研究または評価することからなる
。

【００５９】 本発明のそれ以上の面は、細胞培養において、哺乳動物細胞、例えば、腫瘍細
胞に対する細胞致死性活性を研究する方法を提供する。この方法は、このような
細胞を、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴ
ニストまたはアンタゴニストからなる培地中で、高い被験因子および低い細胞の
濃度においてインキュベートして、細胞致死性活性を研究または評価することか
らなる。このような評価は、この分野において知られている方法、例えば、Ｌｉ
ｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ６８：１４０７−１０、１
９８６およびＳｈｅｕ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２８：６２６−９、１９９３、に記載されている方法に
より実施することができる。

【００６０】 本発明の他の面は、外因的微生物の感染、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌
の感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究において、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグメン
ト、融合タンパク質またはアゴニストを細胞培養試薬として使用することを包含
する。このような成分は、また、感染のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて使用
することができる。

【００６１】 本発明の追加の面は、細胞培養において上皮細胞のデフェンシンを研究するこ
とである。本発明のこの面において、上皮細胞を培養し、病原性刺激因子に対し
て暴露する。次いで、上皮細胞によるｚａｍｐ１ポリペプチドの産生の誘導を測
定する。 本発明の好ましい態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：
２、配列番号：３、配列番号：１０の同様な大きさの領域、本明細書に特別に記
載する他のプローブ、またはそれに対して相補的配列に、ストリンジェント条件
下にハイブリダイゼーションするであろう。一般に、ストリンジェント条件は、
規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列について熱的融点よりも約
５℃低い（Ｔｍ）ように選択される。Ｔｍは、ターゲット配列の５０％が完全に
合致するプローブにハイブリダイゼーションする温度（規定されたイオン強度お
よびｐＨ下に）である。典型的なストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７にお
いて約０．０３Ｍまででありかつ温度が少なくとも約６０℃である条件である。

【００６２】 前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡ
を包含する。ＤＮＡおよびＲＮＡを製造する方法は、この分野においてよく知ら
れている。一般に、ＲＮＡは気管支上皮から単離することが好ましいが、ＤＮＡ
は、また、他の組織からのＲＮＡを使用して製造することができるか、あるいは
ゲノムＤＮＡから単離することができる。全体のＲＮＡは、グアニジンＨＣｌ抽
出および引き続くＣｓＣｌ勾配における遠心による単離により製造することがで
きる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５
２−９４、１９７９）。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡは、ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：１４０８−１２、１９７
２）の方法に従い、全体のＲＮＡから製造される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は
、既知の方法により、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡから製造される。別法において、ゲノ
ムＤＮＡを単離することができる。次いで、ｚａｍｐ１ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを、例えば、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲにより、
同定および単離する。

【００６３】 本発明は、さらに、他の種からの対応物のポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド（オーソログ）を提供する。これらの種は下記のものを包含するが、これらに
限定されない：哺乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊椎動
物および無脊椎動物。特に興味あるものは、他の哺乳動物種、例えば、ネズミ、
ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類からのｚａｍｐ１ポリペプ
チドである。ヒトタンパク質の種相同体は、本発明により提供される情報および
組成物を慣用のクローニング技術と組み合わせて使用して、クローニングするこ
とができる。例えば、タンパク質を発現する組織および細胞のタイプから得られ
るｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡをクローニングすることができる。本明細書に
おいて開示する配列から設計されたプローブでノザンブロットをプロービングす
ることによって、ｍＲＮＡの適当な源を同定することができる。次いで、陽性の
組織または細胞系統のｍＲＮＡからライブラリーを調製する。次いで、種々の方
法により、例えば、完全なまたは部分的ヒトｃＤＮＡでプロービングするか、あ
るいは開示された配列をベースとするデジェネレイトプローブの１またはそれ以
上の組でプロービングすることによって、ｚａｍｐ１をコードするｃＤＮＡを単
離することができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、ＰＣＲ（Ｍｕｌ
ｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）により、本明細書において開示する
、配列から設計されたプライマーを使用して、ｃＤＮＡをクローニングすること
ができる。追加の方法において、ｃＤＮＡライブラリーを使用して宿主細胞を形
質転換またはトランスフェクトすることができ、そして問題のｃＤＮＡの発現を
ｚａｍｐ１ポリペプチドに対する抗体で検出することができる。また、同様な技
術をゲノムのクローンの単離に適用することができる。

【００６４】 当業者は認識するように、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：９および
配列番号：１０に開示する配列はヒトｚａｍｐ１遺伝子およびポリペプチドの単
一のアレレを表し、そしてアレレの変動およびオールタネイトスプライシングが
起こることが期待される。アレレ変異型は、標準的手順に従い、異なる個体から
ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーをプロービングすることによって、クロー
ニングすることができる。配列番号：２および配列番号：１０に示すＤＮＡ配列
のアレレ変異型は、サイレント突然変異体を含有するものおよび突然変異がアミ
ノ酸配列を変化させるものを包含し、本発明の範囲内に入る。

【００６５】 本発明は、また、配列番号：２および配列番号：１０のポリペプチドおよびそ
れらの種相同体／オーソログノポリペプチドに対して実質的に相同である、単離
されたｚａｍｐ１ポリペプチドを提供する。用語「実質的に相同」は、本明細書
において、配列番号：２または配列番号：１０に示す配列またはそれらのオーソ
ログまたはパラログに対して５０％、好ましくは６０％、より好ましくは少なく
とも８０％の配列の同一性を有するポリペプチドを表すために使用される。この
ようなポリペプチドは配列番号：２１または配列番号：１０に示す配列またはそ
れらのオーソログまたはパラログに対して少なくとも９０％の同一性、より好ま
しくは９５％またはそれ以上の同一性を有する。配列の同一性の百分率は慣用法
により決定される。例えば、下記の文献を参照のこと：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ
ａｌ．、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ． ４８：６０３−６１６、１９８６お
よびＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９、１９９２。簡単に述べると
、表３（アミノ酸は標準的１文字コードにより示されている）に示すように１０
のギャップオープニングペナルティー、１のギャップエクステンションペナルテ
ィー、およびＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（ｉｂｉｄ．）の「ブロ
サム６２」スコアリングマトリックスを使用して、２つのアミノ酸配列を整列さ
せて整列スコアを最適化する。次いで、最適な整列の同一百分率は、次のように
して計算される： 同一の整合（ｍａｔｃｈｅｓ）の総数）／（より長い配列の長さ＋２つの配列 を整列させるために、より長い配列の中に導入されたギャップの数）×１００

【００６６】

【表３】

【００６７】 ポリヌクレオチド分子の配列の同一性は、前述した比を使用する同様な方法に
より決定される。 実質的に相同性のタンパク質およびポリペプチドは、１またはそれ以上のアミ
ノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化は好
ましくは小さい特質を有する、すなわち、このような小さい特質は次の通りであ
る：保存的アミノ酸置換（表４参照）およびタンパク質またはポリペプチドのフ
ォルディングまたは活性に影響を実質的に与えない他の置換；小さい欠失、典型
的には１〜約３０アミノ酸の欠失；および小さいアミノ末端およびカルボキシル
末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、約２０〜２５
残基までの小さいリンカーペプチド、または精製を促進する小さいエクステンシ
ョン（親和標識）（アフィニティーラベル）、例えば、ポリ−ヒスチジントラク
ト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：１０
７５、１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ ｏｌ． １９８：３、１９９１）、グルタチオン Ｓ トランスフェラーゼ（Ｓ
ｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１、１９８８）、マルトー
ス結合性タンパク質（ＫｅｌｌｅｒｍａｎおよびＦｅｒｅｎｃｉ、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９０：４５９−４６３、１９８２；Ｇｕａｎ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｇｅｎｅ ９０：４５９−４６３、１９８２；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ ６７：２１−３０、１９８７）、チオレドキシン、ユビクイチン、セ
ルロース結合性タンパク質、Ｔ７ポリメラーゼ、または他の抗原性エピトープま
たは結合性ドメイン。一般に、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７、１
９９１、を参照のこと。親和標識をコードするＤＮＡは商業的供給会社（例えば
、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージイ州ピスカタウェイ；
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチュセッツ州ベバーリイ）から
入手可能である。親和標識を含むポリペプチドは、ｚａｍｐ１ポリペプチドと親
和標識との間にタンパク質分解切断部位をさらに含むことができる。好ましいこ
のような部位は、トロンビン切断部位および因子Ｘａ切断部位を包含する。

【００６８】

【表４】

【００６９】 本発明のタンパク質は、また、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことがで
きる。天然に存在しないアミノ酸は、限定されずに、下記のものを包含する：ト
ランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシ
プロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−ス
レオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチル
ホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ
−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニ
ン、４−アザフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、４−ヒドロキ
シプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα
−メチルセリン。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に組込む、い
くつかの方法はこの分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル
化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用してナンセンス突然変異を抑制する、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ系を使用することができる。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノ
アシル化する方法はこの分野において知られている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ
３０抽出物および商業的に入手可能な酵素および他の試薬からなる、無細胞系に
おいて、ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は実施され
る。タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、下記の文献を参
照のこと：Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１３：２７２２、１９９１；Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２：３０１、１９９１；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：８０６−８０９、１９９３；およびＣｈｕｎｇ ｅｔ
ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０１４５
−１０１４９、１９９３）。第２の方法において、突然変異されたｍＲＮＡおよ
び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクシ
ョンにより、キセノプス・オオサイト（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）中で
翻訳を実施する（Ｔｕｒｃａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１９９９１−１９９９８、１９９６）。第３の方法において、置換す
べき天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在においてかつ所望の
天然に存在しない１またはそれ以上のアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラ
ニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニンまたは４−フルオ
ロフェニルアラニン）の存在において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養する
。天然に存在しないアミノ酸をその天然の対応物の代わりにタンパク質の中に組
込む。Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３：７４７０−７４７
６、１９９４、参照。ｉｎ ｖｉｔｒｏ化学的修飾により、天然に存在するアミ
ノ酸残基を天然に存在しない種に変換することができる。化学的修飾を部位特異
的突然変異誘発と組合わせて、置換の範囲をさらに拡張することができる（Ｗｙ
ｎｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２：３９５−４０３
、１９９３）。

【００７０】 制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、
天然に存在しないアミノ酸、および非天然のアミノ酸をｚａｍｐ１ペプチドのア
ミノ酸残基と置換することができる。「非天然のアミノ酸」はタンパク質合成後
に修飾されてきており、および／または標準的アミノ酸のそれと異なる化学的構
造をそれらの側鎖の中に有する。非天然のアミノ酸は化学的に合成することがで
きるか、あるいは、好ましくは、商業的に入手可能であり、そしてピペコリン酸
、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン
、および３，３−ジメチルプロリンを包含する。

【００７１】 本発明のｚａｍｐ１ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野において
知られている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変
異誘発に従い同定することができる（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５、１９８９）。後者の技術におい
て、単一のアラニンの突然変異を分子中のすべての残基において導入し、そして
、後述するように、生ずる突然変異体分子を生物学的活性（例えば、抗微生物活
性）について試験して、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定す
る。また、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：
４６９９−４７０８、１９９６。また、核磁気共鳴、結晶学、電子回折またはホ
トアフィニティーラベリングのような技術と、推定上の接触部位のアミノ酸の突
然変異との組合わせにより決定した、構造の物理的分析により、リガンド−レセ
プターの相互作用の部位を決定することができる。例えば、下記の文献を参照の
こと：ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２
、１９９２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２４：８
９９−９０４、１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ ｔ． ３０９：５９−６４、１９９２。必須アミノ酸の同一性を、また、関係す
るβ−デフェンシンとの相同性の分析から推定することができる。

【００７２】 既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載
されている方法により、多数のアミノ酸の置換を行い、試験することができる：
Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５
３−５７、１９８８またはＢｏｗｉｅおよびＳａｕｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６、１９８９。簡単に述べ
ると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２またはそれ以上の位置を同時にラ
ンダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異したポリペプ
チドを配列決定して、各位置において許容可能な置換のスペクトルを決定する方
法を開示している。使用できる他の方法は、ファージディスプレイ（例えば、Ｌ
ｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１０８３２−１０８３７
、１９９１；Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号；
Ｈｕｓｅ、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４号）および領域特異的突然変異誘
発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ４６：１４５、１９８６
；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＤＮＡ ７：１２７、１９８８）を包含する。

【００７３】 開示されたｚａｍｐ１ ＤＮＡおよびポリペプチド配列の変異型は、下記の文
献に開示されているように、ＤＮＡシャフリングにより発生させることができる
：Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１、１９９４；Ｓｔｅｍ
ｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−
５１、１９９４；およびＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／２００７８号。簡単に述べると
、親ＤＮＡのランダムフラグメント化によるｉｎ ｖｉｔｒｏ相同組換えおよび
引き続くＰＣＲを使用するリアセンブリーによって、ランダムに導入された点突
然変異を生成することによって、変異型ＤＮＡを発生させる。１ファミリーの親
ＤＮＡ、例えば、異なる種からのアレレ変異型またはＤＮＡを使用して、追加の
変動性をこの方法に導入することによって、この技術を変更することができる。
所望の活性についての選択またはスクリーニング、および引き続く突然変異誘発
の追加の反復およびアッセイは、所望の突然変異体についての選択および同時の
有害な変化に対する選択により、配列の急速な「進化」を提供する。

【００７４】 本明細書において開示するような突然変異誘発法を、高い処理量の、自動化さ
れたスクリーニング法と組合わせて、宿主細胞におけるクローニングされた、突
然変異化されたポリペプチドの活性を検出することができる。活性ポリペプチド
をコードする突然変異化ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、そして現代的装置に
より急速に配列決定することができる。これらの方法は問題のポリペプチド中の
個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能とし、そして未知の構造のポリ
ペプチドに適用することができる。

【００７５】 前述の方法を使用して、当業者は、配列番号：２の残基１〜６５または配列番
号：１０の残基１〜６７またはそれらのアレレ変異型に対して実質的に相同性で
ありかつ野生型タンパク質の抗微生物を保持する、種々のポリペプチドを同定お
よび／または製造することができる。このようなポリペプチドは、また、一般に
上に開示した、追加のポリペプチドのセグメントを含むことができる。

【００７６】 本発明のポリペプチドは、全長のタンパク質、それらのフラグメントおよび融
合タンパク質を包含し、慣用技術に従い遺伝子操作された宿主細胞において産生
することができる。宿主細胞は、本発明の分子の抗微生物活性の結果として、多
少注意して選択しなくてはならない。例えば、ｚａｍｐ１ポリペプチド、フラグ
メント、融合タンパク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、抗微生物
機能の一部分として、宿主細胞を殺すことがあるので、細胞培養物をベースとす
る系を評価しなくてはならない。ｚａｍｐ１ポリペプチドは、潜在的な宿主細胞
の毒性の問題を回避するために、ＰＣＲまたは他のタンパク質の化学的技術によ
る製造を可能とするために十分に小さい大きさを有する。あるいは、天然の、ま
たは操作された前駆体のタンパク質は、成熟ｚａｍｐ１ポリペプチドを生ずる翻
訳後の切断の前に、不活性であり、これによりリソソームのパッケージングの前
に宿主細胞の細胞障害性を制限する。例えば、Ｌｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃ ｅｌｌ ６４：２２９−３０、１９９１、参照。こうして、ｚａｍｐ１ポリペプ
チドに対する前駆体のタンパク質は微生物の細胞培養において産生することがで
きる。

【００７７】 適当な宿主細胞は、外因的ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトすること
ができ、培養により増殖させることができる細胞の型であり、そして細菌、真菌
細胞、および培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞の微生
物の培養された細胞は好ましい。クローニングされたＤＮＡ分子を操作し、外因
的ＤＮＡを種々の宿主細胞の中に導入する技術は、下記の文献に記載されている
：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９８７。

【００７８】 一般に、ｚａｍｐ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内
に一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現のための必要
な他の遺伝因子に、作用可能に連鎖される。ベクターは、また、１またはそれ以
上の選択可能なマーカーおよび１またはそれ以上の複製起点を普通に含有するが
、当業者は認識するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々のベクタ
ー上に提供し、そして宿主細胞のゲノムの中への組込みにより外因的ＤＮＡの複
製を得ることができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、
ベクターおよび他の因子の選択は、当業者のレベル内の日常的設計事項である。
多数のこのような因子は文献に記載されており、そして商業的供給会社から入手
可能である。

【００７９】 ｚａｍｐ１ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグ
ナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列として知られている
）を発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はｚａｍｐ１のそれである
ことができるか、あるいは他の分泌されたタンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ）から
誘導するか、あるいは新規に合成することができる。分泌シグナル配列をｚａｍ
ｐ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しいリーディングフレームで結合
する。分泌シグナル配列は普通に問題のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に
対して５’に配置されるが、ある種の分泌シグナル配列は問題のＤＮＡ配列の中
のどこかに位置決定することができる（例えば、Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．、米
国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５
，１４３，８３０号、参照）。

【００８０】 また、本発明のポリペプチドの中に含有される分泌シグナル配列を使用して、
他のポリペプチドを分泌経路の中に向けることができる。本発明は、このような
融合ポリペプチドを提供する。配列番号：２のアミノ酸残基１〜１８または１２
または配列番号：１０のアミノ酸残基１〜２０または２２から誘導された分泌シ
グナル配列が他のポリペプチドに作用可能に連結された、シグナル融合ポリペプ
チドを、この分野において知られておりかつ本明細書に開示されている方法によ
り、作ることができる。好ましくは、本発明の融合ポリペプチドの中に含有され
る分泌シグナル配列を追加のペプチドに対してアミノ末端的に融合させて、追加
のペプチドを分泌経路の中に向ける。このような構築物はこの分野において知ら
れている多数の用途を有する。例えば、これらの新規な分泌シグナル配列の融合
構築物は、例えば、常態で分泌されないタンパク質の活性成分、例えば、レセプ
ターの分泌を指令することができる。このような融合をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにおいて使用して、ペプチドを分泌経路を通して向けることがで
きる。

【００８１】 培養された哺乳動物細胞は、本発明において適当な宿主である。外因的ＤＮＡ
を哺乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する：リン酸カル
シウム仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １ ４ ：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶ
ａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）、エレクト
ロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１
−８４５、１９８２）、ＤＥＡＥ−デキストリン仲介トランスフェクション（Ａ
ｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９８７）、リポソーム仲介トランスフェクション（Ｈａｗ
ｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３；Ｃ
ｉｃｃａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｆｏｃｕｓ １５：８０、１９９３）、およ
びウイルスベクター（Ａ．ＭｉｌｌｅｒおよびＧ．Ｒｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９０、１９８９；Ｑ．ＷａｎｇおよびＭ．Ｆｉｎ
ｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２：７１４−１６、１９９６）。培養された哺
乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記の特許文献に記
載されている：Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，７１３，３３
９号；Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍ
ｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，５７９，８２１号；およびＲｉｎｇｏ
ｌｄ、米国特許第４，６５６，１３４号。適当な培養された哺乳動物細胞は下記
のものを包含する：ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ
−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
ＣＲＬ １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈ
ａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２、１９７７
）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ Ｎｏ
．ＣＲＬ ６１）細胞系統。追加の適当な細胞系統はこの分野において知られて
おり、そして公衆の寄託機関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（マリイランド州ロックビレ）から入手可能である。一般に、強い転写
プロモーター、例えば、ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルスからのプロモー
ターは好ましい。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号参照。他の適当なプ
ロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からプロモーター（米国特許第４，５７
９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号）およびアデノウイルスの
主要な後期プロモーターを包含する。

【００８２】 薬剤選択を一般に使用して、外来ＤＮＡが挿入された、培養された哺乳動物細
胞について選択する。このようなは普通に「トランスフェクタント」と呼ばれる
。選択因子の存在において培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に移行させる
ことができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい選
択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子
である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、Ｇ−４１８またはその他の存在に
おいて実施される。また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベルを増加
することができる、「増幅」と呼ぶ方法。低いレベルの選択因子の存在において
トランスフェクタントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入された遺
伝子の産物を高いレベルで産生する細胞について選択することによって、増幅は
実施される。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセートに対
する耐性を付与する、ジヒドロフォレートリダクターゼである。他の薬剤耐性遺
伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多薬剤耐性、プロマイシンアセチルトラン
スフェラーゼ）を使用することもできる。変更された表現型を導入するオールタ
ネイティブマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表面のタンパク
質、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩのＭＨＣ、胎盤アルカリ性ホスファター
ゼを使用して、ＦＡＣＳソーティングまたは磁気ビーズ分離技術のような手段に
より、非形質転換細胞からトランスフェクテッド細胞を選別することができる。

【００８３】 植物細胞、昆虫細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細
胞として使用することもできる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクタ
ーとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈ
ｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用することは、Ｓｉｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉ ｏｓｃｉ． （Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８、１９８７、において概観
されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産生は、Ｇ
ｕａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１６２，２２２号およびＷＩＰＯ
公開ＷＯ９４／０６４６３号に記載されている。オートグラファト・カリフォル
ニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（
ＡｃＮＰＶ）から普通に誘導される、組換えバキュロウイルスで、昆虫細胞を感
染させることができる。２つの方法の１つにより、ｚａｍｐ１ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡをＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子のコーディング配列の代わりに
。バキュロウイルスのゲノムの中に挿入する。第１は、野生型ＡｃＮＰＶとＡｃ
ＮＰＶ配列によりフランクされたｚａｍｐ１を含有する転移ベクターとの間の相
同的ＤＮＡ組換えの伝統的方法である。適当な昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞を
野生型ＡｃＮＰＶで感染させ、そしてＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモータ
ー、ターミネーター、およびフランキング配列に作用可能に連鎖されたｚａｍｐ
１ポリペプチドからなる転移ベクターでトランスフェクトする。下記の文献を参
照のこと：ＫｉｎｇおよびＰｏｓｓｅｅ、Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ 、
Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ
．、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４；およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ
．編、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｔｏｔｏｗａ、
ＮＪ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９５。昆虫細胞内の自然の組換えは、ポ
リヘドリンプロモーターにより推進されたｚａｍｐ１を含有する組換えバキュロ
ウイルスを生ずるであろう。組換えウイルスの系統は、この分野において普通に
使用されている方法により作られる。

【００８４】 組換えバキュロウイルスを作る第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗが記載するトラン
スポゾンをベースとする系を利用する（Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉ ｒｏｌ． ６７：４５６６−７９、１９９３）。この系はＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ
キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マリイランド州ロックビレ）で
販売されている。この系は転移ベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ１^TM（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用し、ここでｐＦａｓｔＢａｃ１^TMは「バクミド
（ｂａｃｍｉｄ）」と呼ばれる大きいプラスミドとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
の中に維持されたバキュロウイルスのゲノムの中にｚａｍｐ１ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを動かすために、Ｔｎ７トランスポゾンを含有する。ｐＦａｓｔ
Ｂａｃ１^TM転移ベクターは、ＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターを利用して、
問題の遺伝子、この場合においてｚａｍｐ１、の発現を推進する。しかしながら
、ｐＦａｓｔＢａｃ１^TMはかなりな程度に修飾可能である。ポリヘドリンプロモ
ーターを除去し、バキュロウイルスをベースとするタンパク質プロモーター（ま
た、Ｐｃｏｒ、ｐ６．９またはＭＰプロモーターとして知られている）で置換し
、ここでこのプロモーターは以前にバキュロウイルスの感染において発現され、
そして分泌されたタンパク質の発現に好都合であることが示されている。下記の
文献を参照のこと：Ｈｉｌｌ−ＰｅｒｋｉｎｓおよびＰｏｓｓｅｅ、Ｊ．Ｇｅｎ ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：９７１−６、１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．
、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：１５５１−６、１９９４；および、Ｃｈａ
ｚｅｎｂａｌｋおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：
１５４３−９、１９９５。このような転移ベクター構築物において、基本的タン
パク質プロモーターの短いまたは長いバージョンを使用することができる。その
うえ、自然ｚａｍｐ１分泌シグナル配列を昆虫タンパク質から誘導された分泌シ
グナル配列で置換する、転移ベクターを構築することができる。例えば、エクジ
ステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、蜜蜂のメリチン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、またはバキュロウイルス
ｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）からの分泌
シグナル配列を構築物において使用して、自然ｚａｍｐ１分泌シグナル配列を置
換することができる。さらに、転移ベクターは、発現されたｚａｍｐ１ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端におけるエピトープ標識、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエ
ピトープ標識をコードするＤＮＡとのインフレーム融合物を含むことができる（
Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ． ８２：７９５２−４、１９８５）。この分野において知られている技術
を使用して、ｚａｍｐ１を含有する転移ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中
に形質転換し、そして組換えバキュロウイルスを示す中断されたｌａｃＺ遺伝子
を含有するバクミドについてスクリーニングする。組換えバキュロウイルスのゲ
ノムを含有するバクミドＤＮＡを普通の技術に従い単離し、そしてスポドプテラ
・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、例えば
、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトする。ｚａｍｐ１を発現する組換えベクターを
引き続いて生成させる。この分野において普通に使用されている方法により、組
換えウイルスの系統を作る。

【００８５】 宿主細胞、典型的にはヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐ ｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）から誘導された細胞系統を感染させるために
、組換えウイルスを使用する。一般に、下記の文献を参照のこと：Ｇｌｉｃｋお
よびＰａｓｔｅｒｎａｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂ ｉｎａｎｔ ＤＮＡ 、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、
１９９４。他の適当な細胞系統は、トリコデルマ・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｎｉ）から誘導されたＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯ^TM細胞系統（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）である（米国特許第５，３００，４３５号）。商業的に入手可能な無血清培
地を使用して、細胞を増殖させかつ維持する。適当な培地はＳｆ９細胞について
Ｓｆ９００ ＩＩ^TM（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥＳＦ ９
２１^TM（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）；およびトリコデルマ・ニ（Ｔ
．ｎｉ）細胞についてＥｘ−ｃｅｌｌＯ４５０^TM（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ、カンサス州レネクサ）またはＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯ^TM（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。細胞をほぼ２〜５×１０⁵ 細胞の接種密度か
ら１〜２×１０⁶ 細胞の密度に増殖させ、この時組換えウイルスの系統を０．１
〜１０、より典型的には約３の感染の多重度で添加する。組換えウイルスが感染
した細胞は典型的には感染後１２〜７５時間で組換えｚａｍｐ１ポリペプチドを
産生し、そしてそれを変化する効率で培地の中に分泌する。培養物を通常感染後
４８時間に収集する。遠心を使用して培地（上清）から細胞を分離する。ｚａｍ
ｐ１ポリペプチドを含有する上清を、微小孔フィルター、通常０．４５μｍの孔
大きさのフィルターを通して濾過する。使用する手順は一般に入手可能な実験室
のマニュアルに記載されている（ＫｉｎｇおよびＰｏｓｓｅｅ、ｉｂｉｄ．；Ｏ
’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、ｉｂｉｄ．；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、ｉｂｉｄ ． ）。本明細書に記載する方法に従い、上清からのｚａｍｐ１ポリペプチドの引
き続く精製を実施する。

【００８６】 酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに
関して特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ ａｓｔｏｒｉｓ ）、およびピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌ ｉｃａ ）を包含する。外因的ＤＮＡでサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産する方法は
、例えば、下記の特許文献に記載されている：Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４
，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９３１
，３７３号；Ｂｒａｋｅ、米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈ ｅｔ
ａｌ．、米国特許第５，０３７，７４３号；およびＭｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．
、米国特許第４，８４５，０７５号。選択可能なマーカーにより決定された表現
型、普通の薬剤耐性または特定の栄養（例えば、ロイシン）の非存在において増
殖する能力により、形質転換された細胞を選択する。サッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において使用するた
めに好ましいベクター系は、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，
９３１，３７３号）により開示されているＰＯＴ１ベクター系であり、これによ
りグルコース含有培地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。酵
母において使用するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵
素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｉｎ
ｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６１５，９７４号；およびＢｉｔｔ
ｅｒ、米国特許第４，９７７，０９２号、参照）およびアルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子からのものを包含する。また、米国特許第４，９９０，４４６号；米
国特許第５，０６３，１５４号；米国特許第５，１３９，９３６号および米国特
許第４，６６１，４５４号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕ ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ）、シゾサッカラロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベロマイセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベロマイセス・フラギリ
ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒｇｉｌｉｓ）、ウスチラゴ・マイディス
（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ ａｓｔｏｒｉｓ ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ ）、ピキア・グイレルモンディイ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）およびカンジダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）を包含する、
他の酵母のための形質転換系はこの分野において知られている。例えば、Ｇｌｅ
ｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２：３４５
９−６５、１９８６およびＣｒｅｇｇ、米国特許第４，８８２，２７９号、参照
。ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に
従い、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞を利用することができる
。アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ ｕｍ ）は、Ｓｕｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１６２，２２８号に開
示されている。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換する方法は
、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ、米国特許第４，４８６，５３３号に開示されている。

【００８７】 組換えタンパク質の生産のための宿主としてピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉ ａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ ）を使用することは、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４
５０号、ＷＯ９７／１７４５１号、ＷＯ９８／０２５３６号、およびＷＯ９８／
０２５６５号に開示されている。ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃ ａ ）の形質転換において使用するためのＤＮＡ分子は二本鎖、円形のプラスミド
として普通に製造され、これらは好ましくは形質転換の前に線状化される。ピキ
ア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）におけるタンパク質の生産のため
に、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ（ Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ ）の遺伝子、例えば、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅ ｔａｎｏｌｉｃａ ）のアルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）のそれ
であることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシン
ターゼ（ＤＨＡＳ）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、およびカタラー
ゼ（ＣＡＴ）遺伝子のプロモーターを包含する。宿主染色体の中へのＤＮＡの組
込みを促進するために、宿主ＤＮＡ配列により双方の末端においてフランクされ
たプラスミドの全体の発現セグメントを有することが好ましい。ピキア・メタノ
リカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）において使用するために好ましい
選択可能なマーカーはピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）のＡＤ
Ｅ２遺伝子であり、これはホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシ
ラーゼ（ＡＩＲＣ；ＥＣ４．１．１．２１）であり、これはアデニンの非存在に
おいてａｄｅ２宿主細胞を増殖させる。メタノールの使用を最小としようとする
、大規模の工業的方法のために、双方のメタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１および
ＡＵＧ２）が欠失されている、宿主細胞を使用することが好ましい。分泌された
タンパク質の生産のために、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１
）を欠如する宿主細胞は好ましい。問題のポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有するプラスミドをピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）細胞の中
に導入することを促進するために、エレクトロポレーションを使用する。２．５
〜４．５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する、指
数的に減衰する、パルス電界、および１〜４０ミリセカント、最も好ましくは約
２０ミリセカントの時間定数（τ）を使用する、エレクトロポレーションにより
、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）細胞を形質転換することが
好ましい。

【００８８】 細菌大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ）および他の属の株を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有
用である。これらの宿主を発現し、その中にクローニングされた外来ＤＮＡ配列
を発現する技術はこの分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．、ｉｂｉｄ．）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌におい
てｚａｍｐ１ポリペプチドを発現させるとき、ポリペプチドを、典型的には不溶
性粒子として、細胞質の中に保持させることができるか、あるいは細菌の分泌配
列によりペリプラスミック空間の中に向けることができる。前者の場合において
、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば、グアニジンイソチオシアネートまたは
尿素を使用して、変性する。次いで変性されたポリペプチドをリフォルディング
させ、変性物の希釈により、例えば、尿素の溶液および還元されたグルタチオン
および酸化されたグルタチオンとの組合わせに対する透析、および引き続く緩衝
化生理食塩水に対する透析により、二量体化させることができる。後者の場合に
おいて、細胞を崩壊させて（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）
ペリプラスミック空間の含量を解放し、これにより変性およびリフォルディング
の必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリプラスミック空間から可
溶性の、機能的形態で回収することができる。

【００８９】 形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素
および選択した宿主細胞の成長に必要な培地中で培養する。規定された培地およ
び複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野において知られており、
そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよび無機質を含む。培
地は、また、必要に応じて、成長因子のような成分を含有することができる。一
般に、外因的に添加されたＤＮＡを含有する細胞について成長培地を選択する。
この選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の欠如により実施され、必須栄
養素は発現ベクター上に担体されるか、あるいは宿主細胞の中に共トランスフェ
クトされた選択可能なマーカーにより補足される。炭素、窒素および微量栄養素
の適切な源を含む培地中で約２５℃〜３５℃の温度において、ピキア・メタノリ
カ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）細胞を培養する。慣用の手段、例えば、小さい
フラスコの震盪または発酵槽のスパージにより、液体培地を十分にエアレーショ
ンする。ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）のために好ましい培
地は、ＹＥＰＤ（２％のＤ−グルコース、２％のＢａｃｔｏ^TMペプトン（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）、１％のＢａｃｔｏ ^TM 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．００４％のアデ
ニンおよび０．００６％のＬ−ロイシン）である。

【００９０】 分画および／または慣用の精製方法および培地を使用して、発現された組換え
ｚａｍｐ１ポリペプチド（またはキメラｚａｍｐ１ポリペプチド）を精製するこ
とができる。試料の分画のために、硫酸アンモニウム沈降および酸またはカオト
ロープ抽出を使用することができる。典型的な精製工程は、ヒドロキシアパタイ
ト、サイズ排除クロマトグラフィー、ＦＰＬＣおよび逆相高性能液体クロマトグ
ラフィーを包含することができる。適当なクロマトグラフィーの媒質は、誘導化
デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製のシリカ、
およびその他を包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体は好ましく
、ＤＥＡＥファスト−フロー・セファローズ（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）は特に好
ましい。典型的なクロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチ
ル基で誘導化された媒質、例えば、フェニル−セファローズＦＦ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）、トヨパールブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ、ペンシルベニア州モ
ントゴメリヴィレ）、オクチル−セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびそ
の他；またはポリアクリル樹脂、例えば、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１（
Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）およびその他を包含する。適当な固体の支持体は、ガラス
ビーズ、シリカをベースとする樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋
アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、および
その他を包含し、これらはこれらを使用する条件下に不溶性である。これらの支
持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および
／または炭水化物部分によるタンパク質の結合を可能とする反応性基で修飾する
ことができる。化学的カップリングの例は、臭化シアンの活性化、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドの活性化、エポキシドの活性化、スルフヒドリルの活性化、ヒ
ドラジドの活性化、およびカーボジイミドの化学的カップリングのためのカルボ
キシルおよびアミノ誘導体を包含する。これらおよび他の固体の媒質はこの分野
においてよく知られており、かつ広く使用されており、そして商業的供給会社か
ら入手可能である。レセプターのポリペプチドを固体の媒質に結合する方法は、
この分野においてよく知られている。特定の方法の選択は日常的設計事項であり
、そして一部分選択した支持体の性質により決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉ ｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ＆ Ｍｅｔｈｏｄ ｓ 、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、スイス国ウッ
プサラ、１９８８、参照。

【００９１】 本発明のポリペプチドは、それらの構造および結合の性質を利用することによ
って、単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロ
マトグラフィーを使用して、ヒスチジンに富んだタンパク質またはＨｉｓ標識を
有するタンパク質を精製することができる。簡単に述べると、ゲルにまず２価の
金属イオンを負荷してキレート化剤を形成する（Ｓｕｌｋｏｗｓｉｋｉ、Ｔｒｅ ｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３：１−７、１９８５）。ヒスチジンに富ん
だタンパクは、使用する金属イオンに依存して、このマトリックスに異なるアフ
ィニティーで吸着され、そして競合溶離、ｐＨの低下、または強いキレート化剤
の使用により溶離されるであろう。他の精製法は、レクチンアフィニティークロ
マトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパ
ク質の精製を包含する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．１
８２、″Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ″、Ｍ
．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、
１９９０、ｐｐ．５２９−３９）。本発明の追加の好ましい態様の範囲内におい
て、問題のポリペプチドと親和標識（例えば、マルトース結合タンパク質、ＦＬ
ＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、免疫グロブリンドメイン）との融合物を構築して、精製
を促進することができる。

【００９２】 タンパク質のリフォルディング（および、必要に応じて、再酸化）手順を好都
合に使用することができる。タンパク質を＞８０％の純度、より好ましくは＞９
０％の純度、なおより好ましくは＞９５％の純度に精製することが好ましく、そ
して特に好ましくはタンパク質は薬学的に純粋な形態である、すなわち、汚染す
る高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して９９．９％より高い純度であ
り、そして感染因子または発熱因子を含有しない。好ましくは、精製されたタン
パク質は他のタンパク質、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。

【００９３】 ｚａｍｐ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを、また、化学的合成により
製造することができる。ｚａｍｐ１ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー
であり、グリコシル化されているか、あるいはされていないことができ、ペキル
化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されているか、あるいはされていないことができ、そし
て初期のメチオニンアミノ酸残基を含むか、あるいは含まないことができる。例
えば、ｚａｍｐ１ポリペプチドは、独占的固相合成、部分的固相法、フラグメン
ト縮合または古典的溶液合成により合成することができる。ポリペプチドは好ま
しくは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５ ：２１４９、１９６３、に記載されているように、固相ペプチド合成により製造
される。アルファ−アミノ末端が保護されたアミノ酸を使用して、この合成は実
施される。不安定性側鎖を有する３官能性アミノ酸を、また、適当な基で保護し
て、ポリペプチドの組立ての間に望ましくない化学的反応が起こるのを防止する
。アルファ−アミノ保護基を選択的に除去して、引き続いてアミノ末端において
反応が起こるようにする。アルファ−アミノ保護基を除去する条件は、側鎖の保
護基を除去しない。

【００９４】 アルファ−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の分野において有用であ
ることが知られている基である。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフル
オロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳香族
ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、置換ベンジ
ルオキシカルボニルおよび９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（Ｆｍｏ
ｃ）］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｃｏ）
、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］およびア
ルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が包含される。好ま
しい保護基はｔＢｏｃおよびＦｍｏｃである。

【００９５】 選択される側鎖の保護基はカップリングの間に無傷に止まらなくてはならず、
そしてアミノ末端の保護基の脱保護の間に、またはカップリング条件の間に除去
されてはならない。側鎖の保護基は、また、合成の完結後に、仕上げられたポリ
ペプチドを変更しなであろう反応条件を使用して除去されなくてはならない。ｔ
Ｂｏｃ化学において、３官能性アミノ酸のための側鎖の保護基は大部分ベンジル
に基づく。Ｆｍｏｃ化学において、側鎖の保護基は大部分ブチルまたはトリチル
に基づく。

【００９６】 ｔＢｏｃ化学において、好ましい側鎖の保護基はアルギニンについてトシル、
アスパラギン酸についてシクロヘキシル、システインについて４−メチルベンジ
ル（およびアセトアミドメチル）、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンにつ
いてベンジル、ヒスチジンについてベンジルオキシメチル（およびジニトロフェ
ニル）、リジンについて２−Ｃｌ−ベンジルオキシカルボニル、トリプトファン
についてホルミルそしてチロシンホルミル２−ブロモベンジルである。Ｆｍｏｃ
化学において、好ましい側鎖の保護基は、アルギニンについて２，２，５，７，
８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）または２，２，４，６，
７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、アスパラ
ギン、システイン、グルタミンおよびヒスチジンについてトリチル、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンについてｔ−ブチル、
リジンおよびトリプトファンについてｔＢｏｃである。

【００９７】 ホスホペプチドの合成のために、ホスフェート基の直接的または組立て後の組
込みを使用する。直接的組込みの戦略において、セリン、スレオニンまたはチロ
シン上のホスフェート基は、Ｆｍｏｃ化学においてメチル、ベンジル、またはｔ
−ブチルにより保護するか、あるいはｔＢｏｃ化学においてメチル、ベンジルま
たはフェニルにより保護することができる。ホスフェート保護なしのホスホチロ
シンの直接的組込みをＦｍｏｃ化学において使用することができる。組立て後の
組込みの戦略において、セリン、スレオニンまたはチロシンの非保護のヒドロキ
シル基を固相上でジ−ｔ−ブチル−、ジベンジル−またはジメチル−Ｎ，Ｎ’−
ジイソプロピル−ホスホアミダイトで誘導化し、次いでｔ−ブチルヒドロ−ペル
オキシドで酸化する。

【００９８】 固相合成は、通常、アルファ−アミノ保護（側鎖保護）アミノ酸を適当な固体
の支持体にカップリングさせることによってカルボキシル末端から実施される。
クロロメチル、クロロトリチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させるとき、
エステル結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端に遊離のカルボキシ
ル基を有するであろう。あるいは、アミド樹脂、例えば、ベンズヒドリルアミン
またはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ｔＢｏｃ化学について）およびリ
ンク（Ｒｉｎｋ）アミドまたはＰＡＬ樹脂（Ｆｍｏｃ化学について）を使用する
とき、アミド結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端にカルボキシア
ミド基を有するであろう。これらの樹脂は、ハンドルまたはリンカーを含むか、
あるいは含まない、結合した第１アミノ酸を含むか、あるいは含まない、ポリス
チレン−またはポリアミド−をベースとするか、あるいはポリエチレングリコー
ル−グラフト化されているかどうかにかかわらず、商業的に入手可能であり、そ
してそれらの製造は下記の文献に記載されている：Ｓｔｅｗａｒｔ、ｅｔ ａｌ
．、″Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ″（第２
版）、（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード
、１９８４）およびＢａｙｅｒおよびＲａｐｐ、Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ ． ３：３、１９８６；およびＡｔｈｅｒｔｏｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｏｌｉｄ
Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ 、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８９。

【００９９】 必要に応じて側鎖において、およびアルファ−アミノ基において保護された、
Ｃ末端のアミノ酸を、種々の活性化剤、例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミ
ド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカーボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）およ
びカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を使用して、ヒドロキシメチル樹脂に結
合させる。それはクロロメチルまたはクロロトリチル樹脂に直接的にそのセシウ
ムテトラメチルアンモニウム塩の形態で、あるいはトリエチルアミン（ＴＥＡ）
またはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在において結合させること
ができる。アミド樹脂への第１アミノ酸の結合は、カップリング反応の間のアミ
ド結合の形成と同一である。

【０１００】 樹脂の支持体への結合後、保護化学（例えば、ｔＢｏｃ、Ｆｍｏｃ）に依存し
て種々のの試薬を使用して、アルファ−アミノ保護基を除去する。Ｆｍｏｃ除去
の程度は、３００〜３２０ｎｍにおいて、あるいは導電性セルによりモニターす
ることができる。アルファ−アミノ保護基を除去した後、残りの保護されたアミ
ノ酸を要求される順序で段階的にカップリングして、所望の配列を得る。

【０１０１】 種々の活性化剤、例えば、下記のものをカップリング反応に使用することがで
きる：ＤＣＣ、ＤＩＰＣＤＩ、２−クロロ−１，３−ジメチルイミジウムヘキサ
フルオロホスフェート（ＣＩＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ト
リス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ
）およびそのピロリジン類似体（ＰｙＢＯＰ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−
ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）、Ｏ−（ベンゾトリ
アゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニムヘキサフルオ
ロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびそのテトラフルオロボレート類似体（ＴＢＴ
Ｕ）またはそのピロリジン類似体（ＨＢＰｙＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニムヘキサフルオロ
ホスフェート（ＨＡＴＵ）およびそのテトラフルオロボレート類似体（ＴＡＴＵ
）またはそのピロリジン類似体（ＨＡＰｙＵ）。カップリング反応において使用
する最も普通の触媒添加剤は、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、３−
ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（
ＨＯＤｈｂｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＢＯＢｔ）および１−ヒ
ドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を包含する。各保護された
アミノ酸は過剰量（＞２．０当量）で使用し、そしてカップリングは通常Ｎ−メ
チルピロリドン（ＮＭＰ）中で、あるいはＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２またはそれらの
混合物中で実施する。各段階において、例えば、Ｋａｉｓｅｒ、ｅｔ ａｌ．、 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４：５９５、１９７０、に記載されているよう
に、ニンヒドリン反応により、カップリング反応の完結の程度をモニターするこ
とができる。

【０１０２】 所望のペプチドが完全に組立てられた後、適切な掃去剤とともに試薬を使用し
てペプチド−樹脂を切り放す。掃去剤（例えば、Ｈ２Ｏ、エタンジチオール、フ
ェノールおよびチオアニソール）とともにＴＦＡにより、Ｆｍｏｃペプチドは通
常切り放し、脱保護される。ｔＢｏｃペプチドは通常液状ＨＦで１〜２時間−５
〜０℃において切り放し、脱保護され、これはポリペプチドを樹脂から切り放し
、側鎖の保護基の大部分を除去する。掃去剤、例えば、アニソール、ジメチルサ
ルファイドおよびｐ−チオクレゾールを通常液状ＨＦとともに使用して、切り放
しの間にポリペプチドの中に存在するアミノ酸残基のアルキル化およびアシル化
からカチオンが形成するのを防止する。トリプトファンのホルミル基およびヒス
チジンのジニトロフェニル基を、ＨＦの切り放し前にＤＭＦ中で、それぞれ、ピ
ペリジンおよびチオフェニルにより、除去することが必要である。システインの
アセトアミドメチル基は、酢酸水銀（ＩＩ）により除去するか、あるいはヨウ素
、トリフルオロ酢酸タリウム（ＩＩＩ）またはテトラフルオロホウ酸銀（これは
同時にシステインをシスチンに酸化する）により除去することができる。ｔＢｏ
ｃペプチドの切り放しおよび脱保護のために使用される他の強酸は、トリフルオ
ロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）およびトリメチルシリルトリフルオロアセテ
ート（ＴＭＳＯＴｆ）を包含する。

【０１０３】 ｚａｍｐ１ポリペプチドのリガンド結合性ポリペプチドをリガンドの精製に使
用することもできる。ポリペプチドを、使用条件下に安定である、固体の支持体
、例えば、アガロース、架橋アガロー、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベー
スとする樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド樹脂、およびその他の材
料のビーズ上に固定化する。固体の支持体にポリペプチドを結合する方法は、こ
の分野において知られており、そしてアミン化学、臭化シアンの活性化、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドの活性化、エポキシドの活性化、スルフヒドリルの活性
化およびヒドラジドの活性化を包含する。得られる媒質は一般にカラムの形態に
形造られ、そしてリガンドを含有する流体をカラムに１回またはそれ以上の回数
通過させて、リガンドをリガンド結合性ポリペプチドに結合させる。次いで塩濃
度の変化、カオトロープ剤（グアニジンＨＣｌ）、またはリガンド−レセプター
の結合を崩壊させるｐＨを使用して、リガンドを溶離する。

【０１０４】 リガンド結合性レセプター（または抗体、補体／抗補体の対の一方のメンバー
）またはその結合性フラグメント、および商業的に入手可能なバイオセンサー計
器（ＢＩＡｃｏｒｅ^TM、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、ニュージャ
ージイ州ピスカタウェイ）を使用してアッセイシステムを好都合に使用すること
ができる。このようなレセプター、抗体、補体／抗補体の対のメンバーまたはフ
ラグメントをレセプターのチップの表面上に固定化する。このフラグメントの使
用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２
９−４０、１９９１およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｊ．Ｍｏｌ ．Ｂｉｏｌ． ２３４：５５４−６３、１９９３、に開示されている。レセプタ
ー、抗体、メンバーまたはフラグメントを、アミンまたはスルフヒドリルの化学
を使用して、フローセル内の金薄膜に結合させたデキストラン繊維に共有結合さ
せる。被験試料をセルに通過させる。リガンド、エピトープ、または補体／抗補
体の反対のメンバーが試料の中に存在する場合、それは、それぞれ、固定化され
たレセプター、抗体またはメンバーに結合し、媒質の屈折率を変化させ、これは
金薄膜の表面のプラズモンの共鳴の変化として検出される。このシステムは、オ
ンおよびオフの割合の測定（これから結合アフィニティーを計算することができ
る）および結合の化学量論的評価を可能とする。

【０１０５】 リガンド結合性レセプターポリペプチドを、また、この分野において知られて
いる他のアッセイシステムにおいて使用することができる。このようなシステム
は、結合アフィニティーを測定するスキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ
、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２、１９４９、参照）
および比色アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３ ：５４５−４８、１９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ２４５：８２１−２５、１９９１、参照）を包含する。

【０１０６】 ｚａｍｐ１ポリペプチドを、また、使用して、ｚａｍｐ１ポリペプチドのエピ
トープ、ペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体を製造することが
できる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する方法は、この
分野においてよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
ＮＹ、１９８９；およびＨｕｒｒｅｌ、Ｊ．Ｇ．Ｒ．編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、フロリダ州ボカ
レイトン、１９８２）。当業者にとって明らかなように、種々の温血動物、例え
ば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラッ
トから、ポリクローナル抗体を発生させることができる。

【０１０７】 アジュバント、例えば、明礬（水酸化アルミニウム）またはフロインド完全ア
ジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用して、ｚａｍｐ１ポリペ
プチドの免疫原性を増加させることができる。免疫化に有用なポリペプチドは、
また、融合ポリペプチド、例えば、ｚａｍｐ１またはその一部分と免疫グロブリ
ンポリペプチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリ
ペプチドの免疫原は全長の分子またはその一部分であることができる。ポリペプ
チドの一部分が「ハプテン様」である場合、このような一部分は好都合には免疫
化のために高分子の担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド）に結合させること
ができる。

【０１０８】 本明細書において使用するとき、用語「抗体」はポリクローナル抗体、アフィ
ニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合
性フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）₂ およびＦａｂ’タンパク質分解フラグ
メントを包含する。遺伝子操作された無傷の抗体またはフラグメント、例えば、
キメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結
合性ペプチドおよびポリペプチドもまた包含される。非ヒトＣＤＲのみをヒトフ
レームワークおよび定常領域の上にグラフト化するか、あるいは全体の非ヒト可
変ドメインを組込む（必要に応じて暴露した残基を置換することによって、前記
ドメインをヒト様表面で「クローキング（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」する、ここで「
ベニヤ化された」抗体が生ずる）ことによって、非ヒト抗体をヒト化することが
できる。いくつかの例において、ヒト化抗体はヒト可変領域のフレームワークド
メイン内に非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。抗
体をヒト化することによって、生物学的半減期を増加することができ、そしてヒ
トへの投与のときの悪い免疫反応の可能性が減少させる。本発明において有用な
抗体を発生させるか、あるいは選択する別の技術は、ｚａｍｐ１タンパク質また
はペプチドに対するリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ暴露、およびファージまたは同
様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーの選択（例えば、固定化または
標識化されたｚａｍｐ１タンパク質またはペプチドの使用による）を包含する。

【０１０９】 抗体は、１）それらが限界のレベルの結合活性を示す場合、および／または２
）それらが関係するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結
合すると決定される。第１に、本発明における抗体がｚａｍｐ１ポリペプチド、
ペプチドまたはエピトープと、１０⁶ ／ｍｏｌまたはそれより大きい、好ましく
は１０⁷ ／ｍｏｌまたはそれより大きい、より好ましくは１０⁸ ／ｍｏｌまたは
それより大きい、最も好ましくは１０⁹ ／ｍｏｌまたはそれより大きい、結合ア
フィニティー（Ｋａ）で結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合アフィニ
ティーは、当業者により、例えば、スキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ
、Ｇ．、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ５１：６６０−６７２、１９４９
）により容易に測定することができる。

【０１１０】 第２に、抗体が関係するポリペプチドと有意に交差反応しない場合、抗体は特
異的に結合すると決定される。例えば、標準的ウェスタンブロット分析を使用し
て、抗体がｚａｍｐ１ポリペプチドを検出するが、既知の関係するポリペプチド
を検出しない場合、抗体は関係するポリペプチド分子と有意に交差反応しない（
Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｉｂｉｄ．）。既知の関係するポリペプチドの
例は、オーソログ、すなわち、タンパク質のファミリーのメンバーである同一種
からのタンパク質、例えば、他の既知のヒトβ−デフェンシン、例えば、ｈＢＤ
−１およびｈＢＤ−２）、突然変異のヒトβ−デフェンシン、および非ヒトβ−
デフェンシンである。

【０１１１】 そのうえ、抗体を既知の関係するポリペプチド「に対してスクリーニング」し
て、本発明のポリペプチドに特異的に結合する集団を単離することができる。例
えば、ヒトｚａｍｐ１ポリペプチドに対して発生させた抗体は不溶性マトリック
スに付着した関係するポリペプチドに吸着される；ヒトｚａｍｐ１ポリペプチド
に対して特異的な抗体は適切な緩衝条件下にマトリックスを通して流れるであろ
う。このようなスクリーニングは、密接に関係するポリペプチドに対して非交差
反応性のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の単離を可能とする（下
記の文献を参照のこと：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ 、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ 、Ｃｏｏｌｉｇａｎ、ｅｔ ａ
ｌ．、（編）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）。特異的抗体の
スクリーニングおよび単離は、この分野においてよく知られている（下記の文献
を参照のこと：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ（編
）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３；Ｇｅｔｚｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ａｄ ｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、４３：１−９８、１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 、
Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ．Ｗ．（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、１
９９６；Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：６７−１０１、１９８４）。

【０１１２】 この分野において知られている種々のアッセイを利用して、ｚａｍｐ１タンパ
ク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出し、精製することができる。
典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ 、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８、に詳細に記載されて
いる。このようなアッセイの代表的な例は下記のものを包含する：並流免疫電気
泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合
アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。さらに、抗体を野生型／突然変異のｚ
ａｍｐ１タンパク質またはペプチドに対する結合についてスクリーニングするこ
とができる。

【０１１３】 ｚａｍｐ１ポリペプチドを発現する細胞の標識化；アフィニティー精製による
ｚａｍｐ１ポリペプチドの単離；ｚａｍｐ１ポリペプチドの循環レベルを測定す
る診断アッセイ；根元的な病理学または疾患のマーカーとしてのｚａｍｐ１ポリ
ペプチドの検出または定量；ＦＡＣＳを使用する分析方法；発現ライブラリーの
スクリーニング；抗イディオタイプ抗体の発生；のために、そして中和性抗体；
またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗微生物活性をブロック
するアンタゴニスト；として、ｚａｍｐ１ポリペプチドに対する抗体を使用する
ことができる。

【０１１４】 医薬的に使用するために、本発明のタンパク質は、慣用法に従い、非経口的、
特に静脈内または皮下の送出のために処方される。静脈内投与は、１〜数時間の
典型的な期間にわたる、ボーラス注射または注入によるであろう。一般に、医薬
処方物はｚａｍｐ１タンパク質と、薬学上許容されるビヒクル、例えば、生理食
塩水、緩衝化生理食塩水、水中の５％デキストロースまたはその他との組合わせ
を包含するであろう。処方物は、さらに、１または２以上の賦形剤、保存剤、可
溶化剤、緩衝化剤、バイアル表面上のタンパク質の損失を防止するためのアルブ
ミン、およびその他を含むことができる。処方法はこの分野においてよく知られ
ており、そして、例えば、下記の文献に開示されている：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 、Ｇｅｎｎａｒｏ、編
、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イースト
ン、第１９版、１９９５。治療的投与量は一般に承認された標準に従い、治療す
べき症状の特質および苛酷性、患者の体質、およびその他を考慮して、臨床医に
より決定される。投与量の決定は当業者のレベルの範囲内である。タンパク質は
、急性治療のために、１週またはそれより短い期間にわたって、しばしば１〜３
日の期間にわたって投与することができるか、あるいは慢性的治療において、数
カ月または数年間にわたって使用することができる。

【０１１５】 下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。 実施例１ ＥＳＴ配列のエクステンション ヒト乾癬性皮膚から単離されたＳＡＰ−１ヒトデフェンシンに対する相同的配
列についてＥＳＴデータベースを検索することによって、本発明の新規なｚａｍ
ｐ１ポリペプチドを最初に同定した。単一のＥＳＴ配列が気管支上皮ｃＤＮＡラ
イブラリーの中に発見され、そしてこれはβ−デフェンシンのファミリーに関係
すると予測された。β−デフェンシンのコンセンサスモチーフに基づく第２検索
もまたＥＳＴを同定した。

【０１１６】 対応するｃＤＮＡを同定するために、ＥＳＴを含有するクローンを探したが、
見出されなかった。オリゴヌクレオチドＺＣ１４７４１（配列番号：５）、ＺＣ
１４７４０（配列番号：６）をＰＣＲ反応において使用して、ヒトゲノムＤＮＡ
からｚａｍｐ１ポリペプチドをコードする配列を単離した。反応条件次の通りで
あった：９４℃、１分３０秒間、次いで３５サイクルの９４℃、１０秒間、５８
℃、２０秒間および７２℃、２０秒間、次いで７２℃、１０分間。鋳型として、
１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用し、そしてクロンテク・アドバンテイジ（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ＰＣＲミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、
カリフォルニア州パロアルト）をポリメラーゼ混合物として使用した。次いで生
ずる１１３ｂｐのフラグメントを３．２％のＮｕＳｉｅｖｅ（ＦＭＣ Ｂｉｏｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ、メイン州ロックランド）ゲル上でＱｉａｅｘＩＩゲル抽出キッ
ト（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州チャツワース）を製造業者の使
用説明書に従い使用して精製した。精製した物質を配列決定のための鋳型として
使用した。ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TMモデル３７７ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、コネチカット州ノーウォーク）でＡＢＩＰＲＩＳＭ ^TM 色素ターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）を製造業者のインストラクションに従い使用して、鋳型
を配列決定した。オリゴヌクレオチドＺＣ１４７４１（配列番号：５）、ＺＣ１
４７４０（配列番号：６）をクローンの配列決定のためのプライマーとして使用
した。配列決定反応をハイバイド・オムニジーン温度サイクリングシステム（Ｈ
ｙｂａｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｎｅｔ Ｃｏ．、ニューヨーク州ウッ
ドブリッジ）中で実施した。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ^TM３．１配列解析ソフトウェ
ア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州アンアーバー
）をデータの解析に使用した。生ずる１１３ｂｐの配列を配列番号：１に開示す
る。本来誘導されたＥＳＴ配列を配列番号：１に表す配列と比較すると、推定さ
れたアミノ酸配列の間で１アミノ酸の差を生ずる２塩基対の差が存在することが
示された。塩基対の差の１つは、配列番号：１中の既知の残基に対するＥＳＴ配
列中の未知の「Ｎ」残基からものであったことに注意すべきである。

【０１１７】 一般に、いくつかの技術の１つまたは組合わせを使用して、ｚａｍｐ１ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドの全長の配列を得ることができた。第１に
、前述の配列決定されたクローンに対してコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）である１
またはそれ以上の追加のＥＳＴが同定される場合、このようなＥＳＴに対応する
クローンを、前述したように、順序決定し、配列決定し、そしてもとの配列と一
緒にスプライスして全長の配列を形成することができる。全長の配列の小さい部
分が存在しない場合、５’ＲＡＣＤ反応を実施し、前述したように、生ずるフラ
グメントを配列決定し、もとの配列と一緒にスプライスして全長の配列を形成す
ることができる。また、１またはそれ以上のｃＤＮＡライブラリーを配列番号：
１のすべてまたは一部分でプローブして、推定上の全長のクローンを同定するこ
とができる。前述したように、このような全長のクローンを配列決定することが
できる。

【０１１８】 実施例２ 組織の分布 クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）からのヒト
の多数の組織ブロットを使用して、ノザンを実施した。クロンテク・アドバンテ
イジ・クレンタク・ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｋ
ｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォ
ルニア州パロアルト）を使用して、５８℃のアニーリング温度において、同定さ
れたＥＳＴを直接ベースとする、ほぼ１１３ｂｐのＤＮＡプローブを発生させた
。ＲＥＤＩＰＲＩＭＥ^R ＤＮＡ標識化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州
アーリントンハイツ）を製造業者の使用説明書に従いを使用して、ＤＮＡプロー
ブを³²Ｐで放射能標識化した。ＮＵＣＴＲＡＰプッシュカラム（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ラジョラ）を使用
して、プローブを精製した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフ
ォルニア州パロアルト）溶液をハイブリダイゼーションのために、ノザンブロッ
トのためのハイブリダイジング溶液として使用した。ハイブリダイゼーションを
５５℃において一夜実施し、次いでブロットを２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤ
Ｓ中で室温において洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中で
５０℃において洗浄した。発現は観測されなかった。こうして、ｚａｍｐ１ポリ
ペプチドのｍＲＮＡの正常組織のレベルはノザンブロットの検出感度より低いよ
うに思われる。このような観測は、デフェンシンに関する知識、すなわち、デフ
ェンシンは低いレベルで構成的に発現されるが、感染時において高度に誘導可能
であるという知識、と一致する。

【０１１９】 実施例３ ｚａｍｐ１遺伝子の染色体のマッピング 商業的に入手可能な「ジーンブリッジ ４ ラディエイション・ハイブリッド
・パネル（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐ
ａｎｅｌ）」（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州ハ
ンツヴィレ）を使用して、ｚａｍｐ１遺伝子は染色体８にマッピングされた。ジ
ーンブリッジ ４ ラディエイション・ハイブリッド・パネルは、９３の放射線
ハイブリッドパネルの各々からのＰＣＲａｂｌｅ ＤＮＡと、２つの対照ＤＮＡ
（ＨＦＬドナーおよびＡ２３レシピエント）とを含有する。公衆に入手可能なＷ
ＷＷサーバー（ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／
ｃｇｉｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）は、ジーンブリッジ
４ ラディエイション・ハイブリッド・パネルで構築されたヒトゲノム（「ＷＩ
ＣＧＲ」放射線ハイブリッド地図）のゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ’ｓ）放射線ハイブリッド地図について、ホワイトヘッド・インスチ
チュート／ＭＩＴセンター（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ
Ｃｅｎｔｅｒ）に関するマッピングを可能とする。

【０１２０】 「ジーンブリッジ ４ ＲＨパネル」を使用するｚａｍｐ１遺伝子のマッピン
グのために、２０μｌの反応物をＰＣＲａｂｌｅ ９６ウェルのマイクロタイタ
ープレート（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ）中で構成し、
「ロボサイクラー・グラディエント（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ
）９６」サーマルサークラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において使用した。９５
のＰＣＲ反応物の各々は下記の成分から成っていた：２μｌの１０×ＫｌｅｎＴ
ａｑ ＰＣＲ反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．、カリフォルニア州パロアルト）、１．６μｌのｄＮＴＰミックス（２．５
ｍＭの各々、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ、フォスターシティー、カリフォルニア
州）、１μｌのセンスプライマー、ＺＣ１４，７８０（配列番号：７）、１μｌ
のアンチセンスプライマー、ＺＣ１４，７７６（配列番号：８）、２μｌの「レ
ディロード（ＲｅｄｉＬｏａｄ）」（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉ
ｎｃ．、アラバマ州ハンツヴィレ）、０．４μｌの５０×クロンテク・アドバン
テイジ・クレンタク・ポリメラーゼ・ミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォル
ニア州パロアルト）、２５ｎｇの個々のハイブリッドクローンまたは対照からの
ＤＮＡおよび総体積を２０μｌとするためのｘμｌのｄｄＨ２Ｏ。反応物に等し
い量の鉱油をオーバーレイし、密閉した。ＰＣＲサイクラーの条件は次の通りで
あった：１サイクルの初期の９５℃における５分の変性、３５サイクルの９５℃
における１分の変性、５２℃における１分のアニーリングおよび７２℃における
１．５分のエクステンション、次いで最終の１サイクルの７２℃における７分の
エクステンション。反応物を２％のアガロースゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ、マリイランド州ガイサースバーグ）上の電気泳動により分離した。

【０１２１】 ｚａｍｐ１遺伝子はＷＩＣＧＲ放射線ハイブリッド地図上でヒト染色体８の連
鎖グループの上部から３３．５ｃＲ＿３０００にマッピングされることを結果は
示した。近接および遠位のフレームワークのマーカーは、それぞれ、ＣＨＬＣ．
ＧＡＴＡ６２Ｄ１０およびＷＩ−３８２３（Ｄ８Ｓ１５１１）であった。取り囲
むマーカーを使用すると、８ｐ２３．３−ｐ２３．２領域中のｚａｍｐ１遺伝子
は統合されたＬＤＢ染色体８地図上に位置決定される（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｌｏｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔ
ｈｈａｍｐｔｏｎ、ＷＷＷ ｓｅｒｖｅｒ：ｈｔｔｐ：／／ｃｅｄａｒ．ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂｌｉｃ＿ｈｔｍｌ／）。

【０１２２】 実施例４ 全長のｚａｍｐ１ポリペプチドをコードするＤＮＡの同定およびその配列決定 ゲノムウォーカー（ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^R ）試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
をｚａｍｐ１ポリペプチド特異的アンチセンスプライマーＺＣ１５５９１（配列
番号：１２）と組合わせてを使用し、次いでＺＣ１５５８９（配列番号：１３）
を製造業者の使用説明書に従いを使用してネステッドＰＣＲを実施し、ただし示
唆される６７℃の代わりに６４℃を一次反応において使用することによってＰＣ
Ｒにより、ｚａｍｐ１のコーディング配列の５’末端を得た。ＰＣＲ生成物を２
％のアガロースゲル（Ｇｉｂｃｏ）上で展開し、クイアエックス（Ｑｉａｅｘ）
（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のインストラクションに従いを使用してゲル精製し
た。配列決定プライマーとしてＺＣ１５５８９（配列番号：１３）を使用して生
成物を配列決定すると、推定上の開始メチオニン（配列番号：９のヌクレオチド
１〜２０１または１〜２１９）および５’非翻訳配列の約２５０塩基対にコード
されるｚａｍｐ１ポリペプチドのエクステンションが明らかにされた。

【０１２３】 実施例５ ｚａｍｐ１合成 固相ペプチド合成によりモデル４３１Ａペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フォスターシティー、カリ
フォルニア州）を使用して、４５アミノ酸残基のｚａｍｐ１ペプチド（配列番号
：２の残基２３〜６７）を合成した。初期の支持体樹脂として、Ｆｍｏｃ−リジ
ン（Ｂｏｃ）樹脂（０．５２ｍｍｏｌ／ｇ；Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．、カリフ
ォルニア州サンジョーズ）を使用した。合成のために、１ｍｍｏｌのアミノ酸カ
ートリッジ（Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンジョーズおよび
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フォスタ
ーシティー、カリフォルニア州）を使用した。２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾー
ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホス
フェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、２Ｍ
のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルピロリドン、ジクロロメタ
ン（すべてはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ、フォスターシティー、カリフォルニア州、から）ならびにピペリジン（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミゾリー州セントルイス））および０
．５Ｍの無水酢酸キャッピング溶液（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ、ケ
ンタッキー州ルイスヴィレ）を合成試薬として使用した。

【０１２４】 ペプチド・コンパニオン・ソフトウェア（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ、ケンタッキー州ルイスヴィレ）を使用して、ｚａｍｐ１の合成の
ための凝集の可能性の予測を促進した。単一および二重の双方のカップリングサ
イクルを使用して、合成を実施した。また、カップリングの困難が予測される場
合、アセチル化を使用した。

【０１２５】 標準的ＴＦＡ切断手順（ペプチド切断マニュアルに従う、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により、ペプチドを固相から
切断した。ＲＰ−ＨＰＬＣによりＣ１８、５２ｍｍ×２５０ｍｍの調製用カラム
（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州ヘスペリア）を使用して、ペプチドの精製を実
施した。カラムから画分を収集し、エレクトロスプレー質量分析により正しい質
量について分析した；分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによりＣ１８、４．６ｍｍ×２５０
ｍｍのカラム（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州ヘスペリア）を使用して、純度を
分析した。質量分析により、ｚａｍｐ１の還元された形態の所望の分子量、すな
わち、５１５８が確証された。精製した画分を凍結し、次いで凍結乾燥した。

【０１２６】 還元したペプチドを６ＭのグアニジンＨＣｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．）中に２ｍｇ／ｍｌの初期濃度で溶解した。次いでこの溶液を２．
１体積当量の１ＭのグアニジンＨＣｌに０．５２体積当量のＤＭＳＯ（Ａｌｄｒ
ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と一緒にゆっくり添加した。同一分析用Ｃ
１８カラムを使用する分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより、酸化をモニターした；酸化
は４８時間に完結した。固相抽出Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、マサチュ
セッツ州ミルフォード）を使用して、塩を反応混合物から除去した。酸化された
ペプチドを含有する溶出液を濃縮し、次いでＲＰ−ＨＰＬＣセミ−プレプＣ１８
カラム（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州ヘスペリア）を使用して精製した。４つ
の明確なピークは、エレクトロスプレーＬＣＭＳによりｚａｍｐ１の完全に酸化
形態に対応すると決定された。ピーク２と呼ぶピーク（それはＲＰ−ＨＰＬＣに
より溶離される第２ピークであった）は、部分的デフェンシン遺伝子を使用する
排除プロセスおよびすべての４つのピークのペプチドのマッピングにより、保存
されたデフェンシンジサルファイドパターンを含有することが見出された。この
ピークを単離し、凍結し、そして凍結乾燥した。

【０１２７】 以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で説明したが、
本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である。したがって
、本発明は添付された請求の範囲による以外限定されない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｆｉｇｕｒｅ１は、保存されたβ−デフェンシンのモチーフの３つのジサルフ
ァイド結合の構造を図解する。

【図２】 Ｆｉｇｕｒｅ２は、成熟した、プロセッシングされたヒトＳＡＰ−１の多重ア
ラインメント（例えば、Ｂｅｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３６８ （２）：３３１−５、１９９５）および本発明のｚａｍｐ１ポリペプチド
を図解する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/42 Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／０６４，２９４ (32)優先日 平成９年11月５日(1997．11．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９６４，６８７ (32)優先日 平成９年11月５日(1997．11．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ホロウェイ，ジェイムス エル. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ノースイースト エイティーナイ ンス ストリート 835 (72)発明者 ベインデューア，ナンド アメリカ合衆国，ワシントン 98026，エ ドモンズ，フィフティーセブンス プレイ ス ウエスト 13919 (72)発明者 ベイゲル，ステファニー アメリカ合衆国，ワシントン 98112，シ アトル，トゥエンティーシックスス アベ ニュ イースト 2039 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA13 BA80 CA03 CA09 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 FA02 FA07 FA18 GA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ08 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA19 BA20 CA18 CA25 DA42 MA01 NA01 NA14 ZB092 ZB112 ZB321 ZB332 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA20 CA40 DA75 EA29 EA52 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ） 配列番号：２のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６５の
   配列を有するポリペプチド； ｂ） 配列番号：２のアミノ酸残基１９〜アミノ酸残基６５の配列を有するポ
   リペプチド； ｃ） 配列番号：２のアミノ酸残基２１〜アミノ酸残基６５の配列を有するポ
   リペプチド； ｄ） 配列番号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポ
   リペプチド； ｅ） 配列番号：１０のアミノ酸残基２１〜アミノ酸残基６７の配列を有する
   ポリペプチド；および ｆ） 配列番号：２のアミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列を有するポ
   リペプチド； から成る群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポ
   リペプチドを含む単離されたタンパク質であって、 前記ポリペプチドは配列番号：２または１０のアミノ酸残基３３、４０、４５
   、５５、６２および６３に対応するシステイン残基を有することを特徴とする単
   離されたタンパク質。
2. 【請求項２】 前記タンパク質が、 ａ） 配列番号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポ
   リペプチド； ｂ） 配列番号：１０のアミノ酸残基２１〜アミノ酸残基６７の配列を有する
   ポリペプチド；および ｃ） 配列番号：１０のアミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列を有する
   ポリペプチド； から成る群より選択される配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請
   求項１に記載の単離されたタンパク質。
3. 【請求項３】 アミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列番号：１０の配
   列を有する単離されたタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のタンパク質と、医薬として許容されるビヒ
   クルとを含んでなる医薬組成物。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体の抗イ
   ディオタイプ抗体。
7. 【請求項７】 タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド分子で
   あって、該ポリヌクレオチド分子はコーディング鎖および相補的非コーディング
   鎖から成り、該ポリヌクレオチド分子は、 ａ） 配列番号：２のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６５の配列を有するポリ
   ペプチド； ｂ） 配列番号：２のアミノ酸残基１９〜アミノ酸残基６５の配列を有するポ
   リペプチド； ｃ） 配列番号：２のアミノ酸残基２１〜アミノ酸残基６５の配列を有するポ
   リペプチド； ｄ） 配列番号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基６７の配列を有するポ
   リペプチド； ｅ） 配列番号：１０のアミノ酸残基２１〜アミノ酸残基６７の配列を有する
   ポリペプチド；および ｆ） 配列番号：２のアミノ酸残基２３〜アミノ酸残基６７の配列を有するポ
   リペプチド； から成る群より選択されるポリペプチドに対してアミノ酸配列が少なくとも８０
   ％同一であるポリペプチドをコードし、 ここで前記ポリペプチドは配列番号：２または１０のアミノ酸残基３３、４０
   、４５、５５、６２および６３に対応するシステイン残基を有することを特徴と
   する単離されたポリヌクレオチド分子。
8. 【請求項８】 配列番号：１０のアミノ酸残基３３、４０、４５、５５、６
   ２および６３に対応するシステイン残基を有するタンパク質をコードする単離さ
   れたポリヌクレオチド分子であって、該ポリヌクレオチド分子はコーディング鎖
   および相補的非コーディング鎖から成り、該ポリヌクレオチドは、 ａ） ヌクレオチド２２０〜ヌクレオチド４２０の配列番号：９に示すポリヌ
   クレオチド； ｂ） ヌクレオチド２８０〜ヌクレオチド４２０の配列番号：９に示すポリヌ
   クレオチド；および ｃ） ヌクレオチド２８６〜ヌクレオチド４２０の配列番号：９に示すポリヌ
   クレオチド から成る群より選択されるポリヌクレオチドの配列と少なくとも８０％同一であ
   るヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。
9. 【請求項９】 配列番号：１０のアミノ酸残基３３、４０、４５、５５、６
   ２および６３に対応するシステイン残基を有するタンパク質をコードする単離さ
   れたポリヌクレオチド分子であって、該ポリヌクレオチド分子はコーディング鎖
   および相補的非コーディング鎖から成り、該ポリヌクレオチドは配列番号：１１
   に示すヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分
   子。
10. 【請求項１０】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント；および 転写ターミネーター を含む発現ベクター。
11. 【請求項１１】 前記ＤＮＡセグメントが前記タンパク質に作用可能に連結
    された分泌シグナル配列をさらにコードする、請求項１０に記載の発現ベクター
    。
12. 【請求項１２】 前記分泌シグナル配列が、 ａ） 配列番号：２のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基１８の配列を有するポリ
    ペプチド； ｂ） 配列番号：２のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基２０の配列を有するポリ
    ペプチド； ｃ） 配列番号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基２０の配列を有するポ
    リペプチド；および ｄ） 配列番号：１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基２２の配列を有するポ
    リペプチド； から成る群より選択される、請求項１１に記載の発現ベクター。
13. 【請求項１３】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント；および 転写ターミネーター； を含む発現ベクターが導入されている培養された細胞であって、 前記細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記タンパク質を発現す
    ることを特徴とする培養された細胞。
14. 【請求項１４】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント；および 転写ターミネーター； を含む発現ベクターが導入されている細胞を培養し； これにより前記細胞は前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記タンパク
    質を発現し；そして 前記発現されたタンパク質を回収する、 ことを含む、タンパク質を製造する方法。
15. 【請求項１５】 配列番号：１１のポリヌクレオチドまたは配列番号：１１
    に対して相補的な配列の少くとも１４隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチ
    ドプローブまたはプライマー。